Budowa drobnoustrojów. Metody obserwacji drobnoustrojów.

1. Badanie mikrobiologiczne
a. Metody bezpośrednie
 Bakterioskopia
 Hodowla
 Badanie metabolizmu (metody biochemiczne)
 Wykrywanie antygenów (metody immunologiczne)
 Wykrywanie DNA lub RNA (metody biologii molekularnej)
 Analiza profilu białkowego (spektrometria masowa)
b. Metody pośrednie
 Określenie poziomu przeciwciał w surowicy i płynach ustrojowych
 Próby biologiczne na zwierzętach
2. Mikroskop – budowa i technika mikroskopowania
a. Rodzaje mikroskopów
 Mikroskopy optyczne
o Mikroskop świetlny
 Zwykły
 Ultrafioletowy
 Fal podczerwonych
o Ultramikroskop
o Mikroskop polaryzacyjny
o Mikroskop fluorescencyjny
o Mikroskop kontrastowo-fazowy
o Skanujące mikroskopy optyczne: odbiciowe, fluorescencyjne, dopplerowskie
 Mikroskopy nieoptyczne
o Mikroskop elektronowy
 Skaningowy
 transmisyjny
o Mikroskop sił atomowych
b. Budowa mikroskopu świetlnego zwykłego


c. Elementy mikroskopu świetlnego zwykłego
 Układ mechaniczny
o Podstawa
o Statyw z tubusem
 o Stolik przedmiotowy
o Śruba makrometryczna
o Śruba mikrometryczna
o rewolwer
 Układ optyczny
o Aparat Abbego (kondensor z przysłoną)
o Układ oświetlający
o Obiektyw
o Okular
d. Powiększenie mikroskopu świetlnego zwykłego

𝑝𝑜𝑤𝑖 ę 𝑘𝑠𝑧𝑒𝑛𝑖𝑒𝑜𝑘𝑢𝑙𝑎𝑟𝑢 ∙ 𝑝𝑜𝑤𝑖 ę 𝑘𝑠𝑧𝑒𝑛𝑖𝑒𝑜𝑏𝑖𝑒𝑘𝑡𝑦𝑤𝑢=𝑝𝑜𝑤𝑖 ę 𝑘𝑠𝑧𝑒𝑛𝑖𝑒 𝑚𝑖𝑘𝑟𝑜𝑠𝑘𝑜𝑝𝑢 ( max❑ 2500 𝑥 )

e. Zastosowanie mikroskopu świetlnego zwykłego
 Umożliwia obserwację drobnoustrojów głównie w postaci zabitej i barwionej
 Pozwala na ocenę kształtu, wielkości i ułożenia drobnoustrojów (barwienia proste)
 Pozwala zaobserwować elementy strukturalne komóki bakteryjnej (specjalne techniki
barwienia)
3. Metody obserwacji drobnoustrojów
a. Metody mikroskopowe (ocena morfologii komórki)
b. Metody makroskopowe (ocena morfologii kolonii)
4. Ocena morfologii komórki
a. Wynik barwienia
b. Kształt
c. Wielkość (μm)
d. Układ
e. Obecność i ułożenie rzęsek
f. Obecność otoczki
g. Obecność ciał zapasowych
h. Obecność i ułożenie przetrwalników
5. Wynik barwienia (met. Grama)
a. Bakterie Gram (+)


b. Bakterie Gram (-)


6. Kształt komórki bakteryjnej
a. Kulisty
  Ziarniaki (ziarenkowce np. Staphyloccous aureus, Streptococcus pneumoniae)

o
b. Spiralny
 Krętki np. Treponema pallidum, Borrelia spp.

o
 Śrubowce np. Spirillum spp.

o
 Przecinkowce np. Vibrio cholerae
c. Cylindryczny
 Pałeczki np. Escherichia spp. Salomnella spp.

o
 Laseczki np. Bacillus spp. Clostridium spp.

o
 Pleomorficzny
7. Układy komórek bakteryjnych
 a.
 a) pojedyncze komórki
 b) pary (dwoinki), np. Streptococcus pneumoniae
 c) łańcuszki, np. Streptococcus pyogenes
 d) skupiska:
o czworaczki (tetrady), np. Micrococcus spp.

o pakiety sześcienne (sześcianki), np. Sarcina spp.

o Nieregularne zgrupowania, np. Staphylococcus spp.
8. Wielkość komórki
a. Wirusy max 0,4 μm
b. Bakterie 0,5 – 5 μm
c. Grzyby 5 - 100 μm
9. Ułożenie rzęsek na komórce
a. Monotrychalne (jednorzęse)
b. Ditrychalne (dwurzęse)
c. Lofotrychalne - jednobiegunowe np. Helicobacter pylori
d. Amfitrychalne – dwubiegunowe np. Spirillum spp.
e. Pertrychalne (wkołorzęse) np. Salmonella spp.
f. Atrychalne (bezrzęse)
10. Ułożenie przetrwalników (endospor)
a. centralnie
b. paracentralnie
c. subterminalnie
d. Terminalnie
11. Ultramikroskop
a. Umożliwia oglądanie drobnoustrojów w tzw. Ciemnym polu widzenia (oglądany obiekt – jasny)
b. Zastosowanie:
 obserwacja żywych niezabarwionych drobnoustrojów i ich ruchu
12. Mikroskop kontrastowo-fazowy
a. Umożliwia obserwację bezbarwnych obiektów przezroczystych dzięki specjalnej optyce, która
uwzględnia różnice w gęstości materiałów biologicznych i ich współczynnikach załamania światła
b. zastosowanie: obserwacja żywych, niezabarwionych komórek i ich ruchu, odróżnienie struktur
komórkowych bez barwienia
13. Mikroskop fluoroscencyjny (luminescencyjny)
a. wykorzystuje zjawisko fluorescencji (własnej lub wtórnej fluorochromów – auramina, rodamina,
fluoresceina) obiektów oświetlonych niewidzialnym światłem UV
b. zastosowanie – m.in. wykrywanie prątków gruźlicy, diagnostyka kiły, różnicowanie komórek żywych i
martwych, badania serologiczne (immunofluorescencja)
14. Mikroskop ultrafioletowy
a. Źródło światła - promienie UV
b. Umożliwia oglądanie komórek o wielkości 0,1 μm
c. obrazy rejestrowane na kliszy fotograficznej lub ekranie telewizyjnym
15. Mikroskop elektronowy transmisyjny
a. Zamiast promieni świetlnych - wiązka elektronów, która przechodząc przez pole magnetyczne ulega
odchyleniu
b. Przygotowanie preparatów – wykonanie bardzo cienkich skrawków materiału biologicznego za
pomocą tzw. ultramikrotomu, wyposażonego w specjalne noże szklane lub diamentowe.
c. Skrawki impregnowane są solami metali ciężkich (tzw. cieniowanie), co pozwala uzyskać obraz
trójwymiarowy.
d. Obraz oglądany na ekranie fluoryzującym lub rejestrowany na kliszy. Powiększenie do kilku mln razy.
 e.
16. Mikroskop elektronowy scaningowy – strumień elektronów nie przenika przez preparat, a jedynie go
„omiata”.

a.

Techniki przygotowania i barwienia preparatów mikroskopowych

1. Rodzaje preparatów mikroskopowych

a. Barwione i niebarwione
b. Świeże (przyżyciowe) i utrwalone
c. Preparat bezpośredni (wykonany bezpośrednio z materiału klinicznego) i pośredni (wykonany z
hodowli)
2. Barwienie
a. Bakterie prawie nie załamują światła, w związku z tym, aby je uwidocznić, należy użyć barwnych
związków chemicznych.
b. Barwienie jest procesem drastycznym w trakcie, którego następuje śmierć komórki.
3. Preparaty przyżyciowe
a. służą do obserwacji żywych drobnoustrojów (najczęściej pleśni i drożdży, u bakterii – tylko ocena
ruchliwości)
b. najczęściej nie zabarwione
c. można je przygotować w:
 kropli spłaszczonej na szkiełku podstawowym
 kropli wiszącej na szkiełku z wgłębieniem zwanym komorą Lindnera

o
4. Barwienie przyżyciowe
a. Barwienie żywych drobnoustrojów (przyżyciowo, bez utrwalania), ze względu na powolne wnikanie
barwników – rzadko stosowane.
b. Polega ono na wprowadzeniu do żywych komórek nietoksycznego barwnika o dużej kontrastowości i
w dużym rozcieńczeniu.
c. Barwienie przyżyciowe wykorzystuje się do:
 Obserwacji ruchliwości
 Obserwacji żywotności (odróżnienia komórek żywych od martwych)
 obserwacji sposobu rozmnażania
 wykrywania substancji zapasowych
5. Przygotowanie preparatu barwionego przyżyciowo w kropli spłaszczonej
a. 1. Odtłuścić szkiełko podstawowe.
b. 2. Przygotować zawiesinę drobnoustrojów na szkiełku podstawowym.
 podłoże stałe – pobrać jedną kolonię ezą;
 podłoże płynne - oczko ezy
 połączyć z kroplą 0,85% NaCl
c. 3. Umieścić obok kropli zawiesiny drobnoustrojów kroplę barwnika.
d. 4. Zmieszać obie krople ezą.
e. 5. Przykryć szkiełkiem nakrywkowym.
6. Przygotowanie preparatu utrwalonego
a. 1. Odtłuścić szkiełko podstawowe.
b. 2. przygotować rozmaz na szkiełku podstawowym – j.w., zawiesinę drobnoustrojów rozetrzeć na
szkiełku
c. 3. Pozostawić rozmaz do wyschnięcia na powietrzu
d. 4. Utrwalić (3 krotnie- w płomieniu palnika)
 Cele utrwalenia
o Zabicie drobnoustrojów
o Przyklejenie drobnoustrojów do szkiełka (przeciwdziała zmyciu preparatu podczas
barwienia)
o Częściowa denaturacja struktur komórkowych (ułatwienie wniknięcia barwnika do
wnętrza komórki)
e. 5. Barwienie
7. Metody barwienia
 a. Proste (jeden barwnik)
 Pozytywne - barwią się komórki drobnoustrojów
 Negatywne - barwi się tło, preparaty nie utrwalone; barwniki grubodyspersyjne – nigrozyna,
tusz chiński, czerwień Kongo
b. Złożone (kilka barwników, odbarwiacze)
 Pozytywne (j.w.)
 Pozytywno – negatywne (barwią się elementy komórek bakteryjnych i tło - metoda
uwidaczniania otoczek lub przetrwalników)
8. Typy barwienia

Typ Barwienie Metoda Wynik

Proste – pozytywne Metoda Löfflera Jednolite niebieskie zabarwienie kom. (wyjątek
Corynebacterium spp. - zabarwione nierównomiernie)
Proste – pozytywne Barwienie safraniną Jednolite czerwone zabarwienie kom.
Proste – negatywne Barwienie nigrozyną Tło ciemne, niezabarwione drobnoustroje
Złożone pozytywno- Metoda Burri – Ciemne tło, jasne otoczki, czerwone komórki bakteryjne
negatywne Ginsa
Złożone pozytywno - Metoda Dornera Ciemne tło, czerwone przetrwalniki
negatywne
Złożone - pozytywne Metoda Grama Gram dodatnie – fioletowe
Gram ujemne – czerwone
Gram chwiejne – czerwono-fioletowe
Złożone - pozytywne Metoda Neissera Komórki bakterii – żółto - zielone, ziarna metachromatyczne
(Babesa-Ernst’a) u Corynebacterium spp. – granatowe
Złożone - pozytywne Metoda Waysona Komórki drobnoustrojów ciemnogranatowe, inne np.
Barwienie preparatów nabłonki, leukocyty jasnofioletowo – granatowe
bezpośrednich
Złożone - pozytywne Metoda Wirtza – Komórki bakterii czerwone, przetrwalniki zielone
Conklina
Złożone - pozytywne Metody barwienia Bakterie kwasooporne – czerwone,
bakterii kwasoopornych: tło i pozostałe bakterie – niebieskie
Ziehl-Neelsena
Złożone - pozytywne Metody barwienia Efekt barwienia j.w.
bakterii kwasoopornych
Kinyoun – Gabett'a
Złożone - pozytwne Metody barwienia Bakterie kwasooporne - czerwone,
bakterii kwasoopornych: tło i pozostałe bakterie – zielone
Kinyoun
9.
10. Zasada barwienia metodą Grama
a. Różna barwliwość zależy od składu chemicznego komórek bakteryjnych.
b. Bakterie Gram (+) zawierają kwasy tejchojowe (polimery fosforanu glicerynowego i rybitolowego)
oraz rybonukleinian magnezu połączony z białkiem.
c. Fiolet krystaliczny po połączeniu z rybonukleinianem magnezu i jodem z płynu Lugola tworzy
nierozpuszczalny w alkoholu związek – p-jodorozanilinę.
d. Bakterie Gram (-) mają inna budowę chemiczną i dlatego barwniki wypłukiwane są alkoholem z
komórek, które w dalszym etapie przyjmują barwnik dodatkowy – fuksynę.
11. Germinacja – powrót endospor do życia, czyli tzw. germinacja polega na pobraniu wody, rozerwaniu ściany i
utworzeniu normalnej komórki wegetatywnej.
12. Sporulacja – proces tworzenia enodspor, czyli przetrwalnikowych form bakterii

13.
14.
15. Bakterie Gram-dodatnie posiadają grubą składającą się głównie z peptydoglikanu wielowarstwową ścianę
komórkową, która otacza błonę cytoplazmatyczną. Peptydoglikan jest konieczny do utrzymania struktury
komórki bakteryjnej, rozmnażania i przeżycia w zazwyczaj nieprzyjaznych dla bakterii warunkach
środowiskowych. Peptydoglikan ulega degradacji pod wpływem lizozymu – niszczenie struktury ściany
komórkowej.
16. Gram-ujemne bakterie posiadają unikatową strukturę jaką jest błona zewnętrzna. Ponieważ mają mniejszą
warstwę usztywniającego peptydoglikanu. Błona zewnętrzna otacza komórkę oraz warunkuje je kształt, służy
jako bariera dla dużych cząsteczek czy cząsteczek hydrofobowych. Oprócz tego służy jako ochrona przed
niesprzyjającymi warunkami zewnętrznymi. W części wewnętrznej błony zewn. Znajdują się fosfolipidy
występujące także u innych bakterii, jednak część zewnętrzna tej błony składa się głównie z
lipopolisacharydy (LPS). LPS, nazywany inaczej endotoksyną, jest stymulatorem wrodzonej i nabytej
odpowiedzi immunologicznej. W warunkach in vitro uwalniany jest do podłoża, a w warunkach in vivo – do
organizmu gospodarza aktywując limfocyty typu B.
17. Obecność LPS w organizmie indukuje stan gorączkowy i jest przyczyną wstrząsu. Bakterie z rodzaju Neiseria
wydzielają duże ilości związku zbliżonego w swej budowie do LPS – tzw. Lipopolisacharydu (LOS), którego
obecność w krwioobiegu również wywołuje stan gorączkowy i wstrząs.
18. Niektóre bakterie (gram-dodatnie oraz gram-ujemne) otoczone są dodatkowo przez luźno przylegające do
ich powierzchni warstwy polisacharydowe lub białkowe - określane mianem otoczki. W przypadku, gdy
warstwy te są niejednorodne pod względem grubości i słabo związane z powierzchnią komórki bakteryjnej,
mówimy o warstwie śluzowej. Otoczka i warstwy śluzowej nazywane są także glikokaliksem. Otoczkę trudno
jest ujrzeć pod mikroskopem, ale przestrzeń, którą zajmuje, może być uwidoczniona za pomoca np. Metoduy
Burriego-Ginsa.
19.
20. Związek p-jodorozanilina powstaje w ścianie komórkowej bakterii gram-dodatnich, dlatego podczas
barwienia metodą Grama barwią się one na kolor fioletowy
21. Bakterie nie posiadają jądra komórkowego. Materiał genetyczny zlokalizowany jest w pojedynczych
chromosomach oraz w plazmidach. Chromosom znajduje się w nieregularnym organellum komórkowym –
nukleoidzie. Nukleoidy znajdują się w cytoplazmie i zawierają oprócz chromosomów, różnorodne białka i
RNA.