Politechnika Warszawska

Wydział Instalacji Budowlanych, Hydrotechniki i Inżynierii Środowiska

Studia magisterskie niestacjonarne

Laboratorium z przedmiotu: Biologia środowiska

Temat ćwiczenia: Grupy fizjologiczne mikroorganizmów biorących udział w

procesie kompostowania odpadów komunalnych

Wykonali: Krzysztof Niewiadomski

Katarzyna Zaręba
Piotr Marciniak
Łukasz Michalak
Dariusz Zabrzycki
Paweł Oktabiński
Sebastian Nowak
Żaneta Misiak
Marlena Mędza
Konrad Kuryłowicz

Warszawa, 2020r.
Spis treści:
1. Cel ćwiczenia ...................................................................................................................................................... 2

2. Zakres ćwiczenia ................................................................................................................................................ 2

3. Wstęp teoretyczny .............................................................................................................................................. 2

4. Metodyka ........................................................................................................................................................ 4

5. Wyniki .............................................................................................................................................................. 1

6. Wnioski................................................................................................................................................................. 1

1
1. Cel ćwiczenia
Celem ćwiczenia było poznanie biologicznych metod kontroli procesu unieszkodliwiania
odpadów komunalnych za pomocą metody kompostowania.

2. Zakres ćwiczenia
Zakres ćwiczenia obejmuje poniższe etapy:

1. Określenie stopnia rozkładu odpadów na podstawie analiz mikrobiologicznych próbek

kompostu pobranych z dwóch pryzm o różnym stopniu zaawansowania procesu
kompostowania: świeżo usypanej oraz dojrzałego
2. Określenie stopnia unieszkodliwienia kompostu pod względem sanitarnym na podstawie
wskaźników mikrobiologicznych dla tych kompostów
3. Ocenę efektywności procesu kompostowania w obu próbkach na podstawie
przeprowadzonych analiz

3. Wstęp teoretyczny
Kompostowanie to jedna z najczęściej stosowanych metod biologicznego przetwarzania
odpadów komunalnych, podczas którego w kontrolowanych warunkach tlenowych materia
organiczna w odpadach podlega mineralizacji i częściowej wtórnej syntezie do stabilnych form,
dzięki czemu kompost może być bezpiecznie przechowywany i wykorzystywany w środowisku.
Kompostowanie umożliwia usunięcie patogenów, zmniejszenie masy i objętości odpadów oraz ich
stabilizację.
Metody kompostowania można podzielić na dwie kategorie:
• Kompostowanie w systemach otwartych (pryzmy)
• Kompostowanie w systemach zamkniętych (bioreaktory)

2
 W procesie kompostowania wyróżnia się zasadniczo III fazy. Kolejne etapy charakteryzują
się różną aktywnością poszczególnych grup mikroorganizmów oraz czynnikami fizycznymi, np.
temperaturą oraz zawartością tlenu.
FAZA I. Następuje wzrost temperatury do 25-40 ºC. Dominują mikroorganizmy
mezofilne: bakterie heterotroficzne, promieniowce, grzyby, które są odpowiedzialne za rozkład
substancji organicznych, takich jak cukry, tłuszcze, białka, skrobia. Zachodzą intensywne procesy
biochemiczne z wydzieleniem ciepła.
FAZA II. Wzrasta temperatura do 55-60 ºC, co powoduje zahamowanie aktywności
mikroorganizmów mezofilnych. Następuje dezaktywacja mikroorganizmów patogennych.
Dominują organizmy termofilne tj. promieniowce oraz bakterie przetrwalnikujące, które dalej
prowadzą rozkład substancji biodegradowalnych. Fazę I i II charakteryzują duże zużycie tlenu,
emisja odorów i odcieków. Fazy te łącznie trwają od 1 do 6 tygodni.
FAZA III. Spadek temperatury w pryzmie sygnalizuje zajście III fazy, w której następuje
wyczerpywanie się łatwo rozkładalnych substancji organicznych, a co za tym idzie zmniejszenie
szybkości reakcji biochemicznych. W fazie III zachodzi powolna degradacja trudno rozkładalnych
substancji organicznych i tworzenie humusu. Dominują bakterie sporowe, promieniowce, niektóre
grzyby, bakterie celulityczne, nitryfikacyjne oraz wzrasta liczba form przetrwalnych bakterii. Faza
III może trwać nawet do roku.
Przy prawidłowym przebiegu procesu mineralizacji związków organicznych z upływem
czasu wzrasta liczba bakterii sporowych, w stosunku do ogólnej liczby bakterii, zwiększa się liczba
bakterii nitryfikacyjnych I i II fazy, bakterii rozkładających celulozę oraz promieniowców. Spada
natomiast liczba bakterii termofilnych w stosunku do mezofilnych, bakterii amonifikacyjnych oraz
pleśni.
Analiza bakteriologiczna dla celów sanitarnych obejmuje również oznaczenie wskaźników
kałowego zanieczyszczenia kompostu, tj. bakterii grupy coli, Escherichia coli oraz Clostridium
perfringens. Przy prawidłowym przebiegu procesu obserwuje się wzrost miana tych bakterii oraz
spadek jaj pasożytów.
Dodatkowo wskaźnikiem zachodzących procesów gnilnych jest intensywny rozwój
Proteus vulgaris, co świadczy o nieprawidłowym przebiegu kompostowania.

3
 4. Metodyka

Otrzymano próbkę kompostu pobranego ze świeżo usypanej pryzmy (kompost surowy) oraz
próbkę z kompostem dojrzałym z pryzmy o identycznych rozcieńczeniach 10-1. Dla obu próbek
wykonano szereg rozcieńczeń od 10-2 do 10-8 zaliczając do każdego kolejnego rozcięczenia po 10
ml kompostu do 90 ml wody buforowej i dokładnie mieszając

1) Oznaczenie ogólnej liczby bakterii mezofilnych

Pierwszym punktem jest wykonanie posiewu głębinowego z podłożem agarowym.
Służy on do wyznaczenia ogólnej liczby bakterii mezofilnych. Na podłoże dodaliśmy po 1ml
próbki z danego rozcieńczenia. Wykonano próby dla stężeń: 10-6, 10-7,10-8. Przez 48h
hodowle inkubowane były w temperaturze 26oC. Następnie policzyliśmy wyrosłe kolonie i
określiliśmy liczbę bakterii mezofilnych wyrażoną w jtk/g.s.m. suchej masy kompostu.

2) Oznaczenie ogólnej liczby bakterii termofilnych

W Posiewie głębinowym z podłożem agarowym odżywczym dla wyznaczenia ogólnej
liczby bakterii termofilnych, znalazło się po 1ml próbki z danego rozcieńczenia.
Wykonaliśmy 3 próby, po jednej dla stężeń: 10-4, 10-5,10-6. Hodowle inkubowane były w
temperaturze 55oC przez 24h. Policzyliśmy wyrosłe kolonie i określiliśmy liczbę bakterii
termofilnych wyrażoną w jtk/g suchej masy kompostu.

3) Oznaczenie ogólnej liczby bakterii sporowych

Do sterylnych próbek przeniesiono po 1cm3 z roztworu 10-5, 10-6 i 10-7 .
Później umieszczono je w łaźni wodnej w temperaturze 800C na 15 minut. Na płytki
przeniesiono po 1 ml z probówek i zalano podłożem agarowym odżywczym. Hodowlę
inkubowano w temperaturze 26oC przez 48h. Policzono wyrosłe kolonie i określono liczbę
bakterii mezofilnych wyrażoną jako jtk w przeliczeniu na 1 g s.m. kompostu.

4) Oznaczenie ogólnej liczby grzybów

4
 Oznaczenie wykonano metodą płytkową Kocha, stosując posiew powierzchniowy na
podłożu Sabourauda. Posiew wykonano z rozcieńczeń 10-2, 10-3, 10-4,10-5 . W tym celu użyto
0,1 ml zawiesin przygotowanych na początku badań. Następnie hodowle inkubowano przez
5 dni w temperaturze 26 oC.
Podłoże Sabourauda jest podłożem selektywnym, na którym rosną wyłącznie grzyby,
dlatego w cel określenia jtk/g.s.m. po czasie inkubacji policzyliśmy wszystkie wyrosłe
kolonie i określiliśmy liczbę grzybów wyrażoną w jtk/g suchej masy kompostu.

5) Oznaczenie ogólnej liczby promieniowców

Oznaczenie ogólnej liczby promieniowców również wykonano metodą płytkową
Kocha, stosując posiew powierzchniowy na podłoże według Pochona. Do posiewu użyto po
0,1 ml z rozcieńczeń: 10-2, 10-3 i 10-4. Inkubacja kolonii trwała 7 dni w temperaturze 26ºC.
Po tym czasie zaobserwowano drobne, okrągłe kolonie o charakterystycznym
nieprzyjemnym zapachu. Wyrosłe kolonie typowe dla promieniowców zliczono i wyrażono
jako jtk w przeliczeniu na 1 g suchej masy kompostu.

Oznaczenia do określenia stanu przemian związków azotowych:

6) Oznaczenie miana bakterii amonifikacyjnych
Wykonanie oznaczenia miana bakterii amonifikacyjnych przeprowadzono stosując posiew na
podłoże płynne według Skermana (pepton) dla rozcieńczeń 10-1 ÷ 10-6. Pobrano 1 ml każdego z
nich i przeniesiono do próbówek. Hodowle inkubowano przez okres 7 dni w temperaturze 26oC.
Po upłynięciu okresu inkubacji dostrzeżono zmętnienie zawiesiny. Wynik oznaczenia podano jako
miano bakterii, gdzie wynik dodatni stanowią hodowle, w których zaobserwowano pomarańczowe
zabarwienie po dodaniu odczynnika Neslera.

7) Oznaczenie miana bakterii nitryfikacyjnych I i II fazy

Z wykonanych rozcieńczeń 10-2, 10-3, 10-4, 10-5 oraz 10-6 pobrano 1 ml zawiesiny, a następnie
przeniesiono na podłoże płynne Winogradskiego (zestaw soli wraz z węglanem wapnia). Hodowle
inkubowano w temperaturze 26oC przez okres 14 dni. Wynik oznaczenia podzielony został na
dwie fazy. Występowanie fazy I potwierdza obecność w próbce jonów No2-, zaś fazy II jonów

5
No3-. Po dodaniu odczynnika Griessa, do hodowli z obecnością azotynów zaobserwowano zmianę
zabarwienia próbek na kolor czerwono-różowy (faza I), natomiast po dodaniu odczynnika z
brucyną próbki (z obecnością azotanów - faza II) zmieniły swoje zabarwienie na kolor czerwono-
pomarańczowy.

8) Oznaczenie miana bakterii denitryfikacyjnych

Wykonane oznaczenia dla rozcieńczeń 10-1 ÷ 10-6 polegało na wprowadzenie 1 ml zawiesiny
do próbek z podłożem Giltaya (asparagina, glukoza, cytrynian sodowy, zestaw soli, błękit
bromotymolowy) . Założone hodowle poddano inkubacji przez okres 7 dni w temperaturze 26oC.
Po upłynięciu czasu inkubacji dokonano obserwacji wzrostu bakterii (wynik dodatni). Fakt ten
stwierdzono, gdyż zmętnieniu uległa zawiesina, zaobserwowano występowanie kożucha oraz
powstanie gazu w rurce Durhama.

9) Oznaczenie miana bakterii Proteus vulgaris

Z rozcieńczeń w przedziale 10-1 ÷ 10-6 pobrano 0,1 ml zawiesiny, a następnie wprowadzono do
wody kondensacyjnej znajdującej się w próbówkach ze skosem agarowym, uważając przy tym,
aby nie dotknąć powierzchni skosu. Posiew poddano inkubacji przez czas 24-48 godzin w
temperaturze 37oC. Próbki o wyniku dodatnim uznano te, w których stwierdzono pełzający wzrost
bakterii na całej powierzchni skosu (nad powierzchnią wody kondensacyjnej).

Oznaczenia do określenia stanu unieszkodliwiania kompostu pod względem

sanitarnym:
10) Oznaczenie miana bakterii Clostridium perfringens
Mikroflora niesporowa została usunięta, pobierając po 1 cm3 z rozcieńczeń od 10-1 do 10-7 i
wprowadzając do pustych sterylnych probówek z korkiem. Następnie probówki wstawiono do
łaźni wodnej, ogrzewano przez 15 minut w temperaturze 80 ºC. Do probówek wlano rozpuszczone
podłoże Wilsona-Blaira do około 2/3 objętości, wymieszano i pozostawiono do zastygnięcia.
Hodowle inkubowano przez 24 godziny w temperaturze 370C. Wynik oznaczenia podano jako

6
miano bakterii Clostridium perfringens, przyjmując za próbki dodatnie hodowle, w których
zaobserwowano zaczernienie podłoża świadczące o powstaniu siarczku żelaza.

11) Oznaczenie miana bakterii grupy Coli

Wykonano posiew rozcieńczeń od 10-1 do 10-7 na podłoże płynne wg Kesslera-Swenartona.
Hodowle inkubowano przez 48 h w temperaturze 37°C. Przesiano na podłoże laktozowe z TTC i
tergitolem metodą posiewu powierzchniowego próbki, stwierdzono dodatni wynik na podłożu wg
Kesslera-Swenartona. Następnie Określono miano bakterii grupy coli, przyjmując jako wynik
dodatni próbki, w których zaobserwowano charakterystyczne kolonie które powodują żółte
zabarwienie podłoża.

12) Oznaczenie miana bakterii grupy Coli typu kałowego

Na podłoże laktozowe przesiano z zielenią brylantową oraz na podłoże peptonowe z
tryptofanem próbki. Stwierdzono w nich wynik dodatni badania na podłożu wg Kesslera-
Swenartona. Hodowle inkubowano w temperaturze 44°C przez 24 godziny. Wykonano obserwacje
w podłożu laktozowym z zielenią brylantową wzrostu bakterii w podłożu laktozowym z zielenią
brylantową. W podłożu peptonowym z tryptofanem zbadano obecność indolu, wprowadzając do
podłoża (po ściance próbki) 0,5 cm3 odczynnika Ehrlicha-Böhme'a. Przez obecność indolu na
granicy faz podłoże-odczynnik powstaje różowoczerwone zabarwienie. Wynik oznaczenia podano
jako miano bakterii grupy coli typu kałowego, przyjmując za próbki dodatnie hodowle, w których
zaobserwowano zarówno wzrost bakterii na podłożu laktozowym z zielenią brylantową, jak i
obecność indolu w podłożu peptonowym z tryptofanem.
.

7
 5. Wyniki
Tabela 1 Wyniki oznaczeń dla kompostu surowego
Oznaczenie Rozcieńczenia – kompost surowy Liczba bakterii Miano
jtk/g
10 -1 10 -2 10 -3 10 -4 10 -5 10 -6 10 -7 10 -8
Ogólna liczba bakterii x x x x x np 290 35 3,2 ∙ 1010 -
mezofilnych
Ogólna liczba bakterii x x np np 272 x x x 2,72 ∙ 108 -
termofilnych
Ogólna liczba bakterii x x x np 94 11 x x 1,02 ∙ 108 -
sporowych
Ogólna liczba x 0 0 0 x x x x ~0 -
promieniowców
Ogólna liczba x np 230 42 3 x x x 3,25 ∙ 106 -
grzybów
Ogólna liczba bakterii + + + + + + x x - ≤ 10-6
amonifikacyjnych
Bakterie x + - + - - x x - 10 -4
nitryfikacyjne I fazy
Bakterie x + + + - - x x - 10 -4
nitryfikacyjne II fazy
Bakterie + + + + + + x x - ≤ 10-6
denitryfikacyjne
Proteus vulgaris + + + + - - x x - 10 -4
Bakterie grupy coli + + + + + + x x - ≤ 10-6
Bakterie grupy + + + + + + x x - ≤ 10-6
esterichia coli
Clostridium + + + - - - x x - 10 -3
perfringens

1
 Tabela 2 Wyniki oznaczeń dla kompostu dojrzałego
Oznaczenie Rozcieńczenia – kompost dojrzały Liczba bakterii Miano
jtk/g
10 -1 10 -2 10 -3 10 -4 10 -5 10 -6 10 -7 10 -8
Ogólna liczba bakterii x x x x 290 33 3 x 3,1 ∙ 108 -
mezofilnych
Ogólna liczba bakterii x x np 148 12 x x x 1,34 ∙ 107 -
termofilnych
Ogólna liczba bakterii x x x 133 12 0 x x 1,27 ∙ 107 -
sporowych
Ogólna liczba x np np 45 x x x x 4,5 ∙ 106 -
promieniowców
Ogólna liczba x np 34 2 0 x x x 2,7 ∙ 105 -
grzybów
Ogólna liczba bakterii + + + + + + x x - ≤ 10-6
amonifikacyjnych
Bakterie x + + + + - x x - 10 -5
nitryfikacyjne I fazy
Bakterie x + + + + + x x - ≤ 10-6
nitryfikacyjne II fazy
Bakterie + + + + + + x x - ≤ 10-6
denitryfikacyjne
Proteus vulgaris + + - - - - x x - 10 -2
Bakterie grupy coli + + - - - - x x - 10 -2
Bakterie grupy + + - - - - x x - 10 -2
esterichia coli
Clostridium + - - - - - x x - 10 -1
perfringens

2
6. Wnioski

Porównując ogólną liczbę bakterii mezofilnych do ogólnej liczby bakterii termofilnych w

kompoście surowym można zaobserwować ,że liczba mezofili ( 3,2 * 1010 jtk/g ) jest znacznie
większa od liczby termofili (2,72 * 108 jtk/g) . Na podstawie tych informacji można wnioskować,
że pobrana próbka kompostu surowego znajdowała się w 1 fazie kompostowania. Świadczy o tym
dominacja bakterii mezofilnych.
Ogólna liczba bakterii termofilnych w kompoście dojrzałym wynosi 1,34 * 107 jtk/g, a
bakterii sporowych 1,27 * 107 jtk/g. Podane wyniki mieszczą się w wartościach oczekiwanych dla
kompostu dojrzałego (106 - 107 jtk/g) co świadczy o prawidłowym przebiegu procesu
kompostowania.
Udział bakterii sporowych wśród bakterii mezofilnych w kompoście surowym wynosi
0,318 % co jest zgodne z wynikami literaturowymi [0-5%, zazwyczaj <1%].
W kompoście surowym nie zaobserwowano obecności promieniowców świadczy to o tym,
że kompost znajdował się w początkowej fazie procesu kompostowania. Natomiast w kompoście
dojrzałym ogólna liczba promieniowców wynosiła 4,5 * 106 jtk/g. Na podstawie otrzymanych
danych i porównując wartości z danymi literaturowymi ilość promieniowców potwierdza ,że
badana próbka pochodzi z kompostu dojrzałego.
Ogólna liczba grzybów psychrofilnych i częściowo mezofilnych w kompoście surowym
wynosi 3,25 * 106 jtk/g. Zgodnie z danymi literaturowymi dla kompostu w 1 fazie zawartość tych
grzybów powinna wynosić ok. 106 jtk/g i więcej. Potwierdza to, iż nasza próbka kompostu
surowego znajduje się w 1 fazie kompostowania.
Ogólna liczba grzybów psychrofilnych i częściowo mezofilnych w kompoście dojrzałym
wynosi 3,25 * 105 jtk/g co jest zgodne z wytycznymi dla kompostu dojrzałego wynoszącymi
ok. 105 jtk/g.
Zgodnie z teorią w kompoście surowym znajduje się dużo liczba bakterii amonifikacyjnych
co potwierdza, że badana próbka znajduje się w pierwszej fazie kompostowania (miano ≤10-6)

1
 Porównując ogólną liczbą bakterii nitryfikacyjnych I i II fazy w próbce kompostu
surowego do ogólnej liczby tych samych bakterii w próbce kompostu dojrzałego obserwowany
jest wzrost zawartości tych drobnoustrojów co potwierdza miano tych próbek.
Wysoka zawartość bakterii denitryfikacyjnych w próbkach (miano ≤ 10-6) może
wskazywać na obniżenie zawartości nawozowej kompostu w wyniku przeprowadzanej przez te
drobnoustroje redukcji azotanów do tlenków azotu oraz azotu w postaci gazowej.
Niska zawartość chorobotwórczych bakterii Clostridium perfringens w kompoście
dojrzałym (miano 10-1) świadczy o prawidłowym unieszkodliwieniu odpadów pod względem
sanitarnym. Podobne odczyty zanotowano w przypadku bakterii E. Coli (miano 10-2) co również
potwierdza prawidłowe unieszkodliwienie odpadów pod względem sanitarnym.
W kompoście surowym zaobserwowano wyższą zawartość bakterii Clostridium
perfringens (miano 10-3) co świadczy o tym, że nie zdążyły zajść odpowiednie procesy
powodujące degradację szkodliwej mikroflory ze względu na początkową fazę procesu
kompostowania. Przy prawdiowym przebiegu procesu kompostowania obserwuje się wzrost
miana bakterii E. Coli i Clostridium perfringens co potwierdzono powyższymi wynikami.
Zaobserwowano wzrost miana bakterii Proteus vulgaris w próbce kompostu dojrzałego w
stosunku do próbki kompostu surowego (z 10-4 do 10-2). Świadczy to o hamowaniu zachodzenia
procesów gnilnych co potwierdza prawidłowy przebieg procesu kompostowania.
W kompoście dojrzałym zaobserwowano udział bakterii sporowych wśród bakterii
mezofilnych na poziomie 4,096% co nie jest zgodne z prawidłowym stosunkiem tych bakterii
(prawidłowe wartości 15-80%). Uwzględniając pozostałe prawidłowe wartości potwierdzające
poprawny przebieg procesu kompostowania stwierdzamy, że próbka poddana analizie zawartości
bakterii sporowych w kompoście dojrzałym mogła zostać błędnie pobrana lub dokonano odczytu
w sposób nieprawidłowy. Sugeruje się powtórzenie tego badania.
Podsumowując nasze badania, proces kompostowania zachodzi w sposób prawidłowy a
próbka kompostu surowego znajdowała się w 1 fazie procesu.