Hodowle pierwotne

komórek nerwowych
Rodzaje hodowli komórek nerwowych

• Linie komórkowe
(klonalne,nieśmiertelne)
– gliomy, neuroblastomy,
transfekowane linie komórek
nerwowych

• Hodowle pierwotne
– astrocyty, oligodendrocyty, komórki
Schwann’a, mikroglej, neurony,

• Hodowle komórek w insertach

 Typy hodowli komórek nerwowych

• monolayer
• mieszane agregaty
• skrawki mózgu
• explanty
 Rodzaje komórek nerwowych
w hodowli in vitro

 neurony

 komórki glejowe:
• makroglej (astrocyty i oligodendrocyty)

• mikroglej (komórki immunologiczne układu

nerwowego)
Podstawowe typy hodowli komórek nerwowych
i ich charakterystyka

• Zdolność do podziału • Brak zdolności do • Zdolność do licznych

• Wydzielanie specyficznych podziałów podziałów
gliotransmiterów • Zdolność do pobudzenia • Możliwość uzyskania
• Ekspresja elektrycznego wszystkich populacji
charakterystycznych • Produkcja komórek nerwowych
białek neurotransmiterów • Ekspresja
• Specyficzne fukcje • Charakterystyczna charakterystycznych białek
(mikroglej, kom. Gleju morfologia 5
radialnego) itp.
 Cechy komórek nerwowych warunkujące
ich hodowlę in vitro
Neurony Komórki glejowe

• nie mogą się już dzielić • Zachowują zdolność do

podziałów
• mogą różnicować się
• zajmują miejsce
• są bardzo wrażliwe na zniszczonych neuronów
różnego typu uszkodzenia (tzw. glejoza)
np. niedotlenienie, stres
oksydacyjny • stanowią rodzaj
buforu/wygaszacza
nadmiernie zaktywowanych
neuronów
 Tkanka nerwowa, z której izoluje się komórki
zawiera zarówno neurony jak i komórki glejowe

 Udział procentowy poszczególnych typów

komórek zmienia się z wiekiem

 Po 16 dniu życia płodowego ilość astrocytów w

korze gwałtownie wzrasta

 Zwykle również w hodowli neuronów wzrasta

zanieczyszczenie komórkami glejowymi
 Markery komórek nerwowych

 neurony - MAP2 (microtubule associated

protein - białko wiążące mikrotubule)

 komórki glejowe
• astrocyty - GFAP (ang. glial fibrillary acidic
protein - glejowe kwaśne białko włókienkowe)

• oligodendrocyty - galactose cerebroside -

glikolipid powierzchniowy
Izolacja i hodowla pierwotna
neuronów kory mózgowej szczura:
 Materiał: tkanka z 15-16-dniowych płodów

 Tkankę rozdrabnia się mechaniczne i enzymatycznie

poprzez cięcie a następnie pipetowanie

 Następnie tkankę poddaje się delikatnej trypsynizacji

(0.1% trypsyna, 15 min. w temp. pokojowej) co pozwala
na uzyskanie dużej liczby zdrowych komórek

 Komórki wysiewa się na szalki pokryte poli-lizyną, poli-

ornityną, kolagenem lub poli-lizyna z lamininą,

 Hodowle prowadzi się w pożywce z FBS i/lub

suplementem: selen, putrescyna, transferyna,
progesteron, BSA, insulina, antybiotyki
Skład suplementu stosowanego do
pożywek neuronalnych:
• selen jest kofaktorem w syntezie glutationu
(antyutleniacz), chroni komórki przed foto-
uszkodzeniem

• stężenie glutationu można również zwiększyć

podaniem cysteiny

• transferyna jest białkiem transportującym Fe

• putrescyna jest prekursorem poliamin

• insulina i BSA działają troficznie (odżywczo)

Antybiotyki
 najczęściej używa się penicyliny (25-100
U/ml) i streptomycyny (25-100 mg/ml) lub
gentamycyny (10-100 mg/ml

 Należy pamiętać, że czerwień fenolowa

działa jak agonista estrogenowy, a więc w
niektórych badaniach lepiej używać pożywki
nie zawierającej tego barwnika.
 Warunki izolacji i hodowli neuronów:
 Bardzo ważny jest krótki czas pobierania i izolowania
struktur np. z 8-12 płodów - 30-45 min. z uwagi na
niedotlenienie tkanki

 Konieczne jest dokładne usunięcie naczyń krwionośnych,

aby uniknąć zanieczyszczenie fibroblastami

 Należy unikać napowietrzania zawiesiny komórek

podczas mieszania komórek
(stres oksydacyjny)

 Należy unikać zbyt długiego przetrzymywania hodowli

poza inkubatorem (w ciągu 1 godziny z pożywki znika
prawie cały dwutlenek węgla)
 Hamowanie przerastania hodowli neuronów
komórkami glejowymi
W celu zahamowania rozrostu gleju najczęściej stosuje się
0.5-1.0 mM AraC (2-[b-D-arabinofuranozyl] cytozyna)
występującą też pod nazwą „cytozar” (ang. „cytosar”)

Ponieważ stężenie wyższe niż 1 mM AraC indukuje

apoptozę w neuronach dlatego coraz częściej stosuje się mniej
toksyczne cytostatyki, jak np. 5-fluorodezoksy-urydynę,
arabinozydo-adeninę (AraA), albo B27 (Gibco)

Hodowla w pożywkach bez surowicy ogranicza proliferację

astrocytów stymulowaną przez znajdujące się w surowicy
mitogeny i eliminuje konieczność stosowania cytostatyków
 Komórki glejowe

Komórki glejowe mogą mieć różne kształty:

• wielokątny (epitelialny)- astrocyty

• komórki z rozgałęzionymi wypustkami

rozmieszczonymi symetrycznienie –mikroglej

• komórki z jedną lub dwiema wypustkami

 Hodowle gleju
(podstawowe typy komórek)
• Mikroglej
• Makroglej
• Astrocyty
• Oligodendrocyty
• Ependymocyty Centralny układ nerwowy
• Glej radialny
• Tanycyty
• Komórki Schwanna Obwodowy układ nerwowy
• Komórki salelitarne
• Glej enteryczny
 Izolacja i hodowla astrocytów
• Materiał może pochodzić z różnych obszarów mózgu
noworodka

• Komórki izoluje się podobnie jak neurony najpierw

poprzez rozdrabnianie mechaniczne, a następnie
enzymatycznie (0.1%trypsyna, 15 min. w temp
pokojowej)

• Otrzymaną zawiesinę komórek wysiewa się w

pożywce np. DMEM/F12 z dodatkiem 10-20% FBS i
1% glutaminy i hoduje 7-9 dni zmieniając medium na
świeże co 48-72 godziny
 Izolacja i hodowla astrocytów cd.
 Aby uzyskać czyste hodowle samych astrocytów po
namnożeniu hodowlę (ok. 5-11 dni) poddaje się je
wstrząsaniu w temp.35C przez 6-7 godzin, aby oddzielić
mocniej przyczepione astrocyty typu 1 od neuronów,
astrocytów typu 2 i oligodendrocytów

 W wyniku wstrząsania giną zarówno neurony jak i

oligodendrocyty (ponieważ odrywają się od podłoża)

 Otrzymane w ten sposób dwa typy astrocytów można

następnie hodować razem lub osobno

 Astrocyty można zarówno pasażować jak i mrozić

 Macierzyste komórki nerwowe
 Macierzyste komórki nerwowe płodu są
zdeterminowane i rozwijają się w poszczególne
typy komórek nerwowych, początkowo różnicują
się w obecności EGF, TGF-, bFGF, następnie
muszą być poddawane działaniu bardziej
specyficznych czynników

 Macierzyste komórki nerwowe dorosłych ssaków

w obszarze hipokampa i opuszek węchowych
mogą przekształcać się w neurony, astrocyty i
oligodendrocyty