BIOLOGIA MOLEKULARNA – seminarium

LISTA 4
Replikacja, rekombinacja i naprawa DNA
4.1. Które z poniższych zdań na temat polimeraz DNA DNA-zależnych są poprawne?
a. Dołączają deoksyrybonukleotyd do grupy 3’-OH startera.
b. Używają nici matrycowej aby pomóc wybrać jednostkę deoksyrybonukleotydową, którą należy dodać do rosnącego
łańcucha DNA.
c. Zawierają nukleazę 3’ → 5’, która rozszczepia wiązania fosfodiestrowe błędnie wbudowanych
dezoksyrybonukleotydów.
d. Sprawdzają wielkość przybywającego trifosforanu deoksyrybonukleotydu (dNTP), aby upewnić się, że dokonano
właściwego, uzupełniającego wyboru.
e. Wiążą jeden komplementarny dNTP i dodają drugi komplementarny dNTP, aby zainicjować nowy łańcuch DNA.

4.2. Którą z poniższych funkcji w reakcji katalizowanej przez polimerazy DNA pełni Mg 2+?
a. stabilizują pentakoordynacyjny stan przejściowy tworzenia wiązania fosfodiestrowego,
b. wytrącają nieorganiczny fosforan (Pi) powstający w wyniku reakcji,
c. oddziałują z 3'-OH przychodzącego dNTP,
d. tworzą mostek między 3'-OH startera i fosforanem w dNTP,
e. stabilizują ładunek ujemny na odchodzącym pirofosforanie, który pochodzi z przychodzącego dNTP.

4.3. Dopasuj właściwości lub funkcje w prawej kolumnie do polimerazy DNA w lewej kolumnie.
a. polimeraza DNA I DNA-zależna 1, 2, 3, 5 (1) zaangażowana w replikację
b. polimeraza DNA III DNA-zalezna 1, 2, 4 (2) wymaga startera i matrycy
(3) zaangażowana w naprawę DNA
(4) tworzy większość wiązań fosfodiestrowych DNA
podczas replikacji
(5) usuwa starter i uzupełnia luki podczas replikacji

4.4. Otrzymasz długą, jednoniciową cząsteczkę DNA o składzie zasad C = 24,1%, G = 18,5%, T = 24,6% i A = 32,8%;
polimerazę DNA; [α-32P]dATP (dATP z najbardziej wewnętrznym znakowanym fosforanem), dCTP, dGTP i dTTP; krótki
starter, który jest komplementarny do jednoniciowego DNA; oraz roztwór buforowy z Mg 2+. Jaki jest skład zasad produktu
znakowanego radioaktywnie DNA po zakończeniu jednej rundy syntezy?
Po zakończeniu jednej rundy syntezy nić matrycy będzie kierować polimeryzacją dopełniacza, w którym C = 18,5%, G =
24,1%, T = 32,8% i A = 24,6%. Ponieważ starter jest krótki w stosunku do matrycy, jego udział w składzie nici produktu
można pominąć.

4.5. Genom bakteriofaga G4 to małe, jednoniciowe koło DNA. Replikacja okręgu jest inicjowana, gdy polimeraza RNA, produkt
genu dnaG E. coli, syntetyzuje mały segment RNA, który wiąże się z unikalną sekwencją na chromosomie G4. Inicjacja
syntezy DNA G4 nie występuje w bakteryjnych mutantach genu dnaG, które mają nieaktywną polimerazę RNA. Zaproponuj
funkcję dla małego segmentu RNA.
Mała cząsteczka RNA służy jako starter do inicjacji syntezy DNA przez polimerazę DNA. Synteza polimerazy DNA
łańcucha DNA wymaga startera nukleotydowego z końcem 3'-OH wraz z matrycą. Badania pokazują, że jako starter może
służyć albo oligodeoksyrybonukleotyd, albo oligorybonukleotyd. Polimeraza DNA nie może syntetyzować sekwencji startera
na zamkniętym kole DNA, ale polimeraza RNA wytwarzana przez gen dnaG może syntetyzować krótką sekwencję startera,
która jest następnie wydłużana jako DNA przez polimerazę DNA. Gdy replikacja rozszerzyła się wokół okręgu i osiągnięty
został koniec 5' startera RNA, starter jest hydrolizowany i małą przerwę wypełnia się sekwencją DNA. Bakteryjne mutanty
dnaG nie mogą wspierać infekcji G4, ponieważ nie mogą syntetyzować startera RNA.

4.6. Które z poniższych twierdzeń na temat topoizomeraz są poprawne?

a. Zmieniają liczbę okleceń topoizomerów.
b. Zrywają i ponownie tworzą wiązania fosfodiestrowe.
c. Wymagają NAD+ jako kofaktora dostarczającego energię do napędzania konwersji superskręconej cząsteczki do jej
zrelaksowanej postaci.
 d. Tworzą kowalencyjne związki pośrednie ze swoimi substratami DNA.
e. Mogą, w przypadku określonego typu topoizomerazy, użyć ATP do utworzenia ujemnie zwiniętego DNA ze
zrelaksowanego DNA w E. coli.

Chociaż wszystkie topoizomerazy rozrywają i ponownie zamykają wiązania fosfodiestrowe, zewnętrzne źródło energii
nie zawsze jest wymagane. Łagodzenie stresu skręcającego w ujemnie skręconej cząsteczce DNA poprzez rozluźnienie
jej za pomocą topoizomerazy I jest egzergiczne i nie wymaga wkładu energii, podczas gdy wprowadzanie ujemnych
skręceń z gyrazą DNA jest ergoniczne i musi być sprzężone z hydrolizą ATP. Poszczególne mechanizmy katalityczne
danych topoizomeraz decydują o ich sprzężeniu z hydrolizą ATP.

4.7. Które z poniższych stwierdzeń dotyczących cząsteczek DNA będących topoizomerami są poprawne?
a. Są związane z topoizomerazami.
b. Różnią się od siebie topologicznie tylko tym, że mają różne liczby okleceń (L k).
c. Mogą być oddzielone od siebie metodą elektroforezy.
d. Mają identyczne masy cząsteczkowe.
e. Są to izomery topologiczne lub przestrzenne.

Odpowiedź (a) nie jest prawidłowa, ponieważ topoizomer DNA niekoniecznie musi być związany przez topoizomerazę.

4.8. Na które z poniższych elementów mogą mieć wpływ cechy topologiczne kołowego DNA?
a. ruchliwość elektroforetyczna DNA
b. właściwości sedymentacyjne DNA
c. jego powinowactwo do białek wiążących się z DNA
d. podatność nici DNA na rozwijanie
e. podatność DNA na działanie ligazy DNA.

Jeśli chodzi o odpowiedź (e), superzwijanie jest zwykle właściwością kowalencyjnie zamkniętego kolistego DNA - to
znaczy DNA, w którym nie ma nieciągłości w żadnej nici helisy. Dlatego te cząsteczki nie są substratami dla ligazy
DNA, ponieważ nie mają końców.

4.9. Załóżmy, że ujemnie superskręcony DNA z Lk =23 , T w =25 i W r =−2 jest poddawany działaniu topoizomerazy I. Jakie
byłyby przybliżone wartości Lk , T w i W r po jednym cyklu katalitycznym?
Lk =24 , T w =25 i W r =−1. Topoizomeraza I zwiększa liczbę połączeń DNA o 1 w każdym cyklu katalitycznym. Ten
wzrost następuje kosztem odwinięcia ujemnej supercewki.

4.10. Dlaczego antybiotyki nowobiocyna, cyprofloksyna i kwas nalidyksowy, które hamują gyrazę DNA, są przydatne w
leczeniu infekcji bakteryjnych u ludzi?
Związki te zakłócają podstawową funkcję gyrazy DNA destabilizującą helisę w replikacji DNA bakterii. Hamując jego
działanie, zapobiegają uwalnianiu przez gyrazę dodatnich supercewek, które gromadzą się przed poruszającym się widelcem
replikacyjnym. Ludzkim komórkom brakuje enzymu podobnego do gyrazy, a zatem są one stosunkowo nienaruszone przez te
antybiotyki.

4.11. Które z poniższych stwierdzeń dotyczących ligazy DNA są poprawne?

a. Tworzy wiązanie fosfodiestrowe między 5'-OH i 3'-fosforanem w dupleksowym DNA.
b. Wymaga kofaktora, NAD+ (bakterie) lub ATP (bakteriofagi, eukarioty), w zależności od źródła enzymu, w celu
dostarczenia energii do utworzenia wiązania fosfodiestrowego.
c. Katalizuje reakcję przez mechanizm, który obejmuje tworzenie kowalencyjnie połączonego enzymu adenylanu.
d. Katalizuje reakcję poprzez mechanizm, który obejmuje aktywację gr. fosforanowej DNA poprzez tworzenie
wiązania fosfobezwodnikowego z AMP.
e. Bierze udział w replikacji, naprawie i rekombinacji DNA.
f.

Odpowiedź (a) jest nieprawidłowa, ponieważ enzym łączy 3'-OH z 5'-fosforanem. Odpowiedź (d) jest prawidłowa;
chociaż nie jest to całkowicie opisane w tekście, aktywność ligazy DNA jest wymagana do uszczelnienia nieciągłości w
DNA powstających podczas replikacji, naprawy i rekombinacji DNA.
4.12. Załóżmy, że dwa łańcuchy polinukleotydowe są połączone ligazą DNA w mieszaninie reakcyjnej, do której jako źródło
energii dodano ATP znakowany 32P w grupie α-fosforanowej (najbardziej wewnętrznej). Na jakich produktach reakcji można
by się spodziewać, że będą nosiły radioaktywną etykietę? Wyjaśniać.
W całej reakcji ATP jest hydrolizowany do AMP i pirofosforanu. Tylko AMP zostanie oznaczony. Fosforan biorący udział w
tworzeniu wiązania fosfodiestrowego jest dostarczany przez łańcuch polinukleotydowy i nie powstaje z ATP.

4.13. Które z poniższych stwierdzeń na temat replikacji DNA w E. coli są poprawne?

a. Ma miejsce na widełkach replikacyjnych.
b. Rozpoczyna się w unikalnym locus na chromosomie.
c. Przebiega z jednym widelcem replikacyjnym na cząsteczkę replikującą.
d. Jest dwukierunkowa.
e. Polega na nieciągłej syntezie na wiodącej nici.
f. Przejściowo wykorzystuje RNA jako matrycę.

Chociaż nie jest to wyraźnie określone w tekście, odpowiedź (c) jest nieprawidłowa, ponieważ replikujący się
chromosom E. coli ma dwa widełki replikacyjne, które syntetyzują DNA dwukierunkowo z unikalnego pochodzenia
oriC. Odpowiedź (e) jest nieprawidłowa, ponieważ tylko nić opóźniona jest syntetyzowana w sposób nieciągły.
Odpowiedź (f) jest nieprawidłowa, ponieważ RNA służy jako starter, a nie jako matryca.

4.14. Załóżmy, że plazmid z pojedynczym początkiem

replikacji na swoim kolistym chromosomie i zawierający
tylko geny A, B, C i D zaczyna szybko replikować w
czasie t=0. W t=1 jest dwa razy więcej kopii genów B i
C niż kopii genów D i A. Czy można ustalić kolejność
czterech genów na plazmidzie? Wyjaśniać.
nie można jednoznacznie ustalić kolejności

4.15. Dopasuj funkcje lub cechy związane z replikacją DNA w E. coli wymienione w prawej kolumnie z cząsteczkami lub
strukturami w lewej kolumnie.
a. widełki replikacyjne 7 1. kierunek syntezy jest przeciwny do ruchu widełek
b. oriC 7, 9, 11 replikacyjnych
c. nić opóźniona 1, 5 2. rozwija nici na początku replikacji w połączeniu z białkami
d. nić wiodąca 3 dnaA i dnaC
e. fragment Okazaki 1, 3 3. jest syntetyzowany w sposób ciągły
f. helikaza dnaB 2 4. syntetyzuje większość DNA
g. single-strand binding protein (SSB) 16 5. jest syntetyzowany w sposób nieciągły
h. gyraza DNA 6, 8 6. usuwanie pozytywnych superskrętów
i. prymaza 14 7. miejsce, w którym rozwija się DNA
j. holoenzym polimerazy DNA III 4 8. hydrolizuje ATP w celu zmniejszenia liczby okleceń DNA
k. podjednostka ε polimerazy DNA III 15 9. wiąże białka dnaA, dnaB i dnaC
l. polimeraza DNA I 1, 10, 13 10. wypełnia luki, w których było RNA
m. ligaza DNA 12, 17 11. jest punktem inicjacji syntezy
12. łączy fragmenty nici opóźnionej
13. zawiera 5’→3’ egzonukleazę, która usuwa starter RNA
14. jest polimerazą RNA
15. dokonuje „korekty” większości zsyntetyzowanego DNA
16. stabilizuje rozkręcone DNA
17. używa NAD+ do tworzenia wiązań fosfodiestrowych

4.16. Załóżmy, że stwierdzono, że mutant bakteryjny replikuje swoje DNA z bardzo małą szybkością. Po analizie stwierdzono,
że ma normalny poziom aktywności polimeraz DNA I i III, gyrazy DNA i ligazy DNA. Wytwarza również normalne ilości
dzikich typów białek dnaA, dnaB, dnaC i SSB. Stwierdzono, że sekwencja regionu oriC jego chromosomu jest typu dzikiego.
Jaki defekt może odpowiadać za nienormalnie niski wskaźnik replikacji DNA u tego mutanta. Wyjaśniać.
 Spadek aktywności prymazy odpowiadałby za niski wskaźnik replikacji DNA. Sama synteza DNA wymaga wcześniejszej
syntezy starterów RNA. Również zmniejszone szybkości syntezy dNTP mogą spowolnić replikację.

4.17. Która z eukariotycznych polimeraz DNA jest najprawdopodobniej odpowiedzialna za poniższe aktywności:
a. syntetyzowanie nici wiodącej
polimeraza δ
b. naprawa DNA
polimeraza β
c. syntetyzowanie mitochondrialnego DNA
polimeraza γ
d. inicjacja replikacji DNA
polimeraza α

4.18. Powielanie końców liniowego, dupleksowego DNA stanowi problem dla maszynerii replikacyjnej ludzkiej komórki. Co
powoduje problem i jak komórka go rozwiązuje?
Chodzi o telomery, nie chce mi się przepisywać tego – stryer str. 891-2

4.19. Dopasuj typowy typ mutacji o konsekwencjach fizjologicznych w prawej kolumnie z odpowiednim mutagenem lub
procesem mutagennym w lewej kolumnie.
a. środki alkilujące (aktywowana aflatoksyna B1) 5 1. międzyniciowe połączenia
b. środki deaminujące 4 2. wewnątrzniciowe połączenia
c. światło ultrafioletowe 2, 5 3. pęknięcia jednoniciowe i dwuniciowe
d. psoraleny 1, 2, 5 4. źle sparowane pary zasad
e. promienie rentgenowskie 3, 5 5. blokada replikacji i transkrypcji
f. utleniacze (rodniki hydroksylowe) 4

4.20. Biorąc pod uwagę, że zasada T wymaga więcej energii do zsyntetyzowania niż U, a A paruje się równie dobrze z U lub
T, dlaczego DNA prawdopodobnie zawiera pary zasad A-T zamiast par zasad A-U?
C spontanicznie deaminuje, tworząc U w DNA. Ta zmiana doprowadziłaby do mutacji podczas następnej rundy replikacji
DNA, ponieważ U parowałby z A, zmieniając to, co było parą zasad C-G w parę zasad U-A. Maszyneria naprawcza komórki,
która normalnie używa U w swoim DNA, nie byłaby w stanie odróżnić U w parze zasad A–U powstającej od deaminacji C
od pary utworzonej podczas „normalnej” replikacji. Grupa metylowa na T, która jest prawie powszechnie stosowana w DNA,
odróżnia go od uracylów utworzonych przez deaminację, dzięki czemu uracyle mogą być naprawiane.

4.21. Eukariotyczny DNA może być silnie zmetylowany w pozycji C5 cytozyny. Stopień metylacji jest odwrotnie skorelowany
z ekspresją genów. Chociaż dokładna rola metylacji C5 w ekspresji genów nie jest znana, wiadomo, że te cytozyny z
metylacją C5 mogą powodować mutacje. Jak?
Cytozyna C-5 może samoistnie dezaminować, podobnie jak cytozyna. Gdy cytozyna C-5 ulega dezaminacji, tworzy
tymidynę, a nie uracyl. Dlatego N-glikozylaza uracylowa, enzym naprawczy DNA, nie rozpozna tego produktu deaminacji
jako niewłaściwej zasady i nie usunie go z DNA, powodując mutację przejściową.
4.22. Który z poniższych enzymów lub procesów może być zaangażowany w naprawę DNA w E. coli uszkodzonego przez
tworzenie dimeru tyminy pod wpływem promieniowania UV?
a. Ligaza DNA uszczelnia nowo zsyntetyzowaną nić z nieuszkodzonym DNA, tworząc nienaruszoną cząsteczkę. 4
b. Enzym UvrABC (ekscynukleaza) hydrolizuje wiązania fosfodiestrowe po obu stronach dimeru tyminy. 2
c. Polimeraza DNA I wypełnia lukę utworzoną przez usunięcie oligonukleotydu niosącego dimer tyminy. 3
d. Enzym UvrABC rozpoznaje zniekształcenie helisy DNA spowodowane przez dimer tyminy. 1
e. Fotoreaktywujący enzym absorbuje światło i rozszczepia dimer tyminy, aby ponownie utworzyć dwie sąsiednie
reszty tyminy. – fotoliaza

Białko uvrD jest helikazą, która usuwa 12-nukleotydowy oligonukleotyd niosący dimer tyminy.

4.23. Lek fluorouracyl jest stosowany jako środek przeciwnowotworowy. Nieodwracalnie inaktywuje enzym syntazę
tymidylanową. Wyjaśnij, jak to leczenie opóźnia wzrost tkanki nowotworowej. Czy wpłynie to również na wzrost
normalnych komórek?
Ponieważ syntaza tymidylanowa jest inaktywowana, podaż dTTP jest niewystarczająca do wsparcia syntezy DNA z normalną
szybkością. Jeśli synteza DNA zostanie stłumiona, zmniejszy się również tempo podziału komórek nowotworowych. Ten
rodzaj leczenia wykorzystuje fakt, że komórki nowotworowe dzielą się szybciej niż normalne komórki. Dawkowanie leku jest
dostosowywane tak, aby wpływało przede wszystkim na szybciej dzielące się komórki. Jednak podział niektórych normalnie
szybko dzielących się komórek, na przykład tych wyścielających przewód pokarmowy i komórek krwiotwórczych, może być
również opóźniony.

4.24. Acyklowir jest środkiem przeciwwirusowym stosowanym w celu zmniejszenia bólu i wspomagania gojenia zmian
skórnych wynikających z ospy wietrznej dorosłych. Jego strukturę przedstawiono na rysunku 4.1.
 a. Jaki nukleozyd przypomina ten lek?
guanozyna
b. Dlaczego lek musi być podawany w formie defosforylowanej?
bo jego forma ufosforylowana nie przechodzi przez błonę komórkową, bo ma ładunek ujemny
c. Acyklowir ma bardzo niewiele skutków ubocznych, ponieważ hamuje replikację DNA tylko w komórkach
zakażonych opryszczką. Dzieje się tak, ponieważ wszystkie wirusy opryszczki kodują gen kinazy tymidynowej,
który jest w stanie aktywować lek. Co to za reakcja aktywująca?
fosforylacja
Aktywacja obejmuje dodanie fosforanów do dystalnej grupy -OH kosztem hydrolizy ATP przez kinazy w celu
wytworzenia związku przypominającego 5'-GTP.
d. Kiedy acyklowir jest aktywowany, w jaki sposób hamuje replikację DNA?
Trifosforan acyklowiru będzie służył jako substrat dla polimerazy DNA, a reszty nukleotydowe acyklowiru zostaną
włączone do rosnących łańcuchów polinukleotydowych w miejsce reszt guanozyny. Acyklowir spowoduje jednak
przedwczesne zakończenie powstających łańcuchów polinukleotydowych, ponieważ nie ma wolnej grupy 3’-OH, z
którą kolejne nukleotydy mogą być połączone wiązaniami fosfodiestrowymi.

Acyklowir wprowadzany jest do komórek przez białko transportujące nukleozydy, w tym deoksyguanozynę. W zakażonej
komórce wirusowa kinaza tymidynowa przeprowadza początkowy etap fosforylacji acyklowiru do monofosforanu (acyklo-GMP),
a następnie monofosforan acyklowiru (acyklo-GMP) jest przekształcany w trifosforan acyklowiru (acyklo-GTP) przez enzymy
komórkowe. Trójfosforan acyklowiru (ACVTP) hamuje syntezę DNA, gdyż pozbawiony jest grupy 3’-OH. Gdy polimeraza
wirusowa wprowadzi zmodyfikowany nukleozyd do łańcucha DNA dalsze jego wydłużanie staje się niemożliwe.

e. Dlaczego acyklowir nie wpływa na komórki niezakażone wirusem?

ponieważ nie posiadają one wirusowej kinazy, która przeprowadza pierwszy etap aktywacji leku
f. Wirus opryszczki może stać się niewrażliwy na terapię acyklowirem przez mutacje w jednym z dwóch genów. Czym
mogą być?
Mutacje, które osłabiają zdolność wirusowej kinazy tymidynowej lub polimerazy DNA do wykorzystania analogu,
uczynią zakażone komórki niewrażliwymi na czynnik.

NOTATKI

Lk – liczba okleceń, mówi nam ile razy nić DNA oplata prawoskrętnie drugą nić DNA
Cząsteczki DNA różniące się Lk nazywamy topoizomerami – izomery topologiczne. Zmiana topologicznych właściwości DNA
jest możliwa jedynie przez rozcięcie jednej lub obu nici i ponowne ich połączenie.

Tw – liczba skrętów, mówi nam ile razy nić oplata się wokół osi dupleksu DNA

Wr – liczba zwojów, liczba zwrotów, które oś dupleksu wykonuje wokół osi superhelisy, mówi ile razy oś helisy DNA oplata się
prawoskrętnie samą siebie

Lk =T w +W r
Do zmiany konformacji cząsteczki DNA wystarczy jej rozplecenie i ponowne zaplecenie do nowej postaci bez przecinania
którejkolwiek z nici DNA, podczas gdy do zmiany jej topologii konieczne jest rozcięcie przynajmniej jednej z nici.

Novobiocin blocks the binding of ATP to gyrase. Nalidixic acid and ciprofloxacin, in contrast, interfere with the breakage and
rejoining of DNA chains. These two gyrase inhibitors are widely used to treat urinary tract and other infections including those
due to Bacillus anthracis (anthrax). Camptothecin, an antitumor agent, inhibits human topoisomerase I by stabilizing the form of
the enzyme covalently linked to DNA.

Białka biorące udział w replikacji u E. coli

Mutacje DNA