Wybrane metody oczyszczania

i analizy proteomu

„Progress in science depends on new techniques,

new discoveries and new ideas, probably in that order”
Sydney Brenner
 Analiza białek pozwala odpowiedzieć na wiele ważnych biologicznie
pytań dotyczących badanego białka:

• jaka jest całkowita ilość badanego białka w komórce, a jaki jest

poziom syntezy w poszczególnych typach komórek;
• jaka jest subkomórkowa lokalizacja badanego białka (np. jądrowa,
błonowa, mitochondrialna itd.);
• czy białko ulega translokacji w odpowiedzi na pewne warunki;
• czy białko ulega modyfikacjom potranslacyjnym i jak wpływają one
na funkcje białka;
• czy poziom danego białka w komórce jest regulowany przez szok
cieplny, hormony, czynniki wzrostowe;
• jaka jest funkcja badanego białka w komórce;
• z jakimi innymi białkami oddziałuje badane białko;
• czy poziom białka w komórce zmienia się u chorych osobników.
 Wybór analizowanego białka

Wybór źródła badanego białka

Naturalne Nadekspresja

Ułatwia oczyszczanie

Umożliwia otrzymanie dużych ilości białka

- Analizy biochemiczne
(badanie aktywności enzymatycznej, stabilności,
interakcji białko-białko, białko-DNA)
- Analizy strukturalne (krystalizacja , NMR)
- Otrzymanie przeciwciał
 Hodowle komórkowe

Komórki ssacze
Komórki drożdżowe tzw. linie komórkowe
Metody dezintegracji komórek/lizy komórek

mechaniczne nie- mechaniczne

homogenizacja
młyn kulkowy

fizyczne chemiczne enzymatyczne

sonikacja detergenty lizozym

mrożenie/odmrażanie rozpuszczalniki litykaza
 Dezintegracja komórek

Moździerz
ceramiczny

homogenizator homogenizator
szklano-teflonowy ultradźwiękowy
 Frakcjonowanie komórek poprzez
wirowanie różnicowe

Homogenat
1500g – 10 min.

osad I supernatant I
(całe komórki,
pozostałości komórek, 30000g – 20 min.
jądra)

osad II supernatant II
(mitochondria, 100000g – 2godz.
lizosomy,
peroksysomy)

osad III supernatant III

(mikrosomy) (białka cytoplazmatyczne)
 Oczyszczanie białek metodą chromatografii cieczowej

Wykres
chromatograficzny

Frakcja
cytoplazmatyczna

czas zebrane frakcje zawierające

rozdzielone białka
 Różne rodzaje chromatografii cieczowej

Rozdział białek ze względu na:

• rozmiar - filtracja żelowa (sito molekularne);

• ładunek - chromatografia jonowymienna;

• hydrofobowość – chromatografia oddziaływań hydrofobowych

• powinowactwo – chromatografia powinowactwa

Filtracja żelowa

Mieszanina dużych
i małych białek

złoże chromatograficzne
Chromatografia powinowactwa
Analiza oddziaływań białko-białko metodą pull-down

https://www.thermofisher.com/pl/en/home/life-science/protein-
biology/protein-biology-learning-center/protein-biology-resource-
library/pierce-protein-methods/pull-down-assays.html
 Elektroforeza żelowa białek

• Metoda ta umożliwia monitorowanie składu mieszaniny białek,

sprawdzanie czystości białek, oznaczanie masy cząsteczkowej, analizy

struktury podjednostkowej, określenie punktu izoelektrycznego białka
• W analizie białek stosowane są żele poliakrylamidowe ( dobra
rozdzielczość, duża wytrzymałość mechaniczna)

• Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym umożliwia rozdział cząsteczek

białkowych różniących się wielkością i ładunkiem elektrycznym;

• Rozdział może być jednokierunkowy (1D) – lub dwukierunkowy (2D)

 Analiza białka metodą elektroforezy jednokierunkowej
w warunkach denaturujących (SDS/PAGE)

Elektroforeza pionowa
Białko A Białko B

Do roztworu białka
dodawany jest:
DTT
SDS
barwnik
 Barwienie białek w żelu poliakrylamidowym

Barwienie barwnikiem Coomassie Blue Barwienie srebrem

zwykle powyżej 25 ng/prążek ok. 0,5 ng/prążek
 Barwienie białek w żelu poliakrylamidowym

Barwienie cynkiem

Barwienie barwnikiem fluorescencyjnym

 Analiza białek metodą ogniskowania izoelektrycznego (IEF)

katoda (-)
pH 10,0

punkt izoelektryczny (pI)-

pH w którym cząsteczka ma

zerowy ładunek sumaryczny,

oznaczany przy pomocy

IEF
programu komputerowego

dla białek o znanej sekwencji,

lub empirycznie

pH 3,0
anoda (+)
SDS/PAGE IEF

pH 5,0

pH 2,5
 Analiza białek metodą elektroforezy dwukierunkowej (2D)

Pierwszy kierunek - IEF Drugi kierunek – SDS/PAGE

pH 10,0

IEF

pH 3,0
Barwienie barwnikiem Coomassie Blue Barwienie srebrem
To, czego często nie można dowieść metodami biochemicznymi, można
teraz po prostu zobaczyć, czyli........
przyżyciowa analiza procesów biologicznych metodą mikroskopii
konfokalnej
Obraz w mikroskopie
konfokalnym uzyskiwany
jest poprzez skanowanie
preparatu wiązką lasera, która
wzbudza fluorescencję
barwnika.

Zalety:
• otrzymywanie obrazów
o większej rozdzielczości
i lepszym kontraście;
• uzyskanie trójwymiarowego
obrazu;
•jednoczesna rejestracja
kilku barwników;
Białko GFP (Green Fluorescent Protein) z meduzy
Aequorea victoria (nagroda Nobla 2008)
 komórki ssacze
odczynnik do DNA
transfekcji

dodanie lipopleksu
DNA+ odczynnik do transfekcji
inkubacja 30 min

inkubacja 24 godz.
obserwacja mikroskopowa
R. E. Campbell, Scholarpedia, 2008, 3, 5410
Przeciwciała jako narzędzia

biologii molekularnej

i współczesnej medycyny
• Przeciwciała lub immunoglobuliny–białka wydzielane przez komórki
plazmatyczne (czyli pobudzone limfocyty B) w przebiegu odpowiedzi
immunologicznej typu humoralnego, które mają zdolność do swoistego
rozpoznawania antygenów.
• Jako część układu opornościowego u człowieka i innych kręgowców
przeciwciała odgrywają zasadniczą rolę w obronie organizmu przed
drobnoustrojami i pasożytami
• Obca makrocząsteczka zdolna do wywoływania syntezy przeciwciała jest
nazywana antygenem (lub immunogenem)
• Białka są zazwyczaj efektywnymi antygenami. Swoiste powinowactwo
przeciwciał nie dotyczy całej makrocząsteczki antygenu, ale pewnego
jego miejsca, zwanego determinatą antygenową (lub epitopem)
• Jako narzędzia badawcze stosowane są głównie immunoglobuliny klasy G
(IgG)
 Schemat budowy przeciwciał

• kształt zbliżony do litery „Y”

• zbudowane z dwóch identycznych
zmienny
łańcuchów ciężkich (H) i dwóch
stały
identycznych łańcuchów lekkich (L)
• Odcinki z N-końców łańcuchów lekkich
i ciężkich wykazują zmienność sekwencji
aminokwasowej, natomiast sekwencja łańcuch lekki
C-końców tych łańcuchów jest stosunkowa
stała łańcuch ciężki
Region Fc
• Odcinki zmienne są miejscami wiązania
antygenu
 Przeciwciała poliklonalne i monoklonalne

Przeciwciała poliklonalne (pAbs – ang. polyclonal antibodies) - preparat

cząsteczek przeciwciała uzyskany z różnych klonów komórek limfocytów B.
To mieszanina cząsteczek przeciwciał, które wiążą się z różnymi
częściami antygenu (tzw. epitopami) z różnym powinowactwem.
Przeciwciała monoklonalne (mAbs – ang. monoclonal antibodies)-
wytwarzane przez pojedynczy klon komórek; są skierowane przeciwko
jednemu epitopowi cząsteczki białka;
Przeciwciała monoklonalne i poliklonalne stosujemy
w testach mających za zadanie:

➢ identyfikację

➢ oznaczenie ilościowe

➢ lokalizację

białek lub komórek (własnych lub obcych)

 Metody immunologiczne
Zdolność przeciwciał do bardzo specyficznego oddziaływania
z antygenem wykorzystywana jest w wielu technikach
immunologicznych

• ELISA

• Western blotting

• Immunocytochemia

•Immunoprecypitacja
 Zasada technik: ELISA, Western blotting, immunocytochemia

antygen

epitop

Kompleks immunologiczny
przeciwciało
znacznik

Najczęściej stosowanymi znacznikami są:

- fluorochromy ( w metodach immunofluorescencyjnych)
- enzymy (w metodach immunoenzymatycznych)
- złoto koloidalne, stosowane w badaniach
ultrastrukturalnych (w mikroskopii elektronowej).
 Metody bezpośrednie Metody pośrednie

antygen
antygen

epitop
epitop

Przeciwciało
pierwszorzędowe

przeciwciało
znacznik

Przeciwciało
drugorzędowe
znacznik
 Analiza białek metodą Western Blotting (immunoblotting)

Transfer białek Elektroforeza białek

na membranę w żelu poliakrylamidowym

bufor do transferu
Katoda (-)

żel

membrana
Reakcja ze specyficznymi
przeciwciałami Detekcja

Anoda (+) Membrana

z przeniesionymi
białkami
 Detekcja przeciwciał w metodzie Western Blotting

produkt reakcji enzymatycznej

(detekcja kolorymetryczna
lub chemiluminescencyjna)

drugorzędowe przeciwciało substrat

związane z enzymem

pierwszorzędowe
przeciwciało
badane białko (antygen)

membrana zawierająca przeniesione z żelu białka

 Do znakowania przeciwciał w testach immunoenzymatycznych
najczęściej stosowane są enzymy:
• fosfataza alkaliczna
• peroksydaza chrzanowa

Wizualizacja tych enzymatycznych znaczników może być

przeprowadzona:
• kolorymetrycznie (w miejscu związania przeciwciał do białka
powstaje barwny produkt),
• chemiluminescencyjnie ( enzym przeprowadza reakcję
z wytworzeniem światła).
 Detekcja białek w metodzie Western Blotting

Detekcja kolorymetryczna Detekcja chemiluminescencyjna

 Immunocytochemia (ICC) / Immunohistochemia (IHC)

Immunocytochemia - zajmuje się wykrywaniem i lokalizacją w komórkach (czy

też w szerszym rozumieniu w tkankach - immunohistochemia) substancji
o charakterze antygenowym, za pomocą znakowanych przeciwciał, co umożliwia
obserwacje badanego białka pod mikroskopem i określenie jego subkomórkowej
lokalizacji.
Ta metoda jest wykorzystywana w diagnostyce chorób nowotworowych
(określanie typu oraz stopnia zróżnicowania nowotworu) co ma znaczenie
prognostyczne oraz wpływa na wybór leczenia.
ICC IHC
Zasada immunoprecypitacji (IP)

https://www.thermofisher.com
The principle of Co-IP is the same as IP, except that the proteins associated
with the antigen are also precipitated

https://www.mblbio.com/bio/g/support/method/co-immunoprecipitation.html
ChIP- ang. chromatin immunoprecipitation

C., Zhang, S., and Huang, H. (2015).. Front. Microbiol.

 Zastosowanie przeciwciał

• badania podstawowe

• diagnostyka laboratoryjna ( borelioza, toksoplazmoza, testy alergiczne)

• terapia wielu chorób

Pierwsze kliniczne zastosowania przeciwciał - koniec XIX, Emil Behring

i Shibasabura Kitasato z Instytutu Higieny R. Kocha w Berlinie pokazali, że

surowica zwierzęcia immunizowanego dyfterotoksyną może zostać wykorzystana

do zneutralizowania śmiertelnych dawek tej samej toksyny

u innego zwierzęcia.
Dziękuję za uwagę