udowy i funkcji komórek

Cytochemia

Mikromacierze tkankowe (ang. TMA tissue microarrays) Metoda mikromacierzy

tka
bloczkach parafinowych. Metoda powszechna w skryningowej diagnostyce (przesiewowej)

Metoda FRET eczkami

fluorochromu na drugi,

->
ustrojowych -rdzeniowy)
-> (

-
Diagnostyka w obszarze piersi -
USG.
Izolacja komórek

-> zawiesiny homogennej populacji

komórek
Uzyskanie zawiesiny homogennej:
1. Mechaniczne rozdrobnienie fragmentu tkanki l
2.
3. Izolacja komórek . Oddzielenie komórek
nieuszkodzonych od uszkodzonych w procesie rozdrabniania
4. Uzyskanie zawiesiny komórek -
poprzez *

znakowanych zawiesin komórkowych np. limfocyty znakowan

Homogenizacja, separacja i frakcjonowanie komórek
- ci

Organelli komórkowych
 1.
2.
3.
4.

ich fragmenty.
a) -
kilkukrotne wirowanie homogenatu przy

-
-

b)
i) -

- -

Hodowla komórek

Jest to metoda badawcza i sposób przygotowania populacji komórkowej do dalszych

regulacyjne, jony + zapewnienie warunków fizycznych

.

wykorzystywane:
o Do tworzenia kolejnych hodowli (linie komórkowe)
W

o Funkcjonowania aparatu genetycznego

o Proliferacji
o
o ch
o

o Diagnostycznym defekty genetyczne, zaburzenia metabolizmu

komórkowego
 o hodowla naskórka w leczeniu ubytków skóry,

Korekty
o
zarodkowych komórek macierzystych.
fuzja -

dodanych czynników.
o Dalszy etap fuzji prowadzi do hybrydyzacji -

o
monoklonalnych (immunocytochemia*), wykorzystywane w badaniach
immunochemicznych.
Immunocytochemia bardzo wysoka swoist

orzystywana
mikroskopowych.

1. Hodowle pierwotne
2. Hodowle linii komórkowych
Hodowle pierwotne

Utrzymywanie w warunkach in vitro komórek izolowanych z organów, tkanek

1.
2. Izolacja komórek z pobranej tkanki (mechaniczne rozdrobnienie tkanki ->
awienne

3.
4.
komórki
5. Umieszczenie komórek w naczyniu hodow

Charakterystyka:

rundami replikacji DNA)

tempo proliferacji
 populacji)

macierzystych do innych typów komórek) oraz biochemicznym (zmiana

Ustalone linie komórkowe

Pop -> linia

o
o Proces immortalizacji zachodzi w sposób:

Np. Linie HMT-3522, MCF-10A wyizolowane u pacjentek z

-
Indukowany
Utrzymanie komórek w

komórkowego (np. inaktywacja genu p53, Rb)

o Antygen wirusa SV-40

o Adenowirusy E1A, E1B
o Zmutowany onkogen p53
o Onkogen ha-ras
o Poly T-antygen

Przygoto -
Dadomie e ich
naturalne;lokolizai;

-> in situ (w miejscu)

- -> Techniki mikroskopowe
1. Poddanie procesowi utrwalenia zapobieganie procesom autolitycznym,

o Czynniki chemiczne:
Aldehydy
aldehyd mrówkowy (formalina) -> badania w mikroskopie

aldehyd glutarowy -> badania w mikroskopie elektronowym

Czynniki fizyczne: mikrofale

 Podobny efekt utrwalania wykazuje -

-
o
komórek i ich otoczenia.
2. -
owe) -> zatapianie
3. - -> przez które
-10 mikrometrów
-50 nm do mikroskopii elektronowej)
Badania biochemiczne i molekularne

chemicznych:
- Kwasy nukleinowe
-
nukleinowych

Elektroforeza
elektrycznym

o D
biegunów pola.
1.

2. -> poprzez
wyci
W przypadku kwasów nukleinowych -
o

1. Dwuniciowy DNA faga lambda i

-
dodecylosiarczanu sodu (SDS-PAGE) -> podgrzewanie
o SDS
1. -> ich
 2.

liczby am

o Elektroforeza dwukierunkowa

1. Ogniskowanie izoelektryczne (elektroforeza w gradiencie pH, która

powoduje zatrzymanie d
jego punkowi izoelektrycznemu)
2. Poddanie procesowi SDS-PAGE
do kierunku uprzedniego ogniskowania
3. -> pozwala

Blotting (rozdzielanie)
elektroforezie
o
o Rozdzielone substancje z elektroforezy przeno

zachowanie ich rozmieszczenia

Lepsza identyfikacja wykrywanego odcinka kwasu nukleinowego/

o Metoda Southern blotting

nukleinowych*)
*Hybrydyzacja kwasów nukleinowych

komplementarnej sekwencji nukleotydów w materiale w badaniach mikroskopowych

(hybrydocytochemia, hybrydyacja in situ) i biochemicznych

Podczas znakowania sonda DNA hybrydyzuje z rozdzielonymi fragmentami DNA (arkusz

 o Metoda Northern blotting
znakowane sondy RNA lub DNA
o Metoda Western blotting

Sond znakowane izotopami promieniotwórczymi lub znacznikami

fluorescencyjnymi, antygenowymi lub enzymami.
o Ostatni etap metody

(autoradiografia)
Znakowanie antygenowe lub enzymem: reakcje barwne w
immunocytochemii
o

Manipulowanie DNA

Najistotniejszym problemem badawczym w biologii komórki jest funkcjonowanie

aparatu genetycznego
bakteryjne

o ->
rekombinowany DNA
Odcinki DNA k

o zbiory fragmentów DNA danego

organizmu

odwrotnych transkryptaz (enzym

RNA)

komórce.

transfekcji.

.
 elektroporacja silnego pola elektrycznego; sonoporacja

o do których

komórek ma
[posiadanie dodatkowego, zmodyfikowanego, inaktywowanego (znokautowanego)
genu].
Sekwencjonowanie DNA

znakowanych dideoksynukleotydów homolog naturalnych nukleotydów ->

o -

o Uzyskane fragmenty DNA - od

o Analiza dideoksynukleotydów

sekwencerach.

sze sekwencjonowanie DNA

Hybrydyzacja kwasów nukleinowych

rozdzielenie
dwóch nici
o
warunkiem -
o
DNA, RNA.
o zsyntezowane odcinki DNA lub RNA o komplementarnej
sekwencji nukleotydów, znakowane izotopami (nukleotyd z pierwiastkiem
promieniotwórczym) lub znacznikami chemicznymi

badanie mRNA
 Mikromatryce DNA
genów
o

o badanych komórek odcinkami DNA lub

cDNA (wyznakowane fluorochromami)
o

Metoda analityczna. Polega na: Analiza genomów, transkryptomów,

-DNA-RNA, epigenomów, metagenomów

1. Przygotowanie biblioteki DNA

2. Amplifikacja specyficzna matrycy
3. Masowe sekwencjonowanie

Diagnostyce
Onkologii
Farmakogenetyce
Badaniach transkryptomicznych (analiza ekspresji genów na
poziomie RNA)

Mikromacierze ekspresyjne (microarrays)

(skryningowej) analizie poziomu wielu

komplementarne czt. cDNA lub cRNA, w badanej próbce.

o Z

fragmentacji;

który podlega fragmentacji.

o Wyznakowane fragmenty cDNA lub cRNA

o -

o Obraz mikromacierzy jest skanowany -

danej sondzie w póbce -> otrzymuje
 innych

-> identycznego z
sekwencji nukleotydów -> z wykrywanym odcinkiem
o
jest RNA -> wykonujemy RT-PCR
o Odwrotna transkryptaza

wykrywanego RNA sekwencji nukleotydów.

o
qPCR sie rzeczywistym (aquantitative
PCR)

Pozwala

-> logarytmiczny przyrost liczby

o Po raz pier ->

o Obecnie: barwnikiem do znakowania sond, starterów, amplikonów jest SYBR

Green.

- ->

o ->

o w przez
Badania mikroskopowe

kondensator, obiektyw i okular.

obrazie strukturami) wynosi 0,2 mikrometra

Mikroskop fazowo-kontrastowy

widoczne

typowymi histologicznymi barwnikami bez uszkodzeni

Mikroskop interferencyjny

-kontrastowy

Najlepsze, quasi-trójwymiarowe obrazy daje tzw. kontrast interferencyjno-

owy Nomarskiego (DIC, ang, differential interference contrast), obecnie
chyba najpowszechniej stosowany do obserwacji niezabarwionych komórek.
Mikroskop fluorescencyjny

chemicznych obecnych w
komórkach
Przede wszystkim jest stosowany do wykrywania specjalnych barwników

-
,

ne lub

Schemat budowy mikroskopu florescencyjnego:

 (0,1- - ta, z której obiektyw formuje ostry obraz.

warstwy. W sensie praktycznym oznacza to bardzo ostry obraz, znacznie

Obr

Budowa mikroskopu konfokalnego:

a) Przebieg promieni

b) Przebieg promieni

c) Promienie spoza
Mikroskop dwufotonowy:

Wykorzystuje tzw. efekt dwufotonowy

(w czasie 10-

W
dwufotonowego, natomiast poza tym punktem nigdy do niego nie dojdzie.
W mikroskopie dwufotonowym
pulsy podczerwieni, zogniskowane

ma
Budowa mikroskopu dwufotonowego:

reflection fluorescence)

ka zlokalizowane na
powierzchni komórek.
 Wykorzystuje on tzw.

(100-200 nm) i tylko z takiego obszaru

emitowana jest fluorescencja.

Mikroskopy elektronowe
Mikroskop elektronowy wykorzystuje do tworzenia obrazu

mikroskopów elektronowych wynosi -

typu mikroskopu od 0,2 nm do 5 nm, co pozwala na uwidocznienie w obrazie
mikroskopowym nie tylko nawet najmniejszych struktur

termoemisji lub emisji

polowej przez tzw. (odpow

soczewki elektromagnetyczne: kondensor, obiektyw i projektor.

tylko

Dwa podstawowe typy mikroskopu elektronowego:

Transmisyjny mikroskop elektronowy
 Budowa transmisyjnego mikroskopu elektronowego:

mik
elektronów przechodzi przez preparat,
w którym odpowiednio kontrastowane
( ) struktury w

elektrony
Wytworzony przez soczewki obraz
jest rzutowany na ekran pokryty

-
monochromatyczny obraz utworzony

Skaningowy mikroskop elektronowy

Budowa skaningowego mikroskopu elektronowego:

powierzchni komórkowych;
Daje ich bardzo plastyczny,
prawie trójwymiarowy obraz,

porównaniu z mikroskopem
transmisyjnym.

przez kondensor i obiektyw

skanuje

umieszczony powy
 W danym momencie liczba i kierunek biegu takich elektronów (a zatem

Specjalne metody stosowane w mikroskopii elektronowej

w mikroskopie skaningowym.
Barwienie negatywowe

kompleksy, kwasy nuklei

jasne
twory na ciemnym tle.
Cieniowanie
Cie
elektronowym:

pokrycie
powierzchni preparatu
-2 nm)

napylanego pod

powoduje powstanie

struktur.
Warstewka metalu

badanych struktur. Taka warstewka oddzielona od powierzchni preparatu repliki.

 -fracture)

(wi

dopiero po kilku minutach od chwili jego

Metoda ta jest szczególnie przydatna do

cytoszkieletu.

(2) Mitochondrium.

(3) Otoczka j

-cytoplazma, E- -
Cytochemia klasyczna i cytochemia enzymów
Rutynowe metody barwienia komórek w preparatac

informacji o charakterze chemicznym barwionych struktur.

histopatologicznej. Kluczowym celem wykrycie in situ

substancji) -

Cytochemia klasyczna

Najstarsza a takich metod.

Komórki lub skrawki tkanek um
dobrane substraty dla reakcji cytochemicznej
wykrywanym
Wynikiem takiej reakcji jest barwny
,a
elektronowo) oraz nierozpuszczalny
którego lokalizacja wyznacza

Metody klasycznej cytochemii

wykrywanie raczej spokrewnionych
cukrowce, lipidy, bia ka bogate w niektóre aminokwasy, kwasy nukleinowe), a nie

Najbardziej popularne metody cytochemiczne to:

o
o
o reakcja FIF (fluorescencja indukowana formaldehydem, wykrywa aminy
biogenne)
Cytochemia enzymów

Szczególny
Przeprowadzane reakcje
Komórki inku
substrat(y) o tak dobranej charakterystyce chemicznej, aby produkt reakcji
barwny i nierozpuszczalny.
stratowej enzymów i zazwyczaj nie

wykrywania enzymatycznych znaczników

,
cytochemii lektyn.
 W

Immunocytochemia

Metody immunocytochemiczne

antygenu z

konkretny antygen (jest nim zazwyczaj

(epitop
przestrzennej.

ch i
.

mikroskopowym:
o fluorochromy,
(immunofluorescencja)
o enzymy uw

o metale ci kie (z oto koloidalne), widoczne w obrazie mikroskopu

.
laboratoryjnych

antygenom

laboratoryjnych.
P
pewnym czasie albo izoluje

-
wiele epitopów),
albo przeprowadza selektywn

tylko

hodowlanego (
monoklonalne -
 :
1. Metodami preparatyki biochemicznej wykryto w

2.

wytworzenia
3.

4.

zestawy do przeprowadzania reakcji

immunocytochemicznych.
5.
diagnostyce histopatologicznej.

Cytochemia lektyn

Lektyny to grupa glikoproteidów wyizolowanych

, .
Znakowane lektyny s
grup cukrowcowych w komórkach na tych

immunocytochemicznych.

Hybrydocytochemia

mikroskopowym odcinka DNA lub RNA

dlatego metody te
in situ.

nukleotydów.

dla niego - odcinek DNA lub RNA o komplementarnej sekwencji

nukleotydów.
 fluorochromami, znacznikami
antygenowymi, które
immunocytochemiczne, lub izotopami promieniotwórczymi
.
1. Materia przeznaczony do reakcji hybrydocytochemicznej

nukleinowych w
2.
tkanek w roztworze sondy, która
nukleinowego.
3. Ostatnim etapem procedury jest uwidocznienie znacznika sondy.
:
o z nimi fluorochromów
o
o albo wykorzystanych do immunocytochemicznego wykrycia znaczników
antygenowych. <- Ten wariant FISH
(ang. fluorescent in situ hybridization).

:
o wykrywanie konkretnych genów lub ich fragmentów
o ich lokalizacj
o badanie ekspresji genów (wykrywanie swoistego mRNA)
o (np. wirusów) w komórkach.
:
o w tworzeniu map genowych,
o diagnostyce chorób dziedzicznych i wirusowych
o badaniach nad genetycz

go
Reakcja ta, adaptowana do technik
mikroskopowych z repertuaru metod biologii molekularnej, prowadzi do
wielokrotnego powielenia badanego odcinka
reakcji hybrydocytochemicznej.

i/lub pokrojonych na cienkie skrawki po uprzednim

W ostatnim dwudziestoleciu opracowano wiele metod
) zarówno ca ych organelli, jak i

ew
czasie rzeczywistym.
 zmatycznej, aparatu Golgiego, lizo

uczestnictwo w
Pewne oraz peroksydaza (uwidoczniana reakcj
:

w przypadku komórek nerwowych do wyznaczania przebiegu ich wypustek i lokalizacji

Niektóre wprowadzane do komórek

, co

jonowych oraz regulacji egzocytozy i wielu reakcji enzymatycznych.

Nie ws
w procesie endocytozy
wprowadzane poprzez mikroiniekcje lub (sztucznych

Metoda FRET - (ang. fluorescence resonance energy transfer), rezonansowy transfer

energii fluorescencji

jednego

wówczas, gdy

drugi fluorochrom.
Przy
pierwszego
nieb dojdzie do jego kontaktu z drugim fluorochromem.
fluorescencji (np. zielonej) przez drugi
fluorochrom, czyli zmiana barwy fluorescencji dostrzegana pod mikroskopem.

chemicznych obecnych w komórce;

 receptory, procesów polimeryzacji/depolimeryzacji substancji

Metoda FRET
 Genetyczne znakowanie

Wykorzystuje

GFP, green fluorescent

protein)
pewnym gatunku meduzy.

rekombinacji DNA, gen GFP

tak spreparowany

nim
znako
komórce.

Znakowanie GFP jest wykorzystywane:

o
o sekrecji,
o
o (przez znakowanie komórek macierzystych lub
progenitorowych);
o
Autoradiografia

powszechnie stosowanych w klasycznej, analogowej fotografii).

(nieznakowane)

organelli i struktur subkomórkowych.

preparatu ej.
Promieniowanie (przede wszystkim beta) emitowane przez zawarty w preparacie
miejscami, gdzie jest zlokalizowany, ziarenek
metalicznego srebra, dobrze widocznych w mi
znakowanej izotopem substancji.

autoradiograficznych do wykrywania
znakowanych izotopami sond w hybrydyzacji kwasów nukleinowych, a w
procedurach biochemicznych do
nukleinowych, znakowanych uprzednio izotopami.

Separacja komórek z wykorzystaniem cytometrii

-
metod, których celem jest oszacowanie liczby komórek w danej próbie

lub sygna przez odpowiednio wyznakowane

komórki.
j
mieszaninie (np.
oszacowanie liczby komórek prezentuj antygen, albo liczby limfocytów
CD4+ obecnych w ca j heterogennej populacji komórek).
 adzenie analizy
-
chloroplastów.
jest sorter
jest nie tylko frakcjonowanie komórek, ale
populacje oraz ponowne wykorzystanie, np. w pomiarze ekspresji genów czy
hodowli wysortowanych komórek in vitro.
FACSAria. Jest to
sorter dwu- sz sortowania
komórek.
rzadkich populacji
komórek, np. circulating tumor
cells).

procedurze za

komórek do pomiarów cytometrycznych obejmuje metody cytochemiczne i

immunocytochemiczne. Podobnie jak w badaniach mikroskopowych, od tego, w
jaki spo

zawiesiny komórek
nim szeregowo.
1. laser, a

impulsy elektryczne.
2. zetwarzane przez

3. sortownik komórek, który

rozdziela
wyniku pomiaru komórki u
dodatni, ujemny lub zerowy, a

.
W praktyce laboratoryjno- diagnostyki
adu immunologicznego oceny

leczenie.
 CIEKAWOSTKA:
Zbigniew
, który swoje badania s

fragmentacji DNA podczas apoptozy

(TUNEL).

Karolinska Institute w Szwecji wyjechal do Stanó

Memorial Sloan Kettering Cancer Center oraz Department of Pathology, Medicine, and
Microbiology and Immunology w New York Medical College.

Mikromacierze tkankowe (ang. tissue microarrays)

, co
zmniejsza
Mikromacierze tkankowe stosuje diagnostyce
molekularnej nowotworów.
1. niewielkich fragmentów tkanek
zatopionych w parafinowych bloczkach i umieszczenie ich na
mikromacierzy -
studzienkami.
2. zej preparatyce
histologicznej, a uzyskane
 nowotworowych w badanych fragmentach
immunofluorescencji (IF), fluorescencyjnej
hybrydyzacji in situ (FISH) lub hybrydyzacji in situ RNA. W tym ostatnim
przypadku korzystniejsze jest wykorzystanie

Separacja komórek z wykorzystaniem pola magnetycznego (ang. dynabeads)

Separacja komórek z wykorzystaniem kulek magnetycznych (dynabeads,

MACS) polega na immunomagnetycznym wyznakowaniu komórek
, które
rzez kulki paramagnetyczne.

negatywnej).

komórek.

apisywania i dalszego przetwarzania.

informacji w porównaniu z opie.

Rejestracja obrazu w czasie rzeczywistym pozwala na badanie dynamicznych
komórkach (ruch, transport
).
Wymienione procesy
wideomikroskopia) i

elektronowego.

(struktury

przeprowadzenie trójwymiarowej rekonstrukcji badanych obiektów na podstawie

przekroje.