Diagnostyka epidemiologiczna

Wewnątrzkomórkowe patogeny obligatoryjne , takie jak Chlamydia i Mycoplasma , wymagają do

hodowli kultur komórkowych , co znacznie utrudnia ich diagnostykę . Ocenienie obecności zimnej
aglutyniny ( przeciwciał klasy IgM ) w odpowiedzi na Mycoplasma pneumoniae wymaga czułych i
specyficznych testów . Z tych powodów , techniki amplifikacji kwasów nukleinowych stają się
standardowo stosowane do wykrywania C. trachomatis , a także 4 przydatne do wykrywania innych
gatunków Chlamydia i Mycoplasma . DNA patogenów układu oddechowego , Ch . pneumaniae i M.
Pneumoniae , mogą być wykrywane technika real – time PCR , stosowane w diagnostyce infekcji
układu oddechowego , w tym również dla atypowego zapalenia płuc . Celem molekularnym
amplifikacji technika PCR dla M. Pneumoniae są geny kodujące ATPazy , pozwalające na detekcje
gatunkowo specyficzne . Wiele metod komercyjnych opartych na amplifikacji pozwala na
równoczesne wykrywanie patogenów szlaku moczowo – płciowego , takich jak Ch . trachomatis in
goriarrhoeae . Komercyjne systemy identyfikacji patogenów bakteryjnych i grzybowych opierają się
również na sekwencjach genów kodujących rRNA ( np . MicroSe : Applied Biosystems ,
http://www.appliedbiosystems.com ) . Niedawno pojawiły się komercyjnie testy ( SeptiFast Test )
firmy Roche Diagnostics , przeznaczone do wykrywania i identyfikacji 25 ważnych bakterii i grzybów
bezpośrednio z krwi . Testy te oparte są na amplifikacji techniką real – time PCR i analizie krzywych
topnienia otrzymanych amplikonów wykrytych drobnoustrojów.

Metody diagnostyki epidemiologicznej

W molekularnych badaniach epidemiologicznych większość laboratoriów klinicznych w USA

wykorzystuje do wstępnego genotypowania szczepów makro restrykcyjną analizę genomu w
zmiennym polu elektrycznym ( REA – PFGE ) , często też w kombinacji z innymi metodami .
Alternatywnie stosowane metody DNA – fingerprinting ( najczęściej techniki AFLP , RAPD i rep PCR ) ,
bądź rybotypowanie oparte na hybrydyzacji . Metycylino oporne szczepy Saurus ( MRSA ) 4 rutynowo
typowane genetycznie technika REA – PFGE i DNA fingerprinting ( RAPD i rep – PCR ) . Inne bakterie
takie jak Staphylococcus epidermidis ( MRSE ) , Klebsiella pumanae ESBL 1 Clostridium difficile także
typowane metodami molekularnymi . Techniki typowania genetycznego próbuje się standaryzować
za pomocą systemów D analizy komputerowej oraz automatyzować ( np . RiboPrinter ) . Jednym z
obiecujących systemów molekularnego typowania szczepów jest od kilku lat komercyjnie dostępny ,
wystandaryzowany . automatyczny system DiversiLab ( Spectral Genomics , Houston , TX ) , który
wykorzystuje techniki rep – PCR do różnicowania izolatów bakteryjnych i grzybowych oraz
identyfikacji niektórych grzybów do poziomu gatunku System Diversilab został wystandaryzowany dla
wielu bakterii , drożdżaków i dermatofitów . Cały szereg publikacji donosi o dużej powtarzalności
wewnątrz- i między laboratoryjnej tej metody Komercyjnie dostępne zestawy , automatyzacja ,
prostota wykonania , szybkość ( do ok . 4 godzin ) , przyjazny raport , czyni System Diversitab
atrakcyjnymi dostępnym dla wielu laboratoriów mikrobiologicznych . Jednakże komercyjne techniki
do badan epidemiologicznych , stosowane do określenia powiązań genetycznych w obrębie gatunku
oraz różnicowania wewnątrzgatunkowego , są obecnie dostępne tylko w wąskim zakresie .

Czemu służy analiza epidemiologiczna ?

Wraz z diagnostyka molekularne pojawia się epidemiologia molekularna . Dostarcza ona narzędzi ,
które epidemiolog może wykorzystać w celu :
( 1 ) identyfikacji czynnika powodującego chorobę , Śledzenia drogi transmisji , kolonizacji i przebiegu
choroby ,

( 2 ) wykrycia gospodarza czynników środowiskowych odpowiedzialnych za transmisje , kolonizacje i

choroby ,

( 3 ) wyjaśnienia oddziaływania i wzajemnych relacji pomiędzy drobnoustrojami na poziomie

populacji , zarówno na zewnątrz , jak i wewnątrz gospodarza,

( 4 ) wyjaśnienia , w jaki sposób ta informacja może być wykorzystana do rozwiązania problemu

kontroli zakażeń.

Epidemiologia molekularna bada głównie genetyczna zmienność czynników Infekcyjnych oraz stosuje
wyniki tych badan do ustalania źródła pojawienia choroby sprawdzania czy celowe szczepienia
prowadza do eliminacji czynnika zakaźnego , czy też do zastąpienia go nowym szczepem
niewadliwym są szczepionkę . Jeżeli pominie się sekwencje DNA deponowane w bazie GenBank
ramach projektów sekwencjonowania kompletnych genomów , to wysoki procent nowo
deponowanych sekwencji pochodzi z projektów związanych z epidemiologia molekularna . Metody
określania zmienności ( typowanie ) mogą by oparte na analizie lipopolisacharydów ( LPS ) i kwasów
tłuszczowych , białek oraz kwasów nukleinowych.

Metody badania kwasów nukleinowych to głownie bezpośrednie sekwencjonowanie DNA lub RNA
lub określanie różnic w sekwencjach DNA pośrednio , za pomocą wielu różnych metod , jak np .
profile chromosomowe , analiza restrykcyjna ( RFLP ) , analiza plazmidów , hybrydyzacja z
wykorzystaniem specjalnych sond . Obecnie PCR jest powszechnie stosowany do powielenia
fragmentu genomu , który następnie poddaje się analizie jedna z metod podanych wcześniej.

Techniki molekularne mogą być oparte na analizie genów zakonserwowanych ewolucyjnie ( np . dla
tzw.house – keeping genes „ ) , bądź genów o większej zmienności genetycznej , np . związanych z
wirulencją drobnoustrojów) . Stąd techniki typowania molekularnego oparte na analizie genów
zakonserwowanych ewolucyjnie , takie jak np . MLST , będą umieszczały szczepy w mniejszej liczbie
większych grup , natomiast techniki oparte na analizie genów charakteryzujących się większą
zmiennością- pozwolą na większe zróżnicowanie badanej puli szczepów . Zatem , dla uzyskania
większego różnicowania bardziej przydatna jest technika REA – PFGE , wykazująca większy potencjał
różnicujący niż MLST . W wielu przypadkach w charakterystyce genetycznej badanej puli bakterii
zastosowanie wielu technik jednocześnie może okazać się najlepszym rozwiązaniem .

Metody molekularne detekcji wirusów

oparte na technikach amplifikacji kwasów nukleinowych pozwoliły wyeliminować czasochłonny etap

hodowli wirusów , a tym samym skrócić czas diagnostyki . Detekcja wirusa HSV poprzez amplifikacje
DNA techniką PCR jest testem powszechnie akceptowanym . Technika real – time PCR z sondami typu
FRET znacznie ułatwia specyficzną detekcje i analizę serotypów poprzez analizę krzywej topnienia
DNA produktów PCR . Do detekcji ludzkiego wirusa cytomegalii ( HCMV ) bezpośrednio z materiału
klinicznego ( krwi ) zaleca się stosowanie testów opartych na amplifikacji DNA , które są bardziej czule
, niż metody oparte na wykrywaniu antygenu pp65 . Amplifikacja targetu , bądź sygnału , jest
wykorzystywana do wykrywania wirusa zapalenia wątroby typu C ( HCV ) . Komercyjne testy
jakościowe pozwalają na wykrywanie RNA wirusa HCV w krwi na poziomie 60 IU ml dla testów ...
qualitative Amplicor i 600 IU ml dla Amplicor Monitor „ . DNA wirusa brodawczaka ( HPV ) jest
wykrywane w próbkach klinicznych na drodze amplifikacji sygnalu , amplifikacji matrycy ( targetu ) ,
bada z zastosowaniem hybrydyzacji in situ . System amplifikacji sygnału ..Hybrid Capture „ ( Digene ,
http://www.digene.com ) jest procedura diagnostyczna akceptowaną przez FDA ( Food and Drug
Administration , USA ) w wykrywaniu wirusa brodawczaka HPV : obecnie stosuje go wiele
laboratoriów .

W badaniach epidemiologicznych typowanie genetyczne może mieć zastosowanie w przypadku

nagłego pojawienia się choroby infekcyjnej .

Jeżeli podstawowe dane laboratoryjne potwierdzają związki epidemiczne , to nie ma powodu , aby
stosować techniki molekularne o wysokim potencjale różnicującym genetycznych relacji pomiędzy
szczepami . Do tego typu badan można użyć szybkich i niedrogich technik , np . takich jak ERIC – PCR .
Są one wystarczające do tego , aby zidentyfikować źródło zakażenia . Przykładowo , w przypadku
kontaminacji bakteriami wody czy żywności , prowadzącej do zakażeń układu pokarmowego
( biegunek ) , zakażenia te wcale nie muszą być spowodowane przez pojedyncze , wirulentne klony ,
chociaż klonalnych związków nie należy wykluczyć . Typowanie genetyczne ma tylko potwierdzić lub
wykluczyć związek epidemii ( zakażenia ) ze źródłem zakażenia ( np . żywność , woda )

Natomiast w sytuacji brak danych epidemiologicznych , typowanie molekularne izolatów może

posłużyć do identyfikacji potencjalnych zakażeń , bądź wskazania źródła zakażenia . W tym przypadku
wymagane techniki o wyższym potencjale różnicującym . Czynnik odpowiedzialny za zakażenia
powinien być genetycznie podobny dla wszystkich izolatów otrzymanych od osób zakażonych . Należy
tu jednak pamiętać , ze niektóre bakterie charakteryzują się naturalną kompetencją i łatwo nabywaj
DNA od innych szczepów swojego gatunku ( np . w przypadku pałeczek Haemophilus influenzae duża
ich zmienność stwarza problemy z ustaleniem powiązań klonalnych ) . W takiej sytuacji , zbyt wysoki
potencjał różnicujący techniki mole blednie zaklasyfikować szczepy izolowane pod koniec okresu
epidemii jako nie epidemiczne , zwłaszcza jeżeli nie ma szczepów endemicznych do porównania

Nowe czynniki Infekcyjne – detekcja

Nowe czynniki infekcyjne są bardzo zróżnicowane i wiele z nich należy do mało znanych lub zupełnie
nowych grup systematycznych . Jest oczywiste , że w tego typu diagnostyce metody molekularne
stosowane są jednocześnie z metodami tradycyjnymi , takimi jak mikroskopia świetlna i
elektronowa , hodowle na podłożach sztucznych , identyfikacja biochemiczna i serologiczna oraz
kultury tkankowe . Kiedy podejrzewa się , że choroba spowodowana jest przez nowy szczep . metody
molekularne dają najszybszą i stosunkowo wiarygodną odpowiedź . Dzięki temu stają się one
niezastąpionym narzędziem badawczym i diagnostycznym nowych chorób zakaźnych .

Badanie mikroorganizmów w środowisku w oparciu o analizę kwasów nukleinowych

Ogromna różnorodność mikroorganizmów w środowisku jest niewątpliwie faktem obiektywnym , lecz

jej stopień poznania w zasadniczy sposób zalety od tego , czy w badaniach posłużono się
tradycyjnymi technikami hodowlanymi , czy też zastosowano metody oparte na analizach
molekularnych wyekstrahowanych kwasów nukleinowych . Metody oparte na hodowli
mikroorganizmów na podłożach proste , wygodne , pozwalające na równoczesne szybkie porównanie
wielu próbek przy wykorzystaniu minimum sprzętu laboratoryjnego Przeważająca liczba bakterii
występuje w środowisku , np . glebie , w stadium uśpienia ( ang . dormant phase ) , z metabolizmem
ograniczonym do minimum . Komórki tych organizmów mają rozmiary ultramikrobakterii ( 0,2-0,3 m )
is zaadaptowane do warunków głodowych ( tj . niedobór substancji pokarmowych ) , jakie w glebie
dominują . Dominująca większość mikroorganizmów , które stwierdzane jako żywe komórki
metodami mikroskopowymi , nie jest w stanie wyrosnąć na żadnym z obecnie znanych podłoży
mikrobiologicznych .

Ograniczenia metod hodowlanych , które rzutują na niemożność rzetelnej oceny bioróżnorodności

mikroorganizmów w środowisku mogą być przezwyciężone , jeśli zastosuje się techniki oparte na
bezpośrednim wykrywaniu komórek mikroorganizmów , wykorzystując do tego celu związki
chemiczne występujące w każdej komórce . Tego typu substancjami markerowymi są kwasy
nukleinowe , DNA oraz RNA , których zróżnicowanie sekwencji nukleotydów decyduje o różnicach
strukturalnych oraz funkcjonalnych między poszczególnymi organizmami . Teoretycznie trudno o
bardziej reprezentatywne substancje markerowe do analizy bioróżnorodności , jednakże w praktyce
takze w tym przypadku analiza nie jest pozbawiona różnych ograniczeni . Należy pamiętać , de DNA
powinien być izolowany z możliwie jak największej liczby mikroorganizmów obecnych w danym
biotopie , i co istotne , izolacja nie powinna go zbytnio pofragmentować , a zanieczyszczenia w
postaci białek , kwasów humusowych czy metali powinny być zredukowane do minimum .
Dodatkowo , poszczególne grupy mikroorganizmów ( bakterie , archeony , grzyby , pierwotniaki )
różnia się podatnością na lizę swych komórek z powodu różnic w budowie ich osłon komórkowych .

Wydajność lizy komórek , efektywności stopień oczyszczenia kwasów nukleinowych , a także wielkość
uzyskanych kwasów nukleinowych , razem w zasadniczy sposób wpływają na dalsze etapy analiz
molekularnych . Niektóre grupy bakterii , np. . Firmicutes , Actinobacteria , Cyanobacteria trudniej
ulegają lizie z uwagi na grubą warstwę peptydoglikanu w ścianie komórkowej , co ma istotny wpływ
na skład izolowanego z gleby DNA . Metody oparte na PCR 54 zależne od stopnia czystości DNA ze
względu na to , de reakcja PCR jest hamowana w obecności szeregu zanieczyszczeń , np. . kwasów
huminowych lub jonów metali . Z kolei szereg procedur opartych na klonowaniu wymaga względnie
dużych fragmentów DNA , zwłaszcza gdy wymagana jest ekspresja całego operonu lub
sekwencjonowaniu podlega mutagenom . Niekorzystne jest izolowanie dużej ilości malych
fragmentów DNA , gdyż zwiększa to częstotliwość tworzenia różnych artefaktów w trakcie PCR .
Wiele metod izolacji bakteryjnego DNA z różnego typu gleb opublikowano w różnych czasopismach
od 1980 , kiedy to Vigdis Torsvik z Uniwersytetu w Bergen ( Norwegia ) opublikowała po raz pierwszy
procedurę izolacji bakteryjnego DNA z gleby . Ta oryginalna procedura polegała na separacji w
pierwszym etapie komórek bakterii z cząstek gleby przez różnicowe wirowanie , a następnie lizie
komórek i oddzieleniu DNA oraz RNA od materii organicznej na drodze szeregu separacji
chromatograficznych.

Ogólnie zastosowanie znajdują dwa schematy ekstrakcji kwasów nukleinowych :

-bezpośrednio z gleby , wprowadzony po raz pierwszy przez Ogram ( 1987 ) ,

-oraz pośrednio z wcześniej uzyskanej frakcji komórkowej , wprowadzony przez Holbein ( 1988 ) .
Większość współczesnych procedur opartych jest na bezpośredniej lizie komórek mikroorganizmów
w glebie , a następnie ekstrakcji uwolnionych kwasów nukleinowych ( DNA lub RNA ) I ich dalszym
oczyszczaniu . Stosuje się rozmaite metody lizy komórek mikroorganizmów :

o ( i ) enzymatyczna liza używając lizozymu , proteinazy K lub pronazy .

o ( ii ) chemiczna liza , np . traktowanie siarczanem dodecylosodowym ( SDS ) , fenolem lub
różnymi detergentami ,
o ( iii ) szok termiczny ( cykle zamrażania i podgrzewania ) ,
o ( iv ) wykorzystanie mikrofal ,
o (v ) wykorzystanie ultra dźwięków ,
o ( vi ) mechaniczna liza przez rozbijanie komórek perełkami szklanymi w młynie udarowym lub
mielenie na sucho , albo w obecności ciekłego azotu oraz
o ( vii ) różne kombinacje wspomnianych metod .

Efektem zastosowanych metod jest uzyskanie kwasów nukleinowych o różnym stopniu

zanieczyszczenia białkami , polisacharydami , kwasami humusowymi , lipidami oraz składnikami
mineralnymi , a także o różnym stopniu pofragmentowania w zależności od tego , jak drastyczna była
metoda bezpośredniej liczy komórek , co z kolei zależy od rodzaju gleby .

Poszczególne procedury ekstrakcji DNA , np . gleby dają przeciętnie od kilku do kilkudziesięciu wg

DNA w gramie gleby , a uzyskane fragmenty DNA maja na ogół od 10 do 40 kb . Im procedury
oczyszczania sa efektywniejsze , tym uzyskane DNA jest czystsze , co pokazują wartości stosunków
mierzonej absorbancji A260 / A280 > 1,7 ) oraz A260 / A230 ( > 2,0 ) . Spośród różnych metod
ekstrakcji DNA metody zawierające etap(y ) rozbijania perełkami szklanymi ( ang , bead – beating )
próbek gleby w młynie udarowym dają największe ilości DNA ( najmniej DNA ulega wtórnej adsorpcji
na cząstkach ilastych ) oraz mało towarzyszących związków humusowych o brązowym zabarwieniu ,
przez co stopień czystości DNA jest zwiększony . Wydajność procedury opartej na rozbijaniu sięga 80
% z próbek gleby o wielkości od 250 mg do 1. Podczas gdy , np . liza za pomocą wysokiej temperatury
oraz SDS ( ang , hot – SDS lysis ) prowadzi do strat od 81 do 90 % DNA . W dużym stopniu na ilość oraz
jakość uzyskiwanego DNA wpływa skład buforu ekstrakcyjnego , a zwłaszcza zawartość EDTA oraz
obecność kationów Na + , które zarówno chronią DNA przed degradacja , jaki zmniejsza jego zdolność
adsorpcji do koloidów glebowych .

Jaką metodę wybrać ?

Wybór jednej bądź drugiej metody ekstrakcji DNA z gleby zależy od celów badawczych . Jeżeli pragnie
się uzyskać względnie dużo DNA o szerokim spektrum reprezentatywności mikroorganizmów
występujących w danej glebie , to niewątpliwie należy zastosować metody bezpośredniej ekstrakcji .
Natomiast , gdy celem jest uzyskanie DNA wysokiej jakości do procedur molekularnych czułych na
różne inhibitory oraz gdy potrzebny jest DNA o dużej masie molekularnej , to preferowane są metody
pośrednie bez względu na ich pracochłonność . Ponadto , DNA otrzymany z wyizolowanej bakteryjnej
frakcji komórkowej zawiera zaledwie do 8 % fragmentów eukariotycznego DNA w porównaniu do 61-
93 % tych sekwencji obecnych w bezpośrednich ekstraktach DNA z gleby . W konsekwencji ,
konstruowane biblioteki metagenomu bakteryjnego odpowiednich gleb są znacznie lepszej jakości w
przypadku korzystania z pośrednich metod ekstrakcji DNA .
Co możemy osiągnąć ?

Poznawanie metagenomów różnych środowisk lądowych i morskich jest obecnie poważnym

wyzwaniem , przed jakim stają mikrobiolodzy , nie tylko ze względów poznawczych , ale także z uwagi
na zrozumienie roli ekologicznej , jaką spełniają zespoły mikroorganizmów w biosferze oraz ze
względu na olbrzymi i w znikomym stopniu poznany potencjał do biotechnologicznego wykorzystania
. Skuteczne zmierzenie się z tym wyzwaniem jest możliwe pod warunkiem , że do dyspozycji badaczy
54 wydajne metody ekstrakcji kwasów nukleinowych oraz odpowiednie techniki ich dalszej analizy .
Idealna sytuacja by było opracowanie uniwersalnej metody izolacji DNA / RNA ze środowiska ,
zwłaszcza z różnych gleb , która dawałaby duża ilość czystego i mało pofragmentowanego DNA , a w
przypadku RNA , dodatkowo jeszcze odpowiednio stabilnej poza komórka makrocząsteczki .
Pojawiają się coraz to nowe propozycje . Niestety , są to tylko próby , gdyż zbyt wiele jest różnych
zmiennych oddziałujących na proces izolacji DNA / RNA w różnych glebach , utworach geologicznych
czy odpadach przemysłowych . W rezultacie , dla każdego biotopu czy siedliska należy dobierać
odpowiednia metodę ekstrakcji DNA / RNA .

Metagenomika

• Analiza genomowa puli wszystkich mikroorganizmów , których poszczególne genomy stanowią

metagenom . Analiza bezpośrednia próbek środowiskowych bez potrzeby izolacji , hodowli czy
obserwacji organizmów .

• Metagenomika – Genomika środowisko = Genomika społeczności = Genomika populacji –

Genomika ekologiczna

• Metagenomika wprowadzona przez Jo Handelsman w 1998 jako analityczne podejście do poznania

strukturalnej różnorodności mikroorganizmów w heterogenicznym środowisku glebowym .

Droga do metagenomiki

 Rozbieżne wyniki ilości mikroorganizmów widocznych pod mikroskopem , a tymi które dają
się hodować na podłożach .
 Uznanie genów rRNA za użyteczne chronometry filogenetyczne i identyfikacyjne .
Wyodrębnienie archebakterii . ( Woese 1978 ) .
 Stwierdzenie istnienia w środowisku mikroorganizmów żywych , ale nie poddających siç
hodowli VBNC . ( Colwell 1986 )
 Wykorzystanie sekwencji genów rRNA do opisu różnorodności mikroorganizmów w
środowisku bez potrzeby hodowania . ( Pace 1985 )
 Wprowadzenie techniki PCR i konstrukcja starterów użytecznych do amplifikacji nawet całych
genów . ( Giovannoni 1990 )
 Stworzenie pierwszej biblioteki DNA mieszaniny organizmów ( celulolitycznych )
wzbogaconych na wysuszonej trawie . ( Shanmugan 1995 )
 Skonstruowanie pierwszej biblioteki metagenomu glebowego ( Rondon 2000 )
 Wprowadzenie techniki pirosekwencjonowania do analizy metagenomu bez potrzeby
wcześniejszego Klonowania ( Edwards 2006 )
 Zastosowanie pirosekwencjonowania metatranskryptomu glebowego opartego na rRNA I
MRNA ( Urich 2008 ) .
Cele poznawcze metagenomiki

 Charakteryzowanie filogenetycznej różnorodności mikroorganizmów

 Charakteryzowanie genomów nowych fenotypów milczącej mniejszości
 Wyjaśnianie nowych biochemicznych szlaków w metabolizmie lub przetwarzaniu energii w
zależności od warunków środowiskowych
 Bezpośrednia identyfikacja aktywności enzymatycznej w środowisku i odkrywanie nowych
enzymów milczącej mniejszości
 Identyfikowanie rezerwuarów i struktury oporności na metale i ksenobiotyki wewnątrz
mikrobiomu
 Odkrywanie metabolitów wtórnych i innych drobnych substancji aktywnych biologicznie i ich
roli w formowaniu struktury mikrobiomu
 Poznanie zależności między struktura mikrobiomu ryzosferowego a rozwojem i zdrowiem
rośliny ograniczanie fitopatogenow )
 Charakteryzowanie potencjału bioremediacyjnego mikrobiomu glebowego
Cechy sposobów sekwencjonowania metagenomu

 Sekwencjonowanie klonów
> Duże fragmenty DNA ( do 40 kz ) w wektorach ( BAC , kosmidy ) zapewniają wierność
identyfikacji filogenetycznej w oparciu o bogate bazy sekwencji wzorcowych Identyfikacja
genów i ich aktywności.
> Możliwe jest klonowanie pofragmentowanego DNA lub DNA glebowego zanieczyszczonego
> Możliwa ekspresja genów toksyn zabójczych dla gospodarza – utrata części informacji
filogenetycznej
 Pirosekwencjonowanie
>Brak konieczności klonowania ( PCR ) i związanych z tym problemów .
> Głęboka filogenetyczna analiza metagenomu na podstawie milionów krótkich sekwencji
otrzymanych w jednym cyklu
> Szybkie sekwencjonowanie wielu próbek jednocześnie
> Możliwość równoczesnego oznaczenia strukturalnej i funkcjonalnej różnorodności
mikrobiomu ( rybotagi )
> Produkcja zbiorów olbrzymiej ilości danych ( sekwencji ) wymagających rozbudowanej
bioinformatyki części.

Wyzwania przed metagenomika

 Olbrzymia heterogeniczność gleby pod względem jej parametrów fizycznych , chemicznych i

biologicznych musi być przezwyciężana podczas technik molekularnych stosowanych w celu
poznania metagenomu .
 Występowanie ponad 10 potencjalnych gatunków prokariotów w gramie gleby wymaga
przygotowania ogromnej biblioteki złożonej z milionów klonów zawierającej informacje
genetyczny sięgająca 5 Mz a nawet 10000 Gz . Sekwencjonowanie tak wielkiego
metagenomu, przy uwzględnieniu zróżnicowania sekwencji DNA wewnątrz gatunku , jest
jeszcze nieosiągalne . Pewne nadzieje dają techniki wysokoprzepustowego
sekwencjonowania nowej generacji .
 konieczność udoskonalenia metod ekstrakcji DNA z gleby , konstrukcji wektorów , doboru
czynników ( transkrypcyjne , tRNA ) poprawiających ekspresję obcych genów w nowym
gospodarzu , rozwoju metod czulej analizy funkcjonalnej ( na poziomie komórki ) w kierunku
pożądanych cech fenotypowych podczas przesiewu milionów klonów .
 Dokonanie pełnej integracji analizy filogenetycznej , sekwencjonowania klonów ,
sekwencjonowania losowego lub wybranych genów oraz analizy funkcjonalnej w celu
szerszego poznania nie poddających się hodowli mikroorganizmów , określenia ich roli
ekologicznej oraz otrzymywania nowych substancji aktywnych ( np . antybiotyków , enzymów
, molekuł sygnalnych ) , a także dopracowania podłóż oraz warunków umożliwiających
hodowlę .
 Analizy wewnątrz metagenomu , zwłaszcza porównawcze między różnymi zespołami
mikroorganizmów , będą konieczne w celu poznania ewolucyjnych procesów prowadzących
do różnicowania genomów . specjacji oraz tworzenia zespołu .