Kinga Górecka, biologia stosowana IIst.

Analiza PCR

Wstęp:

PCR inaczej łańcuchowa reakcja polimerazy, jest techniką polegającą na powielaniu in vitro
fragmentu kwasu nukleinowego przy użyciu specyficznych starterów oraz enzymu
polimerazy. Metoda znalazła zastosowanie w różnych dziedzinach w tym biologii
molekularnej czy diagnostyce medycznej. PCR pozwala na powielenie wraz z identyfikacją
niewielkich ilości matrycy, pochodzącej z np. cebulki włosa czy krwi.
Podstawowymi etapami tej techniki są:
● Denaturacja DNA - rozplecenie podwójnej nici DNA
● Annealing DNA - przyłączenie do matrycy starterów
● Elongacja - wydłużanie i synteza nici DNA komplementarnej do matrycy
Na zajęciach powielano odcinek genu osteopontyny - marker w chorobach nowotworowych -
uznaje się, że zwiększenie stężenia osteopontyny (OPN) stwierdzane jest w przypadku wielu
nowotworów i może mieć wartość prognostyczną.

Materiały:

● Woda ● DNA
● PCR bufor ● Probówki - 0.2ml i 2ml
● Primer F ● Pipety automatyczne wraz z
● Primer R odpowiednimi końcówkami
● dNTPmix (2mM) ● Termocykler
● MgCl2 ● Żel agarozowy
● Taq polimeraza

Metodyka:

1. Pierwszym krokiem było przygotowanie mieszaniny reakcyjnej do reakcji PCR

2. Wszystkie składniki, za wyjątkiem DNA, umieszczono w jednej wspólnej probówce
2ml, w ilości na 5 próbek tj.: 46µl wody; 10µl PCR buforu; 7µl Primer F; 7µl Primer R;
10µl dNTPmix; 8µl MgCl2; 2µl Taq polimerazy
 Kinga Górecka, biologia stosowana IIst.

3. Kolejno do pięciu probówek 0,2ml dodano po 18µl stworzonego PCR mix-a,

następnie do 4 z nich dodawano po 2µl DNA, a do ostatniej 2µl wody (kontrola)
4. Probówki umieszczono w termocyklerze na ok 40minut, ustawiając odpowiedni
program do reakcji PCR - 30 cykli
5. Po zakończonych cyklach, do probówek dodano bufor obciążający w ilości 2,5µl
6. Do gotowego 3% żelu agarozowego w pierwszej studzience nałożono marker
wielkości
7. Następnie nakropiono do dalszych studzienek po 10µl próbki DNA zmieszanej z
buforem
8. Przeprowadzono rozdział elektroforetyczny i oglądano żel pod światłem
ultrafioletowym

Wyniki:

Efekt prowadzonej amplifikacji został uwidoczniony na żelu

 Kinga Górecka, biologia stosowana IIst.

Wnioski:

Po przeprowadzonej amplifikacji uzyskaliśmy produkt PCR - który stanowi kilka miliardów

kopii genu.
Produkt reakcji identyfikujemy rozdzielając uzyskany materiał w żelu agarozowym.
Równocześnie z badanym genem nanosimy na żel standardy masowe - czyli fragmenty
DNA o znanych masach cząsteczkowych. Na podstawie położenia badanego genu w
stosunku do standardów masowych określamy jego wielkość.
Wizualizacja cząsteczek DNA następuje w świetle promieni UV dzięki barwnikom, np.
najczęściej stosowanym jest bromek etydyny.
Widok zaobserwowany na żelu przedstawia dodatkową liczbę prążków. Sugeruje to
kontaminacje materiału badanego.
Jednym ze źródeł zanieczyszczenia może być np. nieumiejętne otwieranie probówek z
produktami reakcji PCR - mogące prowadzić do zanieczyszczenia powierzchni roboczych,
czystych probówek, odczynników czy sprzętów.