BIOTECHNOLOGIA

1. PEKTYNAZY

Cechy enzymów jako katalizatorów:

 Wysoka aktywność katalityczna – 1 mol enzymu reaguje z 1000 moli substratu

 Duża specyficzność
 Konkretne (łagodne) warunki działania
 Łatwa regulacja warunków procesu

Zalety preparatów enzymatycznych w technologii żywności

 Pełniejsze wykorzystanie surowców

 Zmniejszenie kosztów produkcji żywności
 Przedłużenie trwałości żywności
 Poprawa cech organoleptycznych produktów
 Przyspieszenie procesów produkcyjnych

Cechy preparatów enzymatycznych:

 Prosta technologia otrzymywania

 Zwykle stosowane w postaci nieoczyszczonej
 Ograniczona i zmienna podaż surowca
 Utrudniona standaryzacja aktywności
 Enzymy zwierzęce charakteryzuje niska termostabilność i ryzyko zanieczyszczenia prionami/
wirusami

- 1895r. - opatentowanie produkcji amylazy z pleśni

- 1930r. - opatentowanie pektynaz dla przemysłu sokowniczego

- Największym producentem enzymów przemysłowych jest Dania (Novozymes)

Zalety wykorzystania enzymów wytwarzanych przez mikroorganizmy rekombinowane:

 Wyższe poziomy ekspresji

 Większa czystość
 Tańsza produkcja technologia rekombinowanego DNA umożliwia inżynierię białek
enzymatycznych
 Można produkować enzymy pochodzące z organizmów ekstremofilnych/patogennych

Enzymy amylolityczne

 Glukoamylaza – Aspergillus niger

 Pullulanaza – Bacillus, Escherichia

Enzymy amylolityczne – zastosowanie przemysłowe

 Przemysł piwowarski – w procesie zacierania słodu/ upłynniania i scukrzania skrobi

 Gorzelnictwo – scukrzanie skrobi ziemniaczanej lub zbożowej (umożliwiają całkowite lub
częścIowe wyeliminowanie słodu)
  Piekarnictwo – wzrost poziomu cukrów fermentowanych przez drożdże skutkuje większą
puLchnością ciasta

Pektynazy

 Pektynoesterazy - hydrolizują wiązania estrowe między grupami metylowymi i

karboksylowymi reszt kwasu galakturonowego pektyny; demetylacja pektyn umożliwia
efektywne działanie poligalakturonazom i liazom kwasu pektynowego
 poligalakturonazy – hydrolizują łańcuch kwasu poligalakturonowego (endo-,
egzopoligalakturonazy) do oligogalakturonidów i kwasu alfa-D-galakturonowego
 Liazy pektynowe (transeliminazy pektyn) - katalizują niehydrolityczny rozkład łańcucha
poligalakturonowego zwany B-eliminacją
 Producenci na skalę przemysłową: Aspergillus, Penicillum, Bacillus, Sccharomyces

Zastosowania pektynaz w przemyśle spożywczym

 przemysł winiarski i owocowo-warzywny do maceracji miazgi, do obniżania lepkości soków i

ich klarowania (poligalakturonazy, pektynoesterazy produkcja soków z kawałkami owoców
zapobieganie szybkiemu mięknięciu mrożonych i konserwowanych owoców)
 w procesie fermentacji tytoniu i herbaty oraz podczas oczyszczania ziaren kawy i kakao

2. IMMOBILIZACJA, PUŁAPKOWANIE

Zastosowania laktazy w przemyśle spożywczym:

 usunięcie laktozy z mleka

 kontrola krystalizacji laktozy w koncentratach mleczarskich (mrożone desery)
 pełne wykorzystanie serwatki i jej permeatu –> zhydrolizowany syrop serwatkowy
 synteza oligosacharydów (GOS) i egzopolisacharydów

Prebiotyki

 Zalecana dzienna dawka: 3g

 cechy: niewielka słodkość, słaba rozpuszczalność w wodzie i niska strawność

Zastosowanie GOS:

 zamienniki sacharozy m.in. do produkcji gumy do żucia oraz żywności funkcjonalnej dla
diabetyków i osób starszych
 preparaty stosowane w produkcji odżywek dla dzieci, jogurtów, deserów, mleka lub maślanki
w proszku
 do produkcji farmaceutyków wspomagających przyswajanie wapnia, środków
przeciwpróchniczych, leków przeciw zaparciom

Immobilizacja - Proces unieruchamiania biokatalizatorów, którego celem jest ograniczenie ich

katalitycznej aktywności do wnętrza systemu katalizatora i uniemożliwienie ich przechodzenia do
ruchomej fazy unoszącej produkt i substrat
Metoda immobilizacji – sieciowanie

 Sieciowanie enzymu z użyciem aldehydu glutarowego

 Wady: możliwa utrudniona dyfuzja substratu do wnętrza preparatu, następuje częściowa
utrata aktywności enzymu w trakcie immobilizacji
 Zalety: stosowany jest tylko jeden odczynnik, nieskomplikowana procedura, tanie,
wielokrotnie wyższa aktywność immobilizatu na jednostkę objętości (10 do 1000 razy) w
stosunku do unieruchomienia na nośniku, podwyższona odporność preparatu na
nienaturalne warunki

Metoda immobilizacji – pułapkowanie

 Immobilizacja we wnętrzu nośnika

 Ten typ immobilizacji wykorzystuje różnicę wielkości biokatalizatora i cząsteczek substratu
 Selektywnie zatrzymuje się enzym lub komórkę za porowatą barierą, którą substancje
rozpuszczone mogą łatwo penetrować
 Na ogół nie tworzy się bezpośrednie połączenie miedzy nośnikiem a czynnikiem aktywnym
 Samo pułapkowanie nie prowadzi na ogół do zaburzeń strukturalnych cząsteczek aktywnych
- pozostawia całą aktywność nienaruszoną

Hydrożele

 dają maksymalną stabilizację struktury zamykanego w ich sieci biokatalizatora i łatwo

namakają, pozwalając na swobodny dostęp substratów
 układy przynajmniej dwuskładnikowe, w których jeden ze składników jest polimerem
hydrofilowym, natomiast drugim składnikiem jest woda
 trójwymiarowe, wysoko uwodnione sieci polimerowe, o własnościach makrocząsteczkowych
zbliżonych do macierzy pozakomórkowej

Polimeryzacja in situ - żele otrzymuje się w wyniku polimeryzacji, w trakcie której powstają nowe
wiązania kowalencyjne

Przy stosowaniu technologii immobilizacji metodą in situ trzeba uwzględnić niekorzystne cechy
reakcji:

 biokatalizator wchodzi w kontakt z reaktywnym monomerem i wolnorodnikowymi

inicjatorami reakcji
 monomer jest silnie toksyczny
 reakcja jest egzotermiczna

Pułapkowanie niekowalencyjne
  zestalanie roztworów polimerów, przez: sieciowanie jonowe (alginiany), chłodzenie
(agaroza, żelatyna), suszenie lub indukowane strącanie (karagen)
 Żele alginianowe
 Kwas alginowy to naturalny kopolimer kwasów mannuronowego i guluronowego,
ekstrahowany z morskich wodorostów. Jest to chyba najważniejszy układ do pułapkowania
biokatalizatorów, oferujący wyjątkowo łagodny sposób immobilizacji żywych komórek

Korzyści technologii immobilizacji

 Uwięzienie enzymu lub komórek zwiększa lokalne stężenie katalizatora.

 W układach immobilizowanych drobne porcje cieczy ulegają sekwencyjnie działaniu
skoncentrowanej masy całego katalizatora
 Czas kontaktu między enzymem a danym wycinkiem substratu ulega znacznemu skróceniu
 Zminimalizowanie czasu, jaki roztwór spędza w reaktorze, znacząco redukuje reakcje boczne,
obniżając koszty późniejszego oczyszczania produktu z produktów ubocznych
 Zwarta konstrukcja reaktora, ułatwiająca specjalne operacje, np.; utrzymywanie w stanie
sterylnym
 Otoczenie wokół immobilizowanego biokatalizatora jest odmienne niż w stanie
homogenicznym. Ładunki powierzchniowe i obszary hydrofobowe w nośniku mogą
oddziaływać specyficznie z katalizatorem
 Zmienione jest środowisko wodne wskutek wpływu na bilans jonowy, pH, aktywność wody i
osmolarność
 Efekty te mogą np. zwiększyć termostabilność enzymu, redukując stopnie swobody łańcucha
polipeptydowego
 Jednocześnie, toksyny i inhibitory często są wypierane przez nośnik, a biokatalizator ulega
mechanicznej protekcji

Ograniczenia technologii immobilizacji

 Empiryczny charakter technologii (nieadekwatne przenoszenie masy, utrudnione

monitorowanie i modelowanie procesu)
 Straty aktywności
 Trudności w utrzymaniu dystrybucji między substancjami rozpuszczonymi a katalizatorem
 Przedłużone działanie

3. METODY IDENTYFIKACJI GENETYCZNIE ZMODYFIKOWANYCH ORGANIZMÓW W ŻYWNOŚCI

- Zdecydowana większość technik polega na identyfikacji zmian w strukturze dwóch biologicznie

czynnych makrocząsteczek: DNA oraz białek

- W przypadku kwasów nukleinowych podstawowe narzędzie diagnostyczne stanowi reakcja

łańcuchowa polimerazy (PCR), pozwalająca na selektywną amplifikację wybranych regionów DNA
wraz z jakościową i ilościową oceną wprowadzonych modyfikacji. Reakcja PCR w czasie rzeczywistym
jest obecnie uznawana za wiodącą metodę analizy zawartości genetycznie zmodyfikowanych
organizmów w roślinach uprawnych i produktach żywnościowych.

- Na określenie modyfikacji genetycznych manifestujących się na poziomie struktury białek pozwalają

testy immunoenzymatyczne polegające na selektywnym rozpoznaniu rekombinantowego białka
przez specjalnie zaprojektowane przeciwciało

Metody detekcji GMO w żywności

  Modyfikacja jest inicjowana na poziomie DNA i polega na wprowadzeniu do istniejącego
zestawu genów nowej sekwencji zapewniającej np. Odporność
 W przypadku białek zasadniczą techniką stosowaną do identyfikacji jest test
immunoenzymatyczny ELISA

Testy immunoenzymatyczne

- Zestawy analityczne bazują na wykorzystaniu przeciwciał selektywnych wobec określonego – w tym

przypadku genetycznie zmodyfikowanego (GM) białka – i następującej po rozpoznaniu antygenu
reakcji barwnej.

 W celu opracowania testu ELISA na GMO należy wyizolować rekombinantowe białko z

żywności czy też rośliny uprawnej, a następnie wyprodukować przeciwciała specyficzne
wobec tej proteiny. Przeciwciała są najczęściej unieruchamiane na mikropłytce i oznakowane
substancją, która w trakcie analizy utworzy barwny produkt. Istnieją dwa typy testów
immunochemicznych polegających na reakcji antygen– przeciwciało wykorzystywanych w
detekcji GMO.
 Testy płytkowe - Przeciwciała skierowane wobec GM białka zostają immobilizowane na
pasku nitrocelulozowym. Po zanurzeniu testera w probówce zawierającej ekstrakt roślinnej
tkanki z transgenicznym białkiem następuje utworzenie kompleksu z częścią przeciwciał
znakowanych barwnym reagentem. Kompleks białkowy dzięki porowatej membranie
wędruje do jednego z przeciwległych końców paska, który ma dwie strefy. Jedna z nich jest
specyficzna dla kompleksu przeciwciało – rekombinantowe białko, a druga dla niezwiązanych
przeciwciał znakowanych tylko barwnikiem.
 Testy mikropłytkowe - Oznaczenie odbywa się na mikropłytce titracyjnej z usuwalnymi 8-12
studzienkowymi paskami, na której unieruchomione są przeciwciała skierowane wobec GM
białka. W zasadniczej wersji kompleks przeciwciało – antygen może być wizualizowany przez
użycie drugiego przeciwciała skoniugowanego z enzymem przeprowadzającym reakcję
chromogenną. Procedura obejmuje często kilka etapów „opłaszczania” oraz przemywania
substancji immobilizowanych na dnie studzienek. Ostatecznym potwierdzeniem obecności
GMO jest reakcja barwna

Techniki PCR

 Konwencjonalny PCR - Ten wariant techniki PCR stosowany jest do analizy jakościowej oraz
półilościowej, wskazując głównie na obecność bądź nieobecność poszukiwanych sekwencji w
próbce. Finalny etap identyfikacji produktów stanowi rozdział elektroforetyczny na żelu
agarozowym z dodatkiem bromku etydyny. Równocześnie z produktami PCR rozdzielane są
markery mas molekularnych w celu precyzyjnego określenia wielkości amplikonu
 Ilościowy kompetytywny PCR - W tej metodzie o parę identycznych primerów
współzawodniczą: cząsteczka DNA o znanym stężeniu oraz docelowa sekwencja DNA.
Fragmenty DNA konkurują ze sobą w serii reakcji, w których ilość jednego ze składników
utrzymywana jest na stałym poziomie, podczas gdy zawartość drugiego jest sukcesywnie
zwiększana. Podstawę analizy ilościowej stanowi wyznaczenie punktu równoważności, w
którym końcowe stężenia produktów amplifikacji obu konkurujących fragmentów DNA są
równe
 PCR w czasie rzeczywistym - Ta alternatywna wersja PCR pozwala na ilościową analizę dzięki
aparaturze monitorującej przyrost powielanej sekwencji w trakcie kolejnych cykli reakcji.
Zalety PCR - metoda jest wiarygodna oraz wysoce powtarzalna, pozostawiając znaczne możliwości
automatyzacji

Wady PCR - konieczność przeprowadzenia minimum dwóch etapów: PCR oraz elektroforezy żelowej
niezbędnych do identyfikacji transgenu, co przy rutynowych analizach jest absorbujące czasowo