Sekwencjonowanie metodą

Sangera- zasada metody

i zastosowanie.

Paulina Mikulska
lekarski, II rok
 Sekwencjonowanie Sangera
● inaczej „metoda terminacji łańcucha”
lub metoda dideoksy,
● jest metodą określania sekwencji
nukleotydowej DNA,
● została opracowana prze Fredericka Sangera
i współpracowników w 1977 roku,
● za opracowanie tej metody F. Sanger otrzymał
w 1980 roku nagrodę Nobla.
 Opis metody
1. Cięcie wyizolowanego z komórki DNA przez
restryktazy:
- rożne enzymy tną DNA w różnych ściśle
określonych miejscach wyznaczonych przez
specyficzny, rozpoznawany przez enzym ciąg
nukleotydów
● W rezultacie powstają fragmenty DNA zakończone
jednoniciowymi odcinkami- lepkimi końcami
2. Replikacja, czyli powielanie uzyskanych
łańcuchów DNA:
- reakcja przeprowadzana jest w czterech
oddzielnych mieszaninach
● W każdej z czterech probówek jako substrat
replikacji umieszcza się ten sam badany fragment
DNA jako matrycę.
Mieszaninę typowych nukleotydów wprowadza się do
poszczególnych probówek.
.
● Dodaje się także polimerazę DNA oraz starter,
czyli kilkunasto nukleotydowy fragment DNA
o znanej nam sekwencji, od którego polimeraza
zaczyna replikację.
● Nastęnie do mieszaniny dodaje się niewielkie ilości
dideoksynukleotydu ddNTP innego do każdej
z czterech probówek:
- adeninowy ddATP,
-tyminowy ddTTP,
-cytozynowy ddCTP,
-guaninowy ddGTP,
które są znakowane radioaktywnie.
● Dideoksy nukleotydy różnią się od
deoksynukleotydów brakiem wolnej grupy -OH
w pozycji 3' cukru deoksyrybozy.
● Polimeraza DNA podczas replikacji wykorzystuje
wolną grupę 3'OH do wydłużania łańcucha DNA.
Brak tej grupy zatrzymuje replikację.
Dideoksy nukleotydy kończą syntezę.
● W wyniku działania polimerazy powstaje
mieszanina fragmentów DNA o różnej długości
i zakończonych innym nukleotydem.
W probówce, do której dodano ddATP będzie
to nukleotyd adeninowym.
3.Elektroforeza
- otrzymane produkty replikacji DNA nanoszone
są obok siebie na żel do elektroforezy.
● W procesie tym naładowane ujemnie fragmenty
DNA pod wpływem pola elektrycznego
przemieszczają się przez pory w żelu.
● Dłuższe fragmenty przemieszczają się wolniej,
a krótsze- szybciej. Dzięki temu zreplikowane
cząsteczki DNA różniące się długością zatrzymują
się w żelu w określonej kolejności. Dłuższe bliżej,
krótsze- dalej od miejsca nałożenia na żel.
● Dzięki radioaktywnemu znakowaniu można
wykonać zdjęcie rentgenowskie, na którym
widoczny jest obraz rozmieszczenia prążków
w żelu. Jest to tak zwany autoradiogram.
Zawiera on 4 kolumny pasków zawierające
od dołu do góry kolejności poszczególnych
nukleotydów w sekwencjonowanym DNA.
Zastosowanie
 Zastosowanie
● W archeologii: pochodzenie i migracja ludów na
Ziemi,
● Zrozumienie molekularnych mechanizmów
funkcjonowania organizmów,
● Ewolucjoniści: powiązania między wymarłymi
a żyjącymi organizmami,
● W medycynie: do identyfikacji mutacji genetycznej,
● W medycynie sądowej- fenotypowe cechy
wybranych osób, np.. kolor włosów, oczu
i na ich podstawie ustalić udział osób
w przestępstwie, powierdzić tożsamość osób
zainionych czy też potwierdzić ojcostwo.
 Wady
● DNA o wysokim stopniu czystości,
● Niezbędna jest znajomość sekwencji kilku
początkwych nukleotydów- stanowiacych starter
replikacji,
● Jednorazowa reakcja pozwala na sekwencjonowanie
minium 100 a maksymalnie tysiąca par zasad,
● Pracochłonna i czasochłonna.
Współczesne modyfikacje metody
Sangera
 Źródła
● https://epodreczniki.pl/a/film/DlT0g1t3y;
● https://pl.wikipedia.org/wiki/Metoda_Sangera;
● https://www.exeley.com/exeley/journals/advancements_
●
https://www.sigmaaldrich.com/technical-
documents/articles/biology/sanger-sequencing.html