01.02.

2023

Cytometria Przepływowa

Cytometr przepływowy
• Cytometr przepływowy służy do szybkiego pomiaru
dużej ilości cząstek lub komórek zawieszonych w
cieczy i przepływających jedna za drugą przez
punkt pomiarowy.
• Układ ciśnieniowo-cieczowy odpowiada za
doprowadzenie komórek do punktu pomiarowego
• Układ optyczny oświetla komórkę światłem
laserowym, a następnie rejestruje fotony
rozproszone na różnych elementach morfotycznych
i wypromieniowanych przez wzbudzone barwniki
fluorescencyjne
• Układ elektroniczny odpowiada za rejestrowanie
sygnałów i przetworzenie ich na obraz zrozumiały
dla człowieka

Budowa cytometru

1
 01.02.2023

Umożliwia ocenę morfologii komórek

poprzez pomiar rozproszenia światła
przez komórki.
1) Detektor FSC – światło rozproszone w osi
promienia świetlnego odpowiadające w
przybliżeniu wielkości komórek
2) Detektor SSC – światło rozproszone pod
kątem 90° do osi padającego promienia
wyrażające ziarnistość (złożoność struktury
wewnętrznej) badanych cząsteczek

Detektor FSC

2
 01.02.2023

Detektor SSC

ANALIZA CYTOMETRYCZNA
LEUKOCYTÓW KRWI OBWODOWEJ
• Opis populacji komórkowych w oparciu o ich właściwości fizyczne
(wielkość i ziarnistości)

3
 01.02.2023

Umożliwia ocenę fluorescencji (FL1, FL2, FL3)

barwników zastosowanych do znakowania
komórek (fluorochromów) po wzbudzeniu
przez promień lasera.

1)Fluorochromy związane są z przeciwciałami

łączącymi się z antygenami powierzchniowymi i
wewnątrzkomórkowymi (cytoplazmatyczne i
jądrowe)

4
 01.02.2023

Materiał diagnostyczny
• Szpik kostny
• Krew obwodowa
• Węzeł chłonny
• Bioptat guza (po przygotowaniu zawiesiny
pojedynczych komórek)
• Inny materiał (np. płyn wysiękowy, płyn mózgowo-
rdzeniowy, popłuczyny pęcherzykowo-oskrzelikowe)

Wszystkie próbki zawierające materiał biologiczny

powinny być traktowane jako potencjalnie zakaźne

Zastosowanie cytometrii przepływowej

• rozpoznawanie białaczek i chłoniaków oraz
monitorowanie przebiegu choroby (w tym
poszukiwanie choroby resztkowej)
• ocena rokowania (cząsteczka oporności
wielolekowej)
• diagnostyka wrodzonych i nabytych zaburzeń
immunologicznych
• diagnostyka trombocytopenii (ocena płytek,
ocena przeciwciał przeciwpłytkowych)
• określenie liczby retikulocytów

Zastosowanie cytometrii przepływowej

• ocena komórek CD34 we krwi obwodowej po
mobilizacji
• analiza antygenów przed podaniem przeciwciał
monoklonalnych
• ocena markerów powierzchniowych komórek
nowotworowych (komórki złuszczone z
powierzchni guzów lub materiał z biopsji
cienkoigłowej)
• poszukiwanie krążących komórek nowotworowych
we krwi obwodowej i szpiku kostnym

5
 01.02.2023

Zastosowanie cytometrii przepływowej

• ocena cyklu komórkowego
• analiza apoptozy (test TUNEL, test z Aneksyną V,
ilość kaspaz)
• ilość wydzielanych cytokin (Th1/Th1,
anafilatoksyny)
• ocena cytoplazmatycznej ekspresji cytokin
• badanie fagocytozy
• ocena wolnych rodników
• w przypadku połączenia cytometru z sorterem –
sortowanie komórek

Zalety stosowania cytometrii

1. Możliwość wyróżnienia poszczególnych typów komórek w
mieszaninie
2. Możliwość jednoczesnej oceny wielu markerów na jednej
komórce
3. Krótki czas od pobrania materiału do wyniku
4. Prędkość zliczania do 30 tys. komórek na sekundę
5. Niewielka ilość materiału potrzebna do badania
6. Możliwość reanalizy wyników
7. Możliwość wykrycia z niezwykłą dokładnością i
powtarzalnością populacji rzadko występujących
nietypowych
8. Możliwość wyłączenia z analizy komórek martwych

Wady stosowania cytometrii

1. Duży koszt sprzętu i odczynników
2. Możliwość zafałszowania wyników przez zlepy dwóch
komórek („dublety”)
3. Utrudniona ocena przez autofluorescencję komórek
4. Potrzeba dobrania barwnika do badanego antygenu
5. Niezadowalająca powtarzalność wyników pomiędzy
laboratoriami
6. Utrudnienie oceny immunofenotypowej komórek
łatwo ulegających uszkodzeniu

6
 01.02.2023

Apoptoza

Apoptoza = Zaprogramowana śmierć komórki

MARTWICA (necrosis, nekroza)

 często nazywana „przypadkową” śmiercią
komórki
 jest biernym, katabolicznym procesem
degeneracyjnym, konsekwencją działania na
komórkę czynników uszkadzających jej funkcje
w sposób nieodwracalny

APOPTOZA
 jest fizjologicznym procesem, dzięki któremu
organizm eliminuje komórki niepotrzebne lub
nieprawidłowe, potencjalnie szkodliwe.
 Jest to proces aktywny, przebiegający z
udziałem metabolizmu komórkowego i
obejmujący aktywację genów i syntezę białek.

7
 01.02.2023

CZYNNIKI WYWOLUJĄCE NEKROZĘ

• Czynniki patogenne:
 wirusy
 hipotermia
 hipoksja
 niedokrwienie
 trucizny

CZYNNIKI WYWOŁUJĄCE APOPTOZĘ

 zmiany fizjologiczne (spadek poziomu
czynników wzrostu, zmiany w dopływie
hormonów)
 działanie czynników uszkadzających w
„dawce” umiarkowanej (zewnętrznych
czynników uszkadzających, toksyn
komórkowych – nadmiaru aminokwasów
pobudzających, wolnych rodników)

WYSTĘPOWANIE APOPTOZY

 zaprogramowana śmierć komórek w czasie embriogenezy

 hormonozależna inwolucja tkanek
 jako mechanizm homeostatyczny zapewniający prawidłową ilość
komórek w tkankach proliferujących
 w układzie immunologicznym (selekcja tymocytów w grasicy, neutrofile
w ostrym zapaleniu)
 apoptoza wywołana przez limfocyty T cytotoksyczne
 atrofia narządów po zatkaniu przewodów wyprowadzających
 apoptoza komórek w guzach nowotworowych
 śmierć komórek w niektórych chorobach wirusowych
 starzenie się komórek
 śmierć komórek w przypadku działania czynników uszkadzających w
małych dawkach

8
 01.02.2023

CHOROBY WYNIKAJĄCE Z ZABURZEŃ

W PROCESIE APOPTOZY

 nadmiar apoptozy – choroby

neurodegeneracyjne, śmierć komórek w
niektórych infekcjach wirusowych (AIDS,
WZW) i bakteryjnych, starzenie się, udar
mózgu i zawał mięśnia sercowego (na
obwodzie niedokrwienia)
 niedobór apoptozy – nowotwory, choroby
autoimmunologiczne

Apoptoza, jak ją wykryć?

Kaspazy

• Proteazy kontrolujące proces apoptozy

• Obecne w komórce w postaci pro-kaspaz
• Odpowiedzialne za fragmentację materiału
genetycznego, cięcie białek cytoszkieletu,
cytozolu, laminin jądrowych
• Aktywacja DNAzy

9
 01.02.2023

Rodzina białek BCL-2

Zmiany morfologiczne
• Kondensacja chromatyny i gromadzenie się jej na
obwodzie jądra
• Pyknoza i rozpad jądra na różnej wielkości pęcherzyki
• Obkurczenie komórki i zagęszczenie cytoplazmy
• Powstanie pęcherzyków apoptotycznych

Zmiany biochemiczne
• Translokacja fosfatydyloseryny do
zewnętrznej warstwy błony komórkowej
• Wypływ cytochromu c i AIF z mitochondriów;
• Aktywacja kaskady kaspaz
• Aktywacja kinaz białkowych i fosfataz

10
 01.02.2023

Zmiany biochemiczne c.d.

• Cięcie DNA na mono- i oligonukleosomy (180-
200 pz i ich wielokrotności)
• Mobilizacja wewnątrzkomórkowego wapnia
• Aktywny proces zależny od ATP

Trudności w detekcji apoptozy

1. Krótki czas trwania – faza egzekucji trwa ok.

30 min.
2. Fagocytoza ciałek apoptotycznych

Metody detekcji apoptozy

• Ocena zmian morfologii komórki
- ocena jądra komórkowego
- stanu kondensacji chromatyny
- znakowanie ciałek apoptotycznych

• Analiza przemieszczenia fosfatydyloseryny – zmiany w

błonie komórkowej
• Ocena aktywności kaspaz
• Ocena stopnia degradacji DNA

11
 01.02.2023

Techniki wykrywania apoptozy

• Cytometria przepływowa
• Immunohistochemia/mikroskopia
• Elektroforeza w żelu agarozowym
• qRT-PCR
• Western Blot
• ELISA

Wykrywanie procesu apoptozy

Aneksyna V/ PI
• Jodek propidyny (PI), jest barwnikiem
barwiącym jądra komórkowe. Nie może
przenikać przez ciągłe błony komórkowe do
wnętrza żywych komórek. Dlatego jest
barwnikiem komórek martwych. Przenika do
wnętrza martwych komórek poprzez
uszkodzone błony komórkowe i interkaluje z
helisą DNA, emitując czerwone światło
fluorescencji (wzbudzenie 535 nm, emisja 617
nm)
• Aneksyna V wiąże się z fosfatydyloseryną

Wykrywanie procesu apoptozy

Cytometria przepływowa – aneksyna V

12
 01.02.2023

Wykrywanie procesu apoptozy

Immunohistochemia – Aktywna kaspaza 3

Test TUNEL: Terminal deoxynucleotidyl

transferase dUTP Nick End Labeling
• Ocena stopnia degradacji DNA
• Enzym terminalna transferaza
deoksynukleotydowa (TdT) w miejscach
pęknięć nici DNA dołącza dUTP
(deoksyurydyno-5´-trifosforan)
• Cząsteczka dUTP skoniugowana jest ze
znacznikiem, np. biotyna, Brd, fluorochromy
• Wizualizacja: cytometria przepływowa,
mikroskopia świetlna i fluorescencyjna

Wykrywanie procesu apoptozy

Cytometria przepływowa – ocena
degradacji DNA

13
 01.02.2023

Wykrywanie procesu apoptozy

Rozdział DNA w żelu agarozowym

Wykrywanie procesu apoptozy

qRT-PCR

14