Zad.

Edycja genomu za pomocą podwójnych splotów

(A) Programowalna nukleaza zawiera specyficzną dla sekwencji dwuniciową przerwę (DSB) w
genomowym DNA. W przypadku braku szablonu naprawy komórka przetwarza DSB głównie przez
NHEJ, co powoduje indele w miejscu edycji. W obecności oddzielnej matrycy DNA zawierającej
sekwencje homologiczne do regionów flankujących DSB, HDR może powodować inkorporację
szablonu naprawy do genomowego DNA.

(B) Nukleazy ZFN, TALEN i nukleozydy oparte na CRISPR zostały również użyte do wprowadzenia
programowalnych DSB specyficznych dla sekwencji. Zdolność Cas9 do przeprogramowania do
wiązania nowej sekwencji (protospacer i PAM) przez zaprojektowanie nowego sgRNA, a nie przez
inżynierię nowego białka wiążącego DNA (takiego jak ZF lub TALE), przekształciła pole edycji genomu
 Edycja epigenomu oparta na CRISPR

(A) Aktywowane przez RNA aktywatory genów można składać poprzez bezpośrednią fuzję dCas9 z
aktywatorami transkrypcji VP64 i VPR, enzym acetylotransferazy histonowej p300 lub demetylaza
DNA Tet1. Alternatywnie, aktywatory transkrypcyjne VP64 i p65-HSF1 mogą być przyłączone do
sgRNA. Mogą być również stosowane aktywowane światłem i warianty aktywowane małą
cząsteczką.

(B) Represory genów programowane przez RNA można składać przez przyłączenie domeny
represorowej KRAB do dCas9 przez bezpośrednią fuzję między dwoma białkami lub przez sgRNA.
Alternatywnie, dCas9 można połączyć z enzymem metylotransferazy DNA DNMT3a lub demetylazą
histonu LSD1, aby uzyskać represor transkrypcyjny.

Zad.2

System ekspresji Główne zalety Główne ograniczenia

System komórek bakteryjnych
System komórek drożdżowych
System wektora ekspresyjnego
bakulowirusa (BEV)
System komórek ssaków
System komórek roślinnych
Zad.3
Jest to najprostszy system, zapewnia
dostępność w krótkim czasie..
Zapewnia prawidłowe fałdowanie
funkcjonalnych białek rekombinowanych
oraz niski koszt produkcji .
Potrafi wytwarzać glikozylowane białka
rekombinowane i nadaje się do produkcji
białek wymagających modyfikacji
potranslacyjnych.
Wysoce adaptacyjny i zdolny do produkcji
białka glikozylowanego z modyfikacjami
potranslacyjnymi.
Szybki wzrost, niski koszt oczyszczania,
wysoka adaptacja do produkcji białka
glikozylowanego i możliwa dowolna
modyfikacja układu ekspresyjnego.
Nie można przeprowadzić glikozylacji w
białkach rekombinowanych.
Wytworzone glikoproteiny sialowane nie
nadają się do spożycia przez ludzi.
Obecność otoczek lipidowych w wirionach i
mniej wydajne przetwarzanie poliprotein.
Związane z powolnym wzrostem, zwiększonym
kosztem fermentacji i wyższym ryzykiem
infekcji wirusowej.
Wysoce specyficzny dla Wybranej rośliny i do
tej pory nie zgłoszono żadnego uniwersalnego
systemu produkcji rekombinowanej.

Wirus Ekspresja Genom Wielkoś Rozmiar Atakowana komórka Integracja Odpowiedź

ć wirusa do genomu immunologiczna
wstawki (nm) gospodarza
Lentiwirus Stabilna RNA <8Kb 80-130 Dzielące/niedzielące Tak Niska
AAV Przejściowa lub Jednoniciow ~4,5Kb 18-26 Dzielące/niedzielące Nie* Bardzo niska
stabilna y liniowy
DNA
Adenowirus Przejściowa Dwuniciowy >8Kb 105 Dzielące/niedzielące Nie Wysoka
liniowy DNA
y-retrowirus Stabilna RNA <8Kb 80-130 Dzielą się. Tak Umiarkowana

Zad.4
Od czasu odkrycia w latach 70-tych, że Agrobacterium tumefaciens jest w stanie przenieść geny do
roślin, stało się najważniejszym narzędziem w biotechnologii roślin. Jest również powszechnie
uważany za jedyny rodzaj bakteryjny zdolny do przenoszenia genów do roślin. Jednak kilka gatunków
bakterii spoza rodzaju Agrobacterium można zmodyfikować w celu pośredniczenia w przenoszeniu
genów do różnych roślin. Bakterie z dwóch rodzin, i trzy rodzaje, Rhizobium sp. NGR234,
Sinorhizobium meliloti i Mesorhizobium loti, zostały wykonane właściwe do transferu genów poprzez
nabycie zarówno rozbrojony plazmid Ti i wektor binarny. Stabilna transformacja trzech gatunków
roślin, tytoniu, ryżu i Arabidopsis została osiągnięta z tych gatunków nie-Agrobacterium.

Transformacja została przeprowadzona przy użyciu drobnych modyfikacji opublikowanych protokołów,

przy użyciu dysku liściowego, kalusa pochodnego scutellum lub metod zanurzenia kwiatowego.
Powstałe rośliny wyraziły odporność na hygromycynę i aktywność GUS, zawierały 1-3 kopie T-DNA w
wyniku analizy southern blot i wykazały normalny zakres wszczepów T-DNA do genomów hosta
poprzez sekwencjonowanie miejsc integracji za pośredniczące w PCR. Aby upewnić się, że transfer
genów nie był wynikiem zanieczyszczenia komórkami Agrobacterium, wdrożono kontrole obejmujące
pcr specyficzne dla danego gatunku, selektywne powlekaniei stosowanie oznakowanego wektora
binarnego.

Tak więc, różne bakterie związane z roślinami, gdy portują rozbrojony plazmid Ti i wektor binarny
(lub prawdopodobnie współintegrujący lub cały plazmid Ti), są w stanie łatwo przenieść T-DNA do
roślin. Plazmid Ti jest samoprzepuszczalny, być może wskazując na istnienie wszechobecnego
naturalnego mechanizmu wpływającego na poziome przenoszenie genów z bakterii do roślin. Jeśli
tak, to znaczna część sekwencji DNA genomu rośliny do tej pory ustalona, która wydaje się
pochodzenia bakteryjnego, mogła pochodzić z takiego transferu w ostatnich ewolucyjnych skalach
czasowych.

Ta alternatywa dla technologii Agrobacterium-mediated może zapewnić dwie różne zalety:

● Może to prowadzić do lepszego wykorzystania naturalnych interakcji bakterii z roślinami, na

przykład z łagodnymi bakteriami nasytowymi, w celu osiągnięcia bardziej wydajnej i
optymalnej transformacji roślin dla gatunków, które okazały się trudne.
● Uciążliwy zarośla patentowe, które otacza agrobacterium technologii transferu genów uczynił
to narzędzie w dużej mierze bezużyteczne dla większości firm, instytucji i osób fizycznych do
celów komercyjnych. Patenty w gąszczu wyraźnie odnoszą się do i roszczenia Agrobacterium.
Nasze obserwacje prowadzą do kompleksowego "obejść" tych patentów, jak gatunki teraz
zdolne do transferu genów są bardzo różne od Agrobacterium.

Zad.5

Głównym białkiem ciał amyloidowych choroby Alzheimera jest 4kD białko zwane Aβ (białko amyloidu
β, β, białko β-amyloidu lub β/A4). Białko Aβ ma długość od 39 do 42 reszt aminokwasowych; formy
Aβ40 i Aβ42 są głównymi wariantami. Wszystkie białka Aβ pochodzą z wewnętrznego rozszczepienia
proteolitycznego białka prekursorowego β-amyloidu (APP). Wadliwe cięcie białka APP powoduje
wytwarzanie Aβ40 i Aβ42, a nieefektywny klirens wariantów prawdopodobnie prowadzi do ich
akumulacji. Niewielka liczba rodzin z wysoką częstością występowania choroby Alzheimera ma
mutacje w genie APP, co oznacza, że ​ten gen jest powiązany z chorobą. Niestety, w większości
przypadków niemożliwe jest zbadanie początku i patogenezy choroby Alzheimera u ludzi. W związku
z tym model zwierzęcy, który naśladuje chorobę Alzheimera, jest nieocenionym narzędziem
badawczym. Stworzono mysie modele choroby Alzheimera z transgenami zawierającymi mutacje w
genie APP, które występują w niektórych rodzinach z dużą częstością występowania wczesnego
(przed 50 rokiem życia) choroby Alzheimera.

● W jednym zestawie tych rodzin, miejsce 717 APP (APP-717) zawiera fenyloalaninę zamiast
waliny.
● W innej grupie rodzin z chorobą Alzheimera miejsca 670 i 671 APP (APP-670/671) zawierają
asparaginę i leucynę zamiast lizyny i metioniny.
● Z cDNA APP skonstruowano transgen z mutacją APP-717.
● Zmodyfikowane introny dodano między eksony 6 i 7, 7 i 8 oraz 8 i 9 cDNA APP.
● Introny zostały wprowadzone do cDNA APP, ponieważ eksperymenty wykazały, że transgeny z
intronami mają zwiększoną szybkość transkrypcji w porównaniu z konstruktami bez nich.
● Konstrukt „APP cDNA-intron” jest kontrolowany przez promotor płytkopochodnego czynnika
wzrostu β, który ulega ekspresji w tkance mózgowej.
● Kompletny konstrukt nazywa się minigenem PDAPP.

Starzejące się myszy transgeniczne (w wieku powyżej 6 miesięcy) z około 40 kopiami minigenu PDAPP
wykazują blaszki amyloidowe, śmierć komórek nerwowych i defekty pamięci.

Konstrukt genu APP-670/671, który jest kierowany przez promotor specyficzny dla mózgu, również
wytwarza myszy transgeniczne z cechami podobnymi do choroby Alzheimera, w tym z nadmiarem
Aβ42. Co ciekawe, ani starzejące się myszy minigenu PDAPP, ani myszy transgeniczne APP-670/671
nie mają splątków neurofibrylarnych. Możliwe, że te struktury są wtórną odpowiedzią na
nadprodukcję Aβ42 u ludzi. Wykazano również, że tworzenie płytek amyloidowych u ludzi jest
związane ze zwiększonym wytwarzaniem białka BACE1 (enzym rozszczepiający APP w miejscu β 1),
jednej z proteaz, która tnie APP z wytworzeniem Aβ. Myszy transgeniczne, które wytwarzają Aβ, ale
także niosą mutację nokautującą w BACE1, nie rozwijają płytek amyloidowych Aβ. Jednak myszy z
nokautem BACE1 wykazują szkodliwe wady behawioralne, co wskazuje, że pewna ilość BACE1 jest
wymagana do normalnego rozwoju i/lub normalnej aktywności mózgu dorosłego. RNAi w celu
zmniejszenia, ale nie zniesienia wytwarzania BACE1 może zatem stanowić atrakcyjne leczenie
zmniejszające lub opóźniające chorobę Alzheimera. Strategia ta jest obecnie testowana na modelach
mysich na myszach niosących transgeny kodujące zmutowane formy APP, które są genetycznie
powiązane z rodzinną chorobą Alzheimera u ludzi. shRNA ukierunkowane na mRNA BACE1 były
przenoszone na wektorze lentiwirusowym, który wstrzykiwano do hipokampu (obszar mózgu, w
którym zazwyczaj obserwuje się płytki amyloidowe związane z chorobą Alzheimera) u myszy
transgenicznych. Myszy, którym wstrzyknięto konstrukt RNA i wykazywały 38% redukcję złogów Aβ i
tworzenia łysinek w ciągu 1 miesiąca od wstrzyknięcia. Chociaż można się wiele dowiedzieć o
chorobie Alzheimera, dostępność modeli zwierzęcych pomogła w wyjaśnieniu podstaw
molekularnych i ujawniła pewne potencjalne cele leczenia zaburzenia, które dotyka około 4 milionów
ludzi w Stanach Zjednoczonych przy rocznych kosztach około 100 miliardów dolarów.