Ekspresja

genów
• Gen jest to fragment DNA, który determinuje
określoną, dziedziczną cechę - zwykle poprzez
syntezę określonego białka lub RNA.

• Wszystkie komórki organizmu jednego gatunku mają

te same geny, lecz nie wszystkie z nich ulegają
ekspresji w jednakowym stopniu.

• W poszczególnych komórkach tylko niektóre geny

ujawniają swoją obecność czyli ulegają ekspresji.
 FUNKCJA

BIAŁKA GENY

BIOLOGIA
MOLEKULARNA
Ekspresja genu – proces, w którym
informacja genetyczna zawarta w
genie zostaje odczytana i przepisana
na jego produkty, które są białkami
lub różnymi formami RNA.
Ekspresja genów w komórce prokariotycznej

• Geny dzielą się na strukturalne, operatorowe i

regulatorowe.

• Gen strukturalny koduje syntezę jednego białka.

• Geny kodujące białka enzymatyczne, uczestniczące w

jednym procesie są zlokalizowane obok siebie, ich
czynność koordynuje leżący w ich sąsiedztwie gen
operatorowy, zwany też operatorem.

• Funkcja operatora jest kontrolowana przez gen

regulatorowy, kodujący represor.

• Zespół genów obejmujący: gen regulatorowy, operator i

geny strukturalne nosi nazwę operonu.
• Aktywny operator pobudza transkrypcję genów
strukturalnych, a w konsekwencji pobudza syntezę
białek kodowanych przez te geny wchodzące w
skład danego operonu. Zahamowanie funkcji
operatora sprawia, iż geny strukturalne tracą swą
aktywność. Zjawisko to nosi nazwę represji.

• Indukcję i represję kontroluje gen regulatorowy

poprzez kodowane przez siebie białko zwane
represorem. Związanie represora przez operator
wywołuje represję, a odłączenie represora
powoduje indukcję, czyli derepresją.
• Niektóre enzymy są stale produkowane przez
komórkę (enzymy konstytutywne), natomiast inne są
syntetyzowane w zależności od sytuacji (enzymy
indukowalne, czyli adaptacyjne).

• W komórkach prokariotycznych, w ich naturalnym

środowisku, enzymy indukowalne występują w
śladowych ilościach.

• Ich ilość i aktywność zmienia się gwałtownie zależnie

od obecności składników odżywczych w podłożu.
 Przykłady indukcji i represji

• Przykładem enzymu indukowalnego w komórkach

Escherichia coli jest β-galaktozydaza, czyli laktaza
rozkładająca laktozę.

• Escherichia coli nie wykorzystuje laktozy do celów

energetycznych, jeżeli w środowisku występuje
dostateczna ilość glukozy. Nie syntetyzuje β-galaktozydazy.
• Jeżeli komórki znajdą się w podłożu zawierającym laktozę,
która jest jedynym źródłem węgla, bardzo szybko pojawia
się β-galaktozydaza i dwa dodatkowe enzymy
uczestniczące w metabolizmie laktozy - indukcja.

• Jeżeli komórki zostaną przeniesione na powrót do

pożywki zawierającej glukozę synteza tych enzymów
ustaje - represja.
• Indukcję zachodzącą pod wpływem substratu, np.
laktozy, nazwano indukcją substratową.

• Czynnikiem wywołującym represję może być

końcowy produkt syntezy, który staje się
korepresorem (wspomagającym funkcję
represora).

• W przypadku enzymów katabolicznych, czynnikiem

powodującym represję może być produkt procesu
katabolicznego. Zjawisko takie nosi nazwę represji
katabolicznej.
 Mechanizm indukcji i represji

• Wyjaśnia hipoteza Jacoba i Monoda.

• Zespół genów, kodujących enzymy uczestniczące w

rozkładzie laktozy, został nazwany operonem laktozowym.

• Geny strukturalne są zlokalizowane obok siebie i pozostają

pod kontrolą genu operatorowego, zwanego też
operatorem.

• Gen operatorowy pozostaje pod kontrolą genu

regulatorowego, leżącego w pewnej odległości od
operatora. Koduje on syntezę białkowego represora.
• Represor - wiąże się z operatorem, przez co unieczynnia
cały operon - zahamowanie syntezy wszystkich enzymów
kodowanych przez geny strukturalne operonu
laktozowego.

• Operator jest fragmentem DNA - związanie represora

zapobiega transkrypcji zarówno samego operatora, jak i
sąsiednich genów strukturalnych, kodujących enzymy.
Uszkodzenie operatora pozbawia go zdolności do wiązania
represora.
• Represor - zarówno wolny, jak i związany z operatorem -
cechuje się wysokim powinowactwem do induktora.
Związanie induktora - laktozy powoduje takie zmiany
struktury przestrzennej represora, że traci on zdolność do
wiązania się z operatorem – co rozpoczyna wspólną
transkrypcję operatora, promotora i genów strukturalnych.

• Funkcję induktora może pełnić także analog substratu, który

nie jest przetwarzany przez komórkę.
• Mutacja genu regulatorowego sprawia, iż nie koduje
on syntezy represora. Operon laktozowy, uwolniony
spod hamującego działania represora, stale
syntetyzuje enzymy uczestniczące w metabolizmie
laktozy. Bakterie takie nie reagują na zmiany w
zawartości laktozy w pożywce.

• Podobny skutek wywiera mutacja operatora.

• Mutacja w obrębie genu strukturalnego powoduje

defekt syntezy tylko jednego enzymu.
Ekspresja genu – proces, w którym
informacja genetyczna zawarta w
genie zostaje odczytana i przepisana
na jego produkty, które są białkami
lub różnymi formami RNA.
 Ekspresja genów w komórce
eukariotycznej
• Chromosom eukariotyczny zawiera pojedynczą, liniową
cząsteczkę dwuniciowego DNA, owiniętą wokół wielu
oktamerów histonowych.

• Większość DNA występującego w komórkach

eukariotycznych nie podlega transkrypcji, a jedynie
znikoma jego część koduje białka. U ssaków sekwencje
kodujące stanowią około 2% chromosomalnego DNA.

• Poszczególne geny są od siebie oddzielone długimi

sekwencjami niekodującymi. Mogą występować w postaci
jednej bądź wieku kopii.
• Poznano wiele czynników hamujących
i aktywujących ekspresję genów eukariotycznych.

• Geny są „wyłączane” przez represory a „włączane”

przez aktywatory.

• Pobudzanie ekspresji genów eukariotycznych jest

bardzo złożone, kombinatoryczne, zachodzi przy
udziale wielu białek i cząsteczek RNA.

• Kontrola ekspresji genów zachodzi na etapie

transkrypcji (najważniejsza), modyfikacji mRNA,
translacji oraz na etapie posttranslacyjnej
modyfikacji białka.
 Promotory i sekwencje wzmacniające
• Transkrypcja genów jest pobudzana przez promotory –
sekwencje inicjujące ten proces.

• Sekwencje wzmacniające – w odróżnieniu od promotorów

– są zlokalizowane daleko od kontrolowanych przez nie
genów. Nie kodują syntezy żadnych produktów,
oddziaływują na funkcje promotorów. Wykazują zdolność
do przyłączania mało poznanych białek regulatorowych.

• Wykryto elementy wzmacniające o swoistości tkankowej.

Na przykład DNA komórek limfoidalnych zawiera
charakterystyczną dla tych komórek sekwencję
wzmacniającą, która pobudza transkrypcję genów
immunoglobulinowych.
 Białka regulatorowe
• Modyfikują proces transkrypcji genów.

• Niektóre z białek noszą nazwę czynników transkrypcyjnych.

Wykazują one wysokie powinowactwo do wybranych
regulacyjnych sekwencji. Funkcje czynników
transkrypcyjnych pełnią przynajmniej niektóre receptory
hormonów steroidowych.

• Czynniki transkrypcyjne rozpoznają różne sekwencje DNA,

służące za miejsca inicjacji transkrypcji.

• W interakcji pomiędzy białkami regulatorowymi a DNA

uczestniczą specyficznie domeny, określane nazwami: palec
cynkowy, motyw helisa-skręt-helisa oraz zamek leucynowy.
• Receptory hormonów z grupy glukokortykoidów są
zlokalizowane w cytosolu, należą do białek regulatorowych.

• Zawierają domenę wiążącą hormon i domenę wiążącą DNA.

Receptor tworzy kompleks z białkiem cytosolowym
(maskującym) - domena wiążąca DNA jest nieczynna

• Związanie hormonu sprawia, iż receptor odłącza białko

maskujące, a domena wiążąca DNA wiąże się z sekwencją
docelową DNA, określaną mianem „elementu odpowiadającego
na hormon”, w skrócie HRE (hormone response element)

• Efektem tego jest pobudzenie lub zahamowanie ekspresji

określonego genu. Tylko te geny, które zawierają HRE są
podatne na regulacyjne działanie glukokortykoidów
Regulacja ekspresji
 Rola histonów

• Histony hamują ekspresje genów - fragmenty DNA,

które związały te białka, stają się niedostępne dla
czynników transkrypcyjnych.

• Wiązanie histonów przez DNA polega na

oddziaływaniu elektrostatycznym

• Odłączenie histonów przywraca DNA zdolność do

uczestnictwa w transkrypcji.
• Acetylacja grup ε-aminowych niektórych reszt
lizylowych pozbawia je ładunku dodatniego,
zmniejsza oddziaływania elektrostatyczne, skutkuje
dysocjacją kompleksu. Odsłonięty fragment DNA
staje się dostępny dla czynników transkrypcyjnych.

• Deacetylacja histonów wywiera efekt odwrotny.

• Wykryto szereg białek enzymatycznych

katalizujących procesy acetylacji i deacetylacji tych
białek. Podobny efekt wywiera fosforylacja i
defosforylacja histonów.
 Metylacja zasad
• Metylacja zasad zawartych w DNA, szczególnie
cytozyny, hamuje ekspresję genów - fragmenty DNA
niepodlegające transkrypcji są w wysokim stopniu
metylowane.

• DNA wielu wirusów podlega transkrypcji w komórkach

zwierzęcych, natomiast metylacja DNA pozbawia go
tej zdolności.
 Indukcja substratowa
• Komórki eukariotyczne, są mało podatne na indukcję
substratową.

• Indukcję substratową obserwuje się przede wszystkim w

wątrobie. Karmienie zwierząt niektórymi aminokwasami
powoduje wzrost aktywności enzymów uczestniczących w
ich degradacji. Dieta bogata w węglowodany pobudza
syntezę glukokinazy w wątrobie.

• Ksenobiotyki indukują enzymy potrzebne do ich

detoksykacji. Szczególnie podatnymi na indukcję
substratową są monooksygenazy, określane zbiorczą
nazwą cytochromu P-450
Mutacje
• Są to zmiany w sekwencji nukleotydowej DNA.

• Najprostszymi z nich i prawdopodobnie najczęściej

występującymi są tak zwane mutacje punktowe,
obejmujące jedną parę zasad.

• Mają zasadniczy wpływ na ekspresję genów dotkniętych

tym procesem. Zmiana chociażby tylko jednej pary
nukleotydowej w części kodującej genu strukturalnego
powoduje, iż w procesie transkrypcji zmutowana nić
matrycowa wprowadza nieprawidłowy nukleotyd do
powstającego na niej mRNA.

• W procesie translacji zmieniony mRNA wbudowuje do

powstającego białka inny aminokwas, niż w przypadku
funkcjonowania prawidłowego mRNA.
 Typy mutacji punktowych
• Mutacje dzielą się na 4 typy.

– Tranzycja polega na zastąpieniu jednej zasady

purynowej drugą zasadą purynową, lub jednej
zasady pirymidynowej drugą zasadą pirymidynową.

– Transwersja polega na zastąpieniu zasady

purynowej zasadą pirymidynową lub odwrotnie.

– Delecja oznacza wypadnięcie jednej pary

nukleotydowej

– Addycja czyli insercja polega na wbudowaniu

dodatkowej pary nukleotydowej.

• Delecja i addycja mogą obejmować kilka nukleotydów.

Mutacje zmieniają ramkę odczytu
 Mutacje samoistne

• Mutacje mogą być spowodowane samoistną, bardzo

rzadko występującą tautomeryzacją zasad, polegającą
na wewnątrzcząsteczkowym przemieszczeniu atomów
wodoru. Adenina (A) normalnie tworzy parę z tyminą
(T), natomiast tautomer A może utworzyć parę z
cytozyną (C).
 Mutacje wywoływane poprzez analogi
zasad

• Zmodyfikowane zasady: 5-bromouracyl i 2-

aminopuryna prowadzą do tranzycji.
 Mutacje wywołane przez czynniki
modyfikujące zasady DNA
• Kwas azotawy powoduje deaminację zasad. W wyniku tego
procesu następuje przekształcenie adeniny (A) w hipoksantynę
(H) , cytozyny (C) w uracyl (U), a guaniny (G) w ksantynę (X). H
tworzy parę z C (zamiast T). W konsekwencji para A=T zostanie
zastąpiona parą GΞC.

• Hydroksylamina modyfikuje cytozynę w sposób przekształcający

ją w produkt tworzący parę z A. Powoduje to przejście pary GΞC
w parę A=T.

• Pochodne akrydyny powodują insercję lub delecję u

bakteriofagów. "Wślizgują się" pomiędzy sąsiadujące ze sobą
pary zasad. Po wycięciu tego fragmentu przez nukleazy
następuje insercja lub delecja.
 Skutki mutacji w patologii

• W patologii ludzkiej spotyka się szereg chorób

będących skutkiem mutacji. Opisano ponad 100
patologicznych hemoglobin, różniących się od
hemoglobiny A pojedynczymi resztami
aminokwasowymi. Krwinki czerwone zawierające
nieprawidłową hemoglobinę na ogół funkcjonują w
sposób wadliwy. Żyją krócej, maleje ich liczba we krwi
krążącej. Pojawiają się skutki wzmożonego rozpadu
hemoglobiny. Rozwija się zespół objawów zwany
niedokrwistością hemolityczną.
• Nie każdy aminokwas w białku jest równocenny
dla jego funkcji biologicznej.

• Niektóre z mutacji mogą nie dawać objawów

chorobowych.

• Jednak w wielu przypadkach białko zawierające

tylko jeden niewłaściwy aminokwas wykazuje
zmienione właściwości biologiczne.

• Wykazano to przede wszystkim na przykładzie

mutacji genów kodujących białka enzymatyczne,
hemoglobinę lub kolagen.
• Patologicznym skutkiem mutacji genów kolagenowych jest
wrodzona łamliwość kości (osteogenesis imperfecta).

• W wyniku mutacji punktowych dochodzi do zastąpienia

glicyny przez inny aminokwas. Następuje upośledzenie
tworzenia potrójnej helisy.

• Dochodzi do spowolnienia hydroksylacji i glikozylacji tak

zmienionego kolagenu, a w konsekwencji do upośledzenia
jego sekrecji poza komórkę syntetyzującą.

• Zmutowany kolagen wykazuje wzmożoną podatność na

denaturację termiczną i zmniejszoną odporność
mechaniczną.
 Mutacje a nowotwory

• Niektóre mutacje prowadzą do transformacji

nowotworowej komórek.

• Obecność w środowisku człowieka substancji o

właściwościach mutagennych sprzyja
występowaniu chorób nowotworowych.

• Kumulacja mutacji jest przyczyną nowotworów

Kumulacja mutacji jest podstawą
transformacji nowotworowej.
Genom
• Zdolność do replikacji DNA i ekspresji genów
dotyczy wszystkich form życia.
• Wszystkie komórki używają podwójnej nici
DNA jako instrukcji genetycznej oraz
wykorzystują zawartą w nim informację za
pośrednictwem RNA.
• Wielkość genomu, skład i sekwencja
nukleotydowa jest charakterystyczną,
niepowtarzalną cechą każdego gatunku.
• Genomem – określamy całą informację genetyczną
zawartą w komórce.

• Opisano genom ludzki. Chromosomy jednej komórki

zawierają około 4 mld par zasad. Zapisanie sekwencji
ludzkiego DNA pod postacią zapisu literowego: A, T,
C, G zajęłoby 1000 książek formatu encyklopedii.

• Tylko około 2% DNA to geny kodujące białka, około

20-30% to geny kodujące RNA (poza mRNA).

• Około 70% DNA wykazuje niepowtarzalną,

specyficzną dla każdego z nas
sekwencję nukleotydową.
 DNA

Specyficzne, niepowtarzalne
sekwencje DNA
~70%

2%
~30% Geny kodujące białka

Geny kodujące RNA poza mRNA

• Genów kodujących białka mamy dużo mniej niż
oczekiwano. Jest ich prawdopodobnie około
25 tysięcy

• Specyficzna budowa ludzkich genów sprawia,

że dzięki wykorzystaniu instrukcji zapisanych
w poszczególnych eksonach, te same geny mogą
kierować produkcją różnych białek.

• Człowiek i szympans mieli wspólnego przodka, ich

sekwencje DNA niewiele się różnią.
• Komórki eukariotyczne zawierają znacznie więcej
DNA w porównaniu z komórkami prokariota.

• Porównuje się ilość DNA w komórkach różnych

gatunków do zawartości DNA w pałeczce okrężnicy
(Escherichia coli).

• Dożdże zawierają 4 - 5 razy więcej DNA w jednej

komórce, niż typowa komórka bakteryjna.

• Komórka muszki owocowej posiada 40 razy więcej,

a komórka człowieka 900 razy więcej DNA niż
komórka Escherichia coli.
• Długość łańcucha polinukleotydowego zawartego w
jednym chromosomie ludzkim jest oceniana na około
4-5 cm, a sumaryczna długość łańcuchów DNA,
zawartych w chromosomach jednej komórki wynosi
około 2 m.

• Łączna długość łańcuchów DNA, zawartych we

wszystkich komórkach człowieka wynosi około 150 x
1012 m, czyli około 1 000 razy więcej niż odległość
Ziemia – Słońce.
• DNA występuje w kompleksach nukleoproteinowych.
Wyróżniamy euchromatynę - o luźnej strukturze i
bardziej zwartą heterochromatynę. Uważa się, iż tylko
euchromatyna zawiera geny podlegające transkrypcji.

• Zawiera histony, które mają znaczenie w replikacji DNA

i w procesie transkrypcji.

• Podstawową jednostką strukturalną chromatyny jest

nukleosom.

• Zwarta struktura nukleosomów rozluźnia się w czasie

transkrypcji, co ułatwia dostęp czynników
transkrypcyjnych do DNA.
 Kopie genów
• Większość genów kodujących białka występuje tylko
w jednej kopii.

• Niektóre występują w dwu identycznych, bądź niemal

identycznych kopiach położonych blisko siebie.

• W większości przypadków identyczne lub prawie

identyczne kopie genu są ułożone w tandemy (po
dwa), rozdzielone regionami niepodlegającymi
transkrypcji.

• Niektóre geny, kodujące zwłaszcza RNA, są obecne w

postaci licznych kopii.
 Sekwencje powtarzalne
• Około 70% ludzkiego DNA wykazuje niepowtarzalną,
specyficzną dla danego człowieka, sekwencję
nukleotydową.

• Pozostałe 30% stanowią sekwencje powtarzalne.

• Proste sekwencje DNA składają z krótkich odcinków od

dwu do kilkunastu par zasad, które powtarzają się
wielokrotnie w tandemach (po dwie). Występują
najczęściej w centromerach i telomerach.

• Centromery zawierają krótkie sekwencje nukleotydowe,

które powtarzają się ponad milion razy.

• Końce chromosomów (telomery) zawierają powtarzalne

sekwencje TTAGGG.
• Niektóre identyczne sekwencje powtarzalne mogą
występować wielokrotnie w miejscach od siebie
odległych.

• Dość powszechnie występują sekwencje powtarzalne

złożone z 3, 4 lub 5 nukleotydów.

• Inne to: długie rozproszone sekwencje jądrowe,

krótkie rozproszone sekwencje jądrowe, długie
powtórzenia końcowe, transpozony (sekwencje, które
mogą przemieszczać się - wędrujące geny).
 Mitochondrialny - mtDNA
• Stanowi <1%

• Jest aktywny genetycznie. Koduje polipeptydy i różne

tRNA oraz rRNA.

• Geny mitochondrialne kodujące białka podlegają

transkrypcji przez mitochondrialną polimerazę RNA
oraz translacji przez rybosomy mitochondrialne.

• U ssaków mtDNA jest przekazywany niemal wyłącznie

w linii żeńskiej.
• DNA mitochondrialny jest wykorzystywany w
genetyce populacyjnej, medycynie sądowej i
genealogii genetycznej

• Geny mitochondrialne ludzi nie zawierają intronów

• Mutacje w genach mitochondrialnych powodują

choroby genetyczne, których objawy dotyczą głównie
tkanek o największym zapotrzebowaniu
energetycznym – mięśniowej i nerwowej
 Specyfika replikacji i transkrypcji
ludzkiego DNA

• Ogólny schemat syntezy DNA jest podobny u

organizmów prokariotycznych i eukariotycznych,
jednak replikacja genomu eukariotycznego cechuje
się pewną specyfiką.

• Ludzki chromosomowy DNA dysponuje licznymi

miejscami rozpoczynającymi replikację, jego
replikacja nie trwa dłużej niż DNA bakteryjnego.
• Geny ludzkie zawierają od 1 do 178 eksonów. Średnio
1 ekson zawiera 145 par zasad, co oznacza, iż koduje
on łańcuch złożony z 48 reszt aminokwasowych.
Przeciętny łańcuch białkowy składa się z 430
aminokwasów, czyli przeciętne białko ludzkie jest
kodowane przez 8-9 eksonów.

• Introny są wielokrotnie dłuższe od eksonów – ich

znaczenienie nie zostało dostatecznie poznane -
regulacyjne?.
• Ludzki genom koduje ??? różnych białek, w procesie
tym uczestniczy jedynie mniej jak 2% spośród około
4 miliardów par zasad.

• Różne domeny strukturalne białka są często

kodowane przez odrębne eksony. Na przykład
łańcuchy immunoglobulinowe składają się z kilku
domen globularnych, o podobnej sekwencji
aminokwasowej - każda z nich jest kodowana przez
odrębny ekson
 Introny i eksony

ekson ekson ekson

promotor intron intron DNA
3’ 5’
start kodon stop kodon
Transkrypcja
5’ 3’ mRNA

cap
poly A
Splicing
ogon
Usuwanie intronów
mRNA Do cytoplazmy
Jądro
Ramka odczytu
 LE 19-8

Eksony

DNA

Transkrypt RNA

RNA splicing
lub
mRNA
 Skracanie telomerów
• W chromosomach eukariotycznych podczas kolejnych
replikacji powstaje coraz krótszy łańcuch DNA.

• Każdy cykl replikacji DNA skraca telomery o 50-100

par zasad.

• W niektórych komórkach skracaniu telomerów

zapobiega telomeraza. Enzym ten działa na końcu
telomeru, gdzie wydłuża wystający koniec 3'
matrycowej nici DNA, dołączając powtarzalne
sekwencje telomerowe.
• Telomeraza funkcjonuje jedynie w komórkach
rozrodczych i nowotworowych.

• Prawidłowe komórki somatyczne nie posiadają

telomerazy i mają ograniczoną liczbę podziałów. Na
przykład, fibroblasty hodowane in vitro obumierają
po kilkudziesięciu podziałach. Okres przeżycia tych
komórek zależy od wieku ich dawcy.

• Przypuszcza się, iż zanik telomerazy w życiu

osobniczym zmniejsza prawdopodobieństwo
transformacji nowotworowej.
 Pochodzenie niekodujących fragmentów DNA
• Jest przedmiotem różnych hipotez.

• Pewną część tego materiału stanowią pseudogeny. Nie

podlegają ekspresji, zachowują eksony i introny. Uważa
się, że są to produkty mutacji genów czynnych.

• Występują tzw. pseudogeny przetworzone - nie zawierają

intronów. Powstały podczas ewolucji poprzez odwrotną
transkrypcję komórkowego RNA. mRNA, pozbawiony
intronów, stał się matrycą do syntezy fragmentów DNA.
Wbudowanie odwrotnego transkryptu do genomu nazwano
retropozycją, a przetworzone pseudogeny określono jako
retroposony niewirusowe. Występują retroposony
wirusowe - są pozostałościami genomów retrowirusów.
 Rekombinacja DNA
• Rozwój wiedzy na temat struktury i funkcji kwasów
nukleinowych umożliwił przenoszenie genów
pomiędzy komórkami różnych gatunków.

• Powstały możliwości izolacji pojedynczych genów z

komórki jednego gatunku i wszczepianie ich do
genomu innego gatunku.

• Techniki laboratoryjne, pozwalające na wycięcie

wybranych fragmentów DNA i zespolenie ich z
innymi fragmentami, noszą nazwę rekombinacji DNA
(inżynierii genetycznej).
 Endonukleazy restrykcyjne

• Istotny postęp wiedzy na temat budowy i

funkcjonowania genomu ludzkiego nastąpił z
chwilą wykrycia i wprowadzenia do praktyki
biochemicznej endonukleaz restrykcyjnych.

• Są to enzymy bakteryjne, które rozkładają DNA

poprzez hydrolizę wiązań fosfodiestrowych w
miejscach o ściśle określonej sekwencji
nukleotydowej, złożonej zwykle z 4 - 6
nukleotydów.
• Rola biologiczna endonukleaz restrykcyjnych polega
na ochronie komórki bakteryjnej przed
bakteriofagami.

• Dotychczas wyizolowano z bakterii ponad 100

endonukleaz restrykcyjnych. Ich trzyliterowe
symbole pochodzą od nazw gatunków bakterii, z
których zostały wyizolowane.

• Rozcinają obydwie nici DNA w ściśle określonych

miejscach, a w konsekwencji powodują ich rozpad na
fragmenty o charakterystycznej wielkości
• Fragmenty DNA (fragmenty restrykcyjne) można rozdzielić
metodą elektroforezy. Porównując ruchliwość
elektroforetyczną substancji wzorcowych i badanych
fragmentów można określić masę cząsteczkową tych
ostatnich.

• Ocena ich wielkości pozwala na identyfikację miejsc, w

których cząsteczka DNA uległa rozcięciu. Na tej podstawie
można sporządzić mapę, pokazującą rozmieszczenie miejsc
restrykcyjnych.

• Mapy restrykcyjne znalazły szerokie zastosowanie

praktyczne w badaniach nad DNA. Umożliwiają one łatwe
porównanie cząsteczek DNA, pod kątem ich pokrewieństwa
bez konieczności badania pełnej sekwencji nukleotydowej.
• Pozwalają na wykrycie osobniczych cech DNA w
obrębie jednego gatunku.

• Niektóre mutacje powodują, iż miejsce restrykcyjne

znika, a wśród produktów trawienia pojawia się
fragment restrykcyjny odpowiadający sumie długości
dwóch fragmentów, obecnych w produktach trawienia
niezmutowanego DNA. Zjawisko to nosi nazwę
„polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych".

• Możliwość wykrycia indywidualnych cech DNA jest

bardzo przydatna w kryminalistyce i w medycynie
sądowej do identyfikacji śladów biologicznych lub
ustalania pokrewieństwa.
 Mapy restrykcyjne

Enzymy restrykcyjne

CK A B A+B M A B 10 kb

A 8 kb
2 kb

B 7 kb
3 kb

A 5 kb
+ 3 kb
B 2 kb
• Fragmenty restrykcyjne, powstające pod działaniem
nukleazy restrykcyjnej, można ponownie zespolić
przez działanie ligazy DNA. Połączenie to może
zachodzić w różnych kombinacjach.

• W rezultacie powstaje nowa cząsteczka DNA o

zmienionej sekwencji nukleotydowej. Tak powstaje
rekombinowany DNA.
 Efekty rekombinacji DNA
• Jeżeli endonukleaza restrykcyjna przecina
poszczególne nici DNA w miejscach od siebie
odległych, powstają końce lepkie, mające skłonność
do samoistnego zespalania się poprzez wiązania
wodorowe pomiędzy komplementarnymi zasadami.

• Można je trwale połączyć przez działanie ligazy DNA.

• Wysoka specyficzność endonukleazy restrykcyjnej

sprawia, iż lepkie końce, zawarte w produktach reakcji
przez nią katalizowanej, są identyczne, niezależnie od
pochodzenia gatunkowego DNA.
• Szczególnie przydatną z praktycznego, medycznego
punktu widzenia jest rekombinacja ludzkich genów z
plazmidami bakteryjnymi - niewielki, koliste,
dwuniciowe cząsteczki DNA rozproszone w
cytoplazmie i replikujące się niezależnie od DNA
chromosomalnego bakterii.

• Plazmid może być poddany fragmentacji przez

endonukleazę restrykcyjną. W miejsce wyciętego
fragmentu plazmidu może być wbudowany gen
eukariotyczny.

• Zrekombinowany plazmid może być wprowadzony do

komórki bakteryjnej.
• Transkrypcja obcego genu przez komórkę bakteryjną
zachodzi sprawnie, natomiast bezpośrednia
translacja jest na ogół niemożliwa, dlatego też
opracowano technikę uzyskiwania
komplementarnego DNA - cDNA - uzyskanego
poprzez odwrotną transkrypcję na matrycy mRNA.

• Wszczepienie cDNA do plazmidu bakteryjnego

umożliwia zarówno jego transkrypcję, jak i
translację.

• Komórka bakteryjna uzyskuje zdolność do syntezy

białka kodowanego przez obcy gen eukariotyczny.
• Wprowadzony obcy odcinek DNA ulega replikacji
i transkrypcji – komórka bakteryjna nabywa nowej
właściwości, kodowanej przez obcy gen np. gen
eukariotyczny.

• W ten sposób manipuluje się genami - wprowadza

obce geny do różnych genomów, co jest podstawą
rekombinacji DNA (inżynierii genetycznej).
• Technika rekombinacji DNA umożliwia wbudowanie
genu jednego gatunku do genomu drugiego gatunku,
np. ludzkiego genu insulinowego do genomu
bakteryjnego. Umożliwia to podjęcie przez bakterie
syntezy insuliny.

• Można zmodyfikować genom bakteryjny czyniąc go

zdolnym do kodowania innych białek ludzkich, np.
erytropoetyny (hormon pobudzający erytropoezę),
interferonu, tkankowego aktywatora plazminogenu,
cytokin itd.

• W ten sposób uzyskano możliwość syntezy ważnych

biologicznie białek na skalę przemysłową.
 Manipulacja materiałem genetycznym
GAATTC GAATTC
CTTAAG CTTAAG

EcoRI
G AATTC G AATTC
CTTAA G CTTAA G

G G AATTC AATTC
CTTAA CTTAA G G
EcoRI końce lepkie EcoRI końce lepkie
DNA Ligaza
G AATTC
CTTAA G
• Przedmiotem modyfikacji są genomy roślinne
i zwierzęce, które nadają roślinom i
zwierzętom cechy najbardziej przydatne z
punktu widzenia człowieka.

• Organizmy będące nośnikami obcych genów

noszą nazwę organizmów transgenicznych
lub organizmów modyfikowanych genetycznie
- GMO.
• Inżynieria genetyczna roślin - podwyższa np.
wartość odżywczą, powoduje wzrost odporności
na suszę, owady, środki ochrony roślin, opóźnia
dojrzewanie owoców.
• Inżynieria genetyczna zwierząt umożliwia:
badanie funkcji genu, tworzenie modelowych
systemów do obserwacji chorób ludzi, produkcję
zrekombinowanych białek (np. niektóre białka
w mleku krowim).
• Poznanie genomu ludzkiego stwarza nowe
horyzonty w naukach medycznych.
 Komórki macierzyste

• Mogą przekształcać się w każdy dowolny rodzaj

tkanki lub narząd, jeśli tylko stworzy się im
odpowiednie warunki wzrostu i rozwoju.
• Mogą odegrać kluczową rolę w leczeniu licznych
schorzeń, jak chociażby cukrzyca, udary mózgu,
rdzenia kręgowego, choroby serca czy stwardnienie
rozsiane.
• Pula komórek macierzystych utrzymuje
w równowadze liczbę komórek somatycznych
organizmu.

• Komórki macierzyste ze względu na źródło

pochodzenia dzielą się na: embrionalne (zarodkowe),
płodowe, somatyczne (dojrzałe).

• Wyróżnić można kilka rodzajów komórek

macierzystych: totipotencjalne, pluripotenjalne,
multipotencjalne, unipotencjalne
 Genom - etyczne refleksje

Osiągnięcia w dziedzinie biologii molekularnej nie

tylko fascynują. Prowadzone badania, a także
praktyczne zastosowania licznych odkryć odczytywane
są przez wielu jako zagrożenie. Z chwilą gdy
przedmiotem badań są mikroorganizmy, rośliny
pytamy głównie o to, czy są to badania moralnie
dopuszczalne i czy skutki ewentualnych modyfikacji
genetycznych nie stanowią zagrożenia dla środowiska
naturalnego i dla człowieka.
W przypadku zwierząt dodatkowo stawiany jest
warunek, by prowadzenie eksperymentów nie
wiązało się z zadawaniem im bólu, a same
eksperymenty znajdowały uzasadnienie w wymiernej
korzyści dla człowieka. Korzyści takie zostały tu już
odnotowane (insulina rekombinacyjna, farmaceutyki
w mleku zwierząt transgenicznych).

Perspektywa etyczna zmienia się w momencie,

gdy badania genetyczne dotyczą wprost człowieka.