MIKROBIOLOGIA PRZEMYSŁOWA:

1:

Drobnoustroje wykorzystywane w biotechnologii muszą zapewnić:

• wysoką jakość produktu
• powtarzalność przeprowadzanych procesów
• bezpieczeństwo
Wybór mikroorganizmów dla danego procesu:
• charakterystyka odżywiania (tani)
• optimum temperaturowe (zbliżone do pokojowej)
• wzrost w aparaturze przemysłowej
• stabilność cech, odporność na manipulacje genetyczne
• produkcyjność
• łatwość wydzielania produktu z medium pofermentacyjnego (nie kumulowane w komórce)
• brak toksycznych produktów metabolizmu i patogennosci
Pozyskiwanie szczepów o znaczeniu przemysłowym:
• izolacja nowych mikroorganizmów o pożądanych cechach (ze środ. naturalnego)
• badanie znanych szczepów (ze środ. przekształconego przez człowieka/z kolekcji szczepów)
Źródło szczepu:
• środ. naturalne
• środ. przekształcone przez człowieka
• kolekcje szczepów
Kolekcje mikroorganizmów: (ok. 1% wszystkich szczepów)
• cel – zapewnienie referencyjnych szczepów dla celów badawczych, porównawczych, edukacyjnych
• cechy szczepów – preparaty aktywne, stałe cechy (fizjologiczne i produkcyjne), niezmieniona
aktywność produkcyjna
• zadania:
ú depozyty publiczne, bezpieczne International Depositary Authority – przechowywanie mikroorg.
w związku z postepowaniem patentowym
ú poszukiwanie nowych szczepow o przydatnych cechach oraz ich ulepszanie z zastosowaniem
metod klasycznych i inżynierii genetycznej
ú klasyfikacja i identyfikacja drobnoustr.
ú badania nad doborem skutecznych metod przechowywania drobnoustrojow w war. laboratoryjnych
ú przeprowadzanie szkolen specjalistow
• atrybuty dobrej kolekcji:
ú wykwalifikowana kadra naukowa
ú katalog szczepow i usług
ú metryczka szczepu
› nr kolekcyjny
› nazwa gatunkowa i synonim szczepu
› data wprowadzenia do kolekcji
› metoda przechowywania
› cechy morfologiczne, biochemiczne
› właściwości toksyczne i chorobotworcze
• w przechowywaniu powinno być zapewnione:
ú czystisc mikrobiologiczna
ú maksymalna zywotnosc kom. (nawet orzy b. malej przezywalnosci drobnoustrojow, ważne jest aby
pozostale kom. char. się cechami biotechnologicznymi na poziomie kultury wyjściowej)
ú stabilność cech fizjologicznych i genetycznych, w tym przede wszystkim produktywność
metabolitów pierwszo- i drugorzedowych
• przechowywanie – dobór indywidualny, należy je przechowywać w rownoleglycj formach z uwagi na
bezpieczenstwo; metody:
ú pasazowanie (okresowe przesiewy) mikroorg. na pożywki stale lub plynne i przechowywanie tych
hodowli w temp. pokojowej lub 4*C
ú skosy agarowe zalane jalowa parafina
ú liofilizacja, zamrazanie w ciekłym azocie
ú metoda opracowana indywidualne – szczególnie cenny szczep
Pozyskiwanie nowych szczepów o znaczeniu przemysłowym (screening):
• podejście typu shotgun – pozyskujemy mikroorg. z roznych zrodel, rozizolowujemy do czystych kultur
i poszukujemy mikroorg. spełniających odpowiednie zalozenia; stos. do poszukiwania mikroorg. o
nowych wl. enzymatycznych ze srod. ekstremalnych
• podejście obiektywne – zakłada poszukiwanie mikroorg. w takich srod. gdzie spodziewamy się je
znaleźć; potrzeba dużo wiedzy o charakterystyce danego mikroorg.
Etapy pozyskiwania nowych szczepów o znaczeniu przemysłowym:
• wybór miejsca
• pobranie próby ze środowiska
• wstępna obróbka próbki
• izolacja

Wybór miejsca i pobranie próby ze środowiska:

Środowisko (naturalne lub przekształcone przez człowieka) – wybrane racjonalnie źródło
mikroorganizmów o pożądanych cechach.
• przetwórstwo skrobii:
ú miejsce pobrania: środ. nat. obfitujące w gatunki mikroorganizmów termofilnych i
hipertermofilnych:
› gorące źródła
› solfatary
• nowe antybiotyki:
ú miejsce pobrania: środ. nat. obfitujące w gatunki promieniowców:
› gleba
› rozkładająca się masa roślinna
› torfowiska
• bioremediacja gleby skażonej prod. ropopochodnymi:
ú miejsce pobrania: środ obfitujące w gatunki mikroorg. zdolnych do biodegradacji węglowodorów:
› gleby obok stacji paliw
› gleby okolic lotnisk
› gleby okolic torowisk kolejowych
Sposób zwiększania liczebności populacji:
• oddziaływanie na środ. przed pobraniem próby (np. węglowodory)
• wprowadzenie do środ. pułapek (np. cukry proste)
• wstępna obróbka fizyczna lub mechaniczna próbki
• hodowla wzbogacająca (nie dotyczy składników podłoża, dotyczy wzbogacenia populacyjnego):
ú cel: zmiana liczebności populacji w próbce podczas inkubacji z zastosowaniem czynnika
selekcyjnego:
› zw. chemiczny
› pH pożywki
› temp. inkubacji
ú przykład - izolacja bakterii propionowych (laseczki g(+), względnie beztlenowe, metabolizują
kwas mlekowy):
› czynniki selekcyjne:
– tlen
– źródło węgla
› warunki:
 – hodowle beztlenowe
– kwas mlekowy i glukoza jako zrodlo wegla
Izolowanie producentów:
• zastosowanie pożywek stałych (np. producent enzymów – pożywka selekcyjna z substratem dla
enzymu)
• podłoża hodowlane (dla max. ekspresji cech genetycznych)
ú metody wyboru:
› pożywki limitujące wzrost niepożądanych mikroustrojów
Testy:
Testy selekcyjne – poszukiwanie producenta do zastosowań przemysłowych:
• główna metoda
• kryterium: cecha biochemiczna powiązana ze zdolnością do produkcji danego bioproduktu
• prosta i szybka metoda
Testy fermentacyjne – ocena przydatności przemysłowej izolanta
• cel: wybór izolanta prowadzącego określony proces z najwieksza wydajnoscia po uwzględnieniu
kosztów
• niewielkie reaktory
• ustalenie optymalnej metody hodowli badanego mikroorganizmu:
ú rozwiązanie konstrukcyjne bioreaktora
ú sposób hodowli (ciągła, dolewowa, okresowa)
ú warunki fizykochemiczne hodowli
ú skład pożywki hodowlanej

2:
Metody identyfikacji drobnoustrojów:
• biochemiczne – np. testy API, system biolog, wstępne przypisanie mikroorg. do gatunku
ú polegają na zdolności mikroorganizmów (wytwarzaniu specyficznych układów enzymów) do:
› asymilacji (konwersji skł. odżywczego do związków wykorzystywanych do budowy
organizmu oraz energii w formie ATP)
› fermentacji (beztlenowej enzymatycznej konwersji zw. organicznych, szczególnie
weglowodanow, do prod. prostszych, glownie alkoholi, oraz energii w formie ATP)
› rozkładu określonych związków
ú określa się na podstawie reakcji chem. zachodzących w odpowiednio skomponowanych
pożywkach wzrostowych
ú wynik testu odczytuje się makroskopowo po czasie inkubacji poprzez:
› obserwacje wzrostu
› zmianę zabarwienia pożywki (powstałą jako efekt metabolizmu)
 › wywołanie r. barwnej przez wprowadzenie czynnika reagującego z metabolitem wytwarzanym
przez mikroorg.
› wydzielenie gazu
• biofizyczne – opierają się o badanie zwiazkow char., bedacych produktami metabolizmu lub bedacych
składnikami strukturalnymi
ú oznaczenie bialek:
› każda jednostka taksonomiczna ma charakterystyczny profil białkowy (molekularny odcisk
palca), jest to skład bialek jakościowy i ilościowy
› np. elektroforeza – otrzymujemy czysta kulture i inkubujemy z markerem metabolicznym (np.
ze znakowanym radioaktywnie aminokwasem – Met z izotopem siarki)
– mikroorg. wbudowują marker w strukury bialek
– nastepuje izolacja bialek
– elektroforeza w zelu poliakrylamidowym
– analiza – otrzymujemy profil białkowy, który jest porównywany z baza danych
› MALDI-TOF Spektrometria mas
– identyfikacja ludzkich patogenow, części drobnoustrojow odzwierzęcych i mikroorg.
środowiskowych
– badanym profil bialek, ale glownie bialka rybosomalne wystepujace w kom.
drobnoustroju w największej ilości i w bardzo podobnej liczbie kopii
– czysta kultura jest nanoszona na plytke ze stali kwasoopornej
– na ta plytke nanoszona jest tez matryca (która jest potrzebna jako zrodlo protonow do
jonizacji)
– rozpuszczalnik odparowuje, matryca krystalizuje (wraz z białkami bakteryjnymi)
– plytka do komory próżniowej, jest poddawana działaniu lasera (który musi być dobrany
aby nie dochodzilo do fragmentacji cząsteczek tylko do wybijania czast. z matrycy)
– matryca ulatwia jonizacje – absorbuje en. lasera i przekazuje ja do analizowanej
substancji, powstają zjonizowane peptydy
– zjonizowane peptydy przyspiesza się w silnym polu elektrycznym i mierzy się czas
przelotu do detektora
– jony o roznej masie poruszają się z rozna predkoscia, otrzymuje się wiec pewien rozkład
peptydow (wg. maswy czast., ladunku i zróżnicowanego czasu przelotu)
– otrzymujemy widmo które może być porównane z referencyjnymi widmami
– ograniczenia:
(a) wymog czystej kultury – nie możemy przeprowadzić na mieszanej kulturze
(b) może być ciężko zidentyfikować blisko spokrewnione mikroorg.
ú oznaczenie char. kw. tłuszczowych:
› skład kw. tłuszczowych oslon kom. (jakościowy i ilościowy) jest char. dla danego gatunku
(przy zachowaniu kontrolowanych warunków hodowli – rodzaj podloza, skład podloza, czas
inkubacji, temp.)
› chromatografia gazowa:
– FAME – fatty acid methyl ester
(a) saponifikacja (przemiana tkanki tłuszczowej w żółto-brunatne masy tłuszczowo-
woskowe) i uwolnienie kw. tluszczowych
(b) metylowanie (otrzymujemy estry)
(c) ekstrakcja z fazy wodnej
(d) rozdzial z zastosowaniem chrom. gazowej
(e) analiza wynikow i porównanie z baza danych
• biologii molekularnej
ú hybrydyzacja kw. nukleinowych – sondy genetyczne
› laczy się krotki fragment kw. nukleinowego (lub jego analogu) z mat. genetycznym zawartym
w danej probie, a ma sekw. komplementarna do sondy
› sondy sa znakowane – fluorescencyjnie lub radioaktywne
› na podlozu stalym lub plynnym
› homologia>60% przynaleznosc do gatunku
› homologia>20% zgodność z danym rodzajem
› homologia<5% organizmy niespokrewnione
 › FISH – fluorescencyjna hybrydyzacja in situ:
– ident. mikroor. pod mikroskopem fluorescencyjnym
– sondy fluorescencyjne, krótkie – znakowane odp. barwnikiem na końcu 5’ – sa
komplementarne do konkretnych sekw. w 16s rRNA
– w utrwalonych kom. dochodzi do hybrydyzacji in situ ( w preparacie mikroskopowym)
– fluorochrom jest pobudzany swiatlem o odp. dlugosci
– intensywność sygnalu fluorescencyjnego zależy od zawartości komórkowego RNA, etapu
wzrostu – czyli możemy ocenic poziom metabolizmu, który wynika z liczby rybosomow
ú analiza sekwencji rDNA (16S rRNA)
ú PCR - metoda powielania łańcuchów DNA polegająca na łańcuchowej reakcji polimerazy DNA w
wyniku wielokrotnego podgrzewania i oziębiania próbki, w warunkach
laboratoryjnych. Wielokrotne powtórzenie etapow:
› 1. denaturacja
› 2. przyłączenie starterow
› 3. wydluzanie lancuchów (elongacja)
ú plazmidowy fingerprinting
• immunologiczne
ú oparte na reakcji miedzy przewciwcialem a antygenem (antygen to może być składnik sciany
kom., toksyna, cala komorka)
ú nie potrzeba izolacji i czystej kolonii
ú testy aglutynacji lateksowej (aglutynacja- jeden z odczynów immunologicznych, polegający na
zlepianiu antygenów upostaciowanych (np. bakterii lub krwinek) pod wpływem swoistej surowicy
krwi oraz znajdujących się w niej specyficznych przeciwciał – aglutynin)
› kulki lateksowe oplaszczone przeciwciałami
› gdy antygen pojawia się w roztworze kulki ulegaja sieciowaniu w duże kompleksy
(aglutynacji)
› wynik pozytywny możemy odczytac makroskopowo
› mało czula metoda
ú testy immunofluorescencyjne (FIA)
› wykorzystują przeciwciała znakowane barwnikami fluorescencyjnymi (np. izotiocyjanian
fluoresceiny, FITC), czast. barwnika przyłączone do czast. immunoglobin kowalencyjnie

› reakcja serologiczna znakowana bezpośrednia lub pośrednia.

– W reakcji pośredniej za pomocą znakowanych fluoresceiną antyludzkich przeciwciał

wykrywa się ludzkie przeciwciała związane z danym mikroorganizmem.

– W reakcji bezpośredniej antygen reagując ze znakowanym przeciwciałem daje znakowany

kompleks antygen-przeciwciało.

› wynik odczytujemy pod mikroskopem fluorescencyjnym

ú testy immunoenzymatyczne
› podstawa jest reakcja miedzy antygenem a przeciwciałem
› uwidacznianie efektu reakcji – reakcja enzymatyczna
› przeciwciała z przyłączonym enzymem (np. peroksydaza chrzanowa)
› jeżeli dojdzie do związania antygenu i przeciwciała, aktywowany jest enzym, który
przekształca chromogen w kolorowy precypitat
› ELISA – test bezpośredni, oznaczanie antygenu
Doskonalenie szczepów:
• bardzo rzadko wykorzystuje się szczepy bedace naturalnymi izolantami (glownie procesy
fermentacyjne w przemysle spożywczym) a większość wykorzystywanych to takie mikroorg. które
musza być ulepszane
• sa rozne powody ulepszania szczepow:
ú zwiększenie wydajności wytwarzania określonego czynnika
ú zachowanie produkcyjności
 ú zwiększenie odporności na fagi
ú ograniczenie problemu pienienia (dot. fermentacji tlenowej)
ú zwiększenie odporności na składniki mediów hodowlanych
ú wyeliminowanie pobocznych produktów przemian
• aby to zrobić musimy znac metabolizm danego mikroorg. (bo często modyfikuje się szlaki metabolitów
pierwotnych lub wtórnych) i to, w jaki sposób odbywa się kontrola danego mikroorg. (bo b. często
udoskonalenie=zniesienie mechanizmow kontroli)
• metody:
ú nieoparte o obce DNA
› mutageneza – czynniki mutagenne, jak wygląda procedura i jakie sa etapy, w jaki sposób
selekcjonuje się mutanty
– mutageny: fizyczne (promieniowanie), chemiczne (zw.alkilujace; analogi zasad)
ú oparte o obce DNA (rekombinacja)
› transdukcja
› konjugacja
› transformacja
› heterokarjoza
› fuzja protoplastów – hybrydyzacja wymuszona, powstala w wyniku obserwacji
naturalnego zjawiska – naturalnej hybrydyzacji
– przekazanie informacji genetycznej z kom. dawcy do kom. biorcy w wyniku ich
fizycznego kontaktu
– polega na wymianie fragmentow DNA pomiędzy chromosomami lub genoforami kom.
dawcy i biorcy
– naturalna hybrydyzacja zachodzi rzadko, przeszkody: sztywna sciana kom., ujemny
potencjal po zewnętrznej scianie blony kom.
– bardzo dobrze sprawdza się w przypadku grzybow, żeby wyeliminować cechy
niekorzystne lub poprawić cechy technologiczne
– pozwala na rekombinacje zarówno wewnątrz- i zewnatrzgatunkowa praz rekombinacje >2
genotypow
– etapy:
(a) musimy otrzymać protoplasty (lub sferoplasty – z resztkami sciany kom.) –
enzymatyczna hydroliza sciany kom. w warunkach zapewniających osmotyczna
stabilizacje struktury (srod. hypertoniczne)
(i) związki stabilizujące srod. osmotyczne: male stężenie soli nieorganicznych,
sacharydow lub alkoholi cukrowych (np. sorbitolu) w buforze (np.
fosforanowym)
(ii) preparat trawiący sciane kom. – zależy od budowy sciany kom.:
1. bakterie G+ - lizozym
2. bakterie G- - lizozym + EDTA (zw. chelatujacy metale) + warunki jonowe
3. grzyby – sok zoladkowy ślimaka Helix pomatia, enzymy lityczne
pochodzenia drobnoustrojow
(iii) najłatwiej otrzymać protoplasty pochodzące z fazy wzrostu wykładniczego
(logarytmicznej)
(b) do fuzji może dojść po zbliżeniu protoplastów na małą odleglosc – aby to osiagnac
stosujemy:
(i) impulsy elektryczne
(ii) srodki modyfikujące blone cytoplazm.
(iii) kationy wapnia w wysokim pH
(iv) glikol polietylenowy – zw. neutralizujący powierzchniowy ladunek ujemny i
zmniejszający sile odpychania protoplastów (fuzogeny – przejściowo uszkodzaja
blone i ulatwiaja proces fuzji)
(c) powstaje układ heterokarionta – jadra rodzicielskie koegzystują obok siebie w tej
samej cytoplazmie
(d) dochodzi do kariogamii i zlania się jader – powstają synkarionty (hybrydy
jednojadrowe) – układ diploidalny
(e) wymiana fragmentow DNA miedzy chromosomami (crossing-over)
 (f) dochodzi do samorzutnej lub indukowanej haploidyzacji, podczas której nastepuje
segregacja nowych genotypow
(g) otrzymujemy haploidalne rekombinanty, które hoduje się w specjalnych pożywkach,
aby odtworzyly sciane kom.
(h) tak samo jak w mutagenezie: po tym procesie nie wiadomo który rekombinant jest
tym pożądanym, wiec jest jeszcze etap selekcji rekombinantow:
(i) wymaga genetycznie trwałych markerow fizjologicznych – auksotrofy o roznych
wymaganiach pokarmowych, mutanty oddechowe lub odporne na dany
antybiotyk W KTÓRYCH zniesiona została auksotrofia/efekt
oddechowy/odporność na dany antybiotyk
› inzynieria genetyczna
– umozliwia laczenie fragmentow genomow z kompletnie roznych organizmow
– przenosimy geny z jednego org. do drugiego i otrzymujemy klony, które nabywają
zdolność do syntezy jakiegoś bialka
– etapy:
(a) izolacja/synteza genu – najtrudniejszy etap
(b) laczenie genu z wektorem
(c) wprowadzenie do komórki gospodarza – odpowiedni system ekspresyjny:
(i) prokariotyczny
1. bakteryjny – opiera się o E.coli lub rozne bakterie z rodzaju Bacillus,
najczęściej stosowany układ do produkcji bialek
a. w krótkim czasie pozwala na otrzymanie dużych il. bialek
rekombinowanych
b. niski koszt hodowli
c. bakterie się szybko dziela
d. latwo się skaluje takie hodowle
e. bakterie maja dobrze opisane mechanizmy transkrypcji i translacji co
pozwala na latwa mutacje
f. możemy uzyskac dość wysoki poziom ekspresji
g. wykorzystywane bakterie sa pozbawione czynnikow patogennych
h. nadaje się do produkcji bialek nieglikolizowanych
i. u E. coli:
i. brak możliwości przeprowadzania modyfikacji posttranslacyjnych
(co jest potrzebne w przypadku wielu bialek eukariotycznych)
ii. bialka często sa produkowane w postaci cial inkluzyjnych, które
trzeba izolować i przefaldowywac (a wtedy tracimy wydajność)
iii. brak wydajnego systemu sekrecji produkowanych polipeptydow
(rekombinowanych)
iv. ograniczona zdolność do tworzenia mostkow disiarczkowych
v. obecność w preparatach LPSu (endotoksyny o wlasciwosciach
pirogennych) – wiec w przypadku bialek przeznaczonych do
zastosowan terapeutycznych trzeba całkowicie usunąć LPS co wiaze
się z dodatkowymi etapami oczyszczania i podnosi koszty
j. u Bacillusa lepiej się to prezentuje – zwłaszcza w kontekście systemow
sekrecyjnych, bo ma je lepsze
2. produkty otrzymane z wykorzystaniem prokariotycznych systemow
ekspresyjnych:
a. somastatyna, insulina, bydlęcy hormon wzrostu, 1 antytrypsyna,
interleukina-2, czynnik martwicy nowotworow, interferony (gamma i )
(ii) eukariotyczne – używamy kiedy potrzebujemy obrobki posttranslacyjnej:
1. oparty o drozdze:
a. zalety: dobrze schar. genetycznie; sa to kom. w których zachodzą
modyfikacje posttranslacyjne; latwo się je hoduje, cena hodowli jest
niewielka w porównaniu z hodowlami kom. ssakow i owadow
b. S.cerevisiae
i. srednia wydajność transformacji mikroorg.
ii. ograniczona liczba wektorow
 iii. brakuje wydajnych systemow sekrecji
iv. ograniczone możliwości modyf. posttransl. – brak amidowania, brak
niektórych fosforylacji lub hydroksylacji, maja tendencje do
hiperglikozylacji – przylaczaja do rdzenia polipeptydu zbyt wiele
mannozy, wiec nie nadaje się do terapeutycznego wykorzystania
c. Pichia pastoris
i. drozdze metylotroficzne – może rosnąć przy dużych stęż. metanolu,
które zabijają inne mikroorg.
ii. lepsza wydajność transformacji
iii. w latwy sposób można doprowadzić do integracji wielu kopii obcego
DNA do jej chromosomu w wyniku czego otrzymujemy stabilne
transformaty
iv. wyzsza produktywność bialka
v. nie ma hiperglikozylacji
d. produkty otrzymane z wykorzystaniem drożdżowych ukladow
ekspresyjnych:
i. oksydaza glukozowa, oksydaza moczanowa, insulina, antygen pow.
WZW typu B, glukagony, hirudyna, płytkowy czynnik wzrostu,
nieglikozylowana albumina ludzka
2. oparty o grzyby pleśniowe/strzępkowe (Aspergillus sp.)
a. geny sa latwo wlaczane do ich chromosomow, po czym te geny stabilnie
się integrują (daje to gwarancje długoterminowej stabilności genetycznej
uzyskanych rekombinantow)
b. maja podobne metody modyfikacji posttranslacyjnych (faldowania) jak w
przypadku ssakow – jesteśmy w stanie otrzymać pelnowartosciowe bialka
c. b. wydajny system sekrecji
d. sa genetycznie poznane i ich hodowla nie sprawia trudności
e. produkty otrzymane z wykorzystaniem tych ukladow ekspresyjnych:
i. fitaza, laktoferyna, renina, glukoamylaza, proteazy
(d) selekcja klonow
(e) praktyczne wykorzystanie klonow
› inzynieria metaboliczna
WYKORZYSTANIE ZREKOMBINOWANYCH SZCZEPOW DO PRODUKCJI INSULINY:
• sposób fermentacyjny – zanim doszło do jego wynalezienia trzeba było znaleźć wydajny system
ekspresji
ú zanim insulina stanie się aktywna – wytwarzana jako pre-proinsulina
› pojedynczy, dlugi lancuch białkowy z nierozdzielonymi polipeptydami A i B i sekcją w
srodku która laczy lancuchy ze sobą i sekwencje sygnalowa na końcu, która mowi kom. kiedy
rozpocząć wydzielanie do środowiska
ú zostaje przeksztalcona w proinsuline – nadal jeden lancuch, dalej z sekwencja sygnalowa
ú aktywna insulina – 2 oddzielne polipeptydy polaczone mostkami disiarczkowymi; bialko
pierwotne musi zostać poddane modyfikacjom posttranslacyjnym żeby się w nia przeksztalcic
› wykorzystanie prokariotycznego systemu opartego o E. coli ALE z wykorzystaniem dwóch
oddzielnych linii
– 1: otrzymujemy lancuch A (w postaci bialka fuzyjnego)
– 2: otrzymujemy bialko fuzyjne zawierające lancuch B
› ekstrahuje się bialka fuzyjne i chemicznie obrabia do otrzymania pojedynczych lancuchow
› lancuchy laczy się co skutkuje otrzymaniem aktywnej insuliny
ú otrzymany produkt to biofarmaceutyk 1. generacji – sekw. aminokwasowa identyczna z
natywnymi białkami ludzkimi
› ale obecnie otrzymuje się biofarmaceutyki 2. generacji – zmienia się sekwencje lancuchow i
niektóre aa w lanuchu, dzięki czemu otrzymujemy analogi szybko dzialajace lub długo
dzialajace
3:
Mikroflora surowcow i produktów poch. roślinnego lub zwierzecego:
• każdy surowiec i produkt to mieszanina, od której składu zaleza ich właściwości (w tym stabilność
biologiczna)
• czynniki warunkujące trwalosc mikrobiologiczna surowcow i produktów:
ú skład chemiczny
› bialka
› tluszcze
› węglowodany
› kw. organiczne
› witaminy
ú czynniki środowiska
› aktywność wody
› temperatura
› tlen
› wilgotność powietrza
ú wzajemne oddz. miedzy drobnoustrojami (jakie mikroorg. zasiedlają dany surowiec lub produkt)
› bezpośrednie
› pośrednie
• surowce i produkty i zasiedlające je mikroorganizmy – swoiste biocenozy (podlegające prawom
sukcesji ekologicznej, czyli zmianom o określonej kolejności), wpływ na ich trwalosc mają:
ú rodzaj mikroflory – saprofity lub patogeny (typowy dla poszczególnych rodzajow – np. owoce sa
zasiedlane przez drozdze)
ú liczebność mikroflory (np. melasa może być wykorzystywana jako składnik podloz hodowlanych,
jeśli jest na niej zbyt duża ilość mikroorg. saprofitycznych ma ona nizsza jakość, bo powodują one
zubożenie melasy)
ú substraty (makrocząsteczki) metabolizowane w określonej kolejności:
› cukry
› bialka
› lipidy
ú mikroflora bytujaca na surowcu (mikroflora rodzima), do której po przetworzeniu surowca (po
powstaniu produktu) moga byc wprowadzone dodatkowe mikroorg. (mikroflorę wtorna)
› zboza maja char. zestaw mikroorg., a podczas scinania zboza pojawiają się mikroorg. bedace
skutkiem tej obrobki
› mieso ma char. mikroflorę, podczas uboju lub przechowywania może zostać naniesiona
dodatkowa mikroflora (może być to mikroflora patogenna)
ú przechowywanie
› zboza przechowywane w silosach musza być wlasciwie przesuszone, jeśli nie sa mogą się
rozwinąć grzyby silosowe (Aspergillus, Penicillium), które powodują zubożenie jakości, a ich
metabolity mogą być toksyczne
› produkty mięsne sa przechowywane w niskiej temp., wymyślono sposób pakowania
próżniowego co spowodowalo ze został wyizolowany nowy gatunek mikroorg. – Clostridium
laramie (czyli ten sposób postepowania spowodowal ze mikroorg. wyewoluowaly zdolności
przetrwania w danych warunkach)
• zrodla zanieczyszczenia mikrobiologicznego surowców:
ú identyfikacja mikroorg. char. dla poszczególnych
surowcow, zaleznosci miedzy mikroorg i wpływu
procesow przetwórczych na zywotnosc tych mikroorg.
jest wazna bo pozwala przewidzieć kierunek przemian
metabolicznych, a tym samym zmiany chemiczne
podstawowych skladnikow danego surowca/produktu, a
tym samym prowadzi do wynalezienia skutecznych
metod przechowywania i utrwalania danych
surowcow/produktów
ú srodowisko – powietrze, woda, gleba
 ú człowiek ma wlasna mikroflorę, niektórzy sa nosicielami patogenow itd.
• mikrobiologiczne psucie zywnosci:
ú uczestniczą w nim org. przystosowane do rozkładu substratow i które rozwijają się w określonej
kolejności po sobie (sukcesja ekologiczna)
ú może zaczynać się zaraz po zbiorze lub po uboju
ú szybkość psucia zależy od:
› czynnikow zewnętrznych
– temp. przechowywania i dystrybucji
– czas przechowywania
– atm. gazowa wokół produktu
– rodzaj opakowania
› czynnikow wewnętrznych
– skład chemiczny
– zawartość wody
– pH
– obecność konserwantów
– czynniki biotyczne – mikroorganizmy:
(a) poczatkowa ilość (wyjsciowa)
(b) szybkość wzrostu
(c) aktywność metaboliczna
(d) interakcje pomiędzy mikroorg.
ú za obniżenie jakości zywnosci jest odpowiedzialna okreslona grupa mikroorg. – SSO (specific
spoilage organisms)
› model zakladajacy, ze za psucie produktu odpowiedzialna jest ta grupa a nie ogolna populacja
drobnoustrojow
› char. dla poszczególnych surowcow
› parametry charakteryzujące SSO:
– potencjal psucia (zdolność do roskladu określonych skl.)
– aktywność psucia (stopien rozkładu określonych skl.)
› interakcje miedzy mikroorg.
– antagonizm (grzyby wytwarzają kwasy i zakwaszają srod. uniemozliwiajac wzrost
bakterii)
– konkurencja (mikroorg. konkurują o składniki których jest b. mało, np. zelazo)
– protokooperacja (mikroorg. zyjace w jednym srod. mogą odnosić korzyści a mogą tez
funkcjonować osobno – prod. zakwasu chlebowego)
– metabioza (najpierw rozwijają się jedne mikroorg., modyf. srod., stwarzają srod. dogodne
dla innych mikroorg.)
– komunikacja „quorum sensing” (komunikacja za pomocą zw. chem.)
› SSO w produktach:
– jaja (bialka, lipidy) – bakterie (Pseudomonas, Serratia, Flavobacterium, Proteus,
Escherichia, Bacillus, Salmonella), grzyby (Penicillium, Cladosporium)
– mąka i prod. mączne (sacharydy) – bakterie (Bacillus, Serratia, Lactobacillus,
Clostridium), grzyby (Penicillium, Aspergillus, Rhizopus, Fusarium)
• rozklad:
ú sacharydow:
› najpierw rozklad mono- i disacharydow
› potem
cukrow
zlozonych:
 – skrobia – mikroorg. z wlasc. amylolitycznymi (Clostridium sp., Bacillus sp., pleśnie)
– pektyny – bakterie psychotrofowe (Pseudomonas, Leuconostac, mezofilne Ervinia,
Flavobacterium, pleśnie Aspergillus i Penicillium)
ú lipidow:
› tłuszcz bez wody – jełczeje, mikroorg. nie mogą się w nim rozwijać
› tłuszcz z woda – rozwijają się tam mikroorg. z wlasciwosciami lipolitycznymi
– Pseudomonas, Micrococcus, Bacillus, Flavobacterium
– Candida, Torula, Rhodotorula (drozdze)
– Geotrichum, Cladosporium, Aspergillus, Penicillium (pleśnie)
ú bialek:
› najwięcej bialek w prod. zwierzęcych
› rozkład bialek – proteoliza; mikroorg. musza mieć wlasc. proteoilityczne
› wieloetapowy proces:
– deaminacja – w
zasadowym pH, jeśli
char. jest
nieoksydacyjny
deaminacje
przeprowadzają liazy
– dekarboksylacja – w
kwasowym pH, w jej
wyniku powstają
aminy biogenne
› mikroorg. z
wlasciwosciami proteolitycznymi:
– Bacillus, Proteus, Pseudomonas, Alcaligenes, Clostridium (bakterie)
– Aspergillus, Penicillum (pleśnie)
• aminy biogenne – wywoluja zmiany w proc. metabolicznych zachodzących u różnych mikroorg., sa
niezbędnym stadium właściwego przebiegu r. chem. w kom. (jako hormony, regulatory wzrostu);
często wplywaja korzystnie na cechy organoleptyczne produktów, ale mogą być toksyczne
ú w zywnosci fermentowanej – zawartość amin biogennych wyzsza
ú w zywnosci niefermentowanej – zawartość amin biogennych nizsza
• w przypadku produktów zywnosciowych szybko psujących ważne sa:
ú odpowiednia technologia produkcji
ú odpowiedni sposób przechowywania
ú obrot zywnosci
• zestaw wytycznych żeby zapobiec zakażeniom zywnosci:
ú system HACCP (system analizy zagrozen i krytycznych punktów kontroli) – ukierunkowany na
zapewnienie bezpieczeństwa zdrowotnego zywnosci, zapewnia identyfikacje, ocene i kontrole
zagrozenia, które jest istotne dla bezpieczeństwa zywnosci, kladzie glowny nacisk na analizę
zagrozen poch. mikrobiologicznego
ú GMP – dobra praktyka produkcyjna (gdzie powinien być zlokalizowany zakład produkcji
zywnosci, jak powinny być rozmieszczone pomieszczenia, wyposażenie, procedury mycia,
dezynfekcji, konserwacji, szkolenia pracowników i ich higiena osobista)
ú GHP – dobra praktyka higieniczna (-,-)
ú RASFF (system wczesnego ostrzegania o niebezpiecznej zywnosci i paszach) – zbieranie
informacji i szybkie przekazanie informacji o produktach które mogą stanowic zagrozenie dla
zdrowia konsumentow
• choroby przenoszone przez zywnosc:
ú choroby zakazne
ú choroby odzwierzecie
ú zatrucia pokarmowe
› ostre schorzenie po spożyciu pokarmow zawierających określone rodzaje drobnoustrojow, ich
toksyny lub inne trujące produkty ich metabolizmu
› spośród chorob infekcyjnych na 3 miejscu w zestawieniu smiertelnosci
› objawy:
– nieswoiste: osłabienie, goraczka, bol glowy
 – swoiste: nudności, wymioty, biegunka, bole brzucha
› powodowane przez 2 rodzaje czynnikow etiologicznych:
– bakterie (zarówno G+ jak i G-)
(a) Listeria monocytogenes – dlugi czas wystąpienia objawow
(b) Staphylococcus aureus – krotki czas wystąpienia objawow
– wirusy (rotawirusy)
› każdy typ zatrucia pokarmowego, do wystąpienia objawow, musi przekroczyć dawke MID –
najmniejsza dawke czynnika infekcyjnego, która jest konieczna do wywolania objawowego
przebiegu choroby [CFU – jednostka tworzaca kolonie]
› dzieli się na grupy:
– intoksykacja – wywolane przez toksynę (przykłady: mikotoksyny, toksyna botulinowa,
enterotoksyna)
(a) zywnosc zanieczyszczona przez mikroorg. które rozwijają się na niej i wydzielają do
niej toksynę, która powoduje niekorzystny efekt po spożyciu (mikroorg. mogą być już
całkowicie unieczynnione po spozyciu)
(b) wywolane przez:
(i) toksyny bakteryjne
1. biegunkowe
2. wymiotne
3. enterotoksyny
4. neurotoksyny
(ii) toksyny wytwarzane przez glony
(iii) mikotoksyny (grzybowe)
1. metabolity wtorne wydzielane przez grzyby
2. grzyby mogą je tworzyć w roznych warunkach temp. i pH, mikotoksyny sa
na nie odporne
3. problemy w detekcji mikotoksyn – w zaleznosci od miejsca z którego
pobierzemy probke możemy trafic na hot-spot albo na brak obecność
grzybow (jest to skutek lokalnego wzrostu grzybow); maskowanie
mykotoksyn – roslina aktywuje swój mech. obronny na dana mykotoksyne,
który polega na jej modyf. chem. (np. przez glikozylacje), jeśli wtedy
zbadamy ziarno pod katem toksyny niemodyfikowanej dostaniemy wynik
negatywny, po zjedzeniu przez zwierze toksyna ulega odmaskowaniu
4. Aspergillus – produkuje glownie Aflatoksyny (w orzeszkach ziemnych,
ziarno kukurydzy i bawełny, produkty nabiałowe)
5. Penicillium expansum – produkuje Patulinę (w jabłkach)
6. powyższe produkują również Ochratoksynę (na zbozach i ziarnach kawy)
7. Fusaria produkują: Fumonizyny (w kukurydzy), Trichoteceny (w ziarnach) i
Zearalenon (w kukurydzy)
– infekcja – mikroorg. wnikają do organizmu, i namnazaja się:
(a) toksykoinfekcja - jeśli w wyniku namnażania uwolnią toksyny
(b) infekcje inwazyjne – jeśli czynniki infekcyjne wnikna do tkanek i narzadow
› toksyny bakteryjne:
– egzotoksyny – produkowane przez bakterie i wydzielane do środowiska
(a) prod. przez bakterie G+
(b) sa to bialka, z duza zawartoscia Lys, Tyr, Glu,, Asp
(c) rozpuszczalne w plynach ustrojowych
(d) nie dzialaja doustnie
(e) inaktywowane w temp. >60* przez kwasy i enzymy trawienne
(i) wyjątki: toksyna botulinowa, enterotoksyna gronkowcowa – silne toksyny i silne
antygeny, które inicjują proces powstawania swoistych przeciwciał
– endotoksyny – elementy strukturalne komorki
(a) prod. przez bakterie G-
(b) są to kompleksy LPS, poprzez lize komórki zostają uwolnione do srod. i wywoluja
toksyczny efekt
(c) w por. do egzotoksyn sa słabymi toksynami i słabymi antygenami
(d) właściwości goraczkotworcze
 (e) stalosc w podwyższonych temp. (cieplostale)

4:
PRZYKLADY TOKSYN BAKTERYJNYCH:
• Clostridium botulinum:
ú beztlenowa, urzesiona (ruchliwa) laseczka G+
ú wytwarza ciepłooporne przetrwalniki (endospory) w niekorzystnych war.
ú wystepuje w roznych srod.: gleba, osady denne, srod. wodne, przewod pokarmowy zwierzat
ú heterogenny (roznice miedzy bakteriami to roznice w metabolizmie i niektóre wytwarzają toksyny
– botulinowe):
› grupy toksyn A B C D E F G – odmienne antygenowo; na roznych obszarach dominuje
określony serotyp produkujący toksynę z danej grupy
› poszczególne serotypy org. produkujących poszczególne rodzaje toksyn roznia się
aktywnoscia proteolityczna
› toksyna botulinowa tworzy się w zywnosci podczas etapu przetrwalnikowania (w cyklu
zyciowym musi zostać uruchomiona sporogeneza żeby doszło do wytwarzania toksyny)
› jest to mikroorg. beztlenowy wiec ta toksyna tworzy się w tych warunkach
› te toksyny to metaloproteazy cynkowe; roznice pomiędzy szczególnymi neurotoksynami
botulinowymi dotycza sekw. aa i miejsca proteolizy
› toksyny botulinowe to neurotoksyny
› synteza toksyn:
– syntezowana w postaci toksyny progenitorowej – jako pojedynczy lancuch nieaktywnego
bialka
– aktywacja bialka ma miejsce po proteolizie (modyfikacji potranslacyjnej), w jej wyniku
powstaje forma dwulancuchowa polaczona mostkiem disiarczkowymi – cięższy lancuch i
lekki lancuch
(a) ciezki lancuch – polaczenie z odp. receptorami (presynaptycznymi)
(b) lekki lancuch – wlasciwy enzym proteolityczny (wysoce specyficzna endopeptydaza)
hydrolizujacy bialka transblonowe kluczowe dla uwolnienia neurotransmiterów
› toksyna dostaje się przez układ pokarmowy, z jelita cienkiego trafia do krwioobiegu i jest
transp. do plytek mięśniowo-nerwowych; w zal. od typu toksyny działanie proteolityczne jest
skierowane na rozne typy bialek transblonowych
› dzialanie toksyny botulinowej (jad kiełbasiany) - botulizm:
– blokuje funkcje nerwow motorycznych
– to skutkuje zwiotczeniem miesni i doprowadza do paraliżu
– jej celem może byc kompleks bialek SNARE (syntaksyna, SNAP25 synaktobrewina –
bialka niezbędne do fuzji pęcherzyka z acetylocholina z blona cytopl. kom. neuronowej i
uwolnienie acetylocholiny, która laczac się z odp. receptorem umozliwia skurcz miesni)
– wiaze się za pomocą lancucha ciężkiego z specyf. białkiem części presynaptycznej plytki
nerwowo-miesniowej, tworzy się endosom, w nim dochodzi do rozpadu wiaz.
disiarczkowego, dzięki temu lancuch lekki za pomocą kanalu jonowego
(współtworzonego przez lancuch ciezki) zostaje uwolniony do cytoplazmy części
presynaptycznej, gdzie endopeptydaza hydrolizuje bialka kompl. SNARE przez co hamuje
 fuzje pecherzykow synaptycznych z blona presynaptyczna i uniemozliwia uwolnienie
acetylocholiny do szczeliny synaptycznej, tym samym blokując skurcz miesni
– jeżeli dojdzie do spożycia skazonej zywnosci objawy mogą wystapic w krótszym lub
dluzszym czasie w zaleznosci od ilości neurotoksyny jaka spozylismy
› skutek: neuropatia nerwu czaszkowego – suchość w ustach, utrudnione połykanie, zaburzona
mowa
– w przyp. braku zgłoszenia objawow lekarzowi choroba postepuje – zstepujaca,
symetryczna slabosc miesni; porazenie nerwu przeponowego smierc
› leczenie: antytoksyny – immunoglobulina przeciwtubulinowa przeciwko określonym grupom
toksyn; ta antytoksyna neutralizuje tylko toksynę znajdująca się we krwi – jeżeli już wniknela
do neuronu to na nia nie dziala, wiec chory musi być obserwowany i musi dojść do regeneracji
sparaliżowanych konczyn, wtedy kom. nerwowe wytwarzają nowe polaczenia z wloknami
miesniowymi
ú konserwy domowe, tzw. wygodna zywnosc
• Staphylococcus aureus
ú ziarniaki G+, tworza ugrupowania
ú szeroko rozpowszchnione w przyrodzie (pospolicie w jamie noso-gardlowej, mikroflorze skory –
glownie to sa komensale ale wystepuja patogeny)
ú względne beztlenowce
ú szeroki zakres temp., pH i NaCl, odporność na wysuszanie, osmo- i halotolerancyjne
ú patogenność zwiazana z wytwarzaniem bialek enzymatycznych i toksyn
› czynniki patogenności: nukleaza, koagulaza, hemolizyna, enterotoksyny (ich produkcja jest
kluczowa do toksyczności tego przykładu mikroorg.)
ú w ukl. pokarmowym nie panuja odpowiednie warunki do ich rozwoju, przez antagonistyczne
działanie mikroflory
ú enterotoksyny (egzotoksyny – wydzielane poza kom., wplywaja szkodliwie na kom. nabłonka
jelitowego w przewodzie pokarmowym; bezpośredni powod zatruc)
› określono 21 typow serologicznych tych toksyn, a typy: A, B, C1,C2, D, E, F to typy
klasyczne; najwięcej zatruc powoduje toksyna A
› tworzone we wszystkich fazach wzrostu, ale najwięcej w fazie stacjonarnej (w zywnosci)
› bialka rozpuszczalne w wodzie, cieplooporne (różny poziom, najbardziej toksyna B), odporne
na proteolizę (tzn. ze przechodzi przez ukl. pokarmowy bez dezaktywacji, dociera do jelita i
tam się manifestuje jej aktywność)
› zrodlo zanieczyszczenia: chorzy ludzie (czasami nosiciele), mleko od chorych krow,
przetwory mięsne (krojone wędliny)
› aby doszło do gronkowcego zatrucia musza zaistnieć rownoczesnie czynniki:
– zrodlo zawierajace enterotoksyczny szczep gronkowca (np. człowiek, bydlo)
– przeniesienie gronkowcow ze zrodla do zywnosci (np. prży braku higieny)
– wlasc. fizykochem. zywnosci sprzyjające namnażaniu się gronkowcow i wytwarzaniu
enterotoksyn
– sprzyjajaca temp. i odp. ilość czasu umozliwiajaca namnażanie gronkowcow i i
wytwarzaie enterotoksyn
– spożycie zywnosci zawierającej wystarczajaca do wywolania objawow ilość
enterotoksyny gronkowcowej
› objawy: bol glowy i brzucha, biegunka, wymioty; zwykle ustepuja samoistnie
TOKSYKOINFEKCJE:
• wystepuja częściej niż intoksykacje, większe zróżnicowanie
• zatrucia pokarmowe, do których dochodzi w wyniku spożycia z pokarmem zywych drobnoustrojow;
efekty sa także skutkiem wytwarzania toksyn, ale aby były objawy musza się namnozyc mikroorg. w
organizmie (i w nim wytworzyć toksyny)
• o ich zjadliwości decydują:
ú zakaznosc (zdolność patogenu do wnikniecia do gospodarz, przebywania i namnażania się
ú inwazyjność – zdolność mikroorg. do pokonywania barier obronnych i rozprzestrzeniania się w
org.
ú toksyczność – zdolność do wytwarzania toksyn lub uwalniania produktów z procesow
metabolicznych
• Salmonella sp.:
 ú rodzina Enterobacteriaceae – paleczki jelitowe
ú G- wystepujaca w przew. pokarmowym zwierzat (ptactwo, gryzonie) i człowieka
ú 2 gatunki (rozne podgatunki, a każdy z roznym typem serologicznym):
› Salmonella enterica – b. heterogenny, roznorodnosc serologiczna (większość bakterii
toksycznych należy do Salmonella enterica subsp enterica (podgatunek enterica))
– np. S.Typhi (serowar: Typhi), S.Enteritidis (serowar: Enteritidis), S.Typhimurium
(serowar: Typhimurium)
› Salmonella bongori – homogenny
ú urzesione (ruchliwe), względne beztlenowce
ú male wymagania wzrostowe (latwo namnazaja się w zywnosci i organizmie)
ú wrażliwe na wysokie stęż. NaCl
ú acydotolerancyjne – przezywaja w pH zoladka i namnazaja się w jelicie cienkim
ú nie sa cieploodporne, sa odporne na wysuszanie
ú patogenność:
› zdolność do przezycia w niskim pH
› zdolność do namnażania się w jelicie
› zdolność do produkcji inwazyn
– grupa czynnikow bedacych odp. za rozmnazanie się bakterii w gospodarzu
– mogą obejmować czynniki enzymatyczne niszczace tkanki bądź zdolne do hamowania lub
unikania reakcji obronnych org.
– bialka i systemy sekrecyjne (umozliwiaja zakotwiczenie na kosmkach jelitowych,
penetracje do wnętrza kom. nabłonka), bialka stymulujące apoptozę makrofagów, enzymy
syntezy aa
– dzięki nim Salmonella kolonizuje jelito żywiciela i wnika wglab sciany jelita, gdzie
uwalnia endotoksyny
› zdolność do produkcji endotoksyn
– polisacharyd sciany kom. – LPS
ú salmonelloza:
› symptomy: mdlosci, wymioty, goraczka, skurcze brzucha
› zrodlo zakazenia: zywnosc pochodzenia zwierzęcego (skazona odchodami zwierzat, np.
woda), niepoddana obróbce termicznej
• Shigella sp.:
ú rodzina Enterobacteriaceae
ú paleczka G-
ú nieruchliwa
ú Shigella dyenteriae, S.flexneri, S.boydii, S.sonnei – oddzielne serogrupy, każdy bezwzględnie
patogenne i wywolujace czerwonkę
ú wzrost w temp. do 48*C
ú acydotolerancyjna, przezywa pH zoladka; wrazliwa na NaCl i na promieniowanie słoneczne
ú zanieczyszczenie fekalne wody, zywnosci, niska higiena osobista
ú w odróżnieniu od innych enteropatogenow (kolonizujących sciane jelita cienkiego) ona zasiedla
nabłonek w okrężnicy i odbytnicy
ú przebieg: adhezja do kom. nabłonkowych okrężnicy/odbytnicy, wnikanie do wnętrza kom., w
cytoplazmie się namnazaja i niszcza komórki powodując owrzodzenia (nie przedostają się do
innych tkanek)
ú czynniki wirulencji:
› bialka adhezyjne (bialka war. kolonizacje)
› inwazyny i bialka odp. za miedzykom. rozprzestrzenianie się
› egzotoksyny:
– toksyna Shiga (ShT) – cytotoksyna (letalna) odp. za hamowanie biosyntezy bialka w kom.
i jej smierc (produkowana przez Shigella dysenterie, powoduje zespol hemolityczno-
mocznicowy)
› enterotoksyny (z ich produkcja sa związane zatrucia pokarmowe)
– ShET1, ShET2
– zaburzają tylko funkcje kom. bez ich uszkadzania
– zaburzają działanie pompy jonowej enterocytow i wchłanianie wody w jelicie co jest
przyczyna biegunki
• Escherichia coli:
ú rodzina Enterobacteriaceae
ú paleczka G-, ruchliwa
ú może być komensalem, może być patogenem
ú na podstawie rodzajow czynnikow wirulencji wyróżniamy serogrupy chorobotwórcze (wirogrupy)
› wszystkie te wirotypy wytwarzają specyf. bialka sprzyjające kolonizacji, przywieraniu i
zdominowaniu mikroflory rodzimej
› EPEC – enteropatogenne; cz. wirulencji: adhezyny, enterotoksyny
› EIEC – enteroinwazyjne; nie produkują toksyn; bytując w jelicie grubym powodują biegunke
czerwonko-podobna
› ETEC – enterotoksyczne; cz. wirulencji: adhezyny, enterotoksyny; wywoluja biegunke
cholero-podobna
– toksyny należące do toksyn A-B 2 podjednostki, podj. B wiaze czast. toksyny ze
swoistym receptorem; podj. A – wlasciwa toksyna
(a) cieplostala ST – mniejsza, wytrzymuje ogrzewanie w 100*C, stymuluje cyklaze
guanylową w kom. nabłonka jelit
(b) cieplochwiejna LT – wieksza, ulega inaktywacji w ogrzewaniu w 65*C, stymuluje
cyklaze adenylową w kom. sluzowki jelit
– mechanizm działania: A wnika do wnętrza kom. i aktywuje cyklaze
(a) w przyp. LT cyklaze adenylową, ona powoduje wzrost wewnatrzkom. stęż. cAMP,
który aktywuje zalezna od niego kinaze bialkowa (kinaza fosforyluje bialka kom. i
bierze udział w transporcie jonow), wiec jest to bezposr. przyczyna zaburzenia
działania pompy sodowo-chlorkowej, dochodzi do nadmiernego wydzielenia jonow
chlorkowych i wody z kom., zahamowania wchłaniania zwrotnego jonow sodowych i
wody, nadmierne wydzielanie plynow i wzmozona ruchliwość jelit, dochodzi do
rozwoju biegunki sekrecyjnej i odwodnienia tkanek
(b) w przyp. ST  nadmierne wydzielanie plynow
› EHEC – enterokrwotoczne; cz. wirulencji: cytolizyna; miejsce namnażania się: jelito grube
› EAEC – enteroadherentne
ú przyczyna zakazenia: brak higieny osobistej pracowniow sektora spożywczego, zanieczyszczenie
wody sciekami ludzkimi
• 5:
• Campylobacter sp.:
ú Campylobacter jejuni – gatunek związany z zatruciami pokarm.
› sa w stanie przetrwać w zoladku, dzięki zdolności do ruchu i odp. czynnikow wirulencji
przenikają się przez sluzowke, przedostają się do kom. nabłonka jelita, i tam się namnazaja
› czynniki wirulencji:
– sprawny aparat ruchowy (polarnie ulozone rzeski) – to pozwala na adhezje do kom.
– adhezyny (CadF) – laczy się z fibronektyna enterocytow (kom. wyscielajacych jelito)
umozliwiajac tym samym adhezje bakterii do kom. jelita (bez nich mutanty nie kolonizują
kom. nabłonkowych)
– inwazyny (bialka sekrecyjne)
– LOS (a nie LPS) – lipooligosacharyd, analog. budowa fragmentu bloy zewn. do LPS ale
rdzen oligosacharydowy (a nie polisach.); budowa specyf. dla danego serotypu
– enterotoksyny – bialka laczace się z receptorami kom. nabłonka jelita cienkiego
(enterocytami) co powoduje zatrzymanie odp. immunologicznej (wytwarzania
przeciwciał) i brak możliwości zwalczenia infekcji; pod względem mechanizmu podobna
do enterotoksyny LT
– cytotoksyna CDT – cytoletalna genotoksyna; uszkadza mat. gen. w kom. eukariotycznej,
przez co zostaje zatrzymany cykl kom. co skutkuje smiercia kom.; zakazenie szczepem
syntetyzującym ją ma gorsze objawy
ú wystepuje w przewodzie pokarmowym zwierzat (ptaków)
ú urzesione (ruchliwe) G-, mikroaerofile (wymaga do wzrostu mniej tlenu niż tlenowce
ú pozytywnie na ich wzrost wpływa obecność CO2 i H2 (<10%)
ú wzrost w temp. 30-47*C, wrażliwe na wysychanie, pasteryzacje
ú odporne na niskie pH, NaCl i zamrazanie
ú nie namnaża się w zywnosci tylko w niej bytuje
 ú przyczyna zatruc: prod. poch. zwierzęcego (niedopieczone/niedogotowane), niepasteryzowane
mleko, kontakt z zakazonym osobnikiem
ú zakazenia krzyżowe – przeniesienie bakterii z miesa na inny produkt (np. w przypadku mycia
surowego kurczaka)
ú campylobakterioza: zapalenie zoladka i zapalenie jelit
• Listeria monocytogenes:
ú paleczki G+, nie produkujące przetrwalnikow
ú względne beztlenowce
ú ruchliwość zalezna od temp. – urzesienie perytrychalne, w wysokich temp. produkcja flagelininy
(bialka budującego rzeske) zostaje ograniczona (nastepuje to już od temp. ciala człowieka)
ú zdolność do wzrostu w szerokim zakresie temp. i pH
ú psychrotrofy (nie tylko znosi niska temp. ale jeszcze się w niej namnaża) i halotoleranty (odp. na
wysokie stęż. soli)
ú srod. bytowania: gleba, wody, scieki
ú zrodla zakazenia: kielki, miękkie sery, niegotowane mleko
ú pokonuje bariery: jelitowa, lozyskowa, krew-mozg
ú wnika droga pokarmowa, pokonuje b ariere jelitowa, dostaje się do wątroby i śledziony; w
hepatocytach i kom. śledziony może się namnazac, jeśli nie dojdzie do zatrzymania zakazenia
bakterie zostają uwolnione do krwioobiegu (zakazenie rozsiane), mogą pokonać bariere krew-
mozg i namnazac się w kom. mózgu u kobiet ciężarnych stanowią zagrozenie dla dziecka
ú listeriozy – samo pojawienie się Listerii w układzie pokarmowym ich nie powoduje, bo naturalna
mikroflora na to nie pozwala, ale jeśli pokonają czynniki hamujące to bakteria rozpoczyna inwazje
ú fagocytoza – sposób na rozprzestrzenianie się w organizmy
ú czynniki wirulencji szczepow zjadliwych:
› inwazyny
› adhezyny
› listeriolizyna O – czynnik rozkladajacy blone fagocytu produkowany przez bakterie po jej
wchlonieciu do fagocytu; dzięki jej produkcji w blonie fagosomu dochodzi do powstania dziur
i bakteria przedostaje się do cytoplazmy kom. i do innych kom.; wykazuje powinowactwo
względem blon zawierajacyh cholesterol (przez to jest zaliczana do toksyn CDTX – z akt.
cytolityczna do blon zaw. cholesterol)
ú 4 etapy patogenezy:
› kom. bakterii przyłącza się do fagosomu (kom. żywiciela)
› wnika do wnętrza kom.
› uwalnia się z fagosomu
› przechodzi do cytoplazmy, namnaża się i migruje do innych kom.
ú gr. ryzyka: dzieci, ciężarne, osoby starsze, z problemami ukl. odpornościowego
• Clostridium perfingens (laseczka zgorzeli gazowej)
ú beztlenowa laseczk G+
ú wrazliwa na niskie temp., wytwarza cieplooporne przetrwalniki
ú temp. 20-50*C, pH 5,5-8
ú szczepy podzielone na 5 biogrup (toksynotypow) A, B, C, D, E – w zal. od toksyn prod. przez
bakterie
ú produkuje toksyny:
›  (fosfolipaza C), , ,  - uszkadzają blony cytoplazmatyczne
› PFO – perfringolizyna O
› CPE – enterotoksyny związane z zatruciami; wytwarzane podczas przetrwalnikowania w
jelicie, uwalniana do srod. podczas lizy komórki; bialko które na końcu C ma region laczacy
się z receptorem enterocytow, a N końcu ma fragment który jest odcinany przez E
proteolityczne, w wyniku czego zwieksza się aktywność enterotoksyny
– wrazliwa na srod. kwaśne dlatego jest tworzona dopiero w jelicie
– odporna na proteolizę
– zdolność do jej prod. może być latwo przekazana
ú przyczyny zatruc: mieso, przetwory mięsne, warzywa, ziola
ú czynniki wirulencji:
› toksyny (produkowane w zal. od serotypu, 1 serotyp=1 toksyna)
– uszkadzające blone cytopl.
 – tworzące pory w blonie zaw. cholesterol; najwieksza akt. w obrebie jelita cienkiego; zal.
od temp.
(a) laczy się z receptorem, tworzy się maly kompleks
(b) w temp. 37*C do małego kompleksu zostaje przyłączone kolejne bialko, tworzy się
duzy kompleks
(c) oligomery dużego komplesu tworza pory przepuszczalne dla kationow, aa i
nukleotydow
– dzialajace wewnątrzkom.
› enzymy hydrolityczne:
– kolagenaza, hialuronidaza, DNaza, neuraminidaza, ureaza, proteaza
• Bacillus cereus – laseczka woskowa
ú w zal. od typu zywnosci na którym występuje może być powodem:
› intoksykacji
– syndrom wymiotny – zatrucie powodowane ETE (toksyna wymiotna – cereulidem), która
jest cieplooporna i kwasooporna; cykliczny peptyd; prod. podczas fazy stacjonarnej i
wydzielana do pożywienia; laczy się z receptorem stymulując dośrodkowego nerwu
błędnego
– powod zakazenia: produkty ryzowe (zywnosc z wieksza iloscia skrobii)
› toksykoinfekcji
– syndrom biegunkowy – zatrucie powodowane enterotoksynami prod. przez mikroorg. w
już organizmie; w jelicie cienkim Bacillusy uwalniają toksyny bedace hemo- lub
niehemolityczna odmiana i dochodzi do aktywacji jelitowej cyklazy adenylowej co
powoduje zwiekszona sekrecje plynow w jelicie i biegunke
– powod zakazenia: prod. mięsne, zupy warzywne, puddingi, sosy, mleko (zywnosc z
wieksza ilość bialka)
ú G+, ruchliwa laseczka tlenowa lub względnie beztlenowa
ú temp. 5-50*C, pH 4,5-9
ú produkuje cieplooporne przetrwalniki
ú chorobotworczosc jest determinowana przez prod. toksyn i enzymow o char. toksyn
ú czynniki wirulencji:
› hemolizyny
› fosfolipazy C
› toksyny (enterotoksyny)
• Yersinia enterocolitica
ú z rodziny Enterobacteriaceae
ú b. heterogenna – dużo biotypów i serotypow
ú ruchliwa, względny beztlenowiec
ú szeroki zakres temp. – psychotrofy
ú odporna na stęż. NaCl i niskie pH
ú wiele czynnikow wirulencji umożliwiających wnikanie do kom. gospodarza, unikanie odp.
immunologicznej i przezywanie wewnątrz kom:
› szybkie tempo podzialow
› zdolność do produkcji toksyn:
– YeST (enterotoksyna) – cieplo stabilna (jak u E.coli)
– bialka Yops (Yersinia Outer Proteins) - zaburzenia w przekazywaniu sygnalu wewnątrz
kom. co powoduje dezorganizacje szkieletu, hamuja odpowiedz zapalna i immunologiczna
ú zakazenia poprzez: mieso, mleko, przetwory mleczne, warzywa, ryby
• Vibrio parahaemolyticus:
ú ruchliwe przecinkowce G-
ú rosna w srod. tlenowym i beztlenowym
ú temp. 4-43*C, pH 5-11, halofile (potrzebują NaCl)
ú czynniki chorobotworczosci:
› termostabilne -hemolizyny (TDH/TRH) – uszkodzenie blon cytoplazmatycznych eukariotow;
unikalne – podwojna specyficzność (sa specyf. względem blon zawierających cholesterol i
sfingolipidy); cieplooporne
– mechanizm działania:
(a) efekt działania zależy od stężenia
 (b) toksyny wiaza się z receptorami, oligomeryzuja i tworza pory, które zaburzają
integralność blony (tak jak perfringolizyna O)
ú zakazenie poprzez: surowe ryby i skorupiaki
• Aeromonas hydrophila
ú ruchliwy przecinkowiec G-, względny beztlenowiec
ú temp. 5-42*C, pH 4-10, halofil
ú wrazliwa na niskie pH i temp. pasteryzacji
ú chorobotworczosc zwiazana z:
› enterotoksynami:
– cytotoksycznymi (aerolizynami) – powoduje smierc komórki; podoba do toksyny 
– cytotonicznymi – moduluje metabolizm kom. nabłonkowych, ale nie powoduje zmian
histopatologicznych
ú powod zakazenia: niedogotowana/surowa zywnosc ze srod. wodnego
ú 2 typy zakazenia:
› choleropodobne
› czerwonkopodobne
• Plesiomonas shigelloides:
ú rodzina Enterobacteriaceae
ú ruchliwe paleczki G-, względne beztlenowce
ú podobne do Shigelli
ú char. dla klimatu tropikalnego – powod zakazenia: woda, zywnosc poch. morskiego
ú produkują:
› enterotoksyny – roznia się stabilnoscia w zal. od temp.
– cieplochwiejne
– cieplostale
• Pseudomonas aeruginosa (paleczka ropy błękitnej) – KOSMOS (artykul)
ú wystepuje w glebie, zbiornikach wodnych
ú paleczka G-, minimalne wymagania odżywcze
ú bakteria oportunistyczna (wywola zakazenie wtedy gdy osoba jest z grupy ryzyka)
ú powodowane przez: mleko surowe, kiełbasy surowe
ú często powod zakazen szpitalnych
ú lekooporna
ú produkują: adhezyny, inwazyny, proteazy, toksyny
• Enterokoki – paciorkowce kałowe
ú rosna w temp. 7-45*C, pH <9,6; tolerują zasolenie
ú cieplooporne, tolerancja niskich temp. odporność na zamrazanie
ú wędliny, konserwy, mleko zagęszczone
ú Enterococcus faecalis – patogen; czynniki wirulencji:
› zestaw czynnikow związany z agregacja – przyleganie do kom. i agregacja; dzięki temu
mikroorg. mogą latwo wymieniac się plazmidami – horyzontalny transfer genow
– As – subst. agregujaca
– Esp – bierze udział w tworzeniu biofilmu (kontaktu miedzy bakteriami)
– Ace – wraz z As bierze udział w kolonizacji kom. gospodarza
› czynniki związane z inwazja i rozpadem:
– cytolizyna – powoduje rozpad leukocytów obojętnochłonnych i makrofagow
– zelatynaza – hydrolazy, po aktywacji doprowadzają do zmian patologicznych w tkankach
– hialuronidaza - -,-
› czynniki ograniczające konkurencje:
– bakteriocyny
– cyklolizyna
• 6: (dokończenie tych patogenow i zaczecie ich identyfikacji - E.coli, gronkowce chorobotwórcze,
beztlenowe laseczki przetrwalnikujace redukujące siarczany (IV))
• Proteus sp.
ú paleczki G-
ú Proteus vulgaris (pałeczka odmieńca)
ú zróżnicowanie serologiczne
 ú nie tylko rozkladaja bialka (wl. proteolityczne) ale maja zdolność do oksydatywnej deaminacji
aminokwasow (hydrolizy mocznika do amoniaku i CO2) – skutkiem tego jest wytwarzanie
produktów które sa dla nas toksyczne:
› indol, skatol merkaptany
ú pojawia się problem gdy jest u nas zbyt dużo produktów białkowych (mięsnych) – samozatrucia
(bakterie dominują mikroflorę)
• POSREDNIE CZYNNIKI WYWOLUJACE ZATRUCIA:
ú pokarmowa intoksykacja azotynowa
› jeśli namnaża się w zywnosci grupa mikroorg. mających aktywna reduktazę azotanową ORAZ
w tej zywnosci sa azotany (V) (NO3-) to azotany sa redukowane do azotynow (azotanów (III);
NO2-), które sa dla nas toksyczne
– B.subtilis, P.fluorescens, E.aerogenes, mikrokoki
ú zatrucia aminami biogennymi
› związki powstale w wyniku dekarboksylacji aminokwasow (przez dekarboksylaze
aminokwasową)
– Morganella morgani, Klebsiella pneumoniae, E. aerogenes, Staphylococcus sp.,
Clostridium perfingens, enterokoki, pediokoki, Lactobacillus sp.
› zarówno w srod. tlenowym jak i beztlenowym

OKOLICZNOSCI SPRZYJAJACE WZROSTOWI CZESTOTLIWOSCI ZATRUC POKARMOWYCH:

• czynniki mikrobiologiczne
ú niezależnie czy to wirusy czy bakterie, te czynniki ewoluują, powstają mutanty dużo bardziej
inwazyjne radzące sobie ze sposobami przechowywania i utrwalania zywnosci, odporne na
antybiotyki (co jest skutkiem przenoszenia antybiotykoodporności ze zwierzat na ludzi)
ú wirus Norwalk – niskie dawki zakazne, odporny, ‘person-to-person’
• czynniki srodowiskowe
ú zmiany w produkcji zywnosci
ú przesycenie gruntow nawozami
ú globalizacja zrodel zywnosci
ú centralizacja produkcji
• czynniki osobnicze
ú wzrastajaca liczba podatnych osob (podeszly wiek, HIV, srodki immunosupresywne)
ú zmiany nawykow żywieniowych (fast-foody, diety)
ú bioterroryzm
• produkcja zywnosci bezpiecznej dla zdrowia wymaga:
ú scislego przestrzegania parametrow procesu technologicznego
ú wysokiej higieny produkcji
ú wnikliwej kontroli mikrobiologicznej

WYKRYWANIE BAKTERII COLI:

• Pożywki selektywne i różnicujące, zwierające laktozę:

ú Podłoża BLB - żółć i zieleń brylantowa lub siarczan sodowo-laurylowy

ú Podłoże Eijkmana - Podłoże różnicujące do stwierdzania zdolności fermentacji

laktozy przez bakterie z grupy coli w analizie wody.

• Potwierdzenie obecności bakterii pochodzenia kałowego

ú Posiew do pożywki BLB (żółć i zieleń brylantowa + laktoza), inkubacja 24/48h,

temperatura 44 (metoda fermentacyjno-probówkowa)
Posiew do wody peptonowej, inkubacja 24-48h w 44 dla stwierdzenia zdolności
bakterii do wytwarzania indolu z tryptofanu.
WYKRYWANIE GRONKOWCOW CHOROBOTWORCZYCH:

 Selektywne pożywki stałe Bairol-Barkera:

(telluryn potasu redukuje się do telluru- czarny metaliczny połysk + lecytyna (z żółtka jajka)
hydrolizowana przez lipazy z wytworzeniem kwasów tłuszczowych, które dają strefę zmienionego
podłoża)

o
 Aktywność katalazy- hodowla na agarze odżywczym 37 C, 18-24h, hodowle zalewa H2O2 i
wydzielają się pęcherzyki gazu

 Aktywność koagulatu- inkubacja hodowli z udziałem liofilizowanej krwi królika. Pod jej
wpływem powstają skrzepy- wynik pozytywny

 Szybszy test: cząsteczki lateksu powleczone przeciwciałami otrzymywanymi z surowicy krwi

królika immobilizowanego. Enterotoksyna- antygen. Test nie wymaga izolacji czystych kultur
Immobilizacja- umieszczenie komorek wykazujących aktywność katalityczną i żywotność w
określonej, ograniczonej przestrzeni w celu przeprowadzenia biokatalizy w sposób wielokrotny.
Komórki te mają częściowo lub całkowicie ograniczony swobodny ruch, a jednocześnie dostęp do
składników odżywczych i możliwość odpływu produktów przemiany.

WYKRYWANIE BEZTL. LASECZEK PRZETRWALNIKUJACYCH REDUKUJACYCH SIARCZANY

(IV):

7:
WYKRYWANIE BAKTERII Z RODZAJU SALMONELLA:
• przednamnazanie w nieselektywnej pożywce płynnej:
ú np. w zbuforowanej wodzie peptonowej
ú temp. 37*C, kilkanaście godzin
• namnażanie selektywne (wykorzystujemy duza odporność Salmonelli na czynniki środowiska; w
równoległych hodowlach, z wyk. 2 typow podłóż):
ú bulion Rappaport-Vasiliadis
› pozywka maksymalna (z peptonem sojowym, nieselektywnym, zapewniającym dostep do C i
N)
› NaCl i MgCl – stosunkowo dużo, przez to jest wysokie ciśnienie osmotyczne
› fosforany potasu (aby zbuforować medium)
› zielen malachitowa – hamowanie jelitowych G- innych niż Salmonella
› niskie pH + zielen malachitowa + MgCl pozwala na wyselekcjonowanie Salmonelli
› podwyzszona temperatura, ok. 24h
ú podloze zmodyfikowane Muller-Kauffmanna (MKTTn) + tetrationian sodu (hamuje proliferacje
kom., które nie wytwarzają jego reduktazy) + novobiocyna (hamuje rozwój bakterii z rodz.
Proteus)
› ekstrakt mięsny (zapewnia C, N, witaminy, aa)
› enzymatyczny hydrolizat kazeiny (zapewnia C, N, witaminy, aa)
› NaCl (wlasciwe ciśnienie osmotyczne)
› CaCO3 (dziala buforująco, neutralizuje i absorbuje toksyczne metabolity tj. powstający w
podlozu kw. siarkowy (powstaje jako prod. uboczny w wyniku dodania jodku potasu do
medium z tiosiarczanem))
› tiosiarczan sodu (substrat syntezy tetrationianu; na nim jest oparta selektywność medium)
› sole zółciowe, zielen brylantowa (hamowanie rozwoju bakterii coli i inhibicja bakterii G+)
• różnicowanie – posiewy izolacyjne (aby dalo się okreslic wygląd pojedynczych hodowli)
ú temp. 37*C, 24h hodowle
ú pozywka XLD (ksyloza, lizyna, deoksycholat)
 › selektywna, roznicujaca
› ekstrakt drozdzowy (C, N, aa)
› laktoza, sacharoza, ksyloza (2:2:1) – mogą być fermentowane, a tego wynikiem jest produkcja
kwasu
– ksyloza fermentowana przez wszystkie bakterie jelitowe tylko nie Shigelle
– ksyloza fermentowana przez Salmonelle i powoduje zakwaszenie
– laktoza fermentowana przez E.coli, wiec dodajemy sacharozy w nadmiarze żeby
wytworzony został kwas
› czerwien fenolowa – indykator zmian pH
› lizyna – Shigella ma zdolność do jej dekarboksylacji, co powoduje alkalizacje podloza;
Salmonella też, wiec jeżeli by jej nie było nie byłoby opcji odróżnienia Shigelli od Salmonelli
› cytrynian żelazowo-amonowy i tiosiarczan sodu – uwidocznienie zdolności do prod.
siarkowodoru; pozwalają na wizualizacje produkcji pod warunkiem srod. alkalicznego
› NaCl
› deoksycholan sodu – ogranicza rozwój mikroflory towarzyszącej
› wygląd:
– typowe kolonie Salmonella sa bezbarwne lub b. jasne, lekko blyszczace z czarno
zabarwionym srodkiem i czerwonymi obrzezami
– kolonie Salmonella H2S-ujemne sa bezbarwne lub jasnoróżowe z ciemniejszymi srodkami
– kolonie Salmonella laktozo-dodatnie sa zolte lub bez char. zaczernienia
ú druga pozywka do wyboru:
› BGA (oparty o zielen brylantowa)
– ekstrakt drozdzowy, enzym trawienia kazeiny, enzym trawienia tkanki zwierzęcej –
składniki typowo odżywcze
– NaCl
– laktoza, sacharoza – cukry które mogą być fermentowane
– czerwien fenolowa – indykator zmian pH
– zielen brylantowa – podstawowy czynnik selektywny, inhibicja G+ i większości laseczek
G- innych niż Salmonella
– wygląd: kolonie Salmonelli sa czerwone (bo nie fermentują tych cukrow), podloze tez;
kolonie szczepow laktozododatnich sa zolte i podloze tez (jako skutek zadziałania
czerwieni fenolowej w odp. na kwasy, które powstają z fermentacji laktozy)
– większość Salmonelli wywołujących zakażenie jest laktozoujemna
› Wilsona-Blaira
– roznica: probki nie poddajemy warunkom szoku cieplnego
› Hektoena:
– umiarkowanie selektywne; roznicujace
– enzym trawienia tkanki zwierzęcej; ekstrakt drozdzowy
– mieszanina soli zolciowych – dodawany do podloz kiedy chcemy uzyskac zahamowanie
wzrostu G+
– laktoza, sacharoza, salicyna – zrodla C, które mogą być fermentowane do kwasow
– blekit bromotymolowy, fuksyna zasadowa(obok soli zolciowych również ogranicza
wzrost G+) – układ wskaznikow pH
– NaCl
– tiosiarczan sodu, cytrynian żelazowo-amonowy – uwidocznienie produkcji siarkowodoru
(precypitat w centrum hodowli)
– mogą na nim rosnąć Salmonella i Shigella, które nie sa zdolne do fermentacji tych
zwiazkow C, wiec nie będą powodowaly zmiany koloru układu wskaznikow pH (a
obecność np. E.coli fermentującej spowoduje zmiane barwy kolonii na zolty lub
pomarańczowy)
– wygląd: Salmonella H2S-dodatnie sa niebieskozielone z czarnym srodkiem; Salmonella
H2S-ujemne sa niebieskozielone bez czarnego srodka
• potwierdzenie – w celu uzyskania serotypu, który został znaleziony w danych warunkach
Nadprodukcja kw. cytrynowego u A.nigger:

W fazie produkcji kwasu cytrynowego (idiofazie) HMP: EMP wynosi 1:4, dominujący staje się szlak EMP,
dostarczający prekursorów do syntezy kwasu cytrynowego. Kwas ten powstaje w wyniku kondensacji
acetylo-CoA i szczawiooctanu, katalizowanej przez syntezę cytrynianową, a następnie z mitochondriów
poprzez cytozol jest wydalany do środowiska hodowlanego. Częściowo jednak ulega przemiane do cis-
akonitanu i izocytrynaianu z udziałem hydratazy akonitanowej i dalszemu utlenienu w cyklu TCA. W
2+ 2+ 2+
warunkach deficytu jonów Fe , Mn , Zn w podłożu aktywność hydratazy jest osłabiona, co powoduje
gromadzenie cytrynianu.
Wzrost stężenia cytrynianu w komórce może hamować akt enzymu glikoli tycznego fosofruktokinazy,
ponieważ jest jego inhibitorem. Jej inhibicji przeciwdziała wysoki poziom wewnątrzkomórkowych jonów
+
NH4 , które nie są wykorzystywane w procesie syntezy biomasy grzybni, bowiem jej wzrost jest
2+
hamowany niedoborem mikroelementów w podłożu, głównie Mn .

Nadprodukcja kwasu cytrynowego odbywa się przy osłabieniu aktywności następujących enzymów w
cyklu TCA:
2+ 2+ 2+
• Hydratazy akonitanowej, hamowanej niedoborem jonów Mn , Fe , Zn

• Mitochondrialnej dehydrogenazy izocytrynianowej hamowanej cytrynianem i niską wartością pH

+
• Dehydrogenazy α-ketoglutaranowej hamowanej dużym stężeniem glukozy i jonów NH4

Rola tego procesu jako alternatywnej drogi oddechowej:

Alternatywna droga oddechowa- mechanizm związany z nadprodukcją kwasu cytrynowego, jeszcze nie do
końca dobrze poznany
Z udziałem aktywnej oksydazy AOX. Enzym ten aktywuje się w grzybni podczas intensywnego
naświetlania środowiska hodownalnego. Odpowiedzialny za przenoszenie elektronów na tlen, ale bez
udziału cytochromów. Alternatywny szlak oddychania jest uboższy energetycznie, komórka uzyskuje
mniejszą ilość cząsteczek ATP (ok. 40%). Aktywacja szlaku u Neurospora crasa, Rhodotorula następuje
najczęściej podczas przejścia z fazy wzrostu logarytmicznego do fazy stacjonarnej.
Ujawnia się w momencie osłabienia aktu oksydazy cytochromowej. Synteza oksydazy alternatywnej
(AOX) jest wtedy indukowana nagromadzeniem się NADH, zmniejszeniem zapotrzebowania na ATP,
2+
niedoborem ADP w mitochondriach oraz niedoborem jonów Cu (niezbędnych do funkcjonowania
oksydazy cytochromowej). Powstający w procesie glikozy NADH jest utleniony w alternatywnym szlaku
oddychania, w którym część energii wydziela się w postaci ciepła.

Promieniowce- morfologia pseudogrzybni, cykl rozwojowy:

• Bakterie polimorficzne (jeden gatunek, różne postacie wegetatywne)

• Gram+

• Wydłużone, nitkowate

• Do grupy tej należą również patogeny, wywołujące choroby ludzi, zwierząt i roślin.

• Niektóre gatunki tworzą symbiozę z roślinami wyższymi (np. z olchami) i wiążą azot
atmosferyczny

• Miejsce występowania: gleba

• Promieniowce rozmnażają się przez podział (fragmentację) pseudogrzybni, czyli
wytworzenie zarodników pseudokonidialnych, jak również przez podział poprzeczny
pseudostrzępek

• Tlenowe, kwasoodporne

• Mają nieodporne na wysoką temperaturę spory, wytrzymujące jednak dobrze wysychanie

• Tworzą „pseudogrzybnię”

ú Wgłębna

ú Substratowa

ú Powietrzna

Grzyby – char. morfologiczna i fizjologiczna tych, o znaczeniu przemyslowym:

• drozdze:
ú nie stanowią homogennej grupy taksonomicznej – znajdujemy
je u:
› Ascomycota (workowce)
› Basidiomycota
ú klasyfikacja poprzez:
› morfologie kom., sposób rozmnazania, cechy hodowlane
› cechy biochemiczne (np. zdolność do wykorzystywania
określonych zrodel C) i fizjologiczne
› analiza genow kodujących rybosomalne kwasy
rybonukleinowe
ú morfologia:
› jednokomórkowe eukarioty
› uzalezniona od stanu fizjologicznego i od funkcji kom., która pełni w populacji
› skupiska – ich forma char. dla gatunku, mogą w nich zyc ale nie musza; mogą także rosnąć w
strzępkach
› budowa kom. typowa dla eukariotow, ale sa pewne cechy char.:
– blona cytoplazmatyczna – dwuwarstwa fosfolipidowa podobna do wyższych eukariotow
ALE brak cholesterolu – jest ergosterol i zymosterol; więcej kwasow tl. nasyconych i
mniej steroli u beztlenowych niż u tlenowych
– miedzy sciana a blona jest przestrzen periplazmatyczna – sa tam glownie enzymy
hydrolityczne: inwertaza (hydrolizuje sacharozę do glu i fru) i fosfataza (uwalnia
fosforany ze zw. organicznych)
 – sciana kom. – glownie glikoproteiny, glukany (tworza siec i sa odp. za moc sciany; np. -
glukany – homopolimery D-glu, polaczone w. -glikozydowymi), chityna (homopolimer
N-acetyloD-glukozoaminy, polaczone w. -1,4-glikozydowymi; budowa warstwowa; na
zewn. stronie i po stronie sciany w przestrzeni periplazmatycznej mannoproteiny (bialka
wysoko glikozylowane; pelnia f. strukturalna i receptorow pozwalających na flokulacje –
zlepianie się kom.)
– cytoplazma: w wyniku starzenia kom. pojawiają się wodniczki zaw. sok kom.; jest
kwasna; sa w niej char. subst. zapasowe – glikogen (magazyn C, w wyniku starzenia
zamienia się w tluszcz), wolutyna (magazyn fosforu)
ú rozmnazanie:
› wegetatywne (odp. za szybki przyrost biomasy) – podzial mitotyczny jadra, podzial
cytoplazmy i powstanie kom. o tej samej ploidalnosci; pączkowanie (S. cerevisiae) – blizna
urodzeniowa na nowym pączku; rozszczepienie (podzial) – drozdze rozszczepkowe, kom. się
poszerzają i rozdzielają; tworzenie artrospor – grzybnia podzielona septami rozpada się na
cylindryczne fragmenty; tworzenie blastospor i
balistospor – przypomina paczkowanie ale o innym
mechanizmie; chlamydospory – nie sluza do
rozmnazania tylko do przetrwania
› generatywne
– faza haploidalna i diploidalna
– haploidy jak i diploidy mogą się rozmnazac
wegetatywnie
– haploidy a i 
– polaczenie a i  skutkuje wytworzeniu zygoty (2n)
która może w sposób stabilny rozmnazac się
wegetatywnie, a w okr. war. może zostać
wzbudzona mejoza, po podziale powstaje worek z
4 haploidalnymi zarodnikami (askosporami, czyli
mejosporami) – tetradom
– askospory kielkuja i daja początek haploidom a lub 
– do polaczenia a i  dochodzi w wyniku wytwarzania feromonów (oligopeptydów), na
które sa wrażliwe haploidy przeciwnego znaku (posiada odp. receptory na te bialka)
ú cechy hodowlane:
› w podlozu plynnych mogą rosnąć jako zmętnienie (flokulacja – proces aseksualny, zdolność
do wytwarzania flokulin(lektyn mannozospecyficznych, lacza się z receptorami mannozy na
sąsiedniej kom) dzięki czemu zlepiają się ze sobą i opadają na dno lub jako blonka/kożuszek
na powierzchni
› w podlozu stalym – roznorodnosc kolonii zwiazana z zaw. lipidow w kom. i
zapotrzebowaniem na aa (Ala i Trp); mazistosc – zdolność do wydzielania
heteropolisacharydow
ú sporulacja;
› aktywność tworzenia spor zależy od wieku kultury, temp. inkubacji, kwasowości pożywki,
składu i natlenienia pożywki
› w laboratorium stosujemy określone pożywki które ograniczają wzrost wegetatywny i
stymulują sporulacje – pożywki sporulacyjne (pelen skład, octan sodu zamiast sacharydow,
niedobor azotu)
› liczność spor zależy od gatunku
› kształt spor typowy dla gatunku – wazna cecha diagnostyczna
› spory odporne na działanie war. środowiska (wyższych temp. i środowiska kwaśnego)
ú czynniki niezbędne do wzrostu
› woda – mogą pobierac tlen wyłącznie rozpuszczony w wodzie; sa gatunki halofilne,
osmofilne, osmotolerancyjne
› zrodlo wegla – związki organiczne (chemoorganotrofy): monosacharydy (enzym – melibiaza
degradujaca melibioze czyli cukier zawierający glu i galaktozę), sacharydy, alkohole, poliole,
kw. organiczne
 › zrodla azotu – zrodla organiczne (pepton, ekstrakt drozdzowy), sol nieorganiczna – fosforan
amonu; azotany, azotyny, aa
› zrodla fosforu – fosforany (media wtedy sa buforowane we wlasciwy sposób i zapewniają
nizsze pH hodowli)
› zrodla wapnia i magnezu – woda wodociagowa lub destylowana suplementowana solami
› witaminy – mezo-inozytol, kwas pantotenowy (generalnie z grupy B); niektóre drozdze mogą
je sobie same wytworzyć a niektóre to auksotrofy i trzeba ich dostarczyć
› temp. hodowlane – mezofilne (odporne na temp. niskie (bo maja więcej kw. nienasyconych w
blonie) i wysokie (bo sa w stanie wytwarzać bialka szoku cieplnego), psychrofilne (niskie
temp.), termofile (wysokie temp.)

Sacharomyces cerevisiae – biochemia procesów:

• EFEKT PASTEURA:

Tlen silnie hamuje fermentację alkoholową. W warunkach tlenowych następuje represja

enzymów szlaku EMP. Dlatego, że metabolity: ATP, jony H+ oraz cytrynian są inhibitorami
fosfofruktokinazy, kluczowego enzymu regulatorowego glikolizy.

Hamowanie w sprzężeniu zwrotnym ma charakter sekwencyjny, ponieważ gromadzenie się

glukozo-6-fosforanu obniża aktywność heksokinazy oraz hamuje transport glukozy przez
błonę cytoplazmatyczną.

W obecności tlenu wzrasta aktywność syntazy cytrynianowej i dehydrogenazy jabłuczanowej-

głównych enzymów cyklu Krebsa oraz zachodzi proces fosforylacji oksydacyjnej w
mitochondrium

• EFEKT CRABTREE:

Wzrastające stężenie glukozy, nawet w warunkach dobrego natlenienia, wzmaga glikolizę, z

równoczesnym obniżeniem aktywności enzymów szlaku HMP i cyklu Krebsa.

Drożdże Crabtree – dodatnie:

ú Prowadzące proces fermentacji w w arunkach tlenowych przy dużych stężeniach

glukozy

Drożdże Crabtree- ujemne:

ú O niskiej aktywnośći fermentacyjnej, które metabolizują sacharydy do etanolu w

warunkach ograniczonego dostępu tlenu

6 mM (0,11 g/dm3)- najniższe stężenie które może działać inhibująco u drożdży

12 mM (0,22 g/dm3) hamuje syntezę oksydazy cytochromu i dehydrogenazy jabłuczanowej

60 mM (0,54 g/dm3) hamuje syntezę oksydoreduktazy NADPH- cytochromu C

8:
• grzyby strzępkowe (pleśnie):
ú gromada: Eumycota – grzyby wlasciwe
ú org. wielokomórkowe, eukariotyczne
ú chemoorganotrofy – zdobrywaja en. wykorzystując organiczne zw. C
ú mogą prowadzic rozne tryby zycia: saprofity, komensale, symbionty, pasożyty
ú rozna rola w zyciu człowieka – poz/neg
ú ich przedwstawiciele sa identyfikowani w roznych jednostkach taksonom.
ú latwo przystosowują się do środowiska – char. oligotroficzny i kosmopolityczny
ú tlenowce
ú azot nieorganiczny (azotan amonu) i organiczny (bardziej preferowany)
ú mezofile (większość), termofile, psychrofile
ú wilgotnosc – chętniej się rozwijają
ú niskie pH – lepiej się w nim rozwijają, wraz z rozwojem grzybow zmniejsza się pH pożywki
ú budowa:
› strzępka – najbardziej powszechna budowa grzyba, polaczone ze sobą kom. tworzące długie
nitki; widać wyraźne przedziały kom. oddzielone septami
› struktury sluzace rozmnazaniu:
– na strzępkach sporangiofor zakończony sporangium (zarodnią) w którym tworza się
sporangiospory (zarodniki; endospory)
– na strzępkach konidiofory (trzonki konidialne), jego budowa char. dla danego rodzaju; po
ich zewn. stronie sa konidia (zarodniki; egzospory), które powstają z fialidów (kom.
konidiogennych)
› strzępki tworzą mycelium (grzybnię); umozliwia docieranie do roznych substr. pokarmowych;
grzybnia wegetatywna – plecha
› sciana kom.:
– sklada się przedewszystkim z policukrow: aminowych, np. chityna – nadaje scianie
sprezystosc; nieaminowych, np. glukany; oraz z bialek i lipidow
– od zewn. strony: amorficzny glukan, glikoproteina zanurzona w glukanie, bialka, siec
chitynowa decydujaca o mocy sciany i bialka umocowane w sieci
– rozni się u strzępek i u zarodnikow
– hydrofobiny – unikalne bialka powierzchniowe; reszty Cys specyf. ulozone, mogą
tworzyć 4 mostki disiarczkowe co skutkuje hydrofob. wlasc. i może spontanicznie
formowac amfipatyczne monowarstwy miedzy hydrofob. i hydrofil. srod.; sa nimi
otoczone zarówno zarodniki (staja się odporne na działanie wilgoci i się ze sobą nie
zlepiają) jak i strzępki (ulatwiaja przylepianie strzępek do hydrofobowych pow. – istotne
w interakcji strzępek z pow. roślin lub zwierzat; ulatwiaja pokonywanie bariery
powietrza)
– np. Aspergillus fumigatus: liniowe -1,3-glukany, chityna, galaktomannany
› zarodniki – morfologia char. dla gatunku
– aplanospory - niezdolne do ruchu, wytwarzane przez grzyby ladowe
– zoospory – zdolne do ruchu, wytwarzane przez grzyby wodne
– kumulują subst. protekcyjne, zaw. dużo grup hydroksylowych
ú rozmnazanie:
› wegetatywne (mitospory)
– artrospory – septowana grzybnia rozpada się na cylindryczne fragmenty, z których każdy
jest przekształcany w spory (endospory)
– porospory – tworza się na skutek rozrastania wewn. warstwy sciany kom.
zarodnikotworczej an trzonkach konidialnych (endospory)
– fialospory (konidia) powstają przez konidiogeneze; egzospory; na tej samej grzybni mogą
tworzyć się:
(a) makrokonidia
(b) mikrokonidia
– sporangiospory (endospory)
› generatywne (mejospory)
– haploidalne, zróżnicowane genetyczne
– askospory (workowce) – zarodniki workowate, zarodnia (ask), endospory, mejoza a
potem mitoza
– basidospory (Basidiomycetes) – egzospory tworza się na podstawce (basidium), mejoza
ú kiełkowanie zarodnikow:
 › nastepuje po nastaniu korzystnych war. srod.
› tworzy się strzępka rostowa, która się wydluza i rozgałęzia
› przejście zarodnika ze stanu spoczynku do aktywności metabolicznej, do czego potrzebna jest
woda
– u mitospor woda zwykle wystarczy
– czasami potrzeba więcej czynnikow do kiełkowania
› kielek roztowy przeksztalca się, a strzępke w która sie przeksztalca charakteryzuje apikalny
wzrost (na dlugosc)
› w strzepce w strefie wierzchołkowej sa przedzialy (klastry) rozniace się umiejscowieniem
rznych struktur:
– na samym wierzchołku same pęcherzyki z rozna zaw. enzymow powodujących hydrolizę i
dobudowanie nowej warstwy wraz z wydluzaniem strzępki oraz materiałów budulcowych
do budowy sciany i odtworzenia protoplastów rosnącej strzępki
– dalej od wierzchołka jest rdzen z sieci aktynowych filamentów, przez które przechodzą
mikrotubule, docierające do końca strzępki
– dalej strefa nadal bez większych organelli ale z mitochondriami prod. energie, która
napedza pobieranie skl. odżywczych przez koniec strzępki
› wegetatywne:
– kielek rostowystrzepkarozgalezienia strzępki grzybnia wegetatywnaosiagniecie
dojrzalosci fizjologicznej, na odp. strukturach tworza się zarodniki (mitospory), które
odrywają się od grzybni
– struktury sluzace do rozmn. bezplciowego – anamorficzne; jest to tylko czesc cyklu
zyciowego
ú caly cykl zyciowy:
› struktura laczaca rozmn. bezpłciowe z płciowym – mycelium; musza na niej zajść konkretne
procesy które powodują przejście do rozmn. płciowego
– np. stres, warunki zw. z pH lub temp., brak skladnikow odżywczych
› 1. etap: plazmogamia (fuzja cytoplazmy) - przez zlewanie strzępek, zlewanie gamet na
mycelium, zlewanie się gametangiów
› 2. etap: dikarion (n+n; jadra sprzężone)
› 3. etap: kariogamia – zlewanie jader, tworzy się zygota (2n) (może nastapic od razu, a może
być tez tak ze grzyb jest w tym stanie w trakcie następnych podzialow
› 4. etap: mejoza – tworza się sruktury produkujące spory, powstają mejospory, które kielkujac
odtwarzają grzybnie
› struktury związane z rozmn. płciowym – teleomorficzne
ú homotalizm – brak zróżnicowania płciowego; do rozmn. płciowego jest potrzebna jedna plecha –
meskie i zenskie gametangia tworza się na tej samej grzybni wegetatywnej
› czasami samozapłodnienie (kiedy sa samozgodne płciowo – autogamiczne)
› kiedy sa niekompatybilne nie dochodzi do samozapłodnienia, np. Neurospora – przy
zapłodnieniu niezbędne jest polaczenie roznych plech
ú heterotalizm – wystepuja plechy meskie i zenskie
ú sposób tworzenia zygoty:
› somatogamia – 2 haploidalne strzępki (zróżnicowane płciowo – heterotaliczne); polega na
zlaniu się strzępek i powstaniu strzępki dwujadrowej; Basidiomycota, skoczkowce
› gametogamia – laczenie gamet: ruchomych (planogamia), nieruchomych (aplanogamia); jeśli
gamety sa niezróżnicowane morfologicznie – izogamia, jeśli roznia się jedynie wielkoscia –
anizogamia, jeśli roznia się morfologicznie – oogamia
› gametangiogamia – zawsze aplanogamiczne,
› deuterogamia – lęgnia zostaje zaplodniona jądrem kom. ze strzępki grzybni lub zarodnika
konidialnego
› spermatyzacja – polaczenie haploidalnego zarodnika (typu spermacjum) ze strzępka
haploidalnej grzybni; nastepuje tylko kiedy zarodnik i grzybnia naleza do roznych typow
płciowych (+/-), w wyniku kontaktu dochodzi do plazmogamii, utworzenia dikarionu i do
kariogamii (po dluzszej przerwie); Ascomycetes, Basidiomycetes
 ú grzyby sa pleomorficzne, wiec identyfikacja grzybow oparta jedynie o morfologie spowodowala ze
ten sam gaunek w różnych stadiach rozwoju ma dwie nazwy

9:
POWTORZENIE Z POPRZEDNIEGO:
• w rozmnazaniu bezpłciowym wystepuje 1 faza – haploidalna
• w rozmnazaniu płciowym mogą wystepowac 3 fazy:
ú haploidalna
ú dikariotyczna (jader sprzężonych)
ú diploidalna
• u poszczególnych grzybow różny jest czas trwania i dominacja faz:
ú u workowców najdluzsza haplofaza
ú u Basidiomycetes najdluzsza dikariofaza
• etapy: plazmogamia, kariogamia, mejoza mogą przebiegac od razu po sobie albo w roznych stadiach
rozwojowych

KONTYNUACJA GRZYBOW PLESNIOWYCH:

• wybrane gromady:
ú Mucoromycota
› np. rodzaje: Rhizopus sp., Mucor sp.
› saprofity; pospolicie wystepuja
› grzybnia wielojadrowa ale nieseptowana (komórczak)
› na sporangioforach (specjalnych strzępkach powietrznych) tworza się sporangia (zarodnie)
wewnątrz których tworza się spory (endospory; mitospory)
› cykl zyciowy (diplofaza i haplofaza):
– rozmnazanie bezpłciowe: spory uwolnione z zarodni kielkuja, aby wytworzyć
wegetatywne mycelium, na którym znowu tworzone sa sporangiofory
– rozmnazanie płciowe: (w większości heterotaliczne)
(a) zetkniecie się dwóch odmiennych płciowo strzępek
(b) w każdej ze strzępek dochodzi do powstania poprzecznej sciany oddzielającej
koncowke każdej strzępki
(c) powstają wielojądrowe gametangia
(d) poprzez stykanie się gametangiów dochodzi do rozpuszczenia sciany miedzy
gametangiami
(e) zawartość gametangiów się zlewa – plazmogamia
(f) nastepuja liczne podzialy mitotyczne – tworzy się wielojadrowa zygospora (forma z
gruba sciana kom., która musi przejść okres spoczynku, kiedy pełni funkcje
przetrwalnika)
(g) zlewanie się jader – kariogamia (2n; kiedy zygospora zaczyna kielkowac)
(h) mejoza – jądra haploidalne
 (i) w skutku tego rozwijają się strzępki powietrzne z chwytnikami i sporangiofory, na
których tworzone sa zarodnie
› dlaczego strzępki się do siebie zbizaja?
– feromony – pochodna -karotenu (kw. trisporowy) tworzony w obu strzępkach (+ i -);
różnoimienne strzępki maja inne szlaki metaboliczne prowadzące do jego produkcji –
pojedyncze strzępki nie sa w stanie wytworzyć go samodzielnie i musza korzystać z
metabolitów pośrednich (intermediatow), które wytwarza strzępka przeciwnego znaku
› Mucor:
– luzna, biala ciemniejaca z czasem grzybnia (bo tworza się na niej zarodnie)
– tworza chlamydospory (spory sluzace tylko do przetrwanie a nie do rozmnazania)
– właściwości lipolityczne (zdolne do wytwarzania lipaz)
(a) czeste zanieczyszczenia powietrza w mleczarniach
(b) wykorzystywane w laboratoriach
– mogą być patogenami (powodem mukoromykoz) – ciezka diagnoza bo sa podobne do
Aspergillus
– możemy mieć tu do czynienia z dimorfizmem:
(a) drozdze mukorowe (TO NIE SA DROZDZE) sa w stanie przeprowadzac fermentacje
alkoholowa i rosna w pożywkach plynnych podobnie jak drodze
(b) M. rouxi – w medium plynnym przy braku tlenu wzrost drozdzoidalny, w obecności
tlenu wzrost strzepkowy
(c) M. racemosus
› Rhizopus:
– luzna, jasnoszara lub oliwkowa grzybnia (ich kolor tez pochodzi od zarodni)
– zanieczyszczenie powietrza w zakładach spożywczych
– produkcja kwasow organicznych, biokatalizatory, fermentacja mlekowa
– mogą wytwarzać mikotoksyny
ú Ascomycota (workowce)
› np. rodzaje: Chaetomium, Byssochlamys sp., Aspergillus
› silnie rozgaleziona grzybnia, podzielona strzępkami; w każdym przedziale kom. jedno jadro
› w rozmnazaniu płciowym sa tworzone worki (aski) z zarodnikami (mejosporami;
askosporami)
› rozmnazanie wegetatywne: np. konidia tworzone na zespołach konidialnych
› cykl zyciowy (haplofaza, diplofaza, stadium dikariotyczne):
– gametangia tworza się na 1 lub roznych osobnikach – homotaliczne i heterotaliczne (jeżeli
homotaliczne może dojść do zapłodnienia a czasem jest ono zablokowane)
– antheridium (plemnie) i ascogonium (legnie) – gametangia; wielojadrowe
– 1. plemnia i legnia lacza się ze sobą: scianami i sciany się rozpuszczają, albo kanalem
sluzacym do przemieszczenia się jader męskich do legni
– 2. jadra nie zespalają się od razu, ale zblizaja się do siebie tworząc jadra sprzężone
(dikarion)
– 3. na powierzchni legni powstają długie, rozgałęzione wyrostki (strzępki workotworcze)
– 4. pary jader sprzężonych wnikają do strzepkow workotworzych
– 5. jadra sprzężone ulegaja wielokrotnym, równoczesnym podziałom; w strukturze
strzepkow workotworczych pojawiają się przegrody oddzielając po dwa jadra roznej plci
– 6. kom. w strzępkach workotworczyk dziela się i dziela się w nich zaw. jadra sprzężone i
tworza się tzw. kom. macierzyste worka
– 7. jadra sprzężone w kom. macierzystych worka się zespalają (2n)
– 8. przekształcenie kom. macierzystych w zarodnie (worki) a jadra w nich dziela się
(mejoza4*1n, mitoza8*1n), jeżeli mamy forme heterotaliczna mamy zarodniki
zróżnicowane płciowo (polowa zarodnikow to +, a polowa to -)
› Chaetomium (np. globosum)
– worek z zarodnikami w perytecjum (ciele owoconosnym otoczonym strzępkami)
– aktywność celulityczna (prod. celulaz) – bierze udział naturalnie w rozkładzie błonnika w
glebie
– może powodować alergie; prod. mikotoksyny
› Byssochlamys (B.fulva, B.nivea – pleśń truskawkowa)
– cykl wegetatywny
 (a) konidia (mitospory) sa nieodporne na temp.
– cykl generatywny
(a) askospory (mejospory) sa b. odporne na temp. i niskie pH (to, plus zdolność do
wzrostu w malej dostepnosci tlenu plus zdolność do prod. enzymow
pektynolitycznych – powodują psucie się pasteryzowanych owocow)
– nie tylko obniza jakość produktów ale tez prod. mykotoksyny (patuline, kwas
bysochlamowy, bysotoksyna A)
› Aspergillus
– rozpowszechnione w przyrodzie (gleba)
– budowa konidioforów – trzonek konidialny rozszerza się tworząc pęcherzyk, na nich sa
metule, fialidy (kom. konidiotworcze), lancuszki konidium
– liczne hydrolazy – przystosowane do zycia w roznych srod. i degeneracja roznych
materiałów
– mogą powodować aspergilloze – patogeny (A.fumigatus, A.clavatus)
– fitopatogeny – patogeny roślinne (A.flavus, A.parasiticus)
– prod. mikotoksyn
– pleśń magazynowa (rosna na niewysuszonym zbozu podczas magazynowania)
– prod. kw. cytrynowego i wiele enzymow (maja znaczenie przemyslowe)
– problemu dla przemyslu:
(a) prod. spożywcze o malej zaw. wody: A.glaucus, A.niger (osmotoleranty)
(b) surowce roślinne np. zboza, nasiona: A.ochraceus, A.oryzae, A.flavus, A.parasiticus
(prod. mykotoksyny)
(c) sciany, materialy budowane: A.niger, A.flavus, A.oryzae
– cykl generatywny z klejstotecjum!!! (owocnik, który może przechowywać askospory)
– cykl paraseksualny (trzeci sposób na rozmnazanie się, pomiędzy wegetatywnym a
generatywnym) – w jego przebiegu nie ma mejozy
(a) strzępki roznych plech (homokariony) lacza się ze sobą (plazmogamia), pomiędzy
nimi tworza się pomosty (anastomozy)
(b) jadra mieszają się ze sobą tworząc heterokarion (grzybnia zawierajaca jadra obu
szczepow) – czesc jader może być haploidalna a czesc diploidalna (bo jadra mogą się
zlac)
(c) mogą się zlac jadra takie same lub podobne (wtedy nie ma konsekwencji) albo od
dwóch roznych plech – wtedy tworza się heterozygotyczne jadra 2n (sa one
niestabilne, gubia chromosomy w sposób przypadkowy, wiec nastepuje haploidyzacja
– przypadkowe przywrócenie do 1n)
(d) po przywróceniu haploidalnej liczby chromosomow dochodzi do mitotycznej
segregacji mat. genetycznegoi dalszego rozmnazania wegetatywnego – powstają
haploidalne rekombinanty
› 10: Penicillium
– char. pędzelkowaty kształt konidioforów
– jak to u workowców grzybnia jest septowana i rozgaleziona
– kom. dwujadrowe lub wielojądrowe
– u niektórych gatunkow tworza się sklerotia (struktury przetrwalnikowe)
– większość to saprofity (aktywnie uczestniczące w rozkładzie materii organicznej, wiec
mogą przyczyniać się do degradacji materiałów i psucia roznej zywnosci – na wilgotnych
podlozach)
– większość jest niebezpieczna przez wytwarzanie mikotoksyn
– obok Aspergillus jako pleśń magazynowa (grzyby silosowe)
– znaczace w biotechnologii (P.camemberti, P.roquefortii – sery; P.chrysogenum –
penicylina G lub V)
– psucie owocow (P.digitatum – zielona zgnilizna; P.italicum – niebieska zgnilizna;
P.expansum – mokra zgnilizna), glownie cytrusow, które maja niskie pH
– cykl zyciowy:
(a) glownie homotaliczne
(b) rozmn. wegetatywne z zespołami konidialnymi i konidiami (mitosporami)
(c) rozmn. generatywne (char. dla workowców) z wytworzeniem workow z mejosporami
(askosporami)
 (d) cykl paraseksualny
› Fusarium:
– typowe dla srod. glebowego, saprofity, większość jest fitopatogenami (prod. pektynazy)
– luzna, jasna grzybnia, podbarwiona od spodu
– zdolność do przetrwania w niekorzystnych war. – np. tolerują niskie poziomy wilgotności,
wysokie temp. (mycie i pasteryzacja), a to jest związane z produkcja licznych form
przetrwalnych:
(a) chlamydospory (typowe dla grzybow)
(b) sklerotia
(c) inne
– w glebie zamieszkują ryzosferę, wywoluja fusarioze kłosów – atakują zboza; do zakazenia
rosliny dochodzi w wyniku mechanicznego uszkodzenia tkanki
– prod. mikotoksyn (o wl. hormonalno-estrogennych)
– 3 cykle zyciowe – wegetatywny, generatywny, paraseksualny
– talicznosc zależy od gatunku
– w cyklu wegetatywnym tworza się sporodochia – pęczki konidioforów, w których
wytwarzane sa konidia (mikrokonidia i makrokonidia – proporcja ich wytwarzania zależy
od war. srod.)
› Botrytis:
– szkody w rolnictwie (B.cinerea – gronkowiec szary, szara pleśń – fitopatogen o niskiej
specyficzności, infekuje rozne rosliny dwuliścienne)
– sa tez wśród nich saprofity
– wytwarza -glukan, przez co przy przetwarzaniu roślin uzyskujemy material w niego
bogaty, przez co trudno jest go przefiltrować
– psychrotrofy – latwo rozwijają się na warzywach w war. chłodniczych
– 3 możliwe cykle zyciowe – przykład: Botrytis cinerea:
(a) na grzybni sa wytwarzane konidiofory, na nich tworza się konidia, zakazona roslina
pokrywa się nalotem czyli wlasnie konidioforami, zarodniki konidialne przenoszone
na kolejne rosliny i powodują dalsze zakazenie (wegetatywny, w lato)
(b) na tej samej grzybni mogą być wytwarzane czarne sklerotia (zbudowane z gesto
splątanych strzępek), ich zadaniem jest gromadzenie subst. zapasowych; mogą
kielkowac wegetatywnie, a w sprzyjających warunkach mogą na nich powstawać
formy rozmn. płciowego – po zapłodnieniu przez sklerotia drugiego typu (spermatia)
tworzy się na nich owocnik typu apotecjum, a na nich powstają askospory
› Alternaria:
– np. A.alternata
– szeroko rozpowszechnione
– saprofity, mogą być fitopatogenami (glownie atakują na zboza)
– prod. fitotoksyn i mikotoksyn
– pleśń magazynowa, wywoluje alergie
– homotaliczne
– 3 możliwe cykle zyciowe (w naturze teleomorfy wystepuja rzadko, glownie rozmn.
wegetatywne)
– w cyklu wegetatywnym char. konidia (porospory), b. długie
› Cladosporium:
– np. C.herbarum (wl. lipolityczne, psychotrof), C.fulvum (patogen pomidorow)
– saprofity, fitopatogeny, pasożyty innych grzybow
– prod. mikotoksyn
– możliwe 3 cykle zyciowe
› Geotrichum:
– np. G.candidum
– niska, biala grzybnia, wgłębnie wzrost drozdzopodobnie
– grzybnia septowana rozpadajaca się na fragmenty (mitospory – astospory/artrokonidia)
– 3 możliwe cykle zyciowe
– akt. proteolityczna i lipolityczna – zanieczyszczenie w przemysle mleczarskim
– rozkład kwasu mlekowego – zakłócenia w produkcji kiszonek
– homotaliczne
 ú Basidiomycota
Surowce i materialy w biotechnologii:
• ważnym etapem projektowania procesu jest opracowanie i optymalizacja składu mediów hodowlanych
(może być ich kilka w jednym procesie)
ú musi zapewnić warunki do zycia
ú musi pozwolić osiagnac dany cel
ú 3 etapy:
› projektowanie – bierzemy pod uwagę potrzeby metaboliczne danego mikroorg. oraz to co jest
potrzebne do otrzymania produktu – formujemy zalozenia
› opracowanie formulacji – bierzemy pod uwagę chemiczny skład mikroorg., stechiometrie
wzrostu oraz kinetykę prod. danego zwiazku
› optymalizacja – 2 sposoby:
– klasyczny – zmienia się tylko 1 czynnik w danym podejściu (1 factor at a time)
(a) wykorzystywana w początkowych etapach pracy z mediami, związanych z prod.
nowych metabolitów lub znanych zwiazkow ale z nowych zrodel
(b) 3 podejscia:
(i) usuwanie – komponenty media sa usuwane 1 po 2 i analizowany jest wpływ na
zdolność metaboliczna o która nam chodzi
(ii) suplementacja – sprawdzenie jak na dana prod. wpływa dodatek zrodel wegla,
azotu i aminokwasow
(iii) zastepowanie – dotyczy glownie zrodel wegla i azotu
– nowoczesne – dobiera się odp. komponenty medium i optymalizuje ich stężenie; stosuje
się programy komputerowe (wiec jest to in-silico); obniza to czas potrzebny do opt.
medium i jest tansze
• media hodowlane używane w procesach przemyslowych musza zapewnić:
ú maksymalizacje:
› wydajności prod. lub biomasy
› stęż. prod. lub biomasy
› szybkości wytwarzania prod.
ú minimalizacje:
› efektow ubocznych
› kosztów
› trudności technologicznych
• media hodowlane używane w procesach przemyslowych (maksymalne częściej stosowane niż
mineralne, bo te sa droższe):
ú pożywki ciekle:
› naturalne, plynne prod. odpadowe: serwatka, melasa, naturalne plyny ustrojowe (mleko),
wyciągi wodne z surowcow naturalnych (brzeczka, bulion itp.)
ú scieki przemyslowe
ú pożywki stale:
› plewy, rozdrobnione ziemniaki paszowe, odpady stale przemyslu spożywczego
• skład medium:
ú woda:
› skl. mineralny zależny od zastosowania
› odpowiednia ilość
› czystość chemiczna i mikrobiologiczna
ú zrodla wegla i energii (najdroższe ze wszystkich surowcow)
› większość wykorzystywanych w przemysle to chemoorganotrofy, wiec zrodla to zw.
organiczne
› czynniki decydujące o wyborze:
– koszt
– tempo metabolizowania
– wspolczynnik przyrostu biomasy
– polozenie geograficzne
– regulacje prawne
 › najbardziej powszechnie wykorzystywane zrodla wegla – węglowodany:
– glukoza – dobrze rozpuszcza się w wodzie, latwo przyswajalna przez większość
mikroorg., czysty produkt końcowy, duza wydanosc, produkcja: enzymatyczna lub
kwasowa hydroliza skrobii ziemniaczanej
– sacharoza – melasa jako jej glowne zrodlo, pulpa cukrowo-ziemniaczana (prod. alkoholu i
enzymow)
– laktoza – dla mikroorg. posiadających hydrolazy katalizujące hydrolizę tego cukru do
glukozy i galaktozy
(a) czasami wykorzystujemy czystą laktozę, np. do produkcji proteaz zasadowych z
B.subtilis
(b) częściej wykorzystujemy serwatkę (prod. uboczny mleczarski), bogata w laktozę, a
oprócz niej sa w niej również inne składniki: aminokwasy, witaminy – skład serwatki
nie jest staly – dostępne plynne, suszone, liofilizowane itd.; do prod. drozdzy i etanolu
– maltoza – cukier slodowy, powstaje po hydrolizie skrobii i glikogenu, wykorzystywana
jako składnik slodu, ekstraktu slodowego i brzeczki piwnej
– skrobia – latwo dostepna, stosowana w postaci czystej a jej zrodlem mogą być tez
produkty (ziemniaki, zboze, tapioka), stos. do produkcji etanolu, acetonu i butanolu;
mikroorg. musi produkować enzymy amylolityczne; jej surowiec musi być poddany
obróbce termicznej (dopiero potem skrobia może być zrodlem wegla, bo jest zamknieta w
granulach, które musza peknac aby mogla być ona wykorzystywana przez org.) – temp.
której jest poddawana to temp. kleikowania
› trzeba wziąć pod uwagę zjawisko katabolicznej represji zrodlem wegla – np. glukoza może
być dobrym zrodlem wegla do produkcji biomasy, ale nie będzie zezwalala na prod.
metabolitu 2-rzedowego
› zrodla wegla niesacharydowe:
– metanol – latwo dostępny, tani; wykorzystywane do hodowli metylotrofów, np.
biosynteza bialka paszowego (SCP – single cel protein) na bazie Methylophilus
methylotrophus lub drozdzy Candida boidini
– glicerol – nietoksyczny, mieszalny z woda, naturalny (w wyniku hydrolizy tluszczow) i
syntetyczny (wykorzystując propylen z ropy naftowej); wazny w prod. dihydroksyacetonu
– tluszcze – 2 role: jako odpieniacze, jako zrodlo wegla; mogą być stos. samodzielnie lub
jako dodatkowe zrodlo C; najczęściej stosowane pochodzenia roślinnego
ú zrodla azotu:
› jakie do jakiego mikroorg.:
– grzyby nizsze – sole amonowe
– mikroorg. utleniające weglowodowy – azot atmosferyczny
– dla niektórych: mocznik (termolabilny, wiec sterylizowane osobno)
– dla innych: mąka – sojowa, bawelniana, kukurydziana
– produkcja enzymow i antybiotykow (zamiast maki sojowej) – preparaty bialek ziemniaka
– namok kukurydziany – prod. uboczny otrzymywany w procesie ekstrakcji skrobii
kukurydzianej
› również może wywolywac represje kataboliczną (np. jony amonowe nie mogą być dostępne w
zbyt dużej ilości, bo to hamuje syntezę niektórych antybiotykow)
ú mikroelementy: Mn2+, Zn2+, Fe3+ (wyj. Lactobacillus), Cu, Co, Mo, Ca, Na, Cl, Ni, Se
(dostarczane z pozywka lub z woda)
ú prekursory (nie sa niezbędne do zycia, nie wplywaja na wzrost ale sa konieczne do syntezy danego
prod. metabolicznego)
› bezpośrednio wbudowywane do pożądanego produktu
› np. do penicyliny G i V (prod. przez Penicillium chrysogenum) wbudowywany jest kw.
fenylooctowy(G) lub kw. fenoksyoctowy
› np. przeprowadzana fermentacja w kierunku L-izoleucyny przez Bacillus subtilis –
prekursorem jest kwas -aminomasłowy; jeżeli mikroorg. produkującym L-izoleucyne jest
Serratia marcescens to prekursorem jest D-treonina
ú ihibitory – wplywaja hamująco na określone przemiany metaboliczne zmieniając ich przebieg
› np. jeśli w srod. Saccharomyces cerivisiae (przeprowadzającego fermentacje alkoholowa -
cukieralkohol) znajdzie się disiarczek sodu to hamuje produkcje aldehydu octowego, a prod.
fermentacji będzie nie etanol a glicerol
 ú induktory – dot. procesow, w których prod. sa enzymy (są enzymy konstytutywne i indukowane,
indukowane pojawiają się dopiero po dodaniu induktora)
› np. -amylaza prod. przez Aspergillus sp. (induktor to skrobia) i Bacillus subtilis (induktor to
maltoza)
› np. celulaza prod. przez Trichoderma viride w odpowiedzi na celulozę w srod.
ú materialy pomocnicze:
› detergenty – musza być prawidłowo dobrane aby nie spowodowaly degradacji oslon kom. u
mikroorg., ich stęż. musza być niewielkie
– ich obecność ulatwia dostep do subst. emulgujących, nierpozpuszczalnych w wodzie
– dzialaja stymulująco na określone enzymy
– zwiekszaja przepuszczalność membran kom.
– zmieniają stopien agregacji kom.
› odpieniacze: szybkie rozbicie piany, dzialaja prewencyjnie, aktywne w malym stęż.
nietoksyczne, latwe w stosowaniu, niska cena, niepalne, nielotne
– naturalne: oleje; syntetyczne: silikony
› subst. stale: sruta rzepakowa, otreby pszenne, sloma
› antyseptyki: formalina (sterylizacja przy fermentacji A.nigger)
› chelatory
› subst. buforujące i regulujące pH
• melasa:
ú produkt odpadowy w produkcji cukru z buraków cukrowych oraz trzciny, brązowy, gęsty syrop,
50% zawartości sacharozy
ú konsystencja i skład zależy od techniki produkcji cukru i jakości zbioru.
ú przeważnie trzeba ją dostosować do konkretnego procesu, aby mogła być w podłożu (ponieważ
zawiera substraty niecukrowe)
ú mono- i disacharydy oraz subst. niecukrowe (np. witaminy jako stymulatory wzrostu)
ú produkcja: drożdży, kwasu cytrynowego, etanolu, azotu, aminokwasów, lotnych związków
organicznych, związków wapnia
ú posiada właściwości buforujące
ú skład podloza opartego o nia trzeba dostosować do danego procesu, np.:
› do produkcji drozdzy i etanolu - neutralizacja CaCO3
› do innych procesow - gotowanie w środowisku kwaśnym, zasadowym, oddzielenie osadu
› do prod. kw. cytrynowego – rozcieńczenie melasy i jej gotowanie z cyjankiem żelazowo-
potasowym, fermentacja razem z osadem, dodatek soli aby wyeliminować wolny cyjanek