ELEKTROFOREZA ELEKTROFOREZA W ELU AGAROZOWYM Agaroza to frakcja agaru oczyszczona z krasnorostw, w postaci handlowej jest biaym lub lekko

tym proszkiem. Jest to polisacharyd zbudowany z okoo 800 liniowo poczonych reszt heksozy (inaczej 400 reszt agarobioza). Agarobioza jest dwucukrem zbudowanym z D-galaktozy i 3,6-anhydro-L-galaktozy. Powstawanie elu agarozowego jest reakcj odwracaln, w wyniku ktrej pojedyncze, losowo zwinite acuchy ukadaj si w dwuniciow, helikaln struktur III-rzdow, ktre rozgaziaj si tworzc sie. Agaroza rozpuszcza si bardzo atwo w gotujcej si wodzie i pozostaje w stanie pynnym a do temperatury okoo 40C. Poniej tej temperatury zestala si w postaci porowatego elu. Po zestaleniu pozostaje w tej postaci nawet w podwyszonych temperaturach sigajcych kilkudziesiciu C. Rozmiary porowatoci mona regulowa stosujc agaroz w rnych steniach. Im wysze jest stenie agarozy, tym bogatsze jest usieciowanie i drobniejsze s pory. Zwykle przygotowuje si ele o steniach agarozy z przedziau 0,4-4,0%. Zalet eli agarozowych jest atwo i szybko ich przygotowania oraz moliwo separacji duych makromoleku np. DNA i RNA. Wad za jest saba wytrzymao mechaniczna eli oraz trudno ich utrwalania po rozdziale. Wyschnite ele rozsypuj si pod wpywem bardzo niewielkich si. el agarozowy stosuj si do rozdzielania DNA o szerokim zakresie mas czsteczkowych. Wad elektroforezy w elu agarozowym jest saba rozdzielczo frakcji DNA rnicego si poniej 5% wielkoci.

Elektroforeza w elu agarozowym prowadzona jest w aparatach ustawionych poziomo, a rozdzia elektroforetyczny prowadzony jest w buforze TBE1 (90 mM Tris-base, 90 mM kwas borowy, 2 mM EDTA, pH 8) lub TAE1 (40 mM Tris-base, 40 mM lodowy kwas octowy, 1 mM EDTA, pH 8).

Czsteczka DNA jest naadowana ujemnie w rodowisku obojtnym i alkalicznym, a wic umieszczona w polu elektrycznym, przemieszcza si w kierunku anody. DNA o tych samych masach czsteczkowych, ale rnych konformacjach charakteryzuje rna ruchliwo elektroforetyczna. Im dusza jest czsteczka DNA lub RNA tym duej odnajduje ona drog poprzez pory elu. Jeeli umiecimy DNA w elu agarozowym i przyoymy niskie napicie to prdko migracji DNA o rnych ciarach czsteczkowych jest proporcjonalna do napicia. Aby otrzyma optymalny rozdzia DNA o wielkoci wikszej ni 2 kp.z, elektroforeza prowadzona jest w polu elektrycznym o nateniu nie wikszym ni 5V/cm. Powyej tego napicia fragmenty DNA przemieszczaj si z prdkoci odwrotnie proporcjonaln do logarytmu ich ciaru

czsteczkowego. Elektroforetyczne zachowanie DNA w elu agarozowym nie zaley od skadu zasad azotowych i sabo zaley od temperatury. Jednak jeeli stosuje si ele agarozowe o steniu mniejszym ni 0,5% naley elektroforez prowadzi w temperaturze okoo 4C. Do uwidocznienia DNA po lub w trakcie elektroforezy stosowany jest rutynowo bromek etydyny (EtBr), ktry interkaluje pomidzy ssiednie pary dwuniciowego DNA (powinowactwo EtBr do jednoniciowego DNA jest znacznie sabsze) (skrypt str. 23). Naley pamita, e obecno zwizku interaklujcego do DNA w elu agarozowym zmniejsza ruchliwo elektroforetyczn DNA o okoo 15%. Innym barwnikiem DNA jest np. SYBR Green, ktrego czuo barwienia dwuniciowego DNA jest okoo 25 razy wiksza ni EtBr. ELEKTROFOREZA W ELU POLIAKRYLAMIDOWYM (PAGE) ele poliakrylamidowe - przygotowywane s z roztworu monomerw akrylamidu i substancji sieciujcych (ang. cross-linkers). Naley zawsze pamita, e akrylamid w postaci monomerycznej jest bardzo siln neurotoksyn i nawet po procesie polimeryzacji stanowi powane zagroenie dla zdrowia ze wzgldu na pozostaoci swobodnych monomerw w objtoci elu. Jako substanj sieciujc stosuje si najczciej N,N-metylenebisakrylamid (bis-akrylamid). Reakcj polimeryzacji, bdc w istocie wolnorodnikow reakcj polimeryzacji, mona zainicjowa chemicznie lub fotochemicznie. Przy chemicznej inicjacji procesu najczciej stosuje si nadsiarczan amonu w obecnoci katalizatora N,N,N,N-tetrametyletylenodiaminy (TEMED). Fotochemiczne wyzwolenie procesu polimeryzacji zachodzi w obecnoci ryboflawiny pod dziaaniem dugofalowego wiata UV i jest katalizowane przez TEMED. Ze wzgldu na wydzielanie si znacznych iloci ciepa podczas polimeryzacji akrylamidu, dla waciwego przebiegu procesu naley przestrzega odpowiedniego dozowania substancji inicjujcych i katalizujcych, tak aby czas polimeryzacji nie by krtszy od 30 minut. W szczeglnych przypadkach, gdy zawarto akrylamidu przekracza 15%, naley zapewni efektywne odprowadzanie powstaego ciepa poprzez umieszczenie kasety z polimeryzujcym elem w ani wodnej. Gsto sieciowania oraz rozmiary porw mona regulowa poprzez odpowiedni dobr stenia akrylamidu i bisakrylamidu. Waciwoci elu przyjto opisywa dwoma parametrami. Najczciej mwi si o cakowitym (ang. total) steniu akrylamidu: T [%] = ((akrylamid + bis-akrylamid) [g] / objto [ml]) x 100 Dopeniajcym parametrem jest wagowy stosunek iloci substancji sieciujcej do sumy akrylamidu i substancji sieciujcej: C [%] = (bis-akrylamid [g] / (akrylamid + bis-akrylamid) [g]) x 100 Ze wzrostem wartoci T maleje redni rozmiar porw. Natomiast minimalny rozmiar porw, przy zadanej wartoci T, uzyskuje si dla wartoci C = 5%. Powyej i poniej tej wartoci rozmiary porw wzrastaj. Elektroforeza w elu poliakrylamidowym jest wykorzystywana do rozdzielania gwnie biaek i analizy maych fragmentw DNA. W elektroforezie poliakrylamidowej najczciej stosuje si technik elektroforezy pionowej. W technice tej nonik elektroforetyczny wypenia szklane rurki (elektroforeza rurkowa) lub znajduje si pomidzy dwoma pytkami rozdzielonymi przekadkami dystansowymi (ang. spacer) (elektroforeza pytowa). Na poniszym rysunku pokazano schematycznie oba rodzaje elektroforezy pionowej.

Rys 2. Schematyczne przedstawienie

rodzajw elektroforezy pionowej. A. elektroforeza rurkowa (ang. tube elektrophoresis) B. elektroforeza pytowa (ang. slab electrophoresis)

Jak atwo zauway, grna cz nonika musi by przykryta warstw buforu elektrodowego (elektrolitu). Rozwizanie takie ma naturaln tendencj do wyciekania buforw z grnego naczynia, co wymaga uwagi laboranta podczas trwania rozdziau. Brak kontaktu elektrolitu z elem powoduje przerwanie obwodu elektrycznego i w zwizku z tym przerwanie procesu elektroforezy. Inn niedogodnoci tego rozwizania jest trudno z odprowadzeniem ciepa generowanego przez przepywajcy prd. Dotyczy to szczeglnie elektroforezy rurkowej. W przypadku elektroforezy pytowej moliwe jest odprowadzanie ciepa przez ciank kontaktujc si z jedn z pyt. Zalet tego typu rozwizania jest zwykle stosunkowo niska cena dostpnych na rynku aparatw. Metody elektroforetyczne stosowane w praktyce s pochodnymi lub kombinacj trzech podstawowych rodzajw separacji. S to: elektroforeza strefowa (ang. zone electrophoresis), izotachoforeza (ang. isotachphoresis) oraz ogniskowanie izoelektryczne (ang. isoelectric focusing). Elektroforeza strefowa - podstawowy i najszerzej stosowany rodzaj elektroforezy. Odbywa si w noniku, w ktrym elektrolit ma w caej objtoci sta warto pH. Rnica dystansw migracji poszczeglnych makrojonw, w cigu okrelonego czasu, w bezporedni sposb wynika z rnicy w ruchliwoci elektroforetycznej tych jonw w noniku w obecnoci pola elektrycznego. Izotachoforeza - w tym rodzaju elektroforezy rozdzia odbywa si w noniku, w ktrym wystpuje niecigo wartoci pH. Makrojony separowanej prbki migruj w obszarze pomidzy dwoma systemami elektrolitw o rnej wartoci pH i rnej ruchliwoci jonw elektrolitu. Elektrolit wiodcy (ang. leading electrolyte) zawiera jony o duej ruchliwoci elektroforetycznej, znacznie przewyszajcej ruchliwo makrojonw. Z kolei elektrolit zamykajcy (ang. tailing electrolyte) zawiera jony o bardzo niskiej ruchliwoci elektroforetycznej, zwykle znacznie niszej od ruchliwoci makrojonw. W obszarze pomidzy tymi dwoma elektrolitami znajduj si separowane makrojony. Wszystkie jony - wiodce, zamykajce oraz makrojony - migruj w tym obszarze z t sam prdkoci ale w cile okrelonym porzdku. Najpierw przemieszczaj si jony wiodce, a za nimi najszybsze makrojony. Potem kolejno makrojony zgodnie z ich malejc ruchliwoci i w kocu jony zamykajce. Wynikiem tego rodzaju elektroforezy jest uporzdkowanie makrojonw zgodnie z ich malejc ruchliwoci elektroforetyczn, przy czym separacja ta zachodzi w bardzo maym obszarze bdcym granic dwch systemw elektrolitw. Uzyskuje si w ten sposb dodatkowy efekt zagszczania makrojonw w maej objtoci. Elektroforeza poliakrylamidowa DNA. Najlepszy rozdzia uzyskuje si dla DNA o dugoci mniejszej ni 1000 par zasad. W elach tych mona efektywnie rozdziela take jednoniciowe fragmenty DNA i RNA. Elektroforez w elach poliakrylamidowych prowadzona jest w aparaturze ustawionej pionowo, a wic migracja czsteczek DNA jest zgodna z kierunkiem siy cienia, gdzie jednoniciowe DNA charakteryzuj si spowolnion, w stosunku do dwuniciowego DNA, migracja w elu. Rozdzia elektroforetyczny prowadzony jest w buforze TBE1. Jest to odmiana elektroforezy strefowej natywnej. DNA w elu poliakrylamidowym mona wybarwia za pomoc np. EtBr lub Sybr Gold.

ele poliakrylamidowe maj przewag nad elami agarozowymi z kilku przyczyn: zdolno rozdzielcza eli poliakrylamidowych jest tak dua, e mona rozdziela czsteczki DNA rnice si o 1 p.z. studzienk elu poliakrylamidowego mona zaadowa znacznie wiksz iloci DNA ni w elu agarozowym DNA odzyskany z elu poliakrylamidowego jest czysty (nie wymaga dodatkowego czyszczenia przy stosowaniu w biologii molekularnej) Elektroforeza poliakrylamidowa biaek. Elektroforeza natywna, to rodzaj elektroforezy strefowej prowadzony zwykle w poliakrylamidzie w warunkach, w ktrych makroczsteczki pozostaj niezdenaturowane. Zalet tego typu separacji elektroforetycznej jest moliwo odzyskania czsteczek biakowych w stanie penej aktywnoci biologicznej. Wad za jest stosunkowo saba rozdzielczo metody.

Rys. 3 Przykad elektroforezy biaek w warunkach natywnych.

Analizie poddano biaka wyekstrahowane z rnych odmian jczmienia. Separacj przeprowadzono w elu 25S uwodnionym w buforze do natywnej elektroforezy pH 5,0, zawierajcym mocznik i niejonowy detergent.

Elektroforeza w obecnoci SDS (strefowa) - ten rodzaj elektroforezy jest najczciej stosowany dla separacji makromoleku biakowych. Zastosowanie SDS (siarczan dodecylu sodu) substancji powierzchniowo czynnej - przyczynia si do znacznego poprawienia rozdzielczoci techniki elektroforetycznej. Potraktowanie czsteczki biaka przez SDS skutkuje powstaniem kompleksw biako-SDS o ustalonym stosunku adunku elektrycznego do masy. Wykazano, e 1g biaka wie 1,4g SDS. W kompleksie takim SDS skutecznie maskuje oryginalny adunek biaka normalnie wystpujcy w danym elektrolicie. Waciwo ta pozwala na atwe i dokadne oznaczenie mas czsteczkowych rozdzielonych biaek. Obecno SDS przynosi szereg korzyci: zdecydowana wikszo biaek jest rozpuszczalna w elektrolitach zawierajcych SDS, szczeglnie po redukcji mostkw disiarczkowych separacja biaek odbywa si zgodnie z ich masami czsteczkowymi barwienia kompleksw biako-SDS jest znacznie wydajniejsze ni samego biaka obecno SDS skutecznie eliminuje enzymatyczn degradacj biaek w trakcie separacji. Elektroforeza nieciga - poczenie izotachoforezy z elektroforez strefow prowadzi do jeszcze lepszych rezultatw separacji biaek. Nonik elektroforetyczny skada si z dwch kontaktujcych si ze sob czci wypenionych elektrolitami o rnym skadzie i rnej wartoci pH (rys. 4) (ang. discontinue electrophoresis or disc-electrophoresis). W grnej czci nonika znajduje si el zagszczajcy, czasami okrelany jako ogniskujcy, (ang. stacking gel), w ktrym realizuje si izotachoforeza. Uporzdkowane i zagszczone tam czsteczki biaka wchodz do drugiej czci nonika zwanej elem separujcym (ang. running gel). W tym elu zachodzi elektroforeza strefowa.

Rys 4. Schemat elu do elektroforezy

niecigej.Skad elektrolitw i warto pH obu eli oraz ich porowatoci rni si.

W wyniku poczenia obu metod uzyskuje si bardzo ostre prki zawierajce biaka o tej samej ruchliwoci elektroforetycznej, co czsto jest interpretowane jako biaka o tej samej masie czsteczkowej (rys 5).

Rys 5. Przykad elektroforezy w obecnoci SDS. Analizie

poddano biaka zwierzce i ryb ekstrahowane z rnych tkanek. Rozdzia wykonano w elu ExcelGel Homogenous 1. Dwie skrajne cieki zawieraj standardy mas czsteczkowych, co pozwala przyporzdkowa biakom na pozostaych ciekach odpowiednie masy czsteczkowe.

BARWIENIE I DOKUMENTACJA. Ukoczenie rozdziau elektroforetycznego nie koczy procedury separacji. Wikszo biaek i kwasw nukleinowych nie jest widoczna w wietle biaym. Niezbdne jest ich wybarwienie (wizualizacja) w elach lub na membranach, tak aby uzyska informacj o dystansie ich migracji i ich iloci w prku Barwienie - stosowanych jest wiele metod wizualizacji eli i membran. Biaka najczciej wybarwia si stosujc naturalne barwniki, takie jak bkit kumassi (ang. Coomassie Brilant Blue) czy czer amidow. Barwnik dodawany jest zwykle do roztworu utrwalajcego pooenie biaka w elu (denaturacja i unieruchomienie moleku), po czym nadmiar barwnika jest wymywany. Pozostaje tylko barwnik zwizany z biakami. Czuo takiej detekcji biaek jest stosunkowo dobra. Mona w ten sposb znale 1 g biaka w prku. Znacznie bardziej czu metod jest barwienie srebrem. Metoda ta pozwala oznaczy 10 ng biaka w prku. Przy pomocy srebra mona rwnie wybarwi kwasy nukleinowe oraz oligonukleotydy, a czuo detekcji zbliona jest rwnie do 10 ng DNA na prek. Barwienie fluoroforami - tradycyjnie oligonukleotydy barwione s przy pomocy bromku etydyny, barwnika wykazujcego waciwoci fluorescencyjne. Obraz separacji makroczsteczek moe by wtedy uwidoczniony w wietle UV (okoo 300 nm). Ten sposb barwienia wymaga duej ostronoci ze strony laboranta ze wzgldu na silnie karcinogenne waciwoci bromku etydyny. Obecnie dostpne s liczne barwniki fluorescencyjne pozwalajce na uwidocznienie biaek i oligonukleotydw po zakoczeniu elektroforezy lub wybarwienie makroczsteczek przed separacj. Wszystkie te znaczniki uwidaczniaj pooenie prkw w wietle UV lub rzadziej w wietle widzialnym. Czuo detekcji jest porwnywalna z barwieniem srebrem lub jest nieco lepsza. Dokumentacja rozdziaw najprostsz form dokumentacji rozdziaw elektroforetycznych wykonanych w elach poliakrylamidowych jest ich wysuszenie pomidzy warstw bibuy i celofanu lub pomidzy dwoma warstwami celofanu. Wysuszony w ten sposb el mona przechowywa dowolnie dugo bez widocznego uszczerbku w jakoci tego dokumentu. ele poliakrylamidowe przygotowane na folii mona suszy bez okrywania celofanem. Trudnoci

pojawiaj si wtedy, gdy trzeba wysuszy el o zawartoci akrylamidu powyej 15%. Odwodnienie elu powoduje silne jego obkurczenie i w rezultacie pkanie. Mona temu przeciwdziaa wypierajc z elu wod glicerolem. ele takie pozostaj jednak nieco lepkie i musz by okryte foli. ele agarozowe nie poddaj si jednak tej formie dokumentowania. Najprostszym sposobem utrwalenia informacji zawartej w elu agarozowym jest sporzdzenie jego fotografii. Technik t mona zastosowa rwnie do eli poliakrylamidowych. Od kilku lat do dokumentacji rozdziaw elektroforetycznych stosuje si z powodzeniem kamery cyfrowe, a uzyskany obraz przechowywany jest w formie elektronicznej w pamici komputera lub na dyskietkach. Kamery cyfrowe pozwalaj na uzyskanie i przetworzenie obrazu eli i membran wizualizowanych barwnie, z zastosowaniem znacznikw fluorescencyjnych lub substratw chromogennych.