Wykład 3 (e-learning)

Biologia molekularna
Dr hab. Małgorzata Knapik-Czajka
Zakład Analityki Biochemicznej UJCM
Ekspresja genów:
transkrypcja
 Ekspresja genu

DNA
cja
y p
k r
ans
Tr

translacja
mRNA Białko
 Transkrypcja
Wieloetapowy proces tworzenia jednoniciowego RNA, którego
sekwencja jest komplementarna w stosunku do jednej z dwóch nici DNA
(nici matrycowej)
Transkrypcja-Prokaryota
Powstanie dojrzałego transkryptu mRNA

Figure 12.10 Genomes 3 (© Garland Science 2007)

Źródło: T. A. Brown: Genomy. Warszawa:

Wydawnictwo Naukowe, str .340
Transkrypcja-Eukaryota
 Transkrypcja
• DNA (gen)
• Polimeraza RNA zależna od DNA
• Substraty - ATP, CTP, UTP, GTP
• Różne białka, w tym białkowe czynniki transkrypcyjne
(TF, transcription factors)
 Polimeraza RNA - Prokaryota
Holoenzym: 2α2ββ’σ
Podjednostka sigma: udział w inicjacji transkrypcji

Źródło:Podstawy genetyki. Drewa G.; Ferenc T.; Urban & Partner; 2007; str.63
 Polimerazy RNA - Eukaryota

3 wielopodjednostkowe polimerazy RNA u Eukaryota

• Polimeraza I - synteza rRNA (18S, 28S i 5.8S rRNA)

• Polimeraza II - synteza pre-mRNA, a także większości snRNA i
miRNA
• polimeraza III - synteza tRNA, 5S rRNA, snoRNA
Lokalizacja:
• polimeraza RNA I - jąderko
• Polimeraza RNA II i III - jądro
Polimeraza RNA II nie rozpoznaje
samodzielnie miejsca startu transkrypcji

Źródło: T. A. Brown: Genomy. Warszawa:

Wydawnictwo Naukowe PWN, 2015, str.
309
 Polimerazy RNA - Eukaryota

• Polimeraza RNA II
- kilkanaście podjednostek, w tym największa podjednostka, której C-
końcowa domena (CTD) może ulegać odwracalnej fosforylacji.
-w fosforylacji/defosforylacji polimerazy II biorą udział kinazy i fosfatazy
-forma nieufosforylowana polimerazy II - udział w inicjacji transkrypcji
-forma ufosforylowana polimerazy II - udział w elongacji
 Transkrypcja
Etapy:
• Inicjacja (i opuszczenie promotora)
• Elongacja
• Terminacja
Transkrypcja-inicjacja

Żródło: T. A. Brown: Genomy. Warszawa:

Rys. 11.17 Ogólny schemat inicjacji Wydawnictwo Naukowe PWN, 2015, str. 312
transkrypcji
 Transkrypcja-inicjacja

• Miejsce startu transkrypcji - pierwszy transkrybowany nukleotyd oznacza się jako +1,
nukleotydy położone na prawo (downstream) od tego miejsca określane są liczbami
dodatnimi, zaś na lewo (upstream) liczbami ujemnymi
• Promotor – odcinek DNA zawierający wszystkie sekwencje (elementy, motywy)
położone zazwyczaj powyżej sekwencji kodującej genu konieczne do zainicjowania
procesu transkrypcji (lub zwiększenia częstości inicjacji transkrypcji) odpowiedzialne za
właściwe wiązanie polimerazy RNA
• Miejsca (sekwencje) regulatorowe – miejsca (sekwencje) w strukturze genu, które są
odpowiedzialne za wiązanie czynników regulujących proces transkrypcji
Transkrypcja u Prokaryota
 Promotor bakteryjny

Źródło: Podstawy genetyki. Drewa G.; Ferenc T.; Urban & Partner; 2007; str. 63
 Żródło: T. A. Brown: Genomy. Warszawa:
Rys. 11.18 Inicjacja transkrypcji u Escherichia coli Wydawnictwo Naukowe PWN, 2015, str. 313
 Transkrypcja-elongacja

• Synteza wiązań fosfodiestrowych między rybonukleotydami przez

polimerazę RNA
• Łańcuch RNA jest syntetyzowany w kierunku 5' do 3’
Transkrypcja-terminacja

Źródło: T. A. Brown: Genomy. Warszawa:

Wydawnictwo Naukowe PWN, 2015, str. 337
Transkrypcja-terminacja

Źródło: T. A. Brown: Genomy. Warszawa:

Wydawnictwo Naukowe PWN, 2015, str. 338
Transkrypcja u Eukaryota
 Promotor w genach Eukaryota
• Promotor dla polimerazy RNA II - seria modułów krótkich sekwencji nukleotydowych,
każdy działa jak miejsce wiązania białek mających wpływ na składanie kompleksu
inicjującego transkrypcję
Moduły:
-promotora podstawowego (np. sekwencja TATA i INR)
-konstytutywne: obecne w wielu promotorach dla polimerazy RNA II. Wpływają na
podstawowy poziom inicjacji transkrypcji, nie odpowiadają na sygnały regulatorowe,
tkankowo specyficzne: np. blok CAAT, blok GC
-odpowiedzi występujące regulujące inicjację transkrypcji w odpowiedzi na różnego typu
sygnały z zewnątrz komórki np. moduł odpowiedzi na cAMP (CRE)
-komórkowo specyficzne – występują w promotorach genów, które ulegają ekspresji w
określonej tkance np. moduł specyficzny dla mioblastów rozpoznawany przez MyoD
Wzór ekspresji genów jest definiowany przez kombinację wielu modułów sekwencji
nukleotydowych, wzajemne położenie i ich aktywację
 Promotor u Eukaryota
Promotor podstawowy, minimalny (ang.core promoter):
minimalny region DNA wystarczający do inicjacji transkrypcji na poziomie
podstawowym
 Promotor dla polimerazy II

Źródło: Allison LA. Podstawy Biologii Molekularnej; wyd UW, 2009 str 316
Źródło: Allison LA. Podstawy Biologii Molekularnej; wyd UW, 2009 str 316
1.

2.

3.

Źródło: http://bio100.class.uic.edu/lectures/18_07_enhancer_location -L.jpg

Ryc.3.10 Uproszczone przedstawienie kompleksu
preinicjacyjnego oraz jego powiązanie ze strukturą chromatyny
i transkrypcją genu. Oddzielające (graniczne) elementy są
przedstawione w końcach 5’ i 3’ aktywnego regionu genu. ORF
– otwarta ramka odczytu (open reading frame), TBP – białko Rozdział 3 „Ekspresja genu” tłumaczenie dr .n med. Izabela
wiążące sekwencje TATA (TATA-binding protein), TF – główny Zawlik; Biologia molekularna człowieka Richard J.Epstein;
czynnik transkrypcyjny (general transcription factor), TSS – Wydanie I polskie ;Wydawnictwo Czelej Sp. z o.o.; Lublin
miejsce startu transkrypcji (transcription start site). 2005, str. 86
 Czynniki transkrypcyjne

Białka wiążące się do specyficznych sekwencji DNA

• Podstawowe czynniki transkrypcyjne (GTF; general transcription
factors) – białka potrzebne do inicjacji transkrypcji, nie mają
znaczenia w regulacji transkrypcji. Wspólne dla wielu promotorów,
wiążą się w proksymalnej części promotora
• Specyficzne czynniki transkrypcyjne – aktywatory i represory. Wiążą
się do odpowiednich elementów regulatorowych DNA
• U Eukaryota podstawowy poziom inicjacji transkrypcji jest niski
 Czynniki transkrypcyjne
Charakterystyczne domeny w strukturze
czynników transkrypcyjnych np:

-palec cynkowy,
-suwak leucynowy,
-helisa - skręt-helisa

Żródło: Allison LA. Podstawy Biologii Molekularnej; wyd UW, 2009 str 341
Białka biorące udział w transkrypcji
• Koaktywatory, korepresory – białka zwiększające lub
zmniejszające szybkość transkrypcji, pośredniczą w
przekazywaniu sygnałów od aktywatorów i represorów
• Z reguły nie wiążą się bezpośrednio do DNA, mogą tworzyć
duże kompleksy
• Funkcje:
-wiążą się z czynnikami transkrypcyjnymi i wpływają na ich
aktywność
-mogą brać udział w remodelingu chromatyny (np. modyfikacja
histonów)
-mogą wprowadzać zmiany strukturalne w DNA
 Kompleks mediatora

Kompleks mediatora:
• zbudowany z wielu białek (około 30 u człowieka)
• pośredniczy w przekazaniu sygnałów na kompleks preinicujący
• wymagany do transkrypcji większości genów eukariotycznych
Lieberman, M., & Marks, A. D. (2013). Marks' basic medical biochemistry: a clinical approach. Lippincott Williams & Wilkins. 4th ed. Str. 275
 Inicjacja transkrypcji-Eukaryota
• Udział ogólnych (podstawowych) czynników
transkrypcyjnych (GTF – general transcription factors) w
budowie platformy białkowej
• Czynnik TFIID: zbudowany z wielu białek, w tym białka TBP
(TATA binding protein), wiążącego sekwencję TATA w
promotorze i co najmniej 12 białek oddziałujących z TBP
(białek TAF)
• Promotor jest rozpoznawany bezpośrednio przez TBP
• Kolejne podstawowe czynniki transkrypcyjne: TFIIB, TFIIF,
polimeraza RNA II oraz TFIIE i TFIIH
T. A. Brown: Genomy. Warszawa:
Wydawnictwo Naukowe PWN, 2015, str. 314
Transkrypcja u Eukaryota - etapy
 Inicjacja transkrypcji
• Przyłączenie TFIID do promotora podstawowego, potem innych
ogólnych czynników transkrypcyjnych oraz polimerazy II
• Przyłączenie czynnika TFII H o aktywności helikazy
• Przejście kompleksu promotorowego zamkniętego w kompleks
otwarty
• Fosforylacja domeny C-końcowej największej podjednostki
polimerazy RNA II
• Uwolnienie promotora i synteza RNA przez polimerazę RNA II
• Odłączenie niektórych czynników transkrypcyjnych od promotora
podstawowego
 Inicjacja transkrypcji
• Remodeling chromatyny,
ekspozycja promotora
• Wytworzenie kompleksu
preinicjacyjnego
• Wytworzenie kompleksu
inicjacyjnego
• Aktywacja i uwolnienie polimerazy
RNA II
 Inicjacja transkrypcji

Źródło:

Źródło: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0022283616300468
https://doi.org/10.1016/j.jmb.2016.04.003
 Transkrypcja-elongacja
• Szybkość syntezy RNA na matrycy DNA – ok. 2000
nukleotydów /min
• Udział białkowych czynników elongacyjnych np. elonginy
-przeciwdziałają pauzowaniu polimerazy RNA
-prawdopodobnie modyfikują strukturę chromatyny
umożliwiając elongację
 Transkrypcja-terminacja
• Miejsce zakończenia transkrypcji: charakterystyczne sekwencje
nukleotydowe w pre-mRNA rozpoznawane przez odpowiednie białka
• Przecięcie pre-mRNA na odcinku pomiędzy motywem zachowawczym (u
ssaków) 5’-AAUAAA-3’ (znajdującym się ok. 10-30 nukleotydów przed
miejscem w pre-mRNA, które w wyniku hydrolizy tworzy 3’ koniec) a
sekwencją bogatą w GU
• Udział specyficznych białek: czynnik specyficzności cięcia i poliadenylacji
(CPSF) i czynnik stymulacji cięcia (CstF)
• Terminacja transkrypcji połączona z poliadenylacją -po przecięciu pre-mRNA
–polimeraza poli(A) niezależna od matrycy przyłącza do ok.200-250
nukleotydów zawierających adeninę (tworzy się na końcu 3’ tzw. „ogon
poliA”)
 Transkrypcja-terminacja

Rys. 12.22 Poliadenylacja mRNA eukariotycznego Źródło: T. A. Brown: Genomy. Warszawa:

Wydawnictwo Naukowe PWN, 2015, str.
352
 Dojrzewanie pre-mRNA
• Dodanie „czapeczki” (m7GpppN) na końcu 5’ pre-mRNA (zachodzi po
rozpoczęciu transkrypcji)
• Poliadenylacja na końcu 3’ mRNA („ogon” poliA)
• Składanie eksonów, wycinaniu intronów (splicing)
 “Czapeczka”:
zmetylowana w pozycji N7 reszta guanozyny
połączona z pierwszym nukleotydem cząsteczki
RNA wiązaniem 5’-5 ’ trifosforanowym

Źródło: : T. A. Brown: Genomy. Warszawa:

Wydawnictwo Naukowe PWN, 2015, str. 349
Rys. 12.21 Tworzenie czapeczki na końcu eukariotycznego mRNA
 Dojrzewanie pre-mRNA
• Składanie (splicing) :
wycinanie z pierwotnego transkryptu intronów i łączenie eksonów
• Kompleks składania RNA (ang. spliceosom):
-kompleks RNA i różnych czynników białkowych
-snRNP-małe jądrowe rybonukleoproteiny- zbudowane z snRNA
(U1,U2,U4,U5,U6 ) i białek
• Miejsca cięcia: konserwatywne motywy sekwencji 5’ i 3’ znajdujących się
w miejscach połączenia intron-ekson
• Po wycięciu intronów następuje ligacja eksonów
Rys. 12.26 Sekwencje konserwatywne w intronach kręgowców

Żródło: T. A. Brown: Genomy. Warszawa:

Wydawnictwo Naukowe PWN, 2015, str. 356
 Alternatywne składanie
Powstawanie 2 lub więcej cząsteczek dojrzałego mRNA z jednego pre-mRNA w drodze
łączenia eksonów w różnych kombinacjach

Żródło: T. A. Brown: Genomy. Warszawa:

Wydawnictwo Naukowe PWN, 2015, str. 360
 Losy mRNA

• Przejście dojrzałego mRNA do cytoplazmy

• Translacja
• Degradacja mRNA
 Degradacja mRNA

Różne szlaki degradacji mRNA

Szlak degradacji z usuwaniem czapeczki

zależnym od deadenylacji
• Usuwanie „ogona” poliA - deadenylazy
• Usuwanie czapeczki na końcu 5’
• Hydroliza RNA-egzonukleaza

Źródło:
 Redagowanie RNA
• Redagowanie RNA-potranskrypcyjna modyfikacja mRNA prowadząca do zmiany sensu transkryptu
-modyfikacja chemiczna zasad
-insercje nukleotydów
Udział specyficznych białek i krótkich przewodnich RNA (gRNA) tworzących kompleks edytosomu
-Przykład: Synteza białka apoB w wątrobie i jelicie

Źródło : Lieberman, M., Marks, A. D., & Peet, A. (2013). Marks' basic medical biochemistry. Wolters Kluwer Health/Lippincott Williams & Wilkins,.
Ekspresja genów:
translacja
 Kod genetyczny

• Trójkowy
• Kolinearny
• Jednoznaczny
• Zdegenerowany
• Niezachodzący
• Bezprzecinkowy

Rys. 1.20 Kod genetyczny

Żródło:T. A. Brown: Genomy. Warszawa:

Wydawnictwo Naukowe PWN, 2015, str. 23
 Kod genetyczny

• Czy kod genetyczny jest uniwersalny?

• Przykład: kodon UGA-standardowo STOP, genom mitochondrialny

ssaków: tryptofan
 Translacja
Translacja: synteza łańcucha polipeptydowego na matrycy mRNA
Odczyt sekwencji kodonów (mRNA) w kierunku 5’-3’

• Rybosomy
• mRNA
• Aminokwasy w postaci związanej z tRNA
• Peptydylotransferaza (rybozym)
• Odpowiednie białka: enzymy, czynniki wspomagające inicjację oraz
elongację, czynniki uwalniające konieczne do terminacji translacji
• GTP jako źródło energii
 Żródło:https://micro.magnet.fsu.edu/cells/
ribosomes/ribosomes.html

Rys. 13.10 Elementy składowe rybosomu eukariotycznego i bakteryjnego Żródło : T. A. Brown: Genomy. Warszawa:
Wydawnictwo Naukowe PWN, 2015, str. 394
Koniec 21 10 22
 Alternatywne składanie
Powstawanie 2 lub więcej cząsteczek dojrzałego mRNA z jednego pre-mRNA w drodze
łączenia eksonów w różnych kombinacjach

Żródło: T. A. Brown: Genomy. Warszawa:

Wydawnictwo Naukowe PWN, 2015, str. 360
 Losy mRNA

• Przejście dojrzałego mRNA do cytoplazmy

• Translacja
• Degradacja mRNA
 Degradacja mRNA

Różny okres półtrwania mRNA w komórce

Różne szlaki degradacji mRNA

Szlak degradacji z usuwaniem czapeczki

zależnym od deadenylacji
• Usuwanie „ogona” poliA - deadenylazy
• Usuwanie czapeczki na końcu 5’
• Hydroliza RNA-egzonukleaza

Źródło:
 Redagowanie RNA
• Redagowanie RNA-potranskrypcyjna modyfikacja mRNA
prowadząca do zmiany sensu transkryptu
-modyfikacja chemiczna zasad
-insercje nukleotydów
Udział specyficznych białek i krótkich przewodnich RNA (gRNA)
tworzących kompleks edytosomu
-Przykład: Synteza białka apoB w wątrobie i jelicie
Redagowanie mRNA
Synteza białka apoB w wątrobie i jelicie

Źródło : Lieberman, M., Marks, A. D., & Peet, A. (2013). Marks' basic medical biochemistry. Wolters Kluwer
Health/Lippincott Williams & Wilkins,.
Ekspresja genów:
translacja
Ekspresja genu

DNA
cja
y p
skr
an
Tr

Translacja
mRNA Białko
Ekspresja genu
 Kod genetyczny
• Trójkowy

• Kolinearny

• Jednoznaczny

• Zdegenerowany

• Niezachodzący

• Bezprzecinkowy
Rys. 1.20 Kod genetyczny Żródło:T. A. Brown: Genomy. Warszawa:
Wydawnictwo Naukowe PWN, 2015, str. 23
 Kod genetyczny

• Czy kod genetyczny jest uniwersalny?

• Przykład: kodon UGA-standardowo STOP, genom

mitochondrialny ssaków: tryptofan
 Translacja
Translacja: synteza łańcucha polipeptydowego na matrycy mRNA
Odczyt mRNA w kierunku 5’-3’

• Rybosomy
• mRNA
• Aminokwasy w postaci związanej z tRNA
• Odpowiednie białka: enzymy, czynniki wspomagające inicjację oraz
elongację, czynniki uwalniające
• GTP jako źródło energii
• Peptydylotransferaza (rybozym)
Rys. 13.10 Elementy składowe rybosomu eukariotycznego i bakteryjnego Żródło : T. A. Brown: Genomy. Warszawa:
Wydawnictwo Naukowe PWN, 2015, str. 394
Rybosom

Żródło:https://micro.magnet.fsu.edu/cells/ribosomes/ribosomes.html
tRNA jako cząsteczka adaptorowa

Rys. 13.3 Trójwymiarowa struktura tRNA

Rys. 13.2 tRNA – struktura liścia koniczyny. Strukturę tRNA przedstawiono Żródło: T. A. Brown: Genomy. Warszawa:
konwencjonalnie jako liść koniczyny, oznaczając jej różne elementy Wydawnictwo Naukowe PWN, 2015, str. 387
 tRNA jako cząsteczka adaptorowa

Figure 13.1 Genomes 3 (© Garland Science 2007)

Źródło: T. A. Brown: Genomy. Warszawa:

Wydawnictwo Naukowe PWN, 2015, str. 386
 tRNA
• Powstanie aminoacylo-tRNA
• Udział syntetaz tRNA
• 2 klasy syntetaz:
przyłączają aminokwas do grupy 2’ OH (klasa I ) lub grupy
3’OH (klasa II) końcowego nukleotydu w tRNA
• Syntetazy posiadają właściwości korekcyjne
• Źródło energii: ATP
Wiązanie estrowe

Żródło: T. A. Brown: Genomy. Warszawa:

Rys. 13.4 Aminoacylacja tRNA Wydawnictwo Naukowe PWN, 2015, str. 388
 Zasada tolerancji Cricka

Rys. 13.6 Oddziaływanie między kodonem i antykodonem

Żródło: T. A. Brown: Genomy. Warszawa:
Wydawnictwo Naukowe PWN, 2015, str. 390
Żródło :http://www.biomers.net/en/products/DNA/Sequence_Modifications.html

• Dany rodzaj tRNA może połączyć się z więcej niż jednym kodonem
• Dwie pierwsze zasady w kodonie i antykodonie tworzą pary
komplementarne
• Trzeci nukleotyd w kodonie może tworzyć pary nietypowe z
pierwszym nukleotydem antykodonu