Gramdodatnie (+)

Bogatsze i grubsze w peptydoglikan, zabarwienie pozostaje po przepłukaniu alkoholem.

Gramujemne (-)

Cienkie, zabarwienia brak

1. Molekularne podstawy identyfikacji bakterii

W analizach wykorzystuje się wysokoprzepustowe metody
sekwencjonowania, nprozmnażają się przez podział komórki, a wzrost i metabolizm jest
szybki
 są niewielkie (długość do 5 μm, średnica do 2 μm)
 mają zdolność horyzontalnego transferu genów – nabywania DNA od innych
mikroorganizmów i włączania go do własnego genomu

2. Etapy analizy prób środowiskowych do profilowania mikrobioty

 Wybór uniwersalnego markera:
16S rRNA - wchodzi w skład małej podjednostki rybosomalnej 30S.
 Wybór metody izolacji materiału genetycznego (do izolacji DNA plazmidowego z komórek
bakteryjnych, najczęściej wykorzystuje się hodowle płynne, w których podłoże uzupełnione
jest odpowiednim antybiotykiem – gen oporności na antybiotyk znajduje się na plazmidzie.)
 Ocena ilości i jakości wyizolowanego materiału genetycznego;
Analiza jakościowa: maksimum absorbancji białek, częstego zanieczyszczenia DNA przy
izolacji manualnej, wynosi. 280 nm.

 Detekcja inhibitorów reakcji enzymatycznych;

amplifikacja fragmentu 16S – detekcja inhibitorów reakcji PCR
Łańcuchowa reakcja polimerazy
• opracowana przez Kary’ego Mullisa w 1983 r. (Nobel w 1993 r.)
• polega na cyklicznym powielaniu fragmentów DNA w wyniku wielokrotnego podgrzewania i
oziębiania próbki
 Przygotowywanie bibliotek (Izolacja DNA do konstrukcji bibliotek o wielkości insertów
powyżej 1 Mpz odbywa się poprzez unieruchomienie komórek, protoplastów lub jąder
komórkowych w małych bloczkach żelu agarozowego w postaci korków lub mikropaciorków).
 Sekwencjonowanie bibliotek
określanie sekwencji nukleotydów występujących w analizowanym fragmencie DNA metoda
Maxama-Gilberta – opiera się na specyficznej, chemicznej degradacji DNA
metoda Sangera – wykorzystuje polimerazę DNA syntetyzującą wierną kopię nici
matrycowej; w reakcji biorą udział dideoksynykleotydy
sekwencjonowanie nowej generacji NGS – umożliwia równoległe sekwencjonowanie wielu
fragmentów DNA i tym samym otrzymanie w krótkim czasie rozbudowanego zbioru danych
sekwencyjnych; klonalna amplifikacja matrycy; wyznakowane nukleotydy z odwracalnymi
terminatorami syntezy