Wybrane zagadnienia

związane z
biotechnologią
Teresa Kaźmierczak
Biotechnologia

Interdyscyplinarna dziedzina nauki, której celem jest stworzenie produktu na

podstawie istniejących w przyrodzie i naturze organizmów oraz bazując na
procesach, występujących w naturze.

Omawiane zagadnienia:
 Inżynieria genetyczna: klonowanie, enzymy restrykcyjne, wektory, plazmidy,
biblioteki klonów
 Łańcuchowa reakcja polimerazy PCR
 Elektroforeza kwasów nukleinowych i białek
 Hybrydyzacja kwasów nukleinowych
 Organizmy transgeniczne i sposoby ich otrzymywania
Inżynieria genetyczna
 Klonowanie – proces tworzenia identycznej formy z formy oryginalnej. Klonowanie
organizmów żywych oraz materiału genetycznego.
 Enzymy restrykcyjne = restryktazy – enzymy, pochodzące z bakterii, które tną materiał
genetyczny DNA w ściśle określonych miejscach, używane w technikach inżynierii
genetycznej. Nazwy pochodzą od gatunku i szczepu bakterii np. EcoRI (Z E.coli). Tną
ściśle określone sekwencje nukleotydowe. Najczęściej, używane są enzymy klasy II
(ściśle określone miejsca w kwasach nukleotydowych). Enzymy tną sekwencje
palindromowe tzn na nici 5’-3’ i 3’-5’ ich odczyt będzie taki sam np. 5’-GACT-3’ i
5’TCAG-5’. Używane są do przecinania nici DNA w plazmidach (wektorach), tak, by
wprowadzić obcy materiał genetyczny i przenieść go do innego.
Wektory

 Wektory – niewielkie, najczęściej koliste, cząsteczki DNA, które mają za

zadanie przenieść pożądany materiał genetyczny z jednego organizmu do
drugiego, w którym będzie namnażany. Wektorami są najczęściej plazmidy
(koliste cząsteczki DNA, mają miejsce startu transkrypcji genów – ORI oraz
odpowiednie geny do klonowania). Wektory muszą być zdolne do niezależnej
replikacji, zawierać markery (w celu odróżnienia komórek które pobrały
wektor, a które nie pobrały lub w celu wyodrębnienia białek, które są
kodowane na tych plazmidach) i mieć wiele miejsc cięcia dla restryktaz
(MCSs). Wektory klonujące, ekspresyjne (produkują białka) i wahadłowe
(replikują się w różnych organizmach).
 Wektorami mogą być też: bakteriofagi, plazmidy, wirusy.
Plazmid
Klonowanie
Klonowanie i selekcja klonów
Biblioteki klonów

 Kolekcje genomów zawarte i wklonowane w komórki lub organizmy.

 Biblioteki cDNA – biblioteka jako zbiór mRNA w formie cDNA
Łańcuchowa reakcja polimeryzacji –
polymerase chain reaction - PCR
 PCR – łańcuchowa reakcja polimerazy ma za zadanie powielić w niewielkim czasie z
bardzo niewielkiej ilości DNA wiele cząstek. Powielić znaczy zamplifikować. Liczba
kopii z nawet 1 może wzrosnąć do 1 mln. Ułatwia to m.in. Identyfikację DNA,
klonowanie, sprawdzenie, czy plazmid został prawidłowo skonstruowany, wytworzyć
biblioteki DNA, wykorzystać DNA do eksperymentów i do hybrydyzacji. Ilość kopii DNA
to 2n – gdzie n to nr cyklu. Wykonywane jest w termocyklerze.
 PCR składa się z kilku etapów, które są powtarzane 25-40 razy:
1. Denaturacja DNA w 98 st. C – rozplecenie dwuniciowej nici DNA
2. Obniżenie temperatury do około 50 st. C – powolne parowanie się zasad i nici DNA
3. Podwyższenie temperatury do około 55 st. C – wiązanie starterów (krótkie
jednoniciowe DNA) do końców 5’ i 3’.
4. Amplifikacja w temperaturze 72 st. C (polimeraza Taq z bakterii z gorących źródeł) i
powielenie materiału.
Składniki mieszaniny PCR

 DNA jako materiał wyjściowy

 Mieszanina deoksynukleotydów
 Bufor z jonami magnezu
 Polimeraza DNA
 Starter przedni (forward) i starter tylny (reverse)
 Woda czysta molekularnie

Proces przeprowadzany jest w cienkościennych probówkach do PCR.

Termocykler
PCR
PCR - znaczenie
 Powielenie DNA do klonowania
 Powielenie DNA do technik inżynierii
 Zbadanie obecności wirusa w komórce
 Powielenie materiału znajdującego się w kopalinach (DNA jest bardzo trwałe, ale RNA
nie)
 Powielenie materiału genetycznego sprawcy zbrodni
Hybrydyzacja kwasów nukleinowych –
Metoda Southerna
 Na membranie lub płytce znajdują się nici DNA lub RNA, które są
do nich przymocowane. Na zasadzie komplementarności do
mieszaniny dodaje się różne kwasy nukleinowe i te, które będą
hybrydyzować ze sobą (tworzyć podwójne nici) mogą być wykryte
np. za pomocą izotopów, fluorescencji. W taki sposób powstają też
mikromacierze – w dołkach umieszcza się różne cząsteczki i
dodając do każdego z nich ten sam związek sprawdza się, czy
zachodzi hybrydyzacja – zmiana koloru.
Southern Blotting
Mikromacierze
Elektroforeza

 Zdolność poruszania się cząstek naładowanych (białka, kwasy nukleinowe) w polu elektrycznym.
Dzięki temu można przeprowadzić proces rozdziału cząstek naładowanych.
 Zestaw do elektroforezy składa się z: kuwety, żelu (agarozowy najczęściej dla kwasów
nukleinowych i poliakrylamidowy najczęściej do białek), buforu do elektroforezy, próbek, źródła
prądu.
 Żel miesza się z buforem, wkłada grzebień (by utworzyć kieszonki, do których wprowadzana jest
próbka), wprowadza się próbki do kieszonek, zalewa aparat buforem, podłącza się do prądu.
 Żel składa się z porów o różnej średnicy i wielkości, w zależności od tego, jakie jest jego
stężenie. DNA, ze względu na ujemny ładunek (reszty kwasu fosforowego), kieruje się od katody
(-) do anody (+), natomiast białka poruszają się różnie np. zgodnie z wielkością (SDS-PAGE) lub ze
względu na ładunek.
 Rozdział kwasów nukleinowych jest przy stałym natężeniu prądu, a białek przy stałym napięciu
prądu.
 Następnie żel może być wybarwiany np. dla kwasów często jest to bromek etydyny (UWAGA!
KANCEROGENNY) lub MidoriGreen, a białka wybarwia się solami srebra lub błękitem Coomassie.
Elektroforeza
SDS-PAGE – rozdział tylko na podstawie
masy białek
Żele po elektroforezie
Transgeneza

 Technika polegająca na modyfikacji organizmów poprzez umieszczenie w nich genów

organizmów, zazwyczaj nie spokrewnionych z nimi. W tym celu budowane są
konstrukty zawierające promotor, terminator, regulatory. Zmodyfikowane organizmy
są selekcjonowane.
 Techniki transgenezy:
1. Transgeneza somatyczna – transplantacja jąder komórkowych
2. Transformacja za pomocą wirusów
3. Elektroporacja
4. Mikrowstrzeliwanie = armatka genowa rośliny
5. Metoda chemiczna
6. Mikroiniejsca
7. Makroiniekcja
Transgeneza somatycza

 Etapy:
1. Enukleacja oocytu
2. Izolacja jądra z komórek do klonowania
3. Modyfikacja genów
4. Wprowadzenie (elektrofuzja – pole elektryczne lub
metoda mikrochirurgiczna lub za pomocą wirusa)
5. Aktywacja oocytu do podziałów
6. Implantacja do samicy - biorcy
Elektroporacja
Mikrowstrzeliwanie
Co jeszcze robi biotechnolog, oprócz
klonowania?
 Bada procesy zachodzące wewnątrz komórek
 Bada jak zbudowane są białka, cukry, błony i jaka jest ich funkcja w komórkach
 Tworzy białka terapeutyczne, szczepionki, leki
 Tworzy terapie nowotworowe
 Bada skład różnych komórek i związków
 Stosuje różne i ciekawe techniki pomiarowe
 Zmienia zachowania różnych komórek np. by komórki bakterii wytwarzały jakiś
związek
 Produkuje piwo, sery, kiszonki, alkohole i udoskonala te procesy
 I wiele innych…