1.

Cięcie DNA w określonych miejscach przez nukleazy restrykcyjne, co znacznie ułatwia

izolację i manipulację poszczególnymi genami.

2. Klonowanie DNA poprzez zastosowanie wektorów do klonowania lub reakcję łańcuchową

polimerazy, podczas której pojedynczą cząsteczkę DNA można skopiować, tworząc wiele
miliardów identycznych cząsteczek.

3. Hybrydyzacja kwasów nukleinowych, która umożliwia znalezienie określonej sekwencji

DNA lub RNA z dużą dokładnością i czułością na podstawie jej zdolności do wiązania
komplementarnej sekwencji kwasu nukleinowego.

4. Szybkie sekwencjonowanie wszystkich nukleotydów w oczyszczonym fragmencie DNA,

co pozwala na identyfikację genów i wywnioskowanie sekwencji aminokwasowej
kodowanych przez nie białek.

5. Jednoczesne monitorowanie poziomu ekspresji każdego genu w komórce za pomocą

mikromacierzy kwasów nukleinowych, które pozwalają na jednoczesne przeprowadzenie
dziesiątek tysięcy reakcji hybrydyzacji.

W tym rozdziale opisujemy każdą z tych podstawowych technik, które razem

zrewolucjonizowały badania biologii komórki.
Large DNA Molecules Are Cut into Fragments by Restriction Nucleases
W przeciwieństwie do białka, gen nie istnieje jako odrębna jednostka w komórkach, ale raczej
jako mały region znacznie dłuższej cząsteczki DNA. Chociaż cząsteczki DNA w komórce
można losowo rozbić na małe kawałki za pomocą siły mechanicznej, fragment zawierający
pojedynczy gen w genomie ssaka nadal będzie tylko jednym spośród stu tysięcy lub więcej
fragmentów DNA, nie do odróżnienia pod względem średniej wielkości. Jak można oczyścić
taki gen? Ponieważ wszystkie cząsteczki DNA składają się z w przybliżeniu równej
mieszaniny tych samych czterech nukleotydów, nie można ich łatwo rozdzielić, tak jak mogą
to zrobić białka, na podstawie ich różnych ładunków i właściwości wiązania. Co więcej,
nawet gdyby można było opracować schemat oczyszczania, potrzebne byłyby ogromne ilości
DNA, aby uzyskać wystarczającą ilość dowolnego konkretnego genu, aby nadawał się do
dalszych eksperymentów.
Rozwiązanie wszystkich tych problemów zaczęło się pojawiać wraz z odkryciem nukleaz
restrykcyjnych. Enzymy te, które można oczyścić z bakterii, przecinają podwójną helisę DNA
w określonych miejscach określonych przez lokalną sekwencję nukleotydów, rozcinając w ten
sposób długą dwuniciową cząsteczkę DNA na fragmenty o ściśle określonych rozmiarach.
Różne nukleazy restrykcyjne mają różną specyficzność sekwencji i stosunkowo łatwo jest
znaleźć enzym, który może utworzyć fragment DNA zawierający określony gen. Wielkość

1
fragmentu DNA można następnie wykorzystać jako podstawę do częściowego oczyszczenia
genu z mieszaniny.

Różne gatunki bakterii wytwarzają różne nukleazy restrykcyjne, które chronią je przed
wirusami poprzez degradację przychodzącego wirusowego DNA. Każda nukleaza rozpoznaje
określoną sekwencję czterech do ośmiu nukleotydów w DNA. Sekwencje te, jeśli występują
w genomie samej bakterii, są chronione przed rozszczepieniem poprzez metylację reszty A
lub C; sekwencje w obcym DNA na ogół nie są metylowane i dlatego są rozcinane przez
nukleazy restrykcyjne. Z różnych gatunków bakterii oczyszczono dużą liczbę nukleaz
restrykcyjnych; kilkaset, z których większość rozpoznaje różne sekwencje nukleotydów, jest
obecnie dostępnych na rynku.
Niektóre nukleazy restrykcyjne wytwarzają nacięcia naprzemienne, które pozostawiają
krótkie jednoniciowe ogony na dwóch końcach każdego fragmentu (Rysunek 8.21). Końce
tego typu nazywane są końcami spójnymi, ponieważ każdy ogon może tworzyć
komplementarne pary zasad z ogonem na dowolnym innym końcu wytwarzanym przez ten
sam enzym (Rysunek 8.22). Spójne końce generowane przez enzymy restrykcyjne
umożliwiają łatwe połączenie ze sobą dowolnych dwóch fragmentów DNA, pod warunkiem,
że fragmenty zostały wygenerowane przy użyciu tej samej nukleazy restrykcyjnej (lub innej
nukleazy, która wytwarza te same spójne końce). Cząsteczki DNA powstałe w wyniku splotu
dwóch lub większej liczby fragmentów DNA nazywane są cząsteczkami rekombinowanego
DNA; umożliwiły wiele nowych typów badań biologii komórkowej.

Sekwencje nukleotydowe DNA rozpoznawane przez cztery powszechnie stosowane nukleazy

restrykcyjne. Jak w pokazanych przykładach, takie sekwencje mają często sześć par zasad i są
„palindromiczne” (to znaczy sekwencja nukleotydów jest taka sama, jeśli helisa jest
odwrócona (więcej...)
Nukleazy restrykcyjne wytwarzają fragmenty DNA, które można łatwo łączyć ze sobą.
Fragmenty o tych samych spójnych końcach można łatwo połączyć poprzez komplementarne
parowanie zasad pomiędzy ich spójnymi końcami, jak pokazano. Dwa fragmenty DNA, które
łączą się w tym przykładzie (więcej...)

Elektroforeza żelowa oddziela cząsteczki DNA o różnych rozmiarach

Długość i czystość cząsteczek DNA można dokładnie określić za pomocą tych samych metod
elektroforezy żelowej, które okazały się tak przydatne w analizie białek. Procedura jest w
rzeczywistości prostsza niż w przypadku białek: ponieważ każdy nukleotyd w cząsteczce
kwasu nukleinowego ma już pojedynczy ładunek ujemny, nie ma potrzeby dodawania
ujemnie naładowanego detergentu SDS, który jest wymagany, aby cząsteczki białka
poruszały się równomiernie w kierunku elektrody dodatniej. W przypadku fragmentów DNA
o długości mniejszej niż 500 nukleotydów specjalnie zaprojektowane żele poliakryloamidowe
umożliwiają rozdzielenie cząsteczek różniących się długością zaledwie o jeden nukleotyd
(Rysunek 8-23A). Pory w żelach poliakryloamidowych są jednak zbyt małe, aby umożliwić
przejście bardzo dużych cząsteczek DNA; aby rozdzielić je według wielkości, stosuje się

2
znacznie bardziej porowate żele utworzone przez rozcieńczone roztwory agarozy
(polisacharyd izolowany z wodorostów) (Rysunek 8-23B). Te metody separacji DNA są
szeroko stosowane zarówno do celów analitycznych, jak i preparatywnych.

Techniki elektroforezy żelowej do rozdzielania cząsteczek DNA według wielkości. W trzech

pokazanych przykładach elektroforeza przebiega od góry do dołu, tak że największe – a
zatem najwolniej poruszające się – cząsteczki DNA znajdują się w pobliżu szczytu żelu. W
(A) poliakryloamid (więcej...)

Odmiana elektroforezy w żelu agarozowym, zwana elektroforezą w żelu w polu pulsacyjnym,

umożliwia rozdzielenie nawet bardzo długich cząsteczek DNA. Zwykła elektroforeza żelowa
nie rozdziela takich cząsteczek, ponieważ stałe pole elektryczne rozciąga je w taki sposób, że
przemieszczają się przez żel od końca, tworząc wężowe konfiguracje z szybkością niezależną
od ich długości. Natomiast w elektroforezie żelowej w polu pulsacyjnym kierunek pola
elektrycznego zmienia się okresowo, co zmusza cząsteczki do zmiany orientacji, zanim będą
mogły dalej poruszać się w żelu niczym wąż. Ta reorientacja zajmuje znacznie więcej czasu
w przypadku większych cząsteczek, tak że dłuższe cząsteczki poruszają się wolniej niż
krótsze. W rezultacie nawet całe chromosomy bakteryjne lub drożdżowe rozdzielają się na
dyskretne prążki w żelach pola pulsacyjnego, dzięki czemu można je sortować i
identyfikować na podstawie ich wielkości (Rysunek 8-23C). Chociaż typowy ssaczy
chromosom składający się ze 108 par zasad jest zbyt duży, aby można go było sortować
nawet w ten sposób, duże segmenty tych chromosomów można łatwo oddzielić i
zidentyfikować, jeśli chromosomalny DNA zostanie najpierw przecięty nukleazą restrykcyjną
wybraną tak, aby rozpoznawała sekwencje, które występują rzadko ( raz na 10 000 lub więcej
par nukleotydów).

Prążki DNA na żelach agarozowych lub poliakryloamidowych są niewidoczne, chyba że

DNA jest w jakiś sposób oznakowane lub zabarwione. Jedną z czułych metod barwienia DNA
jest wystawienie go na działanie barwnika, bromku etydyny, który fluoryzuje w świetle
ultrafioletowym, gdy jest związany z DNA. Jeszcze bardziej czuła metoda wykrywania
polega na włączeniu radioizotopu do cząsteczek DNA przed elektroforezą; Często stosuje się
32P, ponieważ można go włączyć do fosforanów DNA i emituje energetyczną cząsteczkę β,
którą można łatwo wykryć autoradiografią
3
Oczyszczone cząsteczki DNA można specyficznie znakować radioizotopami lub markerami
chemicznymi in vitro.
Do znakowania izolowanych cząsteczek DNA powszechnie stosuje się dwie procedury. W
pierwszej metodzie polimeraza DNA kopiuje DNA w obecności nukleotydów, które są albo
radioaktywne (zwykle znakowane 32P), albo znakowane chemicznie (Rysunek 8-24A). W ten
sposób można wytworzyć „sondy DNA” zawierające wiele znakowanych nukleotydów do
reakcji hybrydyzacji kwasów nukleinowych (omówione poniżej). Druga procedura
wykorzystuje kinazę polinukleotydową enzymu bakteriofaga do przeniesienia pojedynczego
fosforanu znakowanego 32P z ATP na koniec 5' każdego łańcucha DNA (Rysunek 8-24B).
Ponieważ tylko jeden atom 32P jest włączany przez kinazę do każdej nici DNA, cząsteczki
DNA znakowane w ten sposób często nie są wystarczająco radioaktywne, aby można je było
wykorzystać jako sondy DNA; ponieważ są oznaczone tylko na jednym końcu, okazały się
jednak nieocenione w innych zastosowaniach, w tym w śledzeniu śladów DNA, jak się
wkrótce przekonamy.

Metody znakowania cząsteczek DNA in vitro. (A) Oczyszczony enzym polimeraza DNA
znakuje wszystkie nukleotydy w cząsteczce DNA i może w ten sposób wytwarzać wysoce
radioaktywne sondy DNA. (B) Kinaza polinukleotydowa znakuje tylko końce 5' nici DNA;
(więcej...)

Obecnie metody znakowania radioaktywnego zastępowane są znakowaniem cząsteczkami,

które można wykryć chemicznie lub poprzez fluorescencję. Do wytworzenia takich
nieradioaktywnych cząsteczek DNA wykorzystuje się specjalnie zmodyfikowane prekursory
nukleotydów (Rysunek 8-24C). Cząsteczka DNA wytworzona w ten sposób może związać się
z komplementarną sekwencją DNA poprzez hybrydyzację, jak omówiono w następnej sekcji,
a następnie jest wykrywana za pomocą przeciwciała (lub innego liganda), które specyficznie
rozpoznaje jej zmodyfikowany łańcuch boczny.

Reakcje hybrydyzacji kwasów nukleinowych zapewniają czuły sposób wykrywania

określonych sekwencji nukleotydów.
Gdy wodny roztwór DNA zostanie ogrzany do temperatury 100°C lub wystawiony na
działanie bardzo wysokiego pH (pH ≥ 13), komplementarne pary zasad, które normalnie
spajają dwie nici podwójnej helisy, zostają rozerwane, a podwójna helisa szybko dysocjuje na
dwie pojedyncze pasma. Przez wiele lat uważano, że proces ten, zwany denaturacją DNA, jest
nieodwracalny. Jednakże w 1961 roku odkryto, że komplementarne pojedyncze nici DNA
łatwo przekształcają podwójne helisy w procesie zwanym hybrydyzacją (zwaną także
renaturacją DNA), jeśli są przechowywane przez dłuższy czas w temperaturze 65°C. Podobne
reakcje hybrydyzacji mogą zachodzić pomiędzy dowolnymi dwoma jednoniciowymi
łańcuchami kwasów nukleinowych (DNA/DNA, RNA/RNA lub RNA/DNA), pod
warunkiem, że mają one komplementarne sekwencje nukleotydowe. Te specyficzne reakcje

4
hybrydyzacji są szeroko stosowane do wykrywania i charakteryzowania specyficznych
sekwencji nukleotydowych zarówno w cząsteczkach RNA, jak i DNA.

Jednoniciowe cząsteczki DNA używane do wykrywania sekwencji komplementarnych

nazywane są sondami; cząsteczki te, które niosą markery radioaktywne lub chemiczne
ułatwiające ich wykrywanie, mogą mieć długość od piętnastu do tysięcy nukleotydów.
Reakcje hybrydyzacji z wykorzystaniem sond DNA są tak czułe i selektywne, że pozwalają
wykryć sekwencje komplementarne obecne w stężeniu zaledwie jednej cząsteczki na
komórkę. Można zatem określić, ile kopii dowolnej sekwencji DNA występuje w danej
próbce DNA. Tę samą technikę można zastosować do wyszukiwania pokrewnych, ale
nieidentycznych genów. Aby znaleźć interesujący gen w organizmie, którego genom nie
został jeszcze zsekwencjonowany, można na przykład zastosować część znanego genu jako
sondę.

Różne warunki hybrydyzacji pozwalają na mniej niż idealne dopasowanie DNA. Gdy
pożądane jest jedynie identyczne dopasowanie do sondy DNA, reakcję hybrydyzacji
utrzymuje się zaledwie kilka stopni poniżej temperatury, w której doskonała helisa DNA
ulega denaturacji.

Geny można sklonować z biblioteki DNA.

Można sklonować dowolny fragment DNA zawierający interesujący gen. W biologii komórki
termin klonowanie DNA jest używany w dwóch znaczeniach. W pewnym sensie dosłownie
odnosi się do czynności tworzenia wielu identycznych kopii cząsteczki DNA — amplifikacji
określonej sekwencji DNA. Jednak termin ten jest również używany do opisania izolacji
określonego odcinka DNA (często określonego genu) od reszty DNA komórki, ponieważ tę
izolację znacznie ułatwia wykonanie wielu identycznych kopii DNA będącego przedmiotem
zainteresowania.

Klonowanie DNA w najbardziej ogólnym sensie można przeprowadzić na kilka sposobów.

Najprostszy polega na wstawieniu określonego fragmentu DNA do oczyszczonego genomu
DNA samoreplikującego się elementu genetycznego — zwykle wirusa lub plazmidu. Na
przykład fragment DNA zawierający ludzki gen można połączyć w probówce z
chromosomem wirusa bakteryjnego, a następnie nową, rekombinowaną cząsteczkę DNA
można wprowadzić do komórki bakteryjnej. Zaczynając od tylko jednej takiej
rekombinowanej cząsteczki DNA, która infekuje pojedynczą komórkę, normalne
mechanizmy replikacji wirusa mogą wytworzyć ponad 1012 identycznych cząsteczek DNA
wirusa w mniej niż jeden dzień, zwiększając w ten sposób ilość wstawionego ludzkiego
fragmentu DNA o ten sam współczynnik . Wirus lub plazmid zastosowany w ten sposób
nazywany jest wektorem do klonowania i mówi się, że DNA namnażony przez wstawienie do
niego został sklonowany.

5
Aby wyizolować konkretny gen, często zaczyna się od skonstruowania biblioteki DNA —
obszernego zbioru sklonowanych fragmentów DNA z komórki, tkanki lub organizmu.
Biblioteka ta zawiera (można mieć nadzieję) co najmniej jeden fragment zawierający gen
będący przedmiotem zainteresowania. Biblioteki można skonstruować albo z wirusa, albo z
wektora plazmidowego i zazwyczaj umieszcza się je w populacji komórek bakteryjnych.
Zasady leżące u podstaw metod stosowanych do klonowania genów są takie same dla obu
typów wektorów do klonowania, chociaż szczegóły mogą się różnić. Obecnie większość
klonowania przeprowadza się za pomocą wektorów plazmidowych.
Wektory plazmidowe najczęściej stosowane do klonowania genów to małe, okrągłe
cząsteczki dwuniciowego DNA pochodzące z większych plazmidów, które naturalnie
występują w komórkach bakteryjnych. Na ogół stanowią one jedynie niewielką część
całkowitego DNA komórki bakteryjnej gospodarza, ale ze względu na ich mały rozmiar
można je łatwo oddzielić od cząsteczek chromosomalnego DNA, które są duże i wytrącają się
w postaci osadu po odwirowaniu. W celu zastosowania jako wektory do klonowania,
oczyszczone krążki plazmidowego DNA wycina się najpierw nukleazą restrykcyjną w celu
utworzenia liniowych cząsteczek DNA. Komórkowy DNA, który ma być użyty do
konstruowania biblioteki, jest cięty tą samą nukleazą restrykcyjną, a powstałe fragmenty
restrykcyjne (w tym te zawierające gen, który ma zostać sklonowany) są następnie dodawane
do przeciętych plazmidów i przyłączane poprzez ich spójne końce, tworząc rekombinowany
DNA koła. Te rekombinowane cząsteczki zawierające obce wstawki DNA są następnie
kowalencyjnie uszczelniane za pomocą enzymu ligazy DNA.
Wstawienie fragmentu DNA do plazmidu bakteryjnego za pomocą enzymu ligazy DNA.
Plazmid rozcina się nukleazą restrykcyjną (w tym przypadku wytwarzającą spójne końce) i
miesza z fragmentem DNA przeznaczonym do klonowania (który został przygotowany).
W następnym etapie przygotowania biblioteki, zrekombinowane kręgi DNA wprowadza się
do komórek bakteryjnych, którym nadano przejściową przepuszczalność dla DNA; mówi się,
że takie komórki są transfekowane plazmidami. W miarę wzrostu i podziału tych komórek,
podwajając liczbę co 30 minut, rekombinowane plazmidy również replikują, tworząc
ogromną liczbę kopii kręgów DNA zawierających obce DNA (Rysunek 8-31). Wiele
plazmidów bakteryjnych zawiera geny oporności na antybiotyki, co można wykorzystać do
selekcji komórek, które zostały pomyślnie transfekowane; jeśli bakterie będą hodowane w
obecności antybiotyku, przeżyją tylko komórki zawierające plazmidy. Każda oryginalna
komórka bakteryjna, która została początkowo transfekowana, zawiera na ogół inną obcą
wstawkę DNA; wstawka ta jest dziedziczona przez wszystkie komórki potomne tej bakterii,
które razem tworzą małą kolonię na szalce hodowlanej.
Oczyszczanie i amplifikacja określonej sekwencji DNA poprzez klonowanie DNA w bakterii.
Aby wytworzyć wiele kopii określonej sekwencji DNA, fragment ten najpierw wstawia się do
wektora plazmidowego. Powstały rekombinowany plazmid.

Przez wiele lat plazmidy stosowano do klonowania fragmentów DNA o długości od 1000 do
30 000 par nukleotydów. Większe fragmenty DNA są trudniejsze w obsłudze i trudniej je
sklonować. Następnie badacze zaczęli wykorzystywać sztuczne chromosomy drożdżowe
(YAC), które były w stanie poradzić sobie z bardzo dużymi fragmentami DNA (ryc. 8.32).

6
Obecnie nowe wektory plazmidowe oparte na naturalnie występującym plazmidzie F E. coli
są wykorzystywane do klonowania fragmentów DNA o długości od 300 000 do 1 miliona par
nukleotydów. W przeciwieństwie do mniejszych plazmidów bakteryjnych, plazmid F — i
jego pochodna, sztuczny chromosom bakteryjny (BAC) — występuje tylko w jednej lub
dwóch kopiach na komórkę E. coli. Fakt, że BAC są utrzymywane w tak małych ilościach w
komórkach bakteryjnych, może przyczynić się do ich zdolności do stabilnego utrzymywania
dużych sklonowanych sekwencji DNA: przy obecności tylko kilku BAC jest mniej
prawdopodobne, że sklonowane fragmenty DNA ulegną pomieszaniu w wyniku rekombinacji
z sekwencjami przenoszone na innych kopiach plazmidu. Ze względu na swoją stabilność,
zdolność przyjmowania dużych wstawek DNA i łatwość obsługi, BAC są obecnie
preferowanym wektorem do budowania bibliotek DNA złożonych organizmów, w tym
reprezentujących genomy człowieka i myszy. Wytwarzanie sztucznego chromosomu
drożdżowego (YAC). Wektor YAC umożliwia klonowanie bardzo dużych cząsteczek DNA.
TEL, CEN i ORI to odpowiednio telomer, centromer i miejsce rozpoczęcia replikacji dla
drożdży Saccharomyces cerevisiae.
Wybrane segmenty DNA można sklonować w probówce za pomocą reakcji łańcuchowej
polimerazy.
Teraz, gdy dostępnych jest tak wiele sekwencji genomu, geny można klonować bezpośrednio,
bez konieczności wcześniejszego konstruowania bibliotek DNA. Szybkie klonowanie
umożliwia technika zwana reakcją łańcuchową polimerazy (PCR). PCR umożliwia
miliardową amplifikację DNA z wybranego regionu genomu, skutecznie „oczyszczając” to
DNA z reszty genomu. Metoda PCR jest niezwykle czuła; może wykryć pojedynczą
cząsteczkę DNA w próbce. Śladowe ilości RNA można analizować w ten sam sposób,
najpierw dokonując ich transkrypcji na DNA za pomocą odwrotnej transkryptazy. Technika
klonowania PCR w dużej mierze zastąpiła metodę Southern blot w diagnostyce chorób
genetycznych i wykrywaniu niskiego poziomu infekcji wirusowej. Ma również ogromne
nadzieje w medycynie sądowej jako metoda analizy drobnych śladów krwi lub innych tkanek
– nawet tak małych jak pojedyncza komórka – i identyfikacji osoby, od której pochodzą, na
podstawie jej genetycznego „odcisku palca”.
Klonowanie DNA umożliwia wybranie kopii dowolnej określonej części sekwencji DNA
lub RNA spośród milionów innych sekwencji w komórce i wyprodukowanie w
nieograniczonej ilości w czystej postaci. Sekwencje DNA można amplifikować po pocięciu
chromosomalnego DNA nukleazą restrykcyjną i wstawieniu powstałych fragmentów DNA do
chromosomu samoreplikującego się elementu genetycznego. Powszechnie stosuje się wektory
plazmidowe, a powstała „biblioteka genomowego DNA” jest przechowywana w milionach
komórek bakteryjnych, z których każda niesie inny sklonowany fragment DNA. Poszczególne
komórki, którym pozwala się na proliferację, wytwarzają duże ilości pojedynczego
sklonowanego fragmentu DNA z tej biblioteki. Alternatywnie, reakcja łańcuchowa
polimerazy (PCR) umożliwia klonowanie DNA bezpośrednio przy użyciu oczyszczonej,
termostabilnej polimerazy DNA – pod warunkiem, że interesująca sekwencja DNA jest już
znana.
Procedury stosowane w celu uzyskania klonów DNA odpowiadających sekwencjom
cząsteczek mRNA są takie same, z tą różnicą, że najpierw wykonywana jest kopia DNA
sekwencji mRNA, zwana cDNA. W przeciwieństwie do klonów genomowego DNA, klonom

7
cDNA brakuje sekwencji intronów, co czyni je klonami z wyboru do analizy produktu
białkowego genu.

Reakcje hybrydyzacji kwasów nukleinowych zapewniają czuły sposób wykrywania genu lub
dowolnej innej wybranej sekwencji nukleotydowej. W rygorystycznych warunkach
hybrydyzacji (połączenie rozpuszczalnika i temperatury, w których idealna podwójna helisa
jest ledwo stabilna), dwie nici mogą połączyć się w parę, tworząc „hybrydową” helisę tylko
wtedy, gdy ich sekwencje nukleotydów są prawie idealnie komplementarne. Ogromna
specyficzność tej reakcji hybrydyzacji umożliwia znakowanie dowolnej jednoniciowej
sekwencji nukleotydów radioizotopem lub substancją chemiczną i wykorzystanie jej jako
sondy w celu znalezienia komplementarnej nici partnerskiej, nawet w komórce lub ekstrakcie
komórkowym, który zawiera miliony różnych DNA i RNA sekwencje. Sondy tego typu
znajdują szerokie zastosowanie w wykrywaniu kwasów nukleinowych odpowiadających
konkretnym genom, zarówno w celu ułatwienia ich oczyszczania i charakteryzacji, jak i
lokalizacji w komórkach, tkankach i organizmach. Sekwencję nukleotydową oczyszczonych
fragmentów DNA można szybko i łatwo określić, stosując wysoce zautomatyzowane techniki
sekwencjonowania DNA oparte na metodzie dideoksy. Technika ta umożliwiła określenie
pełnych sekwencji DNA dziesiątek tysięcy genów i całkowite zsekwencjonowanie genomów
wielu organizmów. Porównanie sekwencji genomów różnych organizmów pozwala
prześledzić powiązania ewolucyjne między genami i organizmami, a także okazało się cenne
w odkrywaniu nowych genów i przewidywaniu ich funkcji.

Podsumowując, techniki te umożliwiły identyfikację, izolację i sekwencjonowanie genów

dowolnego interesującego organizmu. Powiązane technologie pozwalają naukowcom
wytwarzać produkty białkowe tych genów w dużych ilościach potrzebnych do szczegółowych
analiz ich struktury i funkcji, a także do celów medycznych.