Biologia molekularna

dla studentów II roku biotechnologii

Aleksandra Boguszewska

Katedra Biologii Molekularnej, p. 17A

godz. konsultacji na profilu na stronie UMCS
(wtorek, środa godz. 14.30-15.30)
aleksandra.boguszewska@mail.umcs.pl
 Tematy wykładów z biologii molekularnej

• Wprowadzenie do biologii molekularnej: definicja, historia; budowa i funkcja DNA, RNA;

od genu do białka: dogmat biologii molekularnej, kod genetyczny, budowa białek.

• Organizacja genomu: genom bakteryjny, genom eukariotyczny – jądrowy, chloroplastowy

i mitochondrialny, eukariotyczne wirusy DNA i wirusy RNA;

• Ekspresja genów: transkrypcja, dojrzewanie RNA, transport przez błonę jądrową,

translacja, modyfikacje potranslacyjne bałek, regulacja ekspresji genów;

• Wybrane metody oczyszczania i analizy białek.

 Podręczniki

▪ Biologia molekularna, krótkie wykłady, wyd.3 – P.Turner i in.,

PWN, 2011 lub wyd. 4 (2021)

▪ Podstawy biologii molekularnej – L.A. Allison, WUW, 2009;

▪ Genomy, wyd.2 – T.A. Brown, PWN, 2009 lub wyd. 3 (2019)

▪ TiBS (Trends in Biochemical Sciences); Nature, Cell

1938 r. – Warren Weaver proponuje termin biologia
molekularna, aby opisać zastosowanie technik
z zakresu nauk fizycznych i chemicznych
(promieniowanie X, radioizotopy, ultrawirowanie
czy matematyka) do badania żywej materii;
William Astbury w „Nature” (1961) napisał,
że biologia molekularna:
... jest szczególnie zainteresowana formami biologicznych
cząsteczek, ich trójwymiarową strukturą, genezą
i ich funkcjonowaniem.
 Biologia molekularna – czym się zajmuje?

Nauka podstawowa zajmująca się badaniem struktury

i funkcji makromolekuł, przede wszystkim kwasów
nukleinowych i białek . Zazębia się ona z takimi dziedzinami
wiedzy jak genetyka, biochemia, biofizyka czy cytologia.
 Historia DNA

1869 r. – F. Miescher izoluje bogatą w fosfor substancję zwaną „nukleiną”

z jąder krwinek białych;

1875 r. – E. Strasburger opisuje twory, zwane później chromosomami;

1929 r. – P.A. Levene charakteryzuje i nazywa kwas rybonukleinowy

i deoksyrybonukleinowy;
 Historia DNA

1944 r. – Oswald Avery sugeruje, że DNA może być nośnikiem informacji genetycznej

1950 r. – Erwin Chargraff określa, że ilości zasad A i T oraz C i G w DNA są równe;

1952 r. – A. Hershey i M. Chase wykorzystują badania nad bakteriofagiem T2,

by potwierdzić, że DNA jest nośnikiem informacji genetycznej;

 Historia DNA

1952 r. – Maurice Wilkins i Rosalind Franklin, wykorzystując krystalografię

rentgenowską, wyjaśniają, że w DNA znajdują się struktury powtarzające się;

1953 r. – Francis Crick i James Watson

prezentują DNA jako helisę złożoną z dwóch
nici powiązanych wiązaniami wodorowymi

DNA jest materiałem genetycznym;

każdy chromosom jest pojedynczą cząsteczką DNA;

geny są fragmentami sekwencji DNA

 Budowa DNA

DNA jest polimerem zbudowanym z powtarzających się jednostek

zwanych nukleotydami (dNTP): dATP, dGTP, dCTP, dTTP

Długość komórkowych cząst. DNA może sięgać kilkaset milionów nukleotydów,

długość dwuniciowej cząst DNA wyraża się liczbą par zasad (pz- ang. bp ) –
kilo par zasad (kpz) lub milion pz (mpz). W laboratoriach często wykorzystuje się
krótkie łańcuchy jednoniciowego DNA, zazwyczaj krótsze niż 50 nt, określane
mianem oligonukleotydów.
 Formy przedstawienia podwójnej helisy DNA

A B

C
 Formy dwuniciowej helisy DNA

A-DNA B-DNA Z-DNA

Kierunek skrętu Prawoskrętna Prawoskrętna Lewoskrętna

Duży rowek Głęboki i wąski Średnio głęboki, szeroki Płytki, w zasadzie

nieobecny

Mały rowek Płytki i szeroki Średnio głęboki, wąski Bardzo głęboki, wąski

Liczba par zasad na 11 10,5 12

pełny obrót helisy

Warunki Mała wilgotność (75%), Duża wilgotność (95%), Duże stężenie MgCl2
duże stężenie soli małe stężenie soli (›3M), NaCl lub etanolu
 Dwuniciowa cząsteczka DNA może podlegać
odwracalnemu rozpleceniu do pojedynczych nici

Natywny DNA
(podwójna helisa) podgrzanie, OH–, formamid

Zdenaturowany DNA
(statystyczny kłębek)

Temperatura topnienia (Tm) DNA –

to taka temp., przy której 50% podwójnej helisy,
DNA jest rozpleciona do pojedynczych nici
 PCR – podstawowa metoda analizy DNA

• PCR (ang. Polymerase Chain Reaction) – reakcja łańcuchowa polimerazy

• Sztuczny proces, który imituje zachodzącą w komórkach replikację DNA

Potrzebne odczynniki:
• woda,
• matrycowe DNA,
• dNTP,
• oligonukleotydowe startery,
• bufor zawierający jony Mg2+ ,
• polimeraza Taq
 Poszczególne etapy cyklu reakcji
PCR

• Reakcja denaturacji DNA

w temp. 93-96°C,
• Przyłączanie się starterów do
matrycowego DNA (ang. annealing)
w temp.42-680C,
• Wydłużanie starterów (elongacja)
w temp. 720C

Postepy Hig Med Dosw. (2010), Kazubek M. i in.

 Zastosowanie reakcji PCR w diagnostyce molekularnej

✓ diagnostyka chorób uwarunkowanych genetycznie (mukowiscydoza,

pląsawica Huntingtona i in.)
✓diagnostyka chorób infekcyjnych (testy wykrywające obecność wirusów
- np. wirusa HIV, wirusa opryszczki (HSV), czy kojarzonego ze
zwiększonym ryzykiem zachorowania na raka szyjki macicy - ludzkiego
wirusa brodawczaka; bakterii - np. dla powodującej boreliozę Borrelia
burgdorferi,
✓ wczesne wykrywanie nowotworów,
✓ diagnostyka sanitarna,
✓ diagnostyka w medycynie sądowej,
✓ transplantologia.
DNA w sztuce – Bio art
 DNA w sztuce – Bio art

Combined Couples DNA Art Abstract Pet Portrait DNA Art on Canvas - Black
$ 429.00 $ 299.00

https://dnaartgallery.com/collections/
DNA w sztuce – Bio art
 Historia RNA

1869 r. – F. Miescher izoluje bogatą w fosfor substancję zwaną

„nukleiną” z jąder krwinek białych;

1929 r. – P.A. Levene charakteryzuje i nazywa kwas rybonukleinowy

i deoksyrybonukleinowy

1955 r. – odkrycie rybosomów

1958 r. - odkrycie tRNA

1960 r. – odkrycie mRNA

 Budowa RNA
Cząsteczka RNA jest liniowym polimerem zbudowanym z nukleotydów
połączonych ze sobą wiązaniami fosfodiestrowymi
 Struktury drugorzędowe RNA

Drugorzędowa struktura RNA

charakteryzuje się obecnością podwójnej helisy
typu A oraz jednoniciowych pętli, które można
podzielić na:
struktury spinki do włosów (ang. hairpins),
wybrzuszenia (ang. bulges),
pętle wewnętrzne (ang. internal loop),
połączenia (ang. junctions)
 Rodzaje par zasad zidentyfikowane
w dwuniciowych helisach RNA

Kanoniczne pary zasad typu Watson-Crick: AU; GC

 Rodzaje par zasad zidentyfikowane
w dwuniciowych helisach RNA

Niekanoniczne pary zasad (ponad 20 różnych typów), najczęściej spotykane to:

GU (ang. wobble GU); GA (ang. sheared, po polsku tzw. nożycowa);
AU oddziaływanie odwrócone typu Hoogsteena (ang. reversed Hoogsteen);
 Oddziałujące trójki zasad w RNA

Trójki zasad mają zwykle parę oddziałującą w sposób klasyczny, zgodnie

z zasadami par typu Watson-Crick a trzecia zasada oddziałuje wieloma różnymi,
niekonwencjonalnymi sposobami.

Niekanoniczne pary oraz trójki zasad są ważnymi elementami procesu

zwijania się RNA i oddziaływań RNA-białko
 Motywy struktury trzeciorzędowej RNA

„cząsteczka tRNA wygląda tak jakby Natura chciała zmusić cząsteczki RNA
do wykonywania zadań przeznaczonych dla białek” – F. Crick (1966)

Zidentyfikowano liczne, bardzo zachowawcze i złożone motywy strukturalne RNA,

m.in. pseudowęzły, zwroty K

motywy oddziaływania mały rowek-adenozyna,

pętle czteronukleotydowe, zamki rybozowe,

Struktura RNA ludzkiej telomerazy

https://binkley2.ncifcrf.gov/users/bshapiro/telomerase/telomerase.html
 Rodzaje i funkcje RNA w komórce
Cały RNA

RNA niekodujący
RNA kodujący 96% całości
4% całości

pre-mRNA pre-rRNA pre-tRNA „small” lncRNA

(hnRNA) ncRNA tmRNA i różne
inne rodzaje
RNA

mRNA rRNA tRNA

snoRNA 7SL RNA
snRNA Xist
miRNA
piRNA
siRNA

Większość RNA występuje

w kompleksach RNA-białko
zwanych cząstkami
rybonukleoproteinowymi (RNP)
 Poziom RNA w komórkach ssaków

Komórka bakteryjna zawiera 0,05- 0,1pg RNA Frontiers in genetics (2015), Palazzo A. F. et al.
co stanowi ok. 6% jej masy.

Komórka ssaków jako większa zawiera 20-30 pg RNA

co stanowi tylko 1% jej masy.
 Funkcje RNA w komórce

✓ RNA może być materiałem dziedzicznym, np. wirusy RNA

✓RNA może służyć jako „rusztowanie” na którym osadzają się białka,

np. cząstka sygnałowa SRP (7SL RNA);

✓ krótkie cząsteczki RNA mogą bezpośrednio kontrolować ekspresję genów,

np. ryboprzełączniki, RNA związane z interferencją RNA
(siRNA, miRNA, piRNA));

✓ oddziaływania RNA-białko mogą wpływać na aktywność katalityczną białek,

np. telomeraza;

✓RNA może być katalizatorem reakcji chemicznych, tzw. rybozymy;

Struktura bakteryjnej Rnazy P w kompleksie z tRNA

Nature (2010), Reiter N.J et al.

 Historia białka

W roku 1795 chemik i fizyk angielski William Nicholson

pisał:...”wydaje się prawdopodobne, że białko jaja, surowica krwi i twaróg
nie różnią się od siebie w sposób zasadniczy. Do nich można dodać gluten
roślinny, który bardzo przypomina ser”...

1816 r. pierwsze klasyczne doświadczenia wykazujące niezbędność

organicznych związków azotowych w żywieniu zwierząt (F. Mangendie)

1839 r. – szwedzki chemik J. Berzelius nadał im nazwę protein

(gr. proteios –najważniejszy, zasadniczy, podstawowy)
 Białka

Opis cząsteczki Wygląd cząsteczki Liczba aminokwasów

Peptydy od 2

Oligopeptydy kilka - kilkanaście

Polipeptydy poniżej 100

Białka powyżej 100

 Poziomy organizacji cząsteczki białka

Struktura pierwszorzędowa – sekwencja, czyli kolejność ułożenia reszt

aminokwasów w łańcuchu białka,

Struktura drugorzędowa – przestrzenne ułożenie fragmentów łańcuchów

białka, stabilizowane wiązaniami
wodorowymi:

struktura α-helisy

struktura β –harmonijki (β-kartki)

zwroty
 Poziomy organizacji cząsteczki białka

Struktura trzeciorzędowa –
wzajemne przestrzenne ułożenie
fragmentów struktury drugorzędowej
 Poziomy organizacji cząsteczki białka

Struktura czwartorzędowa –
wzajemne przestrzenne ułożenie
łańcuchów polipeptydowych.

Tylko białka zawierające

więcej niż jedną podjednostkę
mają strukturę czwartorzędową!!!
Denaturacja – renaturacja białka
 Sposoby prezentacji struktury atomowej białka

Str. szkieletowa Str. wstążkowa Str. chemiczna Str. powierzchniowa

Białka w sztuce- Bio art

GFP in steel, Julian Voss-Andreae, 2004

Shh (sonic hegdehog) protein