cz.

I Podstawowe molekularne metody w biologii molekularneje

Izolacje kwasów nukleinowych

- w jakich badaniach wykorzystany jest DNA/RNA

Do czego wykorzystywany jest DNA?
•Identyfikacja i analiza sekwencji genów lub pozagenowych rejonów w DNA
•Identyfikacja osobników, odmian, gatunków -na podstawie różnic w DNA
•Oszacowanie zmienności genetycznej między osobnikami, w populacji itp.
•Klonowanie fragmentów DNA

Do czego wykorzystywany jest RNA?

•Które geny są transkrybowane (ulegają ekspresji)
•Kiedy/gdzie w organizmie badane geny są transkrybowane?
•Jaki jest poziom transkrypcji badanych genów?

- metody izolacji DNA/RNA (stosowany podział metod izolacji), od czego może zależeć wybór metody
izolacji
Metody ekstrakcji totalnego DNA/RNA powinny zapewnić otrzymanie dużej ilości
wysokocząsteczkowego DNA lub RNA
Metody ekstrakcji mają na celu uzyskanie totalnego DNA/RNA:
1. z maksymalną wydajnością –duża ilość
2. dobrze oczyszczonego (z białek, lipidów, cukrów) –dobra czystość
3. niezdegradowanego (inaczej wysokocząsteczkowego, długie fragmenty) –dobra jakość

PODZIAŁ METOD IZOLACJI DNA/RNA na grupy

1.METODY ORGANICZNE(zastosowanie do usuwania białek mieszanin zw. organicznych: fenol,
chloroform, alkohol izoamylowy)
2. METODY NIEORGANICZNE (SOLNA)(usuwanie białek przez precypitację z użyciem NaCl)
3. METODY MAGNETYCZNE (zastosowanie kulek magnetycznych wiążących DNA)
4. METODY KOLUMIENKOWE (wiązanie DNA na kolumnach z złożem krzemionkowym, z użyciem
wysokiego stężenia soli chaotropowych)
Wybór metody izolacji DNA zależy od m.in.:
• rodzaju organizmu (gatunek)
• rodzaju tkanki badanej
• jakości zebranego materiału
• sposobu utrwalenia zebranego materiału przed izolacją
• pożądanej ilości DNA
• pożądanej czystości i jakości DNA
• przeznaczenia DNA

Metody izolacji RNA

-Izolacja totalnego RNA
•metodą Chomczyńskiego
•na kolumienkach celulozowych
-Izolacja mRNA -> na kulkach paramagnetycznych
- główne etapy w metodach izolacji DNA

1. Rozdzielenie komórek, rozbicie/strawienie ścian kom.

• homogenizacja mechaniczna
• homogenizacja w ciekłym azocie
• trawienie chitynazą
• trawienie proteinazą K
2. Liza komórek
• detergent w buforze zasadowym
3a. Oddzielenie DNA i usunięcie białek, lipidów, cukrów
• ekstrakcja organiczna (fenol/chloroform) + strącanie DNA alkoholem
• wysalanie białek + strącanie DNA alkoholem
• wiązanie DNA na kolumnach wypełnionych krzemionką
• wiązanie DNA do kulek magnetycznych
3b. Oczyszczenie DNA z zanieczyszczeń
• przepłukiwanie DNA za pomocą buforów płuczących
4. Traktowanie roztworu z DNA za pomocą RNAzy (nie zawsze)
5. Przechowywanie DNA
• DNA zawieszony w lekko zasadowym buforze z dodatkiem EDTA (wychwytuje jony Mg2+) i
przechowuje w +4 lub -20°C

- przygotowanie materiału roślinnego do izolacji DNA/RNA

Przygotowanie materiału roślinnego do ekstrakcji DNA -bardziej skomplikowane niż zwierzęcego

1. Wzrost roślin
2. Zbiór tkanki z roślin (liście, młode siewki, korzenie)
3. Zabezpieczenie tkanki do izolacji
->Świeżo zebrana tkanka
->Tkanka zabezpieczona i przechowywana:
-zamrożona w ciekłym azocie i przechowywanie w -80 C,
-wysuszona w żelu krzemionkowym,
-liofilizowana

RNA
1. Wzrost roślin
2. Zbiór tkanki z roślin (liście, młode siewki, korzenie)
3. Materiał do izolacji RNA
->Świeżo zebrana tkanka
->Tkanka zabezpieczona i przechowywana:
-zamrożona w ciekłym azocie i przechowywanie w -80 C,
4. Homogenizacja tkanki (w ciekłym azocie/ w buforze do lizy)
- środki/ czynności służące do ochrony przed RNAzami (przed, w czasie i po izolacji)
Przed izolacją RNA/w trakcie izolacji RNA:
W laboratorium:
•wyprażanie moździerzy i szkła używanego do pracy z RNA
•używanie wolnych od RNaz końcówek do pipet i probówek
•używanie komercyjnych roztworów do usuwania RNaz ze stołów, pipet, statywów, wirówek itp.
•traktowanie wody i roztworów wodnych używanych w pracy z RNA za pomocą DEPC
(dietylopirowęglanu, ang. diethylpyrocarbonate)
•częste zmiany rękawiczek podczas pracy
Materiał do izolacji RNA:
•izolacja RNA natychmiast po zebraniu/pobraniu próbek lub
•natychmiastowe zabezpieczenie zebranych próbek poprzez ich zamrożenie w ciekłym azocie i
przechowywanie w -80oC
Po izolacji RNA:
•przechowywanie RNA w -80oC, jak najrzadsze rozmrażanie
•synteza cDNA na matrycy RNA

- ocena jakości i czystości oraz stopnia zdegradowania DNA/RNA (metody oceny, zakresy norm, kiedy
DNA/RNA spełniają normy)
DNA
-metoda spektrofotometryczna
1. Ilość DNA (koncentracja) :
Pomiar absorbancji przy długości fali 260 nm
2. Jakość DNA (czystość) :
Pomiary absorbancji przy długości fali 260 nm, 280 nm, 230 nm
DNA dobrej jakości:
proporcja A260/A280: 1.8 –2.0
proporcja A260/A230 : > 2.0 (najlepiej ok. 2.2)
Pomiary można wykonać nawet w objętości 1 ul próbki (w zakresie stężeń próbki 3 –3000 ng/ul)
- metoda elektroforetyczna (jakość)
3. Ocena stopnia zdegradowania DNA - elektroforeza agarozowa

RNA
- metoda spektrofotometryczna
1. Ilość RNA (koncentracja):
Pomiar absorbancji przy długości fali 260 nm
2. Jakość RNA (czystość) :
Pomiary absorbancji przy długości fali 260 nm, 280 nm, 230 nm
RNA dobrej jakości:
proporcja A260/A280: 1.8 –2.0
proporcja A260/A230 : ok. 2.2
Pomiary można wykonać nawet w objętości 1 ul próbki
Ocena integralności (jakości) RNA– elektroforeza w żelu agarozowowym

3. Ocena stopnia zdegradowania RNA -elektroforeza agarozowa

Niezdegradowany RNA, dobrej jakości:
-w żelu wyraźnie widoczne dwa prążki, odpowiadające frakcjom rRNA (rybosomalnegoRNA)
-pozostałe cząsteczki RNA tworzą lekko widoczną smugę)

Enzymy restrykcyjne

- co to są endonukleazy restrykcyjne i ich podział na klasy

ENZYMY, które:
•rozpoznają w DNA specyficzne, kilkunukleotydowe sekwencje
•wiążą się z DNA w tych specyficznych miejscach, które rozpoznają
•przecinają DNA wewnątrz lub w pobliżu miejsc, które rozpoznają w bardzo charakterystyczny
sposób
Typ I –rozpoznające specyficzne sekwencje w DNA, ale tną DNA w przypadkowych miejscach z dala
od miejsca rozpoznawanego.
Typ II -rozpoznające specyficzne sekwencje w DNA i tną DNA w specyficzny, charakterystyczny,
powtarzalny sposób w obrębie tych sekwencji. ->Najszerzej stosowane w biologii molekularnej
Typ III -rozpoznające specyficzne sekwencje w DNA, ale tną DNA w miejscach od nich oddalonych o
20 do 25 nukleotydów

- charakterystyka enzymów klasy II (rozpoznawane miejsca cięcia- tzw. miejsca restrykcyjne, sposób
cięcia, od czego zależy częstotliwość cięcia)
Każda endonukleaza restrykcyjna typu II:
•rozpoznaje w DNA specyficzną, kilkunukleotydową sekwencję czyli tzw. miejsce restrykcyjne
(będąca sekwencją palindromową)
•wiąże się z DNA specyficznie w każdym miejscu, które rozpoznaje
•przecina DNA specyficznie wewnątrz każdej sekwencji nukleotydowej, którą rozpoznaje
•efekt przecięcia DNA to fragmenty zakończone charakterystycznymi „lepkimi” lub „tępymi”
końcami (w zależności od enzymu)
•cięcie jest powtarzalne w 100%
->częstość zależy od długości sekwencji nukleotydowej, którą rozpoznaje dany enzym-> im większa
długość sekwencji tym rzadziej. Więcej miejsc mają enzymy rozpoznające krótsze fragmenty.

- występowanie i rola endonukleaz restrykcyjnych in vivo

Endonukleazy występują naturalnie w komórkach bakterii.
in vivo, w k. bakteryjnej służą do cięcia obcego DNA (np.: genomu wirusa), wprowadzonego do
komórki, poprzez jego pocięcie na drobne fragmenty, zapobiegają w ten sposób replikacji genomu
wirusa czyli powodują ograniczenie/restrykcję replikacji genomu wirusa

- wykorzystanie enzymów restrykcyjnych klasy II in vitro, przykłady zastosowań,

Celem stosowania cięcia za pomocą ENZYMÓW RESTRYKCYJNYCH TYPU II jest powtarzalne,
precyzyjne i stabilne przecięcie DNA i powstanie fragmentów restrykcyjnych o ściśle określonych
końcach.
WYKORZYSTANIE -przykłady
•w konstruowaniu map restrykcyjnych
•do przycięcia końców insertu DNA przed jego wbudowaniem do wektora oraz do przecięcia
wektora (w klonowaniu)
•do cięcia DNA przed hybrydyzacją typu Southern
•przy tworzeniu sond molekularnych do hybrydyzacji typu Southern
•jako etap w niektórych technikach markerów DNA

- co to są mapy restrykcyjne
Tworzenie map restrykcyjnych polega na ustalaniu w cząsteczce DNA (lub fragmencie DNA) pozycji
miejsc restrykcyjnych dla różnych enzymów restrykcyjnych.
Metoda jest stosowana tylko dla małych cząsteczek DNA, mniejszych niż 50kb (czyli 50000 bp).
Tworzone są dla:
•genomów wirusowych, organelli komórkowych,
•sklonowanego fragmentu DNA bakteryjnego lub organizmu wyższego
•wektora plazmidowego
Hybrydyzacja typu: Southern, Northern, Western

hybrydyzacja kwasów nukleinowych -Zdolność spontanicznego łączenie się (parowania)

KOMPLEMENTARNYCH do siebie, jednoniciowych nici kwasów nukleinowych (DNA z DNA lub RNA z
RNA lub DNA z RNA)
Komplementarne nici kwasów nukleinowych ulegają rozdzieleniu (denaturacji) pod wpływem
wysokiej temperatury lub substancji chemicznych. Po usunięciu czynnika denaturującego, nici łączą
się ponownie (renaturacja) na zasadzie komplementacji.
Blotting - procedura przenoszenia kwasów nukleinowych lub białek z żelu na membranę (po
rozdziale ich cząsteczek podczas elektroforezy)

- definicja każdego typu hybrydyzacji i cechy/elementy charakterystyczne,

Southern blotting –przeniesienie DNA na membranę
Northern blotting –przeniesienie RNA na membranę
Western blotting –przeniesienie białek na membranę

Southern blotting
- wykrywanie określonego fragmentu DNA wśród fragmentów uzyskanych po cięciu genomowego
DNA enzymem restrykcyjnym, poprzez hybrydyzację do tego fragmentu komplementarnej sondy
•Hybrydyzacja przeprowadzana jest po rozdziale fragmentów DNA (uzyskanych po resktrykcji) w żelu
agarozowym i ich przeniesieniu na membranę (po blottingu)
•Metoda wykorzystuje zdolność jednoniciowego DNA do hybrydyzacji z sekwencją DNA do niego
komplementarną
• Nazwa techniki od nazwiska twórcy-Edwarda Southerna

Northern blotting
-wykrywanie cząsteczki mRNA jakiegoś genu wśród wszystkich cząsteczek RNA wyizolowanych z
określonego materiału

Western blotting
•Wykrywanie określonego białka wśród innych białek, po ich izolacji i rozdziale w żelu
poliakryloamidowym
•Białka wykrywa się z użyciem specyficznych przeciwciał

- przebieg wszystkich 3 typów hybrydyzacji

Hybrydyzacja typu Southern

1.Izolacja totalnego DNA

2.Cięcie DNA za pomocą enzymu restrykcyjnego (najczęściej rozpoznającego 6 nukleotydowe miejsce

restrykcyjne)

3.Elektroforeza agarozowa pofragmentowanego DNA

4.Blotting dwuniciowych fragmentów DNA na membranę nylonową (kiedyś nitrocelulozowa) i ich
denaturacja

5.Hybrydyzacja znakowanej, jednoniciowej sondy DNA lub cDNA do komplementarnej sekwencji

DNA związanej na membranie =>SONDA W HYBRYDYZACJI TYPU SOUTHERN:
sklonowany/syntetyczny jednoniciowy fragment DNA lub cDNA (dł.ok.100pz), wyznakowany
radioaktywnie lub chemiluminascyjnie

Przygotowywanie sondy
-Klonowanie fragmentu DNA , który ma być sondą (celem zapewnienia ogromnej liczby jego kopii)
-Radioaktywne znakowanie sondy DNA
*metoda ‘nick-translation’
*metoda ‘random priming’
-Nieradioaktywne znakowanie sondy DNA
*za pomocą digoksygeniny (systemDigoxygeniny)
->Detekcja sondy znakowanej digoksygeniną (DIG-system)

6.Wizualizacja wyniku hybrydyzacji w zależności od metody znakowania sondy

Warunki hybrydyzacji metodą Southerna:
Odpowiednio wysoka temperatura warunkuje specyficzność hybrydyzacji sondy z fragmentem DNA
komplementarnym do niej(zbyt niska temp, skutkuje niską specyficznością hybrydyzacji i
możliwością uzyskania fałszywie pozytywnych wyników = hybrydyzacji)

Northern blotting
1.Izolacja totalnego RNA lub mRNA z określonej tkanki

2.Elektroforeza agarozowa wszystkich cząsteczek RNA/mRNA

3.Blotting cząsteczek RNA/mRNA na membranę nylonową (kiedyś nitrocelulozową)

4.Hybrydyzacja znakowanej sondy cDNA do komplementarnej cząsteczki RNA (czyli do mRNA

badanego genu)

5.Wizualizacja wyniku hybrydyzacji w zależności od metody znakowania sondy

SONDA w hybrydyzacji typu Northern-> sklonowany, jednoniciowy fragment cDNA badanego genu
(wyznakowany radioaktywnie lub chemiluminascyjnie)
Western blotting
2.Elektroforeza poliakrylamidowa
1.Izolacja białek z określonej tkanki wyizolowanych białek

3.Blotting białek na membranę
nitrocelulozową
4.Inkubacja membrany z przeciwciałem I
rzędu i jego wiązanie do cząsteczki
poszukiwanego białka
5.Wypłukanie nadmiaru przeciwciała I rzędu
6.Inkubacja membrany z wyznakowanym
przeciwciałem II rzędu i jego wiązanie do
przeciwciała I rzędu
7.Detekcja białka

- cel stosowania każdego typu hybrydyzacji/zastosowanie

Hybrydyzacja metodą Southerna

•Pozwala zidentyfikować (odnaleźć)konkretną sekwencję w DNA poprzez hybrydyzację z sondą (po
to by ją sklonować, sekwencjonować),
•Pozwala określić lokalizację miejsc restrykcyjnych we fragmencie DNA (np.:w genach) bez
konieczności ich klonowania
Wykorzystanie hybrydyzacji metodą Southerna
•do porównania sekwencji homologicznych genów u różnych gatunków (np.: do porównywania
organizacji promotorów, sekwencji regulatorowych)
•w niektórych technikach markerów DNA np.: metodzie markerów RFLP (czyli metodzie analizującej
polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych)
•do potwierdzenia insercji do wektora fragmentu DNA stanowiącego insert

Northern blotting
- metoda pozwala stwierdzić czy określony gen jest transkrybowany w badanej tkance lub w
określonych warunkach środowiska lub na określonym etapie rozwoju organizmu

Western blotting
Metoda pozwala stwierdzić:
•czy z genu powstaje produkt białkowy i jakiego rodzaju
•w jakiej tkance i/lub w jakich warunkach środowiska lub na jakim etapie rozwoju organizmu
powstaje produkt białkowy genu

Klonowanie
- wyjaśnienie terminów związanych z klonowaniem (wektor, rekombinowany DNA, polinker, itp)
->wektor-cząsteczka DNA zdolna do autonomicznej replikacji w komórce tzw. gospodarza i
przez to nadaje się do namnażania (zreplikowania) wstawionego w nią fragmentu z innego DNA
->rekombinowana cząsteczka DNA- jest to każda sztucznie powstała cząsteczka DNA,
zawierająca DNA nie występujące w naturze razem, czyli pochodzące z różnych biologicznych źródeł,
np.: cząsteczka wektora z wstawionym insertem (wstawionym fragmentem DNA)
->ligacja - reakcja enzymatycznego łączenia fragmentów DNA, przeprowadzana przez
enzymy ligazy
->ligazy - enzymy katalizujące tworzenie wiązania fosfodiestrowego w obecności ATP
pomiędzy dwoma fragmentami dwuniciowego DNA (bakteriofagowa T4 DNA ligaza, E. coli ligaza lub
bakteriofagowa T4 RNA ligaza) lub pomiędzy dwoma jednoniciowymi oligonukleotydami
hybrydyzującymi do komplementarnej matrycy DNA (TaqDNA ligaza)
->polinker -tzw. miejsce wielokrotnego klonowania, (inaczej MCS, od multiple cloning site) –
odcinek w wektorze zawierający zestaw unikalnych miejsc restrykcyjnych dla wielu enzymów
restrykcyjnych
->insert - fragment DNA
->klon - grupa komórek zawierających jednakowe cząsteczki zrekombinowanego DNA
->transformacja - uzyskanie przez komórkę nowych genów wskutek pobrania nagiego DNA
->klonowanie fragmentu DNA - Proces produkcji ogromnej liczby kopii określonego
fragmentu DNA dla różnych celów

- cechy dobrego wektora

•Cząsteczka wektora o dł. mniejszej niż <10kb– zapewnia łatwość wprowadzania cząsteczki wektora
do k. gospodarza
•Posiadanie w cząsteczce wektora pojedynczych miejsc restrykcyjnych dla wielu, różnych
endonukleaz (zapewnia duży wybór enzymów do przycinania końców insertu i przecinania wektora)
•Posiadanie w cząsteczce genów markerowych– np. genów odporności na antybiotyki albo genów
kodujących markery histochemiczne lub pokarmowe (służą do identyfikacji kolonii bakteryjnych
transformowanych wektorem oraz do sprawdzenia czy pobrany wektor posiada insert)
•Wydajna replikacja wektora w komórce gospodarza (czyli tworzenie wielu jego kopii)
•Łatwość izolacji cząsteczek wektora z komórki gospodarza po klonowaniu
•Łatwość wycinania insertu z cząsteczek wektora

- etapy klonowania

1.wstawienie insertu (fragmentu DNA, np. fr.genu) do wektora

2.transformacja k. gospodarza cząsteczką wektora z wstawionym insertem (włożenie cząsteczki
wektora do k. gospodarza)
3.namnożenie wektora z insertem w k. gospodarza
4.izolacja cząsteczek wektora z insertem z k. gospodarza
5.wycięcie insertu (klonowanego fragmentu DNA) z wektora

- rola ligaz

Enzymy katalizujące tworzenie wiązania fosfodiestrowego w obecności ATP pomiędzy wolnymi

końcami 3’ i 5’ reszt cukrowych sąsiadujących nukleotydów łańcuchu DNA :
-pomiędzy dwoma fragmentami dwuniciowego DNA (bakteriofagowa T4 DNA ligaza, E. coli ligaza lub
bakteriofagowa T4 RNA ligaza) lub
-pomiędzy dwoma jednoniciowymi oligonukleotydami hybrydyzującymi do komplementarnej
matrycy DNA (TaqDNA ligaza)
Funkcje ligaz in vivo:
-udział w replikacji opóźnionej nici DNA,
-w procesie rekombinacji genetycznej,
-w naprawie DNA

- rodzaje wektorów stosowane w klonowaniu, ich cechy charakterystyczne i przeznaczenie

Rodzaje wektorów:
•pochodne plazmidów E. coli
->miejsce ori z plazmidu pMB1 -pozwala na replikację tylko w k. jednego gat. gospodarza (w
E.coli)
->można wstawić inserty wielkości do 10 kb
->dobra stabilność wektora
->po replikacji występuje w 20-30 kopiach na k. gospodarza w warunkach normalnych
->posiada geny oporności na ampicylinę i tetracyklinę
->posiada pojedyncze miejsca restrykcyjne dla ponad 40 enzymów restrykcyjnych
->Wektor plazmidowy pBR322- jeden z pierwszych, najlepiej poznanych i często
wykorzystywanych wektorów bakteryjnych, skonstruowany przez Bolivara i Rodrigueza w 1976 r.

Sposób identyfikacji kolonii bakteryjnych zawierających wektor (plasmid) z insertem - pożywka z

ampicyliną i tetracykliną
->Wektor plazmidowy pUC18/19
-miejsce ori z plazmidu pMB1, pozwala na replikację w k. jednego gospodarzu (w E.coli)
-brak genu rop (brak hamowania kolejnych cykli replikacji)
-po replikacjach występuje do 500 kopii na komórkę bakterii
-w wektor można wstawić inserty do 10 kb
-dobra stabilność wektora
-posiada gen oporności na ampicylinę i gen dla Beta-galaktozydazy (lacZ)
-ma polilinker(miejsce MCS) –fragment wektora zawierający pojedyncze miejsca restrykcyjne dla
wielu enzymów (tutaj wewnątrz genu LacZ)
-prosty sposób detekcji wektora z insertem
 ->Wektor plazmidowy pUC8 –-Identyfikacja kolonii z wektorem z insertem

•pochodne bakteriofagów Lambda i M13

->w klonowaniu wykorzystuje się cykl lityczny bakteriofaga λ
Cykl lizogennny -Bakteriofag λ integruje do DNA bakteryjnego w wyniku rekombinacji między
sekwencją bakteryjną attλ a sekwencją attB w genomie faga.
Cykl lityczny - Bakteriofag λ po wniknięciu do k. bakterii produkuje wiriony (kopie) uwalniane przez
lizę k. gospodarza
->Wektory skonstruowane w oparciu o genom bakteriofaga λ muszą zawierać geny białek
kapsydu oraz geny warunkujące syntezę DNA i lizę komórki gospodarza natomiast region
warunkujący integrację i rekombinację może być usunięty

•Kosmidy (połączenie plazmidu i fragmentów COS faga Lambda)

->plazmid niosący miejsca cos λ
->konkatamery (cząsteczka DNA zbudowana z jednakowych odcinków połączonych ze sobą
na zasadzie głowa-ogon) cząsteczek kosmidowych połączone swoimi miejscami cos działają jako
substraty do pakowania in vitro, ponieważ miejsce cos jest jedyną sekwencją potrzebną cząsteczce
DNA by została rozpoznana jako "genom λ" przez białka pakujące DNA do cząsteczek faga λ.
->cząstki zawierające kosmidowy DNA nie umożliwiają syntezy nowych cząstek faga
natomiast replikują się jako plazmidy
->kosmid może mieć rozmiar poniżej 8 kb, wstawić można 44 kb nowego DNA zanim osiągnie
limit cząstki faga λ.

•Fagmidy (połączenie plazmidu i fagahelperaM13)

->wektor plazmidowy do klonowania zawierający plazmidowe miejsce startu replikacji ORI
oraz ORI replikacji faga M13 lub innego bakteriofaga z jednoniciowym genomem
->jeśli w kom E. coli znajdą się jednocześnie fagmid i replikacyjna forma faga pomocniczego,
który ma geny umożliwiające wytworzenie fagowych enzymów replikacyjnych oraz białek płaszcza
następuje uaktywnienie fagowego ori replikacji -> zachodzi synteza fagów będących jednoniciową
wersją fagmidowego DNA w ten sposób dwuniciowy plazmidowy DNA można przekształcić w
jednoniciowy matrycowy DNA używany do sekwencjonowania
 ->system zapobiega niestabilności cząsteczek DNA klonowanych w wektorach M13 i
umożliwia wstawianie do fagmidów fragmentów do 10 kb a nawet większych

•BAC - Sztuczny chromosom bakteryjny

->sztuczna cząsteczka, stworzona na bazie plazmidu F z E. coli, używana jako wektor do
klonowania DNA
-wielkość insertu to 150-300 kb
-dobra stabilność wektora
-występuje w jednej kopii na k. gospodarza
-skonstruowany na bazie plazmidu F z E.coli
-posiada region replikacji z plazmidu F, MCS oraz marker selekcyjny (gen oporności na kanamycynę,
gen dla B-galaktozydazy)
-zachowuje się jak plazmid E.coli

•YAC - Sztuczny chromosom drożdżowy

-wielkość YAC 10 –15 kb
-wielkość wstawianego insertu 600 kpz (standardowo), a nawet do 1500 kb i więcej
-występuje w jednej kopii na komórkę gospodarza
-nie zapewnia stabilności klonowanego DNA z powodu rekombinacji
-skonstruowany na bazie plazmidu+ drożdżowe sekwencje centromeru, telomeru, ORI
-powielają się w Saccharomyces cerevisiae

- zalety i wady klonowania, po co się klonuje

zalety:
Klonowanie dostarcza ‘czystej’ (nie zanieczyszczonej innym DNA) próbki fragmentu DNA -
Każda kolonia bakteryjna zawiera liczne kopie tylko jednej rekombinowanej cząsteczki DNA (wektor
+ insert)
wady:
->

Fragmenty DNA klonuje się w celu:

->Rozdzielenia od siebie różnych fragmentów DNA uzyskanych razem (np.: po izolacji) na
poszczególne klony
->uzyskania ogromnej liczby kopii dowolnego fragmentu DNA np.: do sekwencjonowania;
jako sondę
->sekwencjonowania sklonowanego fragmentu DNA z użyciem uniwersalnych starterów
(komplementarnych do sekwencji wektora przy miejscu wbudowania insertu)

- biblioteki genomowego DNA i cDNA (co to jest, cechy charakterystyczne, do czego służą, jak się je
przygotowuje)

Biblioteka genomowego DNA

 ->liczba klonów bakterii konieczna do umieszczenia w wektorach kompletnego,
pofragmentowanego genomu człowieka
->to kolekcja ogromnej liczby wektorów (umieszczonych w k. gospodarza), z których każdy
zawiera pojedynczy fragment DNA z genomu określonego gatunku, a wszystkie razem zawierają cały
genom tego gatunku
->Powstaje przez pocięcie DNA genomowego enzymem restrykcyjnym i umieszczenie
wszystkich fragmentów w wektorach, a następnie transformowanie nimi komórek gospodarza
(bakterii lub drożdży)
->Do stworzenia biblioteki genomowego DNA stosuje się wektory o dużej pojemności (YAC,
BAC), do których można wbudować inserty o długości >20 kpz
->przechowywanie fragmentów genomowego DNA

Biblioteka cDNA
->To kolekcja wektorów, z których każdy zawiera cząsteczkę cDNA dla jakiegoś mRNA,
(wyizolowanego z określonej tkanki w określonym czasie)
->Powstaje wskutek umieszczenia w każdym wektorze jednej cząsteczki cDNA
zsyntetyzowanego dla jakiegoś mRNA (wyizolowanego z okręślonej tkanki w określonym czasie), i
następnie transformowania tymi wektorami bakterii
->Odzwierciedla to, jakie geny były aktywne w określonej tkance w określonym czasie ( bo
ich RNA zamieniono na cDNA i wstawiono do wektorów)
->przechowywanie cząsteczek cDNA

PCR
- co to jest PCR, cel reakcji, produkt reakcji

PCR (Polymerase Chain Reaction)

- łańcuchowa reakcja polimerazy
- umożliwia wykładnicze namnożenie (zamplifikowanie) dowolnie wybranego fragmentu DNA (o
długości max. do 2-5 kb) w probówce, bez konieczności stosowania klonowania
- otrzymuje się określony fragment DNA w ogromnej licznie kopii

- skład mieszaniny reakcyjnej, informacje o podstawowych składnikach i ich roli w reakcji

•matryca DNA (genomowy DNA lub cDNA)

•para starterów flankujących (ograniczają amplifikowany fragment matrycy DNA )
•deoksyrybonukleotydy(dNTPs, nukleotydy)
•termostabilna polimeraza DNA ( reakcja przeprowadzana w termocyklerze)
•bufor odpowiedni dla użytej polimerazy DNA, zawierającyMgCl2
wielkość amplifikowanego fragmentu DNA jest wyznaczona przez miejsca przyłączania starterów na
obu niciach DNA

-etapy metody PCR – co dzieje się w każdym z nich

1.Wstępna denaturacja matrycy DNA (94C, 5 min)

2. Denaturacja DNA (94C-95C)
->w wyniku pękania wiązań wodorowych pomiędzy zasadami azotowymi dochodzi do rozdzielenia
się podwójnej nici DNA
3. Przyłączanie starterów (temp. zależna od sekwencji starterów) CYKL
4. Elongacja DNA (72C)
->przyłączanie się polimerazy DNA do miejsca asocjacji starterów z matrycą DNA; kompleks
rozpoczyna syntezę komplementarnej nici do matrycy
5. Końcowa elongacja DNA (72C, 5min?)

- dlaczego w PCR zachodzi teoretycznie „wykładniczy” przyrost ilość produktu,

W PCR zachodzi teoretycznie wykładniczy przyrost ilości produktu, ponieważ w każdym cyklu PCR
ilość nici DNA zostaje podwojona, jednak w rzeczywistości dopiero w 3 cyklu powstają produkty DNA
o pożądanej długości.
teoretyczny wzór: 2n rzeczywisty wzór: 2n-2.

- jaka jest długość produktów uzyskiwanych w pierwszych cyklach? Skąd taki efekt?

Produkty amplifikacji powstałe w cyklach nr 1-2 są dłuższe niż finalnie oczekiwanych produktów i
dopiero w cyklu nr 3 uzyskuje się dwuniciowe produkty o pożądanej długości. Wynika to z tego, że w
1 cyklu produktami są 2 długie nici DNA, w drugim cyklu produktami są 2 długie nici DNA identyczne
z produktami 1 cyklu oraz 2 nici DNA stworzone z całkowicie nowego DNA. W 3 cyklu powstają krótki
produkty będące kopiami nowozsyntetyzowanego DNA.

- zależność między wydajnością a czasem jej trwania – skąd zmiany w wydajności reakcji w czasie jej
trwania
RT-PCR

- co to jest RT-PCR, cel wykonania reakcji , co jest produktem reakcji

RT-PCR to technika uzyskiwania komplementarnego DNA (complementary DNA;cDNA) do
jednoniciowego RNA w reakcji odwrotnej transkrypcji
Ilość utworzonych cząsteczek cDNA dla każdej cząsteczki mRNA zależy od ilości cząsteczek tego
mRNA w komórkach w momencie izolacji (czyli od poziomu ekspresji genu dla tego mRNA)
Cel techniki:
-utworzenie cząsteczek cDNA (komplementarnego DNA) na matrycy cząsteczek RNA,
czyli stworzenie dla każdej cząsteczki RNA komplementarnej do niej cząsteczki cDNA

-cDNA jest znacznie stabilniejszy niż RNA i nie jest wrażliwy na pocięcie przez RNazy
-cDNA może być amplifikowany za pomocą PCR i wykorzystany do badań z użyciem tej techniki
-cDNA może być wykorzystywany w różnych badaniach dotyczących ekspresji genów

- skład mieszaniny reakcyjnej, informacje o podstawowych składnikach i ich roli w reakcji

Do syntezy nici cDNA potrzebne są:
•totalny RNA lub poly(A) RNA (dobra jakość, niezanieczyszczony, niezdegradowany) -> matryca do
syntezy dwuniciowego cDNA , który następnie może byc matrycą do PCR
•pojedynczy starter (ang.reverse primer), najczęściej: oligo(dT)18 starter lub 6-nukleotydowy starter
(o losowej sekwencji)
•dNTPs (deoksyrybonukleotydy),
•bufor
•odwrotna transkryptaza (enzym dobudowujący nić DNA do nici RNA),
•inhibitor RNAz
•polimeraza Taq
•ligazy

- etapy metody RT-PCR – co dzieje się w każdym z nich

1. Synteza pierwszej nici cDNA na matrycy poly(A) mRNA
Do totalnego RNA lub poly(A)RNA przyłącza się pojedynczy starter o losowej sekwencji. Do startera
dołącza się enzym odwrotna transkryptaza, która dobudowuje nić cDNA do nici RNA.
2. Synteza drugiej nici cDNA na matrycy pierwszej nici cDNA
RNaza H niszczy częściowo nić RNA, której resztki służą jako startery. Startery przyłączają się do
specyficznych sekwencji budujących nić cDNA. W miejscach przyłączania się starterów dołącza się
polimeraza DNA (najczęściej Taq polimerazy DNA), która syntetyzuje nową komplementarną nić DNA
do cDNA powodując powstanie dwuniciowej cząsteczki cDNA.
3. Dwuniciowy cDNA może być dalej amplifikowany z użyciem polimerazy DNA(najczęściej Taq
polimerazy DNA) na zasadzie PCR.

- w jakich badaniach wykorzystuje się produkt reakcji RT-PCR czyli cDNA

• Detekcja określonego cDNA(RNA ) w badanym materiale czyli detekcja ekspresji tego genu
np. za pomocą PCR
• Określenie ilości cDNA genu poziomie czyli określenie poziomu ekspresji tego genu w
konkretnej próbie / tkance / organie np. za pomocą Real Time PCR
• Porównanie poziomu ekspresji genu w różnych układach (tkanki, odpowiedź na stres, wiek
etc.) np. mikromacierze Real Time PCR
• Do badania funkcji białka kodowanego przez jakiś gen np. transformacja genetyczna
• Sekwencjonowanie cDNA czyli ustalenie sekwencji kodującej genu np. przez
sekwencjonowanie cDNA

Sekwencjonowanie DNA

- co to jest sekwencjonowanie, po co, cel metody

- to techniki określające kolejność nukleotydów we fragmencie DNA

- dostarcza wielu cennych informacji o strukturze i funkcji genów,
-znajomość pełnej sekwencji DNA badanych organizmów umożliwia zrozumienie molekularnych
mechanizmów ich funkcjonowania i ewolucji
-umożliwia szukanie mutacji

- sekwencjonowanie metodą Sangera: skład mieszaniny reakcyjnej, rola poszczególnych składników

przebieg reakcji, wizualizacja produktów – w jaki sposób odczytuje się kolejne nukleotydy w
sekwencji
Metoda Sangera= Sekwencjonowanie poprzez terminację łańcucha
->metoda sekwencjonowania pierwszej generacji
-> Ustalanie sekwencji jednoniciowego fragmentu DNA na podstawie syntezy łańcuchów DNA
komplementarnych do niego

->Składniki mieszaniny reakcyjnej:

•matryca -jednoniciowy DNA
-> fragment DNA sklonowany w wektorze
-> w jednoniciowym wektorze bakteriofagowym M13
-> w dwuniciowym wektorze plazmidowym, po denaturacji alkalicznej lub termicznej
•pojedynczy starter (Starter komplementarny do sekwencji wektora)
•polimeraza DNA
•bufor dla polimerazy DNA
•deoksyrybonukleotydy (dNTPs)
•dideoksyrybonukleotydy (ddNTPs) zwane terminatorami

->przebieg reakcji
Próbkę DNA, która ma zostać sekwencjonowana, miesza się w probówce ze starterem, polimerazą
DNA i nukleotydami DNA (dATP, dTTP, dGTP i dCTP). Dodaje się także cztery wyznakowane
barwnikiem, terminujące dideoksynukleotydy, ale w znacznie mniejszych ilościach niż zwykłe
nukleotydy.
Mieszaninę najpierw ogrzewa się w celu denaturacji matrycowego DNA (rozdzielenia nici), a
następnie chłodzi, tak aby starter mógł związać się z jednoniciową matrycą. Po związaniu startera
temperatura jest ponownie podnoszona, umożliwiając polimerazie DNA syntezę nowego DNA
zaczynając od startera. Polimeraza DNA będzie kontynuować dodawanie nukleotydów do łańcucha,
aż zdarzy jej się dodać dideoksy nukleotyd zamiast normalnego. W tym momencie nie jest już
możliwe dodawanie żadnych nukleotydów, więc nić zakończy się dideoksy nukleotydem.
Proces ten powtarza się w kilku cyklach. Do czasu zakończenia cykli jest praktycznie gwarantowane,
że dideoksynukleotyd zostanie włączony w każdą pozycję docelowego DNA w co najmniej jednej
reakcji. Oznacza to, że probówka będzie zawierać fragmenty o różnych długościach, kończące się w
każdej pozycji nukleotydowej w oryginalnym DNA (patrz rysunek poniżej). Końce fragmentów
zostaną wyznakowane barwnikami wskazującymi ich końcowy nukleotyd.
Po zakończeniu reakcji fragmenty przepuszcza się przez długą, cienką rurkę zawierającą matrycę
żelową w procesie zwanym kapilarną elektroforezą żelową. Krótkie fragmenty poruszają się szybko
przez pory żelu, a długie fragmenty poruszają się wolniej. Gdy każdy fragment przecina „linię mety”
na końcu rurki, jest oświetlany laserem, umożliwiając wykrycie dołączonego barwnika.
Najmniejszy fragment (kończący się tylko jednym nukleotydem za starterem) przecina linię mety jako
pierwszy, a następnie kolejny najmniejszy fragment (kończący się dwoma nukleotydami za
starterem) i tak dalej. Zatem na podstawie zarejestrowanych barwników w detektorze, sekwencja
oryginalnego fragmentu DNA może być zbudowana jeden nukleotyd po drugim. Dane
zarejestrowane przez detektor składają się z szeregu pików o danej intensywności fluorescencji, jak
pokazano na chromatogramie powyżej. Sekwencja DNA jest odczytywana z pików na
chromatogramie.

Detekcja produktów sekwencjonowania:

-> Znakowanie startera (radioaktywne, fluoroscencyjne )-elektroforeza próbek z dodatkiem każdego
z czterech rodzajów ddNTPs w odrębnych kieszonkach żelu
-> Znakowanie terminatorów -ddNTPs -elektroforeza fragmentów po sekwencjonowaniu
zakończonych przez różne ddNTPS (znakowane różnymi znacznikami)w jednej kieszonce żelu i -
automatyczny odczyt sekwencji
- przykłady metod sekwencjonowania II i III generacji

Metody sekwencjonowania drugiej generacji:

1. Pirosekwencjonowanie np.: Sekwenator454 (Roche/454 FLX Pirosequencer)
-> Procedura wieloetapowego sekwencjonowania z użyciem wielu enzymów
2. „Brigde amplification” i wydłużanie o jedną zasadę np.: Analizator Illumina (Illumina Genome
Analyzer)
3. Sekwencjonowanie oparte o ligację np.: Sekwenator SOLiD ( Applied Biosystems SOLiD
Sequencer)

Metody sekwencjonowania trzeciej generacji

1. Sekwencjonowanie z wykorzystaniem nano-porów
Nanopory:
-transmembranowe kanały białkowe o śr. 1,5 -2,6 nm
-umieszczone w roztworze jonowym, poddane działaniu pola elektrycznego
-śr. kanału rozmiarze wystarczającym do przepuszczania jedynie pojedynczej nici DNA
•Pojedyncza nić DNA w polu elektrycznym migruje przez kanał, wpływając na jego średnicę
•Każdy nukleotyd wywołuje inną zmianę konformacji kanału –efekt to różnice w mierzonym
natężeniu prądu

2. Sekwencjonowanie DNA nowej generacji (NGS)

-Sekwencjonowanie przez syntezę Ion Proton Sequencer = next-generation sequencer(NGS)
 cz.II Budowa i ewolucja genomów u Prokariota i Eukariota

Budowa i ewolucja genomu u Prokariota:

- organizacja i upakowanie genomów prokariotycznych

1. Chromosom/chromosomy bakterii
-w połączeniu z białkami tworzą NUKLEOID (DNA bakteryjny + białka)
-wielkość genomu na ogół 0,2-13 Mb (a nawet 30 Mb)
2. Plazmidy
-autonomiczne cząsteczki DNA koegzystujące z chrom. bakterii
-wielkość (na ogół ) kilka -kilkaset kb

Budowa i upakowanie genomu prokariotycznego:

1.koliste lub liniowe chromosomy

2.DOMENOWY model budowy nukleoidu E. coli

każda z domen jest niezależna - może być transkrybowana niezależnie
cząsteczki zanurzone w rdzeniu białkowym, cząsteczki RNA pełnią rolę upakowującą tworzącą zwartą
strukturę genomu E. coli
białko HU –jedno z białek pakujących o funkcji zbliżonej do histonów
rdzeń białkowy tworzą: gyraza DNA, topoizomeraza I DNA -utrzymują stan superskręcenia
Archeony mają białka pakujące bardziej zbliżone do histonów niż do białek HU

3. DNA w chromosomie bakteryjnym ulega SUPERSKRĘCENIU

superskręcenie umożliwia zmniejszenie średnicy chromosomu, przecięcie:

-> struktury białkowej/ RNA pętla jest superskręcona i tylko dana pętla ulega rozwinięciu
->nici DNA rozluźnieniu ulega struktura DNA i jest bardziej dostępna do transkrypcji

- cechy charakterystyczne całych genomów i genów prokariotycznych

->zwarta budowa genomu prokariotycznego pod względem ułożenia genów (niewielka ilość
sekwencji niekodujących, przestrzenie międzygenowe niewielkie, brak intronów, obecność
operonów)
Geny Archeonów mają czasem budowę nieciągłą i zawierają introny
Geny prokariotyczne są KRÓTSZE niż eukariotyczne Śr. długość genu bakteryjnego to 2/3 genu
eukariotycznego po usunięciu intronów
Geny Archeonów są nieco krótsze niż geny bakteryjne
U Prokariota ta sama sekwencja DNA może wchodzić w skład różnych genów –geny zachodzące

->Ułożenie genów bakteryjnych w genomie:

-rozrzucone
-tandemowe (OPERON -grupa genów stanowiących jedną jednostkę transkrypcyjną, czyli
znajdujących się pod kontrolą jednego promotora i podlegających wspólnie ekspresji)

U większości Prokaryota w operonach znajdują się geny kodujące enzymy jednego szlaku
metabolicznego np.: wykorzystanie cukru jako źródła energii lub synteza aminokwasu
Wyjątek -W genomach Aquifex aeolicusi Methanocaldococcus janaschii operony zawierają geny z
różnych szlaków metabolicznych

->W genomach Prokaryota mogą być pojedyncze sekwencje powtarzające

•Stanowią średnio 6,9 % genomu
•Zlokalizowane na ogół w regionach międzygenowych
•Rola regulacyjna
•Rola w organizacji i ewolucji genomów, bo między takimi sekwencjami (jednego typu) dochodzi do
dużej liczby zdarzeń rekombinacyjnych
np.: sekwencje MITE (miniature inverted-repeat transposable element), sekwencje insercyjne,
transpozony DNA
WYJĄTEK :Bakteria Neisseria meningitidis Z2491 posiada 3700 kopii 15 różnych sekwencji
powtarzalnych, stanowiących razem 11% jej genomu (2,18 Mb)

->Plazmidy:
-niezależne, autonomiczne cząsteczki DNA w k. prokariotycznych, koliste lub liniowe,
-zdolne do autonomicznej replikacji,
-wielkość NA OGÓŁ : kilka -kilkaset kb (ALE: są i dużo większe np.: u Rhizobium)
-koegzystują w k. z głównym chromosomem bakteryjnym,
-zwykle przenoszą geny nie występujące w chromosomie i które nie są niezbędne,

1.Rola w ewolucji prokariotów.

Umożliwiają wprowadzenie do k. prokariotycznych puli egzogennego DNA.

2.Zawierają geny warunkujące specyficzne cechy fenotypowe, przydatne w określonych

(nietypowych) niszach ekologicznych

ALE: Gatunek blisko spokrewniony -Treponema pallidum –ma genom w postaci pojedynczej kolistej
cząsteczki DNA (1138 kbp), zawiera 1041 genów i nie zawiera żadnego z genów obecnych na
plazmidach Borrelia
 ->Niektóre Prokaryota mają genomy wielochromosomowe – podzielone na 2 i więcej
cząsteczek
Vibrio cholera
Genom to 2 cząsteczki DNA, 3885 genów:
-Chromosom główny -71% genów
-Megaplazmid– zawiera INTEGROM, zestaw genów i innych sekwencji DNA do „porywania” genów z
bakteriofagów i innych plazmidów

Jeśli gatunek Prokariota ma genomy wielochromosomowe to:

•Chromosom główny -zawiera zasadniczą część genów metabolizmu podstawowego, równomiernie
rozmieszczonych
•Chromosom/y dodatkowe –zawiera mniejszą pulę genów, na ogół skupionych w niewielkich
fragmentach DNA. Chromosomy dodatkowe mają często charakterystyczne dla plazmidów systemy
replikacji typu ABC lub geny o charakterze adaptacyjnym.
Wewnątrzkomórkowy komórkowy transfer genów z chromosomu głównego do plazmidu i jego
przekształcenie w chromosom dodatkowy

->Wielkość genomów Prokaryota

•Genomy gat. Prokaryota na ogół znacznie mniejsze niż genomy gat. Eukaryota
•Archeony mają mniejsze genomy niż Bakterie właściwe
•Większość genomów Prokaryota poniżej 5 Mb

- zależność między wielkością genomu a liczbą genów u Prokariota

najmniejszy genom =najmniejsza liczba genów
większy genom =więcej genów
=>charakterystyczne dla Prokaryota
najmniejszy- gat. obligatoryjnie pasożytnicze ,
najmniejsza liczba genów
Archeowce mają nieznacznie większy genom
niż obligatoryjni pasożyci (większy genom)
Ile jest genów u Prokaryota?
Szacuje się, że ok. 500 genów wystarcza do
zakodowania funkcji życiowych wolnożyjącej
komórki Prokaryota
ALE u Prokaryota: Ogromna zmienność , co do
liczby i rodzaju posiadanych genów, nawet
między różnymi szczepami jednego
gatunku !!!
- zależność między liczbą genów a trybem życia org. prokariotycznych

•Wielkość genomu Prokaryota zależy od środowiska i sposobu życia gatunku bakterii:

•Najmniejsze genomy – gat. obligatoryjnie pasożytnicze lub symbiotyczne
Redukcja genomów obligatoryjnych pasożytów lub symbiontów przyczyny:
1. Generowanie większej liczby delecji niż insercji (m.in. wskutek ograniczenia wprowadzania
egzogennego DNA w wyniku horyzontalnego transferu genów)
2. Utrata genów warunkujących biosyntezę związków, które są dostarczane przez
gospodarza. Efekt to eliminacja genów umożliwiających przeżycie poza organizmem
gospodarza
•Największe genomy – gat. wolnożyjące w glebie - korzystne jest utrzymywanie wielkiego genomu,
dużej liczby genów by przetrwać (produkty mogą zapewnić przetrwanie w wyniku nagłej zmiany w
środowisku)

- mechanizmy odpowiadające za powstanie nowych genów u Prokariota

Pojęcie gatunku w świecie Prokaryota?
Gatunek- grupa osobników, które mogą się ze sobą krzyżować i dawać płodne potomstwo
Przyjęta przez biologów definicja gatunku nie ma zastosowania do Prokaryota
Powód: Łatwość wymiany genów/ fragmentów DNA między odrębnymi gatunkami(czyli brak bariery
przepływu genów)
1. Nabywanie genów od innych gatunków -horyzontalny (poziomy) transfer genów (HGT)
•koniugacja (za pomocą plazmidu F)
•transformacja
•transdukcja

->E. coliK12 -ok. 13% genomu pochodzi od innych gatunków

->Transfer genów zachodził między bardzo odległymi gatunkami (często żyjącymi w podobnych
niszach ekologicznych) nawet między bakteriami właściwymi i archeonami:
->Thermotoga maritima-1877 genów z tego 451 genów od archeonów(6,4 % genomu )
2.Duplikacja niektórych lub wszystkich genów w genomie (alternatywa dla HGT)- zduplikowany gen
może zyskać inne funkcje i zostać nowym genem
3.Rekombinacje prowadzące do rearanżacji genetycznych (insercje, delecje, inwersje)
4. Redukcja genomu (dotyczy głównie bakterii pasożytniczych)

Budowa i ewolucja genomów organellarnych (mitochondrialnego i chloroplastowego):

- organizacja i wielkość genomów organellarnych, ilość cząsteczek genomów w organellach i
komórce

1. Genom mitochondrialny
-wiele kopii cząsteczek DNA w jednym organellum
-koliste lub liniowe
-wielkość: 6 kb-2500 kb
2. Genom chloroplastowy
-20-40 kopii kolistych cząsteczek DNA w jednym organellum
-wielkość 120-200 kb

W każdym organellum występuje kilkanaście -kilkadziesiąt kopii cząsteczki DNA, W każdej komórce
kilkadziesiąt organellów
Genomy organellów mają część genów związanych z syntezą białek (geny dla rRNA, tRNA) oraz
pełnionymi przez nie funkcjami, pozostałe białka kodowane są jądrowo
W organellach odbywa się transkrypcja i translacja

- cechy charakterystyczne genomów organellarnych

genom mitochondrialny (mtDNA)

Najczęstsza forma mtDNA -forma KOLISTA, ALE występuje też forma LINIOWA JEDNOLITA (orzęski,
niektóre glony, drożdże)
U wielu Eukaryota występują obie formy mtDNA

Liczba kopii mtDNA w mitochondrium –różna

człowiek
-do 10 kopii mtDNA/mitochondrium, czyli ok. 8000 -10000 na komórkę (do 1000
mitochondriów/komórka)
-najwięcej mitochondriów -włókna mięśniowe poprzecznie prążkowane, mięsień sercowy, nerki,
ośrodkowy układ nerwowy (dlatego zespoły chorobowe dziedziczone mitochondrialnie to głównie
schorzenia neurologiczne i encefalomiopatie)
drożdże –ponad 100 kopii /mitochondrium, czyli ok. 6500/komórka

Wielkość genomów mitochondrialnych

-od 6 kb (Plasmodium) do 2500 kb u dyniowatych (melon) zawierają 5-100 genów
•Kręgowce –małe genomy mitochondrialne, geny w mtDNA bez intronów
•niższe Eukaryota (np. drożdże) i rośliny kwiatowe -duże genomy mitochondrialne, geny z dużą
ilością sekwencji niekodujących

- geny w genomach organellarnych

->geny kodujące niektóre białka związane z łańcuchem oddechowym, geny kodujące niektóre rRNA
->Większe genomy mtDNA–zawierają też geny dla tRNA, białek rybosomowych i białek biorących
udział w transkrypcji, translacji i transporcie innych białek do mitochondrium z cytoplazmy
->Ssaki -13 genów białek związanych z fosforylacją oksydacyjną:
cytochromu b
3 podjednostki oksydazy cytochromowej
2 podjednostki ATPazy
7 podjednostek dehydrogenazy NADH
22-25 geny kodujące tRNA
2 geny rRNA(12S i 16S)
->Człowiek -13 genów białek związanych z fosforylacją oksydacyjną:
cytochromu b
3 podjednostki oksydazy cytochromowej
2 podjednostki ATPazy,
7 podjednostek dehydrogenazy NADH
22 geny kodujące tRNA
2 geny rRNA(12S i 16S)

GENY POTRZEBNE DO TRANSLACJI MITOCHONDRIALNEJ, POLIMERAZA DO TRANSKRYPCJI

NAJCZĘŚCIEJ JEST PRODUKOWANA Z GENOMU JĄDROWEGO
->ok. 10% genów jądrowych koduje pozostałe białka mitochondrialne (w tym pol. DNA, pol. RNA,
białka rybosomalne)
Mitochondrium nie jest samodzielne i nie może funkcjonować samodzielnie w oderwaniu od
genomu jądrowego, natomiast zawiera pewną liczbę genów

Im większy genom mitochodrialny tym większa liczba genów w genomie

-> u ssaków brak intronów w genomie - budowa zwarta, geny zachodzące
-> u roślin wyższych, drożdży występują introny - budowa mało zwarta

Chloroplasty i genom chloroplastowy

•Stroma –enzymy wiązania CO2 biosyntezy aminokwasów, metabolizmu lipidów.
•Błony tylakoidów –białka reakcji świetlnych fotosyntezy.
•ok. 100 chloroplastów –w k. miękiszu liścia
•Chloroplastowy DNA (cpDNA) chromosomy KOLISTE, przypominają chromosomy bakteryjne, leżą w
stromie
•Liczba kopii cpDNA/chloroplast: do 100 (młody liść);20-30 (stary liść).
Genomy chloroplastowe (cpDNA) mają 120-200 kb
Bardziej jednolita wielkość i zawartość genomów niż w genomach mitochondrialnych
-> geny związane z translacją (rRNA)
-> geny związane z ekspresją
-> geny związane z funkcjonowaniem

Struktura i funkcjonowanie mitochondriów i chloroplastów zależą od genów jądrowych

•Genomy organellarne mają geny kodujące niektóre białka organelli
•Geny jądrowe kodują pozostałe białka, które po syntezie w cytoplazmie są transportowane do
organelli
- przekazywanie potomstwu genomów organellarnych
•organelle wydają się przypadkowo segregować w mitozie i mejozie
•mutacje w organellowym DNA prowadzą do powstania heteroplazmonu tj. komórki z dwoma lub
więcej genetycznie różnymi typami organelli
•przy przypadkowej segregacji może powstać komórka potomna z przewagą lub odwrotnie
niewielką ilością organelli z defektem
Mitochondria (i mtDNA) dziedziczone głównie matecznie
Człowiek -udział mtDNA plemnika w dziedziczeniu pozajądrowym-0,1%(w komórce jajowej –do
tysięca mitochondriów, w plemniku ~ 20)
Ogórek -wyjątek –dziedziczenie mitochondriów w linii męskiej
Możliwe warianty dziedziczenia organelli:
• matczyne mitochondriów i ojcowskie/obu rodziców dla plastydów (eliminacja plastydów z k.
generatywnej pyłku może zachodzić na różnych etapach gametogenezy)
ALE:
• matczyne mitochondriów i plastydów -kukurydza
• ojcowskie mitochondriów i matczyne plastydów -banan
• ojcowskie mitochondriów i plastydów -sekwoja wiecznozielona

- koncepcje dot. pochodzenia genomów organellarnych

TEORIA ENDOSYMBIOZY
Organella –relikty wolnożyjących bakterii, które weszły w związek symbiozy z przodkiem k.
eukariotycznej
Część genów z organellowego DNA została przeniesiona do genomu jądrowego,
Transfer DNA w obu kierunkach (i między organellami) zachodzi do dziś
Dawca mtDNA -bakteria tlenowa zbliżona do Rickettsia
Dawca cpDNA –bakteria zbliżona do cyjanobakterii

Dowody na pochodzenie genomów organellarnych od genomów Prokaryota:

•oba organella powstają wyłącznie z istniejących mitochondriów i chloroplastów
•Genomy -przypominające genomy bakterii a nie genomy jądrowe (kolista cząsteczka DNA, brak
histonów, różnice w kodzie genetycznym)
•Własny system translacji -przypominający system prokariotyczny (pierwszy aminokwas białek to
fenylometionina a nie metionina jak u Eukaryota)
•Streptomycyna -hamuje biosyntezę białka u bakterii i w organellach (nie u eukariontów)
•Rifamycyna -wybiórczo hamuje RNA polimerazę u bakterii i w organellach
•Inhibitory translacji eukariotycznej -nie hamują translacji w organellach
Chloroplasty powstały 1,2 mld lat temu. Pierwotnie zawierały tysiące genów, których liczba uległa
redukcji do kilkudziesięciu. We wszystkich liniach rozwojowych roślin pozostały geny odpowiedzialne
za fotosyntezę i translację

Ewolucja genomu mitochondriów u ssaków

mtDNA ssaków ewoluuje kilkakrotnie szybciej niż DNA jądrowy
Przyczyny:
•mało sprawne mechanizmy naprawy
•brak ochrony przez chromatynę
•wysokie stężenie wolnych rodników powstających w procesach utleniani

Budowa i ewolucja genomu jądrowego u Eukariota:

- organizacja i upakowanie genomu jądrowego,

Komórki Eukaryota posiadają:

-genom jądrowy (cząsteczki DNA zawarte w jądrze)
-genom mitochondrialny (cząsteczki DNA zawarte w mitochondriach)
-genom chloroplastowy – (cząsteczki DNA zawarte w chloroplastach roślin)

GENOM JĄDROWY u EUKARYOTA:

•cząsteczki DNA wyłącznie liniowe
•cząsteczki DNA upakowane w sposób wysoce uorganizowany, czyli w postać chromosomów
•jednakowy sposób upakowania cząsteczek DNA do postaci chromosomów
•różna liczba chromosomów u różnych gatunków Eukaryota
•liczba chromosomów to cecha charakterystyczna każdego gatunku Eukaryota

1. NUKLEOSOM
-podstawowa jednostka budowy chromatyny (kompleks: nić DNA + histony ) u Eukaryota
•jednostka strukturalna chromatyny
•odcinek DNA o dł. 140-150 bp nawinięty na 8 histonów rdzeniowych = OKTAMER RDZENIOWY (po 2
histony: H2A, H2B, H3 i H4)
•Nukleosomy są oddzielone odcinkiem DNA o dł. 50-70 bp
•Nukleosom stabilizowany przez histon łącznikowy H1 (lub H1a-e, H10, H1t, H5) –tworząc
CHROMATOSOM (solenoid) -> oddziaływania pomiędzy ogonami N-końcowymi histonów
•Histony rdzeniowe mają podobny plan budowy
•HISTONY:
->bogate w lizynę lub argininę
->wysoce konserwowane białka

Ogony histonów wystające z rdzenia nukleosomu są modyfikowane wskutek:

•acetylacji i deacetylacjI
•fosforylacji
•metylacji i demetylacji
•ubikwitynacji
•modelowania chromatyny

N-końcowe ogony histonów wystają z rdzenia nukleosomu w ściśle określonych pozycjach

•nukleosomy odgrywają aktywną rolę w transkrypcji, reperacji DNA, mitozie, „wyciszania genu”

2. NIĆ CHROMATYNOWA 10nm - nieupakowana forma chromatyny (raczej rzadka w żywych

jądrach )

Histony rdzeniowe łączą się z DNA za pomocą ok. 140 wiązań wodorowych między aminokwasami a
atomami tlenu w szkielecie fosforanowo-cukrowym

3. WŁÓKNO CHROMATYNOWE 30 nm - utrzymywane jest dzięki oddziaływaniom N-końcowych

ogonów histonów z rdzeniami sąsiednich nukleosomów

->podstawowy typ chromatyny w czasie interfazy

->Wiązanie się histonu H1 z DNA jest asymetryczne

Histon H1 wiąże się z DNA łącznikowym na jednym końcu i w środku DNA owiniętego wokół rdzenia
nukleosomu

4.CHROMOSOM - domeny strukturalne -

pętle DNA (40-100 kb) połączone z matriks w rejonach bogatych w AT
Chromosom metafazowy –typowa struktura Eukaryota
•Najbardziej zwarta forma upakowania chromatyny
•Formowane w cyklu komórkowym po zajściu replikacji a przed podziałem
•Składa się z 2. kopii chromosomowej cząsteczki DNA – są to CHROMATYDY SIOSTRZANE
•Chromatydy siostrzane są utrzymywane razem w obszarze CENTROMERU
•Ramiona chromosomów mają struktury końcowe -TELOMERY

Stopień upakowania chromatyny warunkuje dostępność chromatyny dla ekspresję genów

➔ Heterochromatyna
◆ Heterochromatyna konstytutywna (DNA centromerów i telomerów,inne obszary
DNA bez genów)
◆ Heterochromatyna fakultatywna (Geny nieaktywne w pewnych komórkach i w
pewnych etapach rozwoju)
➔ Euchromatyna (Obszary DNA zawierające aktywne geny)

- cechy i elementy charakterystyczne genomu jądrowego

 ➔ Chromatydy siostrzane
➔ Centromer

•Konstrukcyjny fragment chromosomu •Niezbędny

dla prawidłowej segregacji podczas mitozy i mejozy
• zbudowane z DNA powtarzającego się ( DNA
satelitarny)
• miejsce, gdzie do sekwencji w odpowiedni sposób
są przyłączane białka, które łączą się z białkami
stanowiącymi element, który wiąże mikrotubule
wrzeciona kariokinetycznego z centromerem
•wyższe Eukariota mają inną budowę centromeru
niż centromer drożdży
➔ Telomery
•konstrukcyjne fragmenty chromosomu
•wyznaczają końce chromosomów
•rola zabezpieczająca końce chromosomu przed skracaniem w replikacji
•2 specjalne białka wiążą się z odcinkiem telomerowym(regulują długość i utrzymują fr.
jednoniciowy sekwencji telomerowej) •końce
telomerowe chromosomów -utrzymywane w obszarach peryferyjnych jądra (dzięki innym
białkom)

- liczba chromosomów a złożoność org. eukariotycznych

BRAK KORELACJI-> np. jedwabnik ma więcej chromosomów (56) niż człowiek (46) mimo, że jest
mniej złożonym organizmem
Wielkość genomów Eukaryota a liczba chromosomów –BRAK KORELACJI

liczba chromosomów u gat. Eukaryota nie jest ważna ewolucyjnie

•JEST charakterystyczna dla danego gatunku (zestaw chromosomów metafazowych gatunku –to
KARIOTYP), ale:
•NIE ODZWIERCIEDLA genetycznej złożoności organizmu
•NIE MA związku z wielkością genomu
•NIE JEST związana z właściwościami biologicznymi organizmów
•NIE MÓWI nic genomie
WNIOSEK: Odzwierciedla jedynie niejednorodność zdarzeń ewolucyjnych, które ukształtowały
architekturę genomów

- wielkość genomu jądrowego, co to jest paradoks poziomu C

Paradoks C - nierówność pomiędzy wielkością genomów a liczbą genów obserwowana u niektórych

organizmów eukariotycznych
Paradoks ‘wartości C’ DNA –cecha genomów Eukaryota
1. Brak bezpośredniej, dokładnej korelacji między wielkością genomu a genetyczną złożonością i
poziomem organizacji organizmów eukariotycznych
2. ALE istnieje minimalna wielkość genomu potrzebna do osiągnięcia określonego stopnia rozwoju
systematycznego
3. Istnieje szeroki zakres wielkości genomów w obrębie niektórych gromad ( np: podobne organizmy
pod względem złożoności różnią się znacznie wielkością genomu)
4. Wielkość genomu nie jest skorelowana z liczbą genów, ale widać korelację między liczbą genów a
wzrostem złożoności organizmu

wielkość genomu jądrowego różna w zależności od gatunku, jednak nie jest skorelowana ze
złożonością organizmu.
Minimalna wielkość genomu zwiększa się w każdej gromadzie
Genom jądrowy człowieka ma wielkość 3200 Mb i zawiera 24 elementy, których długość waha się od
50-263 Mb
mniej zwarte genomy ->więcej sekwencji powtarzalnych w DNA pozagenowymi intronów w genach

- zależność między wielkością genomu jądrowego a jego złożonością

->BRAK bezpośredniej, dokładnej korelacji

- czy jest zależność między wielkością genomu eukariotycznego a liczbą genów

NIE - > S. cerevisiae – genom 12 Mb (0,004 genomu człowieka = 3 200Mb) -ok. 6000 genów z
porównania do genomu człowieka –powinno być mniej niż 140
Eukaryota różnią się wielkością genomów i liczbą genów
Wzrost liczby genówu organizmów o wyższej złożoności
Liczba genów u organizmów, których genomy zsekwencjonowano, waha się od 470 do > 45 000

- budowa (cechy charakterystyczne) genów eukariotycznych, rozmieszczenie genów w

chromosomach
NA OGÓŁ: BARDZIEJ ZŁOŻONE EUKARIOTA to MNIEJ ZWARTE GENOMY
Gęstość genów w chromosomie zmienna, w zależności od miejsca w chromosomie duże różnice:
Gęstość genów w chromosomie Arabidopsis: 1-38 genów na 100 kb, (ALE w odcinkach
centromerowych 7-9 genów na 100 kb)
Gęstość genów w chromosomie człowieka: 0-64 genów na 100 kb

Typowy gen Eukaryota ma podzieloną budowę, czyli zawierają egzony i introny. Podzielona budowa
GENU dominuje u wyższych Eukaryota.
Egzony można identyfikować na podstawie sekwencji je flankujących oraz ORF (open reading
frame=otwarta ramka odczytu; każda sekwencją DNA lub RNA, która potencjalnie może ulec
translacji na białko. ORF mieści się w genie między kodonem 'START' a kodonem 'STOP'.)
Zgodne sekwencje na granicy egzonów i intronów w prekursorowym mRNA, umożliwiające
precyzyjne wycięcie intronu -> np. Fragment mRNA genu eukariotycznego zawierający intron typu
5’GU -AG 3’
Geny kodujące białka zawierają tzw.otwarte ramki odczytu (ORF), składające się z serii kodonów
wyznaczających sekwencje aminokwasów w białku
ORF zaczyna się od kodonu start inicjującego translację (zazwyczaj ATG), a kończy jednym z kodonów
stop (TAA, TAG, TGA).
Rozmiary GENÓW rosną wraz z wzrostem podzielonej budowy genu ->wskutek większej liczby,
dłuższych INTRONÓW
Egzony–śr. długość 100-200 bp Introny –różna długość
W przeciętnym genie człowieka tylko 4% to sekwencje kodujące

PODSUMOWANIE BUDOWY GENÓW:

1.Większość genów - budowa niepodzielona u drożdży (niższe Eukaryota) ALE budowa podzielona u
wyższych Eukaryota
2. Egzony-zazwyczaj krótkie (100-200 bp), typowy egzon koduje mniej niż 100 aminokwasów
3. Długość genu zależy głównie od liczby i długości jego intronów
4. Introny mogą mieć różną długość (0,5 -100 kb)
5. Sekwencje egzonów są konserwowane ewolucyjnie, sekwencje intronów szybciej ewoluują
6. Pozycja intronów w homologicznych genach różnych organizmów jest często konserwowana, lecz
ich długość może znacznie się różnić

- typy rodzin genowych + przykłady

Wiele genów tworzy RODZINY GENÓW

1.Rodzina genów –to grupa genów w obrębie genomu, kodujących pokrewne lub identyczne białka
(lub RNA)
2. Rodzina genów powstała na drodze duplikacji ancestralnego genu i nagromadzenia mutacji w jego
kopiach
3. Geny w rodzinie genów mają podobną budowę

TYPY RODZIN GENÓW:

➔ RODZINA PROSTA (klasyczna)
-geny dla rRNA człowieka
280 kopii jednostki zawierającej geny dla: 28S, 5.8S i 18S rRNA
(zgrupowania w 5 chromosomach: 13, 14, 15, 21, 22 każde zgrupowanie z 50-70 kopii
transkrybowanych jako 45S rRNA i przedzielonych nietranskrybowanymi odcinkami
(tzw.'spacer‘))
2000 kopii genu dla 5S rRNA (zgrupowanie w chromosomie 1)
–Geny dla tRNA występują w wielu kopiach u Pro-i Eukaryota
-Geny histonów występują w zgrupowaniach,a te zgrupowania w wielu kopiach

➔ RODZINY ZŁOŻONE
Zgrupowania ludzkich genów α- i β-globinowych
 Sekwencje najbardziej zróżnicowanych genów z grupy β-globin tj. genów β i ε -globiny
wykazują 79% identyczności
Pseudogen θ jest transkrybowany, lecz produkuje niefunkcjonalne białko, pozostałe
pseudogeny nie są transkrybowane
Geny α- i β-globin mają podobną budowę

U wyższych Eukaryota zwiększa się liczba genów lecz nie liczba samych RODZIN GENÓW
Procent unikalnych genów maleje wraz z wielkością genomów, a procent genów należących do
RODZIN WIELOGENOWYCH wzrasta.

Funkcje genów:
->większość genów człowieka koduje białka
-Przekazywanie sygnału (21,1%)
-Ekspresja, replikacja i utrzymywanie genomu (23,2%)
-Procesy transportu biochemicznego; fałdowanie białek; procesy immunologiczne;białka
strukturalne (38,2%)
-Ogólne biochemiczne funkcje komórki (17,5%)
->ok. 2500 genów koduje funkcjonalne RNA

- sekwencje powtórzonego DNA w genomie jądrowym, rodzaje, powstawanie, rola

Sekwencje powtórzone w genomie

➔ Powtórzenia rozproszone
 ➔ DNA powtórzony tandemowo
◆ DNA satelitarny powtórzony tandemowo
● wirowanie w gradiencie gęstości -uwidocznienie DNA satelitarnego
● Satelitarny DNA reprezentuje wysoko-powtarzalne sekwencje o
nietypowym, w stosunku do całego genomu, składzie par G/C do A/T
● Większość satelitarnego DNA ma długość kilkuset tysięcy par zasad i
zlokalizowana jest w rejonach centromerowych i przycentromerowych

◆ VNTR -Variable Number of Tandem Repeats = sekwencje o zmiennej liczbie

tandemowych powtórzeń

● minisatelitarne:jednostka powtarzająca się 10-25 (60) pz,

zgrupowania do 20 kpz powtórzone w genomie tysiące razy
np. DNA telomerowy
Wykorzystanie VNTR (markerów minisatelitarnych) w badaniach o
ustalanie ojcostwa

● mikrosatelitarne:powtarzająca się jednostka 1-6 (10) pz,

zgrupowanie do kilkuset pz powtórzone w genomie setki tysięcy razy
Mikrosatelity o powtórzeniach dwunukleotydowych:140,000 kopii w
genomie, połowa to AC
Powtórzenia pojedynczych nukleotydów, np. AAAAAA -120,000 kopii

->Powstawanie zmian w liczbie kopii sekwencji powtarzalnej w wyniku poślizgu polimerazy podczas
replikacji
-> Powstawanie zmian w liczbie kopii sekwencji powtarzalnej w wyniku nierównomiernego c/o w
mejozie

- powstawanie nowych genów u Eukariota (przez duplikacje: od fragmentu DNA po cały genom),
przykłady poliploidów

Powstawanie nowych genów przez duplikację:

1. całego genomu (poliploidyzacja)
2. pojedynczego chromosomu lub jego części
3. pojedynczego genu lub grupy genów, fragmentów genów

Poliploidalność - posiadanie przez organizm więcej niż dwóch kompletnych zestawów chromosomów
➔ Autopoliploidalność (euploidalność)
- zduplikowanie całego zestawu chromosomów
-nie są zdolne do krzyżowania się z organizmami posiadającymi pełną liczbę chromosomów
Mechanizm:
•nieprawidłowy przebieg mejozy (powstanie niezredukowanych gamet)
•endoploidyzacja w komórkach linii płciowej
Skutki:
•Szybkie powstawanie nowych gatunków
•BEZPOŚREDNIO nie prowadzi do zwiększenia liczby genów
•dodatkowe kopie chromosomów posiadają DODATKOWE kopie genów
•Kopie genów -możliwość podlegania MUTACJOM bez zakłócania żywotności organizmu
•Zdarzała się dość często w ewolucji niektórych grup

➔ Autopoliploidalność (aneuploidalność) np. trisomiki, tetrasomiki

Mechanizm:
•nondysjunkcja (nie rozejście się )pojedynczych chromosomów w mejozie
Skutki:
•powstanie osobników z zaburzeniami, często śmiertelne
•Niewielkie znaczenie ewolucyjne
Mieszańce autopoliploidów i diploidalnych form rodzicielskich są zazwyczaj sterylne –szybka
specjacja formy poliploidalnej

->powstanie gamet o niezdredukowanej liczbie chromosomów, jeśli połączą się 2 takie same
gamety to powstanie eutatetraploid, bariera w krzyżowaniu się z organizmem produkującym
gamety o prawidłowej liczbie chromosomów ( nieprawidłowość parowania się
chromosomów w dalszej mejozie)

Autopoliploidy - przykłady:
Autopoliploidalność dość częsta u roślin:
 Przykład: Gatunek wiesiołka -Oenothera gigas–to tetraploid ,pochodzący z gatunku
diploidalnego wiesiołka Oenothera lamarckiana
Autopoliploidalność rzadka u zwierząt:
Zwłaszcza mających dwie odrębne płci (bo pojawia się problem więcej niż jednej pary
chromosomów płci)
Przykład: Gryzoń z rodzaju wiskacza w Argentynie -tetraploid

➔ Allopoliploidalność

Mechanizm:
•krzyżowanie międzygatunkowe ("poziome" przekazywanie genów) a następnie powstanie u
mieszańca niezredukowanych gamet
•połączenie gamet z dwóch najczęściej blisko spokrewnionych gatunków, tworzy się
mieszaniec międzygatunkowy (nie jest allopoliploidem) jeśli powstaną u mieszańca
niezredukowane gamety zawierające pełne zestawy chromosomów z obu gatunków.

Skutki:
•Powstawanie nowych gatunków (specjacja)
Przykłady:
Pochodzenie pszenicy twardej (Triticum durum) i pszenicy uprawnej (Triticum aestivum) -
heksaallopoliploid

Duplikacje całych genomów zachodziło w przeszłości u Eukaryota

Dowód-ślady duplikacji pozostałe w genomach: występowanie zduplikowanych grup genów z
zachowaniem ich kolejności
Ogółem, w genomie człowieka występuje 1077 zduplikowanych fragmentów, obejmujących 10 310
genów

- co dzieje się z zduplikowaną kopia genu?

➔ Pozostawienie identycznych / bardzo podobnych kopii zduplikowanych genów –jeśli jest to
korzystne ewolucyjnie (STABILIZACJA DUPLIKACJI)
‘Ewolucja zespołowa’-wielokrotna konwersja genów może doprowadzić do utrzymania
identyczności sekwencji poszczególnych członków rodziny wielogenowej klasycznej (prostej)
Konwersja genów –zapewnia utrzymanie identyczności zduplikowanych kopii genów, jest to
zamiana jednej kopii genu na inną, by utrzymać / zwiększać ilość kopii danego genu
- elementy transpozonowe mogą występować w wielu kopiach, może zajść
rekombinacja - wymiana odcinków między chromosomami właśnie w tych miejscach
gdzie znajdują się el. transpozonowe jednego typu
- zduplikowany fragment znajduje się sąsiadująco do fragmentu oryginalnego
- zależnie od presji selektywnej na dany organizm
- ewolucja zespołowa - jeżeli korzystne jest pozostanie dwóch kopii obok
siebie, które dają ten sam produkt i były aktywne to ta kopia dalej pełni
swoją rolę i pozostaje identyczna / bardzo zbliżona do kopii oryginalnej ->
jeśli produkt końcowy białkowy / RNA danego genu jest potrzebny i im
więcej tym lepiej np. rodzina prosta ( geny produkujące rRNA / tRNA),

- w mejozie powinny powstać 2 gamety z allelem A i 2 gamety z allelem a, ale wskutek

zamiany odcinka między tymi chromosomami w miejscu genu A lub a może dojść do
wycięcia jednego z alleli i zastąpienia allelem z drugiego chromosomu
- 3A i 1a -> jeśli powstanie nieprawidłowa kopia tego genu dla rRNA któregoś
z tych typów to jest ona na zasadzie konwersji zamieniana na kopię
oryginalną, by utrzymać prawidłowe kopie oryginałów, by wszystkie mogły
dawać identyczne produkty w wyniku czego będzie możliwa efektywna,
precyzyjna translacja
➔ Kopie zduplikowanych genów gromadzą mutacje i stają się nieaktywne, gdy obecność kopii
genów nie przynosi korzyści (brak presji selekcyjnej na kopię genu)
kopia genu może bez szkody dla organizmu gromadzić mutacje, w efekcie przestaje
funkcjonować prawidłowo i zostaje pseudogenem
◆ Pseudogeny
● niefunkcjonalne kopie genu
● Pseudogeny zwykłe –kopie genów, które stały się nieaktywne z powodu
akumulacji mutacji
● Pseudogeny akumulują mutacje

➔ Kopie zduplikowanych genów zyskują nowe funkcje (presja selekcyjna na jeden gen)
- akumulacja mutacji - powstanie mutacji korzystnej dla organizmu
- geny ułożone jeden za drugim - u przodka nastąpiła duplikacja
- geny funkcjonują u dorosłych (bardzo podobne) i geny funkcjonujące w życiu
zarodkowym ( prawdopodobnie jedna z kopii oryginalnej genu, która zyskała nowe
funkcje i zmieniła okres aktywności )
- mechanizmy duplikacji fragmentów sekwencji DNA (duplikacje fragmentów genów, duplikacje
genów, duplikacje grup genów)

1. Nierówny c/o między chromatydami nie siostrzanymi i Nierówna wymiana siostrzanych

chromatyd -> udział powstawania nowych genów
EL. TRANSPOZONOWE – rola w generowaniu rekombinacji między chromosomami lub w obrębie
tego samego chromosomu
SKUTEK -rearanżacje genomów, w tym duplikacje fragmentów genomu

- inwersja / delecja fragmentu chromosomu ( w obrębie chromosomu)

1.1. Model duplikacji genów poprzez nierówny c/o w obrębie sekwencji powtarzalnych
(el. transpozonowych) między homologicznymi chromosomami na przykładzie
 rodziny genów globin

Porównanie zespołów genów β -globinowych człowieka i myszy z zaznaczeniem położenia

transpozonów

2. Odwrotna transkrypcja (retrogeny)

2.1. Zduplikowane kopie genów powstałe przez odwrotną transkrypcję…
 2.1.1. ...mRNA
- RETROPSEUDOGENY = Pseudogeny przetworzone -powstałe
wskutek odwrotnej transkrypcji mRNA genu do cDNA i wstawienie
do genomu, nieaktywna kopia bez promotora i intronów
- fragment cDNA RETROPSEUDOGENU został wstawiony w pobliżu
promotora innego genu -> fragment jest transkrybowany więc jest
RETROGENEM
2.1.2. ...antysensownego mRNA -> jeśli przyjmie on promotor z genu znajdującego
się poniżej w nici DNA może ulec odwrotnej transkrypcji ->retropseudogen
od razu staje się retrogenem z własnym promotorem, bo jeśli nastąpi
transkrypcja nie własnego promotora ale z promotora obcego to zostaje
ztranskrybowany cały gen łącznie z promotorem właściwym; na podstawie
tej kopii nie będzie produkowane białko, bo RNA jest antysensowny i introny
nie zostaną wycięte, ale po odwrotnej transkrypcji może się stać
RETROGENEM

3. Duplikacja egzonów
3.1. Powstawanie nowych genów przez duplikację odcinków genu kodujących domeny,
czyli duplikacja domen –rearanżacje istniejących genów
-często każdy egzon daje konkretną strukturę (alfa / beta-kartka) duplikacja często
skutkuje dodaniem kolejnej domeny w białku, co może być korzystne
 3.2. Powstanie duplikacji egzonu w wyniku nierównego c/o w obrębie sekwencji
powtarzalnych
- w przypadku gdy na dwóch chromosomach homologicznych w intronach
między egzonami oraz za egzonami występują identyczne elementy
transpozonowe w mejozie chromosomy mogą ustawić się nieprawidłowo i
chromosomy będą się parować z przesunięciem, w wyniku czego w trakcie
c / o wymianie ulegną nierówne fragmenty (nierówny c /o) w efekcie
fragment, w którym nastąpi ta rekombinacja na jednym chromosomie
pojawi się w sposób zduplikowany, a na drugim będzie go mniej o ten
element. Efektem dla tego genu będzie to, że na jednym chromosomie
homologicznym zyska dodatkowy fragment, o który nastąpiło przesunięcie ,
który został objęty rekombinacją, natomiast na drugim chromosomie brak
będzie tego genu, więc na drugim chromosomie brak będzie tej domeny
tego egzonu. Być może będzie dalej funkcjonował ale w zmieniony sposób
lub straci swoją funkcję, bo produkt białkowy będzie niefunkcjonalny,
natomiast gen, który zyskał dodatkowy egzon wskutek nierównomiernego
c /o może stać się genem, który zyska nowe, lepsze funkcje.

Przykład duplikacji egzonów-polipeptyd kolagenu α2 typu I u kręgowców

•polipeptyd zbudowany z wielokrotnych powtórzeń Gly-X-Y

•gen kolagenu α2 kury kodujący 338 powtórzeń składa się z 52 egzonów
•liczba powtórzeń Gly-X-Y w egzonach zmienna (15, 18, 33, 36, 54)
4. Tasowanie egzonów- rearanżacja fragmentów genów
 4.1. Tasowanie domen –odcinki kodujące domeny strukturalne z zupełnie różnych genów
łączą się tworząc nową sekwencję kodującą

4.2. Powstawanie nowych genów przez tasowanie odcinków kodujących domeny z

różnych genów –rearanżacje istniejących genów
Modułowa budowa białka tkankowego aktywatora plazminogenu -przykład
tasowania egzonów

gen składa się z kilku domen strukturalnych, egzonów; na zasadzie podobieństwa tych sekwencji
kodujących stwierdzono, że prawdopodobnie pierwszy egzon, pierwsza domena tego genu pochodzi
z jakiegoś genu dla fibronektyny, genu który miał zdolność do wiązania z fibryną i w efekcie teraz
białku które powstaje ( aktywatora plazminogenu) daje zdolność do wiązania się z fibryną, która jest
w skrzepie, jest to gen, którego produkt reguluje krzepnięcie krwi.
Druga domena pochodzi z innego genu ( naskórkowego czynnika wzrostu), prawdopodobnie teraz w
genie aktywatora plazminogenu stymuluje podziały komórkowe, co jest dla tego genu korzystne bo
ma on regulować krzepnięcie krwi.
Kolejne 2 domeny pochodzą prawdopodobnie jeszcze z innego genu, z genu dla plazminogenu, który
także pomaga wiązać się ze skrzepem fibrynogenu.
W efekcie powstała hybryda - gen dla aktywatora plazminogenu, którego produkt białkowy to
połączenie domen z 3 innych domen genów, co zapewnia produktowi lepsze funkcjonowanie, bo ma
możliwość bardziej efektywnego wiązania się z fibryną w skrzepie, ma zdolność stymulacji podziałów
komórkowych.

EL. TRANSPOZONOWE –rola w przenoszeniu fragmentów genów (czyli w tasowaniu egzonów)