Inżynieria genetyczna

organizmy transgeniczne
ksenotransplantacja
 Inżynieria genetyczna
Zespół technik badawczych pozwalający na wyizolowanie i charakterystykę
określonych genów, a także wprowadzenie do nich określonych zmian.

Opiera się ona na technikach rekombinacji DNA czyli, technikach, która pozwala na
pobranie, wyizolowanie, modyfi kację i przenoszenie fragmentów DNA z jednego
organizmu do drugiego, nie tylko w obrębie jednego gatunku lecz również pomiędzy
gatunkami.
W przypadku, gdy sekwencja DNA z organizmu – dawcy integruje się w materiale
genetycznym w organizmie – biorcy, cecha w nim zawarta staje się zintegrowaną
częścią genomu i w ten sposób organizm uzyskuje nową cechę.
Inżynieria genetyczna pozwala ponadto na dezaktywację lub zmniejszenie ekspresji
konkretnego genu. W tym przypadku, można dokonywać próby eliminowania go bądź
regulacji jego działania (tzw. technika knockout).
 Inżynieria genetyczna

• Rolnicy i hodowcy zwierząt krzyżowali organizmy

hodowlane w celu ulepszenia niektórych cech , np.
uzyskania większej mleczności.
• W następstwie krzyżowania osobnik potomny dziedziczy
materiał genetyczny obu organizmów i oprócz cechy
pożądanej przejmuje także inne właściwości.
• Obecnie zyskaliśmy nowe możliwości otrzymywania
organizmów o pożądanych cechach.
• Posługując się metodami biotechnologii możemy
zmieniać, usuwać, a nawet przemieszczać geny
pomiędzy organizmami. Właśnie temu służy inżynieria
genetyczna.
• Inżynieria genetyczna polega na przenoszeniu genów z
jednego żywego organizmu do innego.
• Umożliwia ona uzyskanie szczepów bakterii wytwarzających
użyteczne białka, a także wyhodowanie roślin i zwierząt, w
których komórkach ulegają ekspresji obce geny.
• Konsekwencją tych osiągnięć jest ogromny postęp w takich
dziedzinach, jak farmaceutyka, medycyna i genetyka człowieka
oraz rolnictwo.
• Geny zawierają w sobie pełną instrukcję chemiczną potrzebną
organizmowi do funkcjonowania a ponieważ informacja ta jest
przekazywana z pokolenia na pokolenie, potomstwo przejmuje
cechy swoich rodziców.
• Obecnie naukowcy używają enzymów do rozrywania struktur
DNA w konkretnych miejscach, wkładają w nie nowe kawałki i
na powrót je "sklejają". Mogą oni w ten sposób "wyciąć i
wkleić" geny z jednego do drugiego organizmu zmieniając w
ten sposób strukturę DNA a zatem także naturalne cechy
organizmu.
• Metody inżynierii genetycznej mają bardzo
szerokie zastosowanie:
w rolnictwie - do produkcji tzw. roślin i zwierząt
transgenicznych, które dzięki wprowadzeniu
dodatkowego zespołu genów posiadają nowe
właściwości, np. zboże odporne na herbicydy czy
niekorzystne warunki środowiska, zwierzęta ze
zmienionym genem hormonu wzrostu, które
osiągają szybszy przyrost masy ciała.
w farmakologii - Bakterie wykorzystywane są do
produkcji bardzo ważnych substancji białkowych i
leczniczych, takich jak ludzkiej insuliny.
w diagnostyce medycznej - To właśnie inżynieria
genetyczna pozwala na postawienie skutecznej
diagnozy dzięki umiejętności klonowania, czy
rekombinacji fragmentów DNA.
• w terapii genowej - Inżynieria pozwala na
wymianę wadliwego genu i zastąpienie go genem
działającym poprawnie, może być ona
wykonywana na komórkach somatycznych jak i
zarodkowych.

• inżynieria genetyczna człowieka - Polega ona na

poprawieniu lub wzmocnieniu niektórych cech
ludzkich, np.: regulacja snu, zapotrzebowanie na
pokarm, agresja czy skłonności do częstych
zachorowań.
 Enzymy restrykcyjne Endonukleazy
restrykcyjne restryktazy
• Są to enzymy należące do hydrolaz
• Stanowią grupę wyodrębnioną spośród DNAz
• Rozpoznają konkretne sekwencje w obrębie dwuniciowego
DNA i często hydrolizują konkretne wiązania
• Rozpoznawana sekwencja z ma charakter symetryczny o
długości od 4 do 8 par zasad (pz)
• Rozpoznawanie przez restryktazy specyficznej sekwencji
DNA, połączone ze specyficznym cięciem, spowodowało, że
wraz z ligazami DNA, używa się ich w biologii molekularnej
do manipulacji fragmentami DNA. Samych restryktaz używa
się m.in. do tworzenia map restrykcyjnych cząsteczek DNA
(na przykład map plazmidów).
• Nazwy enzymów restrykcyjnych tworzone są
od pierwszej litery nazwy rodzajowej i dwóch
pierwszych liter nazwy gatunkowej, pisanymi
kursywą.
• Po nich może wystąpić kilka liter lub cyfr
arabskich oznaczających szczep bakterii.
• Nazwa zakończona jest rzymską cyfrą
oznaczającą, jako który kolejny enzym został
on wyizolowany z danego szczepu.
 Przykłady
• BamH I – pierwszy enzym wyizolowany z Bacillus
amyloliquefaciens szczepu H
• Sma I – pierwszy enzym wyizolowany z Serratia
marcescens szczepu Sb (nazwa szczepu została
pominięta w nazwie enzymu)
• NgoM IV – czwarty enzym wyizolowany z
Neisseria gonorrhoeae szczepu MS11
• Uba 58 I – enzym wyizolowany z
niezidentyfikowanej bakterii (Unidentified
bacterium) RFL58
 Przykłady wybranych enzymów restrykcyjnych

Enzym Pochodzenie Rozpoznawana cięcie

sekwencja
EcoRI Escherichia coli 5'GAATTC 5'---G AATTC---3'
3'CTTAAG 3'---CTTAA G---5'
BamHI Bacillus 5'GGATCC 5'---G GATCC---3'
amyloliquefaciens 3'CCTAGG 3'---CCTAG G---5'
TaqI Thermus aquaticus 5'TCGA 5'---T CGA---3'
3'AGCT 3'---AGC T---5'
Sau3A Staphylococcus 5'GATC 5'--- GATC---3'
aureus 3'CTAG 3'---CTAG ---3'
KpnI Klebsiella 5'GGTACC 5'---GGTAC C---3'
pneumoniae 3'CCATGG 3'---C CATGG---5'
SphI Streptomyces 5'GCATGC 5'---G CATGC---3'
phaeochromogenes 3'CGTACG 3'---CGTAC G---5'
XbaI Xanthomonas badrii 5'TCTAGA 5'---T CTAGA---3'
3'AGATCT 3'---AGATC T---5'
• Pierwszym wyizolowanym enzymem restrykcyjnym był enzym EcoRI.
• Wyizolowany został z bakterii Escherichia coli szczepu RY13.
• EcoRI rozpoznaje następującą sekwencją DNA:
5' G A A T T C 3'
3' C T T A A G 5‚
EcoRI przecina DNA, dając końce lepkie

Lepkie końce - końce kohezyjne – kilkunukleotydowy jednoniciowy

odcinek DNA znajdujący się na końcu dwuniciowego DNA
EcoRI niesymetrycznie przecina dwuniciową cząsteczkę w taki sposób, że
na nowo powstałych zakończeniach znajdują się jednoniciowe
fragmenty o długości czterech nukleotydów z wystającym końcem 5′
5′ G 3′ 5′ A A T T C 3′
3′ C T T A A 5′ 3′ G 5′
Cząsteczki DNA zakończone komplementarnymi końcami lepkimi, w
odróżnieniu od cząsteczek zakończonych końcami tępymi, mogą łączyć się
ze sobą (hybrydyzować) poprzez wiązania wodorowe (stąd nazwa
„lepkie”), co ułatwia ich ligację
• Tępe końce – powstają w wyniku nacięcia obu
komplementarnych nici w tym samym
miejscu.
• Eznym restrykcyjny SmaI przecina DNA, dając
końce tępe
• Enzymy restrykcyjne naturalnie występują u bakterii, stanowiąc
element systemu restrykcji–modyfikacji, chroniącego komórkę
przed wnikaniem obcego DNA (na przykład DNA bakteriofagów).

• System ten zakłada istnienie w komórce mikroorganizmów dwóch

rodzajów enzymów:

• endonukleaza (ang. restriction endonuclease, REaza) - hydrolizuje

wiązania fosfodiestrowe w obrębie specyficznych sekwencji
niezmetylowanego DNA,

• metylotransferaza - modyfikuje te wiązania poprzez przyłączenie do

nich grupy metylowej, co chroni DNA gospodarza przed restrykcją.
 Taka para enzymów tworzy system R-M system restrykcja-
modyfikacja (ang. restriction – modification system)

Modyfikacja taka chroni DNA przed atakiem własnych enzymów

restrykcyjnych.
• Zjawisko restrykcji i modyfikacji opisane zostało raz pierwszy ponad 60 lat
temu. Zaobserwowano, że namnażanie się bakteriofagów bywa w pewnym
stopniu hamowane przez niektóre szczepy bakteryjne, które podlegały
infekcji. Okazało się, że modyfikacja bakteryjnego DNA w określonym
szczepie może chronić przed infekcją fagiem. Jest za to odpowiedzialny
szczególny wzór metylacji i swoiste enzymy restrykcyjne
• Wkrótce wykazano, że systemy RM nie ograniczają się jedynie do
bakteriofagów, ale dotyczą każdego rodzaju DNA, wnikającego do komórki
bakteryjnej w wyniku transdukcji, koniugacji, bądź transformacji.

• W 1972 roku Paul Berg wraz z zespołem, wykorzystując zasadę działania

tych systemów, stworzył pierwsze rekombinowane DNA. Doświadczenie to
uznaje się za swoiste narodziny inżynierii genetycznej.
• Następnie Herbert Boyer i Stanley Cohen przez hydrolizę enzymami
restrykcyjnymi stworzyli pierwszy plazmid in vitro.

• W 1978 roku odkrycie i opisanie enzymów restrykcyjnych, które

przyczyniło się do rozkwitu technologii rekombinacji DNA oraz nadało
nową jakość badaniom z dziedziny genetyki molekularnej, zostało
wyróżnione Nagrodą Nobla, którą otrzymali Werner Arber, Hamilton O.
Smith oraz Daniel Nathans.
• Systemy R-M podzielony jest na cztery grupy - podział uwzględnia właściwości
związane z typem rozpoznawanej sekwencji, lokalizację miejsca cięcia w
stosunku do rozpoznawanej sekwencji oraz strukturę molekularną systemu.

• typ I - występują u bakterii Enterobacteriaceae, Bacillus subtilis, Neisseria

gonorrhoeae, Citrobacter freundii, Mycoplasma pulmonis, Klebsiella
pneumoniae, Lactococcus lactis i Staphylococcus aureus. Systemy tej klasy
zbudowane są z trzech genów: hsdS, hsdM i hsdR. Są one położone blisko siebie
w chromosomie bakteryjnym w tej samej orientacji. Sekwencja przez nie
rozpoznawana jest asymetryczna. Składa się ona z dwóch krótkich odcinków
zasad o określonej specyficzności, przedzielonych kilkoma niespecyficznymi
parami nukleotydów,
• typ II - występują u bakterii Lactococcus. Charakteryzują się prostą organizacją
genetyczną - w systemach są obecne dwa geny strukturalne, które kodują
odpowiednio endonukleazę i metylotransferazę. Endonukleaza rozpoznaje
specyficzną, sekwencję DNA (o długości od 4 do 8 nukleotydów) i powoduje
przecięcie obu nici DNA. Metylotransferaza (wymagająca kofaktora w postaci S-
adenozylometioniny) rozpoznaje oraz metyluje tę samą sekwencję, w ten
sposób chroniąc DNA przed aktywnością endonukleazy. Cechą
charakterystyczną endonukleaz typu II jest fakt, że przecięcie nici DNA ma
miejsce w obrębie/w stałej odległości kilku nukleotydów, od miejsca
rozpoznawanego przez system RM. Endonukleazy typu II nie wymagają energii
w postaci ATP do przeprowadzenia reakcji,
• typ III - jest to pierwszy opisany u bakterii gramdodatnich typ systemów
RM.
Składają się na nie dwa enzymy:
1. metylotransferazy (kodowanej przez gen mod, działającej niezależnie od
endonukleazy Res)
2. endonukleazy restrykcyjnej (kodowanej przez gen res). Ich transkrypcja
zachodzi spod wspólnego promotora. Białko Res funkcjonuje w
kompleksie z białkiem Mod, dzięki czemu reakcje modyfikacji i restrykcji
endonukleolitycznej dotyczą tej samej, specyficznej sekwencji.
Endonukleaza Res przecina dwuniciowy DNA w odległości 24-27
nukleotydów poniżej niezmetylowanej specyficznej sekwencji,
• typ IV - najsłabiej poznany typ. Istnieje hipoteza zakładająca, że ewolucja
systemów typu IV rozpoczęła się poprzez fuzje genów podjednostek typu
III (Mod i Res). Do tych systemów zaliczono endonukleazy restrykcyjne,
które trawią tylko zmetylowane DNA.
Cechy systemów restrykcji i modyfikacji typu I, II, III, IV
 Organizmy zmodyfikowane genetycznie

• Organizmy zmodyfikowane genetycznie w skrócie GMO

(ang. Genetically Modified Organisms) to organizmy,
których geny zostały celowo zmienione przez człowieka.

• Używa się też nazwy: Organizm Transgeniczny –

zawierający przenoszony gen – wtedy tzw. transgen.

• Według art. 3 ustawy z dnia 22 czerwca 2001 r. o

organizmach genetycznie zmodyfikowanych GMO to
organizm inny niż organizm człowieka, w którym materiał
genetyczny został zmieniony w sposób nie zachodzący w
warunkach naturalnych wskutek krzyżowania lub naturalnej
rekombinacji.
 Główne zastosowania modyfikacji:
1. zmodyfikowane mikroorganizmy są używane do produkcji
pewnych substancji chemicznych, takich jak np. insulina

2. modyfikowanie roślin pozwala dodać/wzmocnić cechy

zwiększające opłacalność produkcji.

Modyfikacje genetyczne budzące najwięcej kontrowersji to

przeważnie wprowadzenie genów pochodzących z innych
gatunków, które nadają modyfikowanemu organizmowi
pożądaną cechę, nie występującą u niego naturalnie.
 Modyfikacje, jakim podlegają organizmy

• Zmniejszenie aktywności genów naturalnie

występujących w danym organizmie
• Do organizmu wprowadzone zostają
dodatkowe kopie jego własnych genów
• Wprowadzany gen pochodzi z organizmu
innego gatunku (organizmy transgeniczne)
 Regulacje prawne w UE
Ujęcie zagadnienia GMO w ramy prawne, w poszczególnych krajach czy grupach
państw jest zróżnicowane. Generalnie można wyróżnić podejścia:
 sektorowe (wertykalne),
 horyzontalne,
 mieszane.
Prawodawstwo w Unii Europejskiej reguluje następujące obszary :
o kontrolowane wykorzystanie mikroorganizmów GMO,
o zamierzone uwalnianie GMO do środowiska i wprowadzanie do obrotu,
o nadzór nad genetycznie zmodyfikowaną żywnością i paszami,
o nadzór i kontrola nad transgenicznym przemieszczaniem się GMO.

Dyskusja, na temat przyszłości GMO, która koncentruje się na rewizji dyrektywy

2001/18/WE i umożliwieniu państwom członkowskim odrębności prawnej przy
decydowaniu o uprawie GMO na podstawach innych niż te oparte na ocenie
ryzyka dla zdrowia i środowiskowego.
 Regulacje prawne w Polsce
Zagadnienia GMO reguluje „Ustawa o mikroorganizmach i organizmach
genetycznie zmodyfikowanych, 22 czerwca 2001 r. :
 zamkniętego użycia i zamierzonego uwolnienia,
 wprowadzania do obrotu oraz wywozu zagranicę i tranzytu,
 zadań organów administracji rządowej.

Zgodnie z ostatnim stanowiskiem rządu z 2008 r. Polska dąży do uzyskania

statusu kraju wolnego od GMO, a więc zakazu uprawy, obrotu i uwalniania
do środowiska w celach doświadczalnych.
Popiera się jedynie prowadzenie prac laboratoryjnych.
 Modyfikacje genetyczne
w biologii i medycynie

Organizmy transgeniczne mają szerokie zastosowania

w badaniach współczesnej biologii i medycyny
molekularnej, między innymi w badaniach nad rakiem,
chorobami dziedzicznymi, chorobami zakaźnymi oraz
w badaniach nad mechanizmami rozwoju (tzw.
modele transgeniczne).
Przykłady organizmów transgenicznych w medycynie:
Mysi model białaczki
 Modyfikacje genetyczne zwierząt
W 1980 r. profesor Jon W. Gordon zmodyfikowanym genetycznie zwierzętom nadał
nazwę transgeniczne.
Modyfikacje zwierząt mają na celu uzyskanie zwierząt o pożądanych cechach w hodowli –
szybciej rosnące świnie, ryby, zastosowaniu ich w produkcji białek, enzymów, innych substancji
wykorzystanych w przemyśle farmaceutycznym (jako bioreaktory), uodpornieniu na choroby.
Modyfikacje zwierząt nie są tak popularne jak roślin, głównie ze
względu na trudności w samym procesie modyfikacji, proces jest bardzo skomplikowany i trwa
długo, koszty są bardzo duże. Zwierzęta
modyfikowane genetycznie często chorują lub są bezpłodne.
GloFish® to ogólna nazwa ryb kilku gatunków,
które poddano gentycznej modyfikacji
polegającej na wszczepieniu genu
odpowiedzialnego za fluorescencyjny kolor od
meduzy. Pierwsze eksperymenty dotyczyły
popularnego w akwarystyce jak i w badaniach
laboratoryjnych danio pręgowanego (Danio
rerio). Później oprócz zwiększenia oferty
kolorystycznej modyfikacji poddano jeszcze
żałobniczkę (Gymnocorymbus ternezi) oraz
brzankę sumatrzańską (Puntius tetrazona).

2007 rok chińscy naukowcy przywitali fluoryzującą

transgeniczną świnką
Fluoryzujące modyfikacje polegają na wprowadzeniu
do genomu rozwijającego się zarodka genu białka
GFP (green fluorescent protein) - małego białka (238
aminokwasów), wykazującego naturalną
fluorescencję, występującego u meduzy Aequorea
victoria.
Gen ten jest powszechnie stosowanym w
laboratoriach genem reporterowym. Opracowano
wiele jego modyfikacji zwiększające intensywność
świecenia, a także wiele wariantów fluoryzujących w
innych barwach, np. na niebiesko (blue, BFP),
cyjanowo (cyan, CFP), żółto (yellow, YFP) i czerwono
(red, RFP).
• W badaniach biologicznych bardzo często wykorzystuje się organizmy
modelowe. Najczęściej zastępują one człowieka, który ze względów
etycznych nie może być obiektem doświadczalnym.
• Modelami są na przykład: bakteria E. coli, mysz, muszka owocowa,
szympans, zaś wśród roślin tytoń i ryż.
• Prowadzone na nich badania pomagają m.in. ustalić przyczyny chorób i
skutki działania leków.
• Organizmy modelowe muszą spełniać kilka warunków, przede wszystkim
powinny:
 być małe i niewymagające pod względem warunków hodowli; wyjątkiem
są czasem szympansy i świnie, które jednak wykorzystuje się jedynie
podczas końcowych testów;
 w krótkim czasie wytwarzać liczne organizmy potomne, by prowadzone na
nich doświadczenia dawały rzetelne wyniki;
 przechodzić krótki cykl rozwojowy, co pozwoli zaobserwować długofalowe
skutki wprowadzonych zmian;
 posiadać niewielką liczbę genów, ponieważ ułatwia to analizę zmian
genetycznych;
 należeć do gatunków pospolitych, powszechnie występujących.
Organizmy modelowe
Ssaki
Mysz
Szczur
Organizmy modelowe
nie odnoszące się do ssaków
Archaea
Caenorhabditis elegans
Saccharomyces cerevisiae
Danio pręgowany
• zwierzęta w przeciwieństwie do roślin trudniej jest rozmnażać przez
klonowanie,
• więcej czasu potrzeba na ich reprodukcję, a ich rozród jest
trudniejszy, z tego powodu używanie ich oznacza wyższe koszty
badań.
• zwierzęta transgeniczne często chorują, ciąże są odrzucane,
a pochodzące z nich osobniki są na ogół niepłodne.
• Modyfikacje zwierząt są bardzo kosztowne. Zabiegi uwieńczone
urodzeniem się zmodyfikowanej krowy pochłaniają około 300-500
tys. dolarów, owcy 60 tys., a świni 25 tys. Jednak wykorzystanie
takich zwierząt znacznie ułatwia produkcję niezbędnych dla
medycyny surowców. Oszacowno, że w USA rocznie potrzeba dla
chorych ok. 4 kg czynnika krzepliwości krwi. Tę ilość można uzyskać
w ciagu roku z mleka jednej transgenicznej krowy lub 13
transgenicznych owiec.
 Modyfikacje genetyczne w rolnictwie

Modyfikacje roślin uprawnych polegają przede wszystkim na wprowadzeniu

lub usunięciu z nich określonych genów.

Modyfikacje mają przede wszystkim na celu:

o zwiększenie odporności na herbicydy i szkodniki,
o zwiększenie odporności na infekcje wirusowe, bakteryjne i grzybowe,
o przedłużenie trwałości owoców,
o poprawę składu kwasów tłuszczowych oraz aminokwasów białek,
o zwiększenie zawartości suchej masy,
o zmianę zawartości węglowodanów, karotenoidów i witamin,
o usunięcie składników antyżywieniowych – toksyn, związków
utrudniających przyswajanie składników, związków które podczas obróbki
kulinarnej ulegają reakcjom chemicznym wytwarzając toksyny, zwiększając
np. zawartość nutraceutyków, czyli substancji niezbędnych dla zdrowia,
Na świecie najczęściej modyfikowanymi roślinami są:
kukurydza, pomidory, soja zwyczajna, ziemniaki, bawełna,
melony, tytoń.
W Europie najczęściej modyfikuje się: kukurydzę, rzepak,
buraki cukrowe, ziemniaki.
Kraje produkujące najwięcej GMO to w kolejności: USA,
Argentyna, Kanada, Brazylia, Chiny, RPA.
Przykłady organizmów
transgenicznych w rolnictwie:
• transgeniczne pomidory
o przedłużonej trwałości
(obecnie nie ma dostępnych
na rynku)
• transgeniczne rośliny tytoniu,
odporne na herbicydy
• soja transgeniczna odporna
na działanie glifosatu
Pomidor transgeniczny Flavr Savr - pierwsze
GMO wprowadzone do obrotu

Pomidor transgeniczny Flavr Savr w 1994 roku był

pierwszym GMO wprowadzonym do obrotu. Modyfikacja
genetyczna pomidora Flavr Savr polegała na zmniejszeniu
w nim aktywność genu, który odpowiada za proces
dojrzewania i mięknięcia pomidora. Tak zmodyfikowany
pomidor lepiej znosił transport i dłużej zachowywał
świeżość.
 Dostępność w Polsce

Według danych ISAAA (ang. International Service for the

Acquisition of Agri-biotech Application, Międzynarodowy
Instytut Propagowania Upraw Biotechnologicznych) w Polsce
w 2008 r. trzy tys. hektarów było wykorzystywanych pod
uprawy roślin genetycznie zmodyfikowanych
tj. trzykrotnie więcej niż rok wcześniej.

W Polsce dozwolone jest również stosowanie do karmienia

zwierząt hodowlanych pasz zawierających organizmy
modyfikowane genetycznie. W samej Unii Europejskiej od ok.
12 lat jest dopuszczona do uprawy, przez Europejski Urząd ds.
Bezpieczeństwa Żywności (EFSA), odmiana kukurydzy
zmodyfikowanej MON 810.
 Podstawowe techniki

Klonowanie zostanie opisane w niniejszej prezentacji natomiast

technika PCR zostanie opisana w kolejnej prezentacji
 Klonowanie

Klonowanie – w potocznym rozumieniu proces tworzenia

idealnej kopii z oryginału.

W biologii mianem klonu określa się organizmy mające

identyczny lub prawie identyczny materiał genetyczny.

Klonami są więc organizmy powstałe w procesie

rozmnażania wegetatywnego, takie jak kolonie bakterii,
jednokomórkowców, odrośla i rozmnóżki roślin etc.
Terminy klon i klonowanie (ang. clone, cloning) wprowadził do
biologii J.B.S. Haldane na określenie procesu i produktów
transferu jądrowego zastosowanego w swych pionierskich
doświadczeniach przez Johna Gurdona.

W XIX-wiecznym angielskim, termin clon oznaczał roślinę

wyhodowaną z ukorzenionej gałązki, w zgodzie z pierwotnym,
greckim (ὁ κλωνος – gałązka, odrośl), rozumieniem słowa.
Metodę tę stosuje się od starożytności do propagacji roślin o
pożądanych cechach. M. in. w ten właśnie sposób od tysiącleci
utrzymuje się jednorodność odmian winogron stosowanych
przy produkcji wina. Proces ten po polsku nazywa się
szczepieniem.
 Termin klonowanie jest używany w kilku znaczeniach:

1) Klonowanie to proces tworzenia organizmów mających taką samą informację

genetyczną jak dawca. Szczególnym przypadkiem jest twinning, czyli
powstawanie lub otrzymywanie bliźniąt monozygotycznych, gdzie nie można
wyróżnić dawcy.

2) Klonowanie organizmów oznacza procedurę otrzymywania organizmów o takiej

samej informacji genetycznej, z reguły poprzez procedurę transferu jądra z
komórki somatycznej do komórki jajowej pozbawionej uprzednio jądra. W
przypadku klonowania roślin stosuje się procedurę odróżnicowania komórek
dawcy do komórek merystematycznych.

3) Klonowanie genów – w genetyce i biologii molekularnej proces wyosobniania

genu. Polega na łączeniu fragmentów materiału genetycznego z wektorem
molekularnym i ich namnażaniu w innym organizmie. Otrzymuje się w ten
sposób wiele kopii tego samego genu. Termin klonowanie genów odnosi się też
do identyfikacji genów poprzez wykorzystanie procedury klonowania genów. Jeśli
pojedynczy fragment genomu jest przenoszony z jednego wektora do drugiego,
taki proces określa się mianem subklonowania.
 Metody klonowania ssaków

Opracowanych jest kilka metod klonowania ssaków.

Do klonowania zarodków - czyli jeszcze nie zróżnicowanych komórek -
stosuje się następujące metody:

1. izolacji blastomerów,
2. reagregacja blastomerów,
3. dzielenie zarodków,
4. transplantacja jąder komórkowych.

Ta ostania metoda jest także stosowana do klonowania

somatycznego, czyli takiego w którym wykorzystywane są
komórki pochodzące z osobników dorosłych. Tą metodą
właśnie została sklonowana - jako pierwszy ssak - w 1996 roku
owca Dolly.
 Klonowanie zarodków metodą izolacji blastomerów

Polega na usunięci osłonki przejrzystej zarodka gdy występuje on w

stadium 4-komórkowym - składa się z 4 blastomerów (wykorzystywane
też są czasami zarodki składające się z 2, lub 8 blastomerów), a
następnie umieszczeniu w pożywce pozbawionej jonów magnezu i
wapnia, co powoduje osłabienie połączeń pomiędzy blastomerami i
rozdzielenie się ich.
Następnie rozdzielne blastomery hoduje się w warunkach in vitro do
momentu uzyskania przez nie stadium moruli lub blastocysty.
Następnie wszczepie się je do macicy samicy-biorcy.

Klonowanie tą metodę jest jednak mało skuteczne. Jest to metoda

czysto laboratoryjna.
 Klonowanie zarodków metodą dzielenie (bisekcji)

Polega na przecięciu zarodków występujących w stadium

moruli lub blastocysty odpowiednie przygotowanym
skalpelem.
Jest to zabieg stosunkowo prosty, dzieli się zarodek na
dwie równe części, i po krótkiej hodowli in vitro
przeszczepie się je do samic-biorczyń.
Ograniczeniem tej metody jest możliwość uzyskania tylko
dwóch identycznych genetycznie osobników - dzielenie
zarodka na 3, 4 i więcej części nie przynosiło rezultatów.
Klonowanie zarodków metodą reagregacji blastomerów (klonowanie
chimerowe)

Organizm chimerowy - chimera - jest to organizm złożonych z komórek

pochodzących z dwóch lub więcej, organizmów, czyli pochodzący z komórek
różniących się pod względem genetycznym i genotypowym.

Klonowanie chimerowe opiera się na hipotezie inside-outside, wg której

zewnętrznie położone komórki zarodka wytwarzają trofoblast
(odpowiedzialny za implantację w ścianie macicy), a z komórek będących
wewnątrz, odizolowanych od środowiska zewnętrznego, rozwinie się
ostatecznie przyszły osobnik. W metodzie tej pojedyncze blastomery
wyizolowane wcześniej z zarodka klonowanego (zwykle 4 lub 8 komórkowego)
otacza się innymi blastomerami - tzn. blastomerami nośnikowymi. Następnie
po hodowli in vitro wszczepie się taki już chimerowy zarodek do samicy-
biorcy.
Metoda ta mimo że pozwala na uzyskanie większej liczby klonów pozostaje
jednak metodą czysto laboratoryjną, ze względu na duże trudności z
hodowlą i przeżywalnością agregowanych blastomerów.
 Klonowanie metodą transplantacji
jąder komórkowych
Jest to najczęściej wykorzystywana metoda klonowania. Jest
jedyną która pozwala na sklonowanie dorosłych osobników,
oraz umożliwiająca uzyskanie wielu klonów. Ta właśnie
metodą sklonowana została owca Dolly.

Polega na usunięciu jądra komórkowego z niezapłodnionego

oocytu (komórki jajowej) i wszczepieniu jądra z innej komórki
- pochodzącej z organizmu jaki chcemy klonować. Jądro
można obierać z komórek zarodka, z komórek hodowanych in
vitro, a także co najważniejsze w tej metodzie, z dorosłych już
osobników. W przypadku Dolly były to komórki pochodzące z
wymienia jednej z owiec.
Pierwszym etapem tej metody klonowania jest usuniecie jądra z
niezapłodnionego oocytu. Zabieg polega na mikrochirurgicznym usunięciu
chromosomów ułożonych w płytce metafazowej II podziału mejotycznego.

Następnie izoluje się jądra z komórek które zostanie sklonowane. W

przypadku klonowania zarodków będą to blastomery, a przypadku klonowania
dorosłego osobnika będą to komórki pochodzące z różnych tkanek.
Kolejnym etapem jest wprowadzenie wyizolowanego jądra do oocytu, z
którego wcześniej usunięto jego własne jądro. Zabieg ten można
przeprowadzić metodą mikrochirurgiczną - polegającą na bezpośrednim
wprowadzeniu jądra do komórki jajowej za pomocą mikromanipulatora, lub
metodą niechirurgiczną - za pomocą inaktywowanego wirusa Sendai (wirus z
grupy wirusów grypy) albo poprzez elektrofuzję, czyli za pomocą impulsów
pola elektrycznego. Oocyt z umieszczonym wcześniej jądrem pod osłonką
przejrzysta umieszcza się w roztworze dielektryku pomiędzy dwoma
elektrodami. Impulsy prądu stałego powodują fuzję.
Następnie aktywuje się oocyt - czyli pobudza go do rozwoju. W tym celu
stosuje się czynniki chemiczne: np. alkohol etylowy, lub fizyczne: np. impulsy
prądu stałego. W końcu rozwijający się zarodek wszczepie się do macicy
samicy-biorcy.
Owca Dolly (5 lipca 1996 r.
– 14 lutego 2003 r.) – owca
domowa, pierwsze zwierzę
sklonowane z komórek
somatycznych dorosłego
osobnika metodą transferu jąder
komórkowych. Dolly została
sklonowana przez naukowców
z Instytutu Roslin we wsi Roslin
pod Edynburgiem w Szkocji
– Iana Wilmuta i Keitha
Campbella wraz z zespołem.
Urodzona 5 lipca 1996 roku Dolly
przeżyła sześć lat.
Schemat procedury klonowania, na drodze
której powstała Dolly
Wypchana Dolly jako eksponat w Royal
Museum of Scotland
 Klonowanie ludzi
Naturalną konsekwencją sukcesów w klonowaniu ssaków jest idea
sklonowania człowieka.
Budzi ono głębokie kontrowersje natury etycznej. Wiadomości o
sklonowaniu ssaków wywołały panikę wśród prawodawców wielu krajów,
którzy zabronili klonowania ludzi, szczególnie w celach reprodukcyjnych.
Pierwsze pozornie wiarygodne doniesienie o sukcesie transferu jądrowego u
człowieka pojawiło się w 2004 roku z południowokoreańskiej grupy
badawczej pod kierunkiem Woo Suk Hwanga, której udało się otrzymać
pluripotentne komórki macierzyste, wyprowadzone ze sklonowanych
ludzkich blastocyst. Rok później okazało się jednak, że badania te były
sfałszowane.
Odmiennie przedstawia się sprawa klonowania w celu pozyskania komórek
macierzystych. Ponieważ komórki macierzyste mogą się różnicować do
wszystkich typów komórek ciała, komórki macierzyste otrzymane w wyniku
klonowania mogą mieć potencjalne zastosowanie terapeutyczne, a
procedura taka nie wiąże się z otrzymywaniem organizmu.
Mimo to, nawet klonowanie komórek macierzystych posiada silnych
wrogów w środowiskach wyznawców wielu religii, w tym katolicyzmu, ze
względu na to, że wiąże się z procesem tworzenia sztucznych embrionów.
 Klonowanie wymarłych gatunków zwierząt

Klonowanie wymarłych gatunków zwierząt budzi

zrozumiałe zainteresowanie, zwłaszcza w świetle filmów
fantastycznych takich jak Jurassic Park. Procedury takie
pozostają jak na razie w sferze fantastyki, choć niektóre
ośrodki rozpoczęły badania nad możliwością takiej
procedury. Np. Muzeum Australijskie ogłosiło projekt
sklonowania wilka workowatego, z którego jednak się
wycofano. Pierwszym etapem projektu miało być
otrzymanie biblioteki genowej.
Główne trudności ze zrealizowaniem projektu sklonowania
wymarłego organizmu:
o brak odpowiedniego DNA. DNA dostępny ze źródeł kopalnych
bądź to muzealnych jest bardzo fragmentaryczny i dostępny w
znikomych ilościach. Nie jest jasne, czy możliwe jest
otrzymanie wystarczającej ilości i jakości by odtworzyć
sekwencję kompletnego genomu.
o obecne metody klonowania wykorzystują transfer jądra. Nie
jest jasne, czy nagi DNA mógłby być wystarczający.
Paradoksalnie, nagi DNA może być lepszym substratem do
klonowania, gdyż może łatwiej ulegać reprogramowaniu
epigenetycznemu. Zważywszy, że komórki jajowe pewnych
organizmów, np. żab, mają aktywne mechanizmy potrafiące
odtworzyć chromatynę i otoczkę jądrową, etap ten może być
mniej trudny niż myślimy.
o kwestia wyboru donora komórki jajowej – większość
transferu jądrowego pomiędzy różnymi gatunkami się nie
powodzi.
 Przyszłe, potencjalne możliwości klonowania ludzi
Skrajnymi, ale potencjalnie wykonalnymi celami technik klonowania
ludzi są:
 masowa produkcja klonów, w celu np. tworzenia z nich zastępów
tanich żołnierzy albo niewolników

 produkcja klonów pozbawionych mózgu w celu używania ich jako

"zapasowych ciał". W razie np. nieuleczalnej choroby albo śmierci na
skutek urazu istniałaby możliwość wszczepienia mózgu do organizmu
"pustego" klona i dalsze życie

 produkcja dorosłych klonów w celu pozyskiwania z nich cennych

organów do przeszczepów

 produkcja klonów jako forma świadomego sterowania cechami

potomstwa - np. zamiast rodzić "niepewne genetycznie" dzieci, można
by mieć dziecko-klona - identycznego ze sobą samym lub innym
członkiem rodziny, lub "zamówić" sobie dziecko - klona osoby
obdarzonej szczególnymi talentami.
 Ksenotransplantacja
Niedostatek organów i tkanek do przeszczepów od zmarłych dawców stanowi
obecnie poważny problem w transplantologii
Listy pacjentów oczekujących na przeszczep (np. serca, nerki, wątroby,
wysepek Langerhansa) z roku na rok dramatycznie się wydłużają.
Według danych Poltransplantu w 2014 r. w Polsce liczba pacjentów
oczekujących na przeszczep była znacznie większa niż liczba wykonanych
transplantacji

Wyciąg z Krajowej Listy Oczekujących na

przeszczep w 2014 r.
 Czy istnieją zatem jakieś alternatywy dla ludzkich
narządów i komórek?
Ksenotransplantacja, czyli przeszczep międzygatunkowy, wydaje się być
odpowiedzią na współczesny niedobór organów.
Wykorzystanie zwierząt jako łatwo dostępnego źródła narządów, tkanek i
komórek do transplantacji mogłoby w przyszłości uratować życie setek
pacjentów na całym świecie

Ksenotransplantacja to procedura przeszczepu, implantacji lub infuzji do

organizmu człowieka żywych komórek, tkanek lub organów pochodzących od
innych organizmów niż człowiek
Pierwsze dane dotyczące prób przeszczepienia człowiekowi narządu od gatunku
innego niż człowiek pochodzą z 1667 roku, kiedy to Jean-Baptiste Denis dokonał
pierwszej ksenotransfuzji krwi jagnięcia 15-letniemu chłopcu

1682 roku wykonano pierwszy przeszczep tkanek, uzupełniając ubytek czaszki

rosyjskiego arystokraty fragmentem czaszki psa. Mimo sukcesu zabiegu taki
sposób postępowania spotkał się z krytyką ze strony Kościoła katolickiego i
licznymi zarzutami natury etycznej

Kolejną próbą ksenotransplantacji, podjętą w 1906 roku przez Mathieu Jaboulaya,

było przeszczepienie człowiekowi nerek pochodzących od kozy i świni. Badacz ten
jako pierwszy opisał nadostre odrzucenie ksenoprzeszczepu

W 1963 roku w Stanach Zjednoczonych miały miejsce dwie operacje z

wykorzystaniem naczelnych jako dawców. W Denver Thomas Starzl przeszczepił 6
pacjentom nerki pochodzące od pawianów. Chorzy przeżyli od 19 do 98 dni

W latach 1969–1974 rozpoczęto próby ksenotransplantacji wątroby. Troje dzieci

otrzymało wątrobę od szympansów — najdłuższy okres przeżycia po zabiegu
wynosił zaledwie 2 tygodnie.
 WYBÓR GATUNKU BĘDĄCEGO POTENCJALNYM
ŹRÓDŁEM ORGANÓW DO KSENOTRANSPLANTACJI

Od 1992 roku stopniowo zaczęto odchodzić od

wykorzystywania naczelnych jako dawców narządów w
ksenotransplantologii.
Narządy wewnętrzne szympansów (Pan troglotydes) i
pawianów (Papio species), mimo podobieństwa
anatomicznego i fizjologicznego do organów ludzkich,
są zbyt małe.
Niewielkie rozmiary narządów sprawiały, że np. serce
można było wykorzystać tylko do ksenoprzeszczepów u
dzieci.
Dodatkowymi utrudnieniami związanymi z
wykorzystywaniem naczelnych jako dawców był fakt, że są
one trudne w hodowli.
Cechują się małą płodnością, wydają na świat zazwyczaj
jednego potomka, późno osiągają dojrzałość płciową i
charakteryzują się długim czasem ciąży.
Kolejnym utrudnieniem jest mała różnica filogenetyczna
pomiędzy człowiekiem i małpami naczelnymi, która stanowi
istotne zagrożenie, ponieważ wirusy pawianów i
szympansów, do których zalicza się w szczególności pawiani
endogenny retrowirus (BaEV, baboon endogenous
virus), małpi wirus niedoboru odporności (SIV, simian
immunodeficiency virus), małpi wirus T-limfotropowy
(STLV, simian T-lymphotropic virus), wirus atakujący układ
oddechowy (RSV, respiratory syncytial virus), wirus Shope’a
(SFV, Shope fibroma virus) oraz wirus SV40 (simian virus
40), mogą być niebezpieczne również dla ludzi.
Do ksenoprzeszczepów zaczęto poszukiwać wśród zwierząt
dalej spokrewnionych filogenetycznie.
Stwierdzono, że najwięcej korzystnych cech
umożliwiających wykorzystanie ich w celu przeszczepienia
narządów człowiekowi wykazują świnie.

Głównymi zaletami świń jako dawców nerek są mały koszt

hodowli, duży potencjał rozrodczy oraz doświadczenia z
tym gatunkiem w zakresie inżynierii genetycznej. Ponadto
świnie cechują się zbliżonymi do człowieka parametrami
anatomicznymi i fizjologicznymi

Mają podobną osmolarność moczu, filtrację kłębuszkową i

przepływ krwi przez nerki. Podobny jest też rzut minutowy
serca i ciśnienie tętnicze. Ich znaczny dystans filogenetyczny
w stosunku do człowieka zmniejsza ryzyko przeniesienia
zakażeń wirusowych i nowotworów
Porównanie świni i pawiana pod względem cech istotnych przy wyborze gatunku
odpowiedniego do ksenotransplantacji.
Zachęcam Państwa do lektury
1. Stanisław Surma, Marcin Adamczak „Ksenotransplantacja
nerki”, Forum Nefrologiczne 2019, 12, 114–124,
2. Adam Jasiński, Ryszard Słomski, Marlena Szalata, Daniel
Lipiński, „Transplantacja narządów – wyzwanie dla
biotechnologii”, Biotechnologia, 2006 , 72, 7–28,
3. Jerzy Wiater „CZY DZIĘKI METODOM INŻYNIERII GENETYCZNEJ
KSENOTRANSPLANTACJA STANIE SIĘ FAKTEM? TRANSGENICZNE ŚWINIE
JAKO POTENCJALNI DAWCY NARZĄDÓW DLA CZŁOWIEKA” Kosmos,
Problemy Nauk Biologicznych, 2018, 320, 541–553