Các phương pháp sắc kí

Nội dung

Giới thiệu chung về sắc kí

Sắc kí khí
Sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC)
 Sắc kí là gì?
Vấn đề: Hỗn hợp các chất: Vitamin B1, B2, B3, B6,
B12 trong mẫu sữa bột  xác định hàm lượng từng
chất xem có đáp ứng đúng yêu cầu và số lượng đưa
ra trên bao bì của sản phẩm?

Cách giải quyết:

 Tách riêng từng chất sau đó xác định hàm lượng các
chất bằng cách đo mật thụ quang của các chất.
 Phương pháp sắc kí lỏng cao áp (HPLC): xác định
đồng thời các chất.
Hệ máy HPLC
Sắc kí đồ của mẫu gồm B1, B2, B3, B6, B12
Sơ đồ khối của
HPLC Bình
chứa
dung môi

Xử lí và
Bơm tạo hiển thị tín
áp suất hiệu
cao

Bơm mẫu

Cột sắc kí

Nước thải

Quan trọng nhất: nơi

xảy ra sự tách chất!
Tách chất bằng sắc kí
 Dung môi: acetonitril + đệm photphat (pha động)
 Mẫu: Hỗn hợp B1, B2, B3, B6, B12
 Cột sắc kí: Supelco C18, vỏ thép không rỉ hoặc silica
nóng chảy, bên trong nhồi hạt silica xốp, đường kính
3-10 µm, tráng một lớp mỏng ankyl mạch dài C18H37
không phân cực. (pha tĩnh)
 Detector: UV-VIS.
Định nghĩa

 Sắc kí: quá trình tách chất dựa trên sự phân bố liên
tục của các cấu tử phân tích lên pha tĩnh và pha động.
 Pha tĩnh: pha thường đứng yên, có khả năng hấp thu
các chất phân tích.
 Pha động: Pha di chuyển qua pha tĩnh.
 Do các cấu tử có ái lực khác nhau với pha tĩnh nên
chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi
nhau.
 Cơ sở lý thuyết

Chất phân tích

F1 F2
F3
Pha tĩnh Pha động

F1 và F2 giữ vai trò quyết định, F3 là yếu tố ảnh hưởng không

lớn.
 Các chất khác nhau thì F1 và F2 sẽ khác nhau  di
chuyển trong cột với tốc độ khác nhau  tách khỏi nhau khi
đi ra khỏi cột .
Quá trình tách sắc kí

Nếu ghép nối cột với detector: ghi lại tín hiệu theo
thời gian, thu được sắc kí đồ̀
Các loại tương tác trong sắc kí (a) hấp phu trên bề
mặt rắn; (b) tương tác phân bố; (c) tương tác trao
đổi ion; (d) (size exclusion) sàng lọc kích thước
Phân loại sắc kí
 Theo pha động
Sắc kí khí: pha động là khí
Sắc kí lỏng: pha động là lỏng
Sắc kí chất lỏng siêu tới hạn: CO2 lỏng
 Theo cơ chế:
Sắc kí hấp phụ
Sắc kí phân bố
Sắc kí ion
Sắc kí rây phân tử
 Theo không gian:
Sắc kí cột
Sắc kí lớp mỏng
Sắc kí giấy
Các đại lượng đặc trưng cho sắc kí
Thời gian lưu Định tính

Chiều cao pic

Định lượng

W: độ rộng pic sắc kí

Xác định thời gian lưu của các vitamin
thu được trong sắc kí đồ trước!
 Thời gian lưu (tR) : tính từ lúc bắt đầu bơm mẫu vào
đầu cột tơi khi pic đạt giá trị cực đại
 Thời gian trống (chết): tm
(đối với các cấu tử không bị lưu giữ trên cột)
 Thời gian lưu hiệu chỉnh: tR’ = tR -tm
 Thể tích lưu: VR = F.tR
F: tốc độ chảy của pha động
 Thể tích lưu hiệu chỉnh: VR’ = F.tR’
Độ phân giải
 Để xác định được các
chất, peak của các chất
phải tách khỏi nhau.
(đánh giá mức độ tách
như thế nào?)
 Hệ số tách α (hệ số lưu
giữ tương đối)

R > 1.5 tách tốt!

Tăng độ phân giải?
 Tăng khoảng cách giữa các pic sắc kí, tăng thời
gian lưu thông qua k.
 Làm giảm độ rộng pic : tăng hiệu suất tách.
 Retention factor: Hệ số lưu k

 VS: thể tích pha tĩnh; Vm: thể tích pha động
 Ý nghĩa của k: k lớn, thời gian lưu dài
'
 Tính k từ sắc kí đồ tR
k =
tm
• Hệ số tách α-selectivity factor (còn gọi là hệ số lưu giữ tương đối)
Hệ số tách α là đại lượng đánh giá khả năng tách 2 chất bằng
phương pháp sắc ký. Nó phụ thuộc vào hệ số phân bố của chúng và là tỷ
số của hệ số phân bố của 2 chất; một chất phân tích A và một chất khác
B hoặc một chất chuẩn.
Điều kiện cần thiết để hai chất A và B tách khỏi nhau là α ≠ 1
α = KDA / KDB = k'A / k'B ≠1 (1.13)
Nói một cách khác hệ số phân bố của hai chất A và B giữa pha tĩnh và
pha động phải khác nhau. Mặt khác từ số thể tích lưu riêng của hai chất,
t'RA / t'RB cũng chính là tỷ số của hệ số phân bố
K DA k 'A t 'RA VRA
'
Vậy có thể tóm tắt là : =α = = ' '
= '
K DB k B t RB VRB
Bài tập

1) Tính hệ số lưu của acid butyric, biết

thời gian lưu của acid butyric trong sắc kí
đồ là 7.63 phút. Thời gian trống của cột là
0.31 phút.

Tăng hiệu suất tách

Thuyết đĩa lý thuyết

Chiều cao đĩa lý thuyết
Thuyết tốc độ, phương trình Van-Deemter.
Thuyết đĩa lý thuyết
 Đĩa lý thuyết: Chia cột thành nhiều phần nhỏ, tại
đó có cân bằng phân bố của chất phân tích giữa
pha động và pha tĩnh.

 Hiệu suất cột được quyết định bởi số đĩa lý

thuyết : số đĩa lý thuyết càng lớn, hiệu suất tách
càng lớn.
 Công thức tính số đĩa lý thuyết (N):

2 2 Thời gian lưu

 tR   tR 
N = 16  = 5.54 
w  w1 / 2 

Độ rộng chân pic Độ rộng nửa pic

 Chiều cao đĩa lý thuyết (H):

L Chiều dài cột

H=
N
 Số đĩa lý thuyết hiệu lực
Thí dụ 1.1: Tính số đĩa lí thuyết, N của cột sắc ký và chiều cao đĩa lí thuyết, H
biết thời gian lưu tRA = 280s, tRB = 300s, độ rộng pic wA = 14s, wB =15s, thời
gian chết, tm=10s. Cột có chiều dài L = 3,2 m.
280  2  300  2
Giải: a) Đối với pic A: N = 16   = 6400 ; Pic B: N = 16   = 6400
 14   15 
Số đĩa lí thuyết của cột đối với cả hai chất là 6400; H = 320 / 6400 = 0,05 (cm).
b) Đĩa lí thuyết có tính tới thời gian không lưu giữ, Neff
2
16 16 t R k ' 2
k ' 2
Neff =16(tR- tm)2/w2 = 2 (t'R)2 = 2 t2m.k'2 ; Neff = 16 2 2 = N
w w w (1 + k ' ) (1 + k ' ) 2
L
Chiều cao đĩa lí thuyết hiệu lực được tính: H eff = (1.17).
N eff
L (1 + k' ) 2 (1 + k' ) 2
Vậy: Heff = . 2
= H. 2
(1.18) k’ = t’R/tm
N k' k'
Mối liên hệ giữa độ phân giải, số đĩa
lý thuyết hiệu dụng

N eff (α − 1)
RS = . hệ số tách
4 α
giữa A và B

2
 k  k: hệ số lưu giữ
Neff = N 
1+ k 
Bài tập
 Tính số đĩa lý thuyêt (n) của cột sắc kí và chiều cao đĩa
lý thuyết (H). Biết thời gian lưu: tRA = 280s, tRB = 300s,
độ rộng pic: wA = 14s, wB = 15s. Cột có chiều dài L = 3,2
m.
Giải:
2 2
Đối với pic A:  tR   280 
N = 16  = 16  = 6400
w  14 
2 2
Đối với pic B:  tR   300 
N = 16  = 16  = 6400
w  15 

Chiều cao đĩa lý thuyết: L 320

H= = = 0.05(cm)
N 6400
Thuyết tốc độ, phương trình Van Deemter

 Thuyết tốc độ: Các yếu tố như đường kính hạt nhồi, kỹ
thuật nạp cột và các yếu tố tốc độ của pha động, hệ số
khuếch tán của chất phân tích trong pha động và pha
tĩnh ảnh hưởng nhiều đến sự dãn rộng vùng chất phân
tích hay độ rộng của pic thu được.
 Chiều cao đĩa lý thuyết H, được hình thành do 3 thành
phần H1, H2, H3:
 H = H1 + H2 +H3.
 Phương trình Van Deemter:

Hệ số khuếch
tán trong pha
A = 2λ d p động

Kích thước
hạt nhồi B = 2γDm
C = Cs + Cm
2
Cs = Kd f / Ds
Hệ số khuếch tán
βd p 2
Chiều dày pha trong pha tĩnh
Cm =
tĩnh Dm
Tìm chiều cao đĩa lý thuyết cực tiểu
 Cách 1: Xác định Hmin từ đường cong thực nghiệm
 Cách 2: Lấy đạo hàm của phương trình Van Deemter:

' B
H = − 2 +C
u
B
 Tại cực tiểu, H’= 0 hay − 2 +C =0
u

B
ut .u =
C

H min = A + 2 B.C
Bài tập
 Một cột sắc kí mao quản dài 30 m, chạy một chất chuẩn ở hai
tốc độ pha động khác nhau, cho các số liệu sau:
Tốc độ (cm/s) Số đĩa lý thuyết
0.5 150 000
1 120 000
Xác định vận tốc tối ưu, chiều cao đĩa lý thuyết và số đĩa lý
thuyết ở vận tốc tối ưu đó.

Giải:
Tính chiều cao đĩa lý thuyết trong 2 thí nghiệm
Thí nghiệm 1: H1= 3000/150 000 = 0.02 cm
Thí nghiêm 2: H2 = 3000/120 000 = 0.025 cm
 Viết phương trình Van Deemter cho 2 trường hợp:

 Với TN1 thay số H = 0.02cm; u=0.5 cm/s; A =0 (do đây

là cột mao quản), ta có:
B
0.02 = + 0.5C (1)
0.5
 Tương tự với TN2, ta có:
B
0.025 = +C (2)
1
 Giải (1) và (2) ta có: B = 0.005 cm2/s; C = 0.02 s.
B 0.005
ut .u = = = 0.5cm / s
C 0.02
 Chiều cao đĩa lý thuyết cực tiểu:
H min = 2 B.C = 0.02cm

 Số đĩa lý thuyết ở vận tốc tối ưu là:

3000
n= = 150000
0.02
Các cách để tăng độ phân giải
Thay đổi cấu trúc cột
Tăng chiều dài cột
Giảm kích thước hạt nhồi
Thay đổi pha tĩnh
Giảm đường kính cột
Tối ưu vận hành cột:
Chỉnh tốc độ pha động tối ưu (ứng với H nhỏ nhất)
Giảm nhiệt độ cột (với GC)
Thay đổi thành phần pha động (với LC)
 ĐỊNH LƯỢNG BẰNG SẮC KÝ
1.4.1 Diện tích pic sắc ký Hầu hết các phép định lượng dựa vào diện tích pic, ngày
nay được xác định bằng cách lấy tích phân píc sắc ký trong sắc đồ. Đơn vị đo diện tích
píc là điểm tín hiệu số
1.4.2 Phương pháp chuẩn nội
Dùng một chất chuẩn có tính chất và nồng độ tương tự chất phân tích nhưng lại
chịu tác động nền càng ít càng tốt làm chất chuẩn nội. (Ci).
Tiến hành 3 phép đo sắc ký: một phép cho chất chuẩn nội, một phép cho chất
chuẩn có nồng độ Cst (từ các chất chuẩn), từ đó rút ra được hệ số ảnh hưởng Fx. Phép
sắc kí thứ ba cho chất phân tích, từ đó tính ra nồng độ của nó. Hệ số Fx chính là đại
lượng đưa vào để loại trừ ảnh hưởng của nền cũng như các điều kiện đo khác.
Cst Ci C h
: = Fx ⇒ Fx = st . i
h st h i h st Ci
C x Ci Ci
= ⇒ Cx = .h x .Fx
hx hi hi

H×nh 1.15 Ph­¬ng ph¸p chuÈn néi x¸c ®Þnh chÊt ph©n tÝch
 ĐỊNH LƯỢNG BẰNG SẮC KÝ
1.4.3 Ph­¬ng ph¸p chuÈn ngo¹i
Th«ng th­êng, ®Ó tiÕn hµnh ®Þnh l­îng chÊt ph©n tÝch, c¸c nhµ ph©n tÝch ph¶i
sö dông c¸c chÊt chuÈn lµ chÝnh chÊt ph©n tÝch cã ®é tinh khiÕt cao.
a) ChuÈn ho¸ mét ®iÓm
Sö dông mét phÐp ®o cña chÊt chuÈn ®· biÕt tr­íc nång ®é, ®o ®éc lËp
vµ song song víi phÐp ®o chÊt cÇn ph©n tÝch. Ph­¬ng ph¸p nµy th­êng ¸p
dông ®èi víi c¸c chÊt ph©n tÝch hoÆc lµ cã hµm l­îng lín hoÆc lµ ®· lµm giµu
tíi møc ®é cÇn thiÕt. Ph­¬ng ph¸p dïng ®Ó ®¸nh gi¸ khi kh«ng yªu cÇu ®é
chÝnh x¸c cao v× ë ®©y ta bá qua c¸c yÕu tè c¶n, h¬n n÷a c¸c sai sè ngÉu nhiªn
cã thÓ lµm gi¶m tÝnh chÝnh x¸c cña phÐp ®o. C¸ch tÝnh kÕt qu¶ nh­ sau:

C x Cst C
= ⇒ C x = st .h x
h x h st h st
Cst
Cx = .Sx
h st

H×nh 1.16 ChuÈn ho¸ mét diÓm

 ĐỊNH LƯỢNG BẰNG SẮC KÝ
b)ChuÈn ho¸ nhiÒu ®iÓm
ChuÈn ho¸ nhiÒu ®iÓm cßn gäi lµ ph­¬ng ph¸p ®­êng chuÈn. Ng­êi ph©n tÝch
thùc hiÖn phÐp t¸ch s¾c ký vµ tÝnh diÖn tÝch ®èi víi chÊt chuÈn cã nång ®é kh¸c nhau
trong ®iÒu kiÖn t­¬ng tù mÉu ph©n tÝch. §iÒu ®ã cã nghÜa cè g¾ng sao cho nÒn phÐp
t¸ch s¾c ký c¸c chÊt chuÈn nµy t­¬ng tù nÒn cña chÊt ph©n tÝch sau nµy. Dùng ®­êng
chuÈn hay ph­¬ng tr×nh håi quy tuyÕn tÝnh sù phô thuéc chiÒu cao (diÖn tÝch) pÝc vµo
nång ®é chÊt ph©n tÝch. TiÕp theo lµ thùc hiÖn phÐp ®o ®èi víi chÊt ph©n tÝch, ta còng
cã diÖn tÝch pÝc S nhÊt ®Þnh. §èi chiÕu nã víi ®­êng chuÈn, tõ ®ã tÝnh nång ®é chÊt
ph©n tÝch trong mÉu.
h x = C x .tgα
hx
⇒ Cx =
tgα

H×nh 1.17 §­êng chuÈn nhiÒu ®iÓm x¸c ®Þnh chÊt ph©n tÝch
 ĐỊNH LƯỢNG BẰNG SẮC KÝ

1.4.4 Ph­¬ng ph¸p thªm chuÈn

Ph­¬ng ph¸p thªm chuÈn lµ ph­¬ng ph¸p ®¬n gi¶n. ChÊt chuÈn ph©n tÝch ®·
biÕt nång ®é ®­îc thªm vµo trong qu¸ tr×nh ph©n tÝch, tõ ®ã tÝnh ra ®­îc nång ®é chÊt
ph©n tÝch cã trong mÉu. Ph­¬ng ph¸p thªm chuÈn lo¹i trõ ®­îc ¶nh h­ëng cña c¸c yÕu
tè nÒn còng nh­ ®iÒu kiÖn ®o nh­ nhiÖt ®é, ¸p suÊt, ngoµi ra nã cßn lo¹i trõ ¶nh h­ëng
cña sai sè ngÉu nhiªn do thao t¸c v.v. Ph­¬ng ph¸p thªm chuÈn lµ ph­¬ng ph¸p cã ®é
chÝnh x¸c cao, khi ph©n tÝch vÕt c¸c chÊt trong nÒn phøc t¹p, ®­îc nhiÒu ng­êi sö
dông.

Δh h x hx
= ⇒ Cx = .Δ C
ΔC Cx Δh

H×nh 1.18 Ph­¬ng ph¸p thªm chuÈn x¸c ®Þnh chÊt ph©n tÝch
1.4 ĐỊNH LƯỢNG BẰNG SẮC KÝ
Phương pháp sắc kí khí
-Chủ yếu ứng dụng tách và phân tích các hợp chất
có khả năng bay hơi ở một nhiết độ nhất định và
không bị phân hủy trong quá trình bay hơi.

- Đại bộ phân chất hữu cơ dễ bay hơi, nên phương

pháp sắc ký khí chủ yếu sử dụng trong phân tích các
chất hữu cơ hay dẫn xuất của chúng.
Hệ sắc kí khối phổ GC-MS
Sắc kí khí
 Pha động: khí trơ
 Pha tĩnh: rắn hoặc lỏng
 Bơm mẫu vào pha động là chất khí (khı́ ́ mang).
 Khí + Mẫu chạy đến cột mao quản.
 Các chất trong mẫu được tách ra khỏi nhau dựa
trên khả năng phân bố khác nhau của chúng trong
pha động và pha tĩnh.
 Sau khi đi ra khỏi cột chất phân tích chạy đến
detector  tạo tín hiệu.
 Bơm
mẫu

Cột săc kí

Khí
mang

Sơ đồ khối của hệ sắc kí khí

CỘT TÁCH TRONG SẮC KÍ KHÍ

Cột nhồi Cột mao quản

42 3/31/2021
 Cột nhồi vs Cột mao quản
 Cột nhồi
 Kích thước:
Dài 2-6 m; đường kính trong 2-
4 mm
 Kích thước hạt nhồi:
37 -44 µm; 250-354 µm
 Hiệu suất tách:
3000-10.000 đĩa lý thuyết
 Dung lượng tách:
0.1-10 µL
 Cột mao quản
 Kích thước:
Dài 15-100m; dtrong 150-
300 µm
 Hạt nhồi: không có
 Hiệu suất tách:
4300 đĩa/m; tổng cộng
khoảng 200.000 đĩa
 Dung lượng tách:
10-2 µL
Các loại cột mao quản
 Pha tĩnh
 Các loại vật liệu làm pha tĩnh:


Chọn pha tĩnh như thế nào?

Chọn theo nguyên tắc: các chất tương tự nhau

sẽ hòa tan vào nhau.
Chất phân cực: pha tĩnh phân cực
Chất phân tích không phân cực: pha tĩnh
không phân cực
Ít bay hơi, không phân hủy ở nhiệt đô ̣ làm việc
của cột
Không có phản ứng bất thuận nghịch giữa chất
phân tích và pha tĩnh cũng như khí mang
Pha động
 Khí trơ: H2, N2, He, Ar…
 Tốc độ pha động với cột nhồi: 25-150 mL/phút
 Tốc độ pha động với cột mao quản: 1-25
mL/phút
 Yêu cầu khí mang:
 + Đảm bảo tính khuyếch tán cần thiết
+ Độ tinh khiết cao 99,99% hay 99,999%
+ Trơ với pha tĩnh cũng như chất phân tích
 + Khả năng hấp phụ bởi pha tĩnh càng ít càng tốt
 + Dễ sử dụng, có tính kinh tế
 Thứ tự rửa giải trong GC
 Phụ thuộc 2 yếu tố:
 Nhiệt độ sôi của chất tan: chất có nhiệt độ sôi thấp 
ra trước, chất có nhiệt độ sôi cao  ra sau.
 Tương tác trong GC: tương tác phân bố giữa chất tan
và pha tĩnh. Chất nào phân bố tốt trong pha tĩnh  ra
trước (nguyên tắc: chất giông nhau hòa tan tốt vào
nhau).
• Pha tĩnh không phân cực:  chất phân cực hơn ra
trước, chất ít phân cực hơn ra sau.
• Pha tĩnh phân cực: chất ít phân cực hơn ra trước,
chất phân cực hơn ra sau.
 Ví dụ: Dự đoán thứ tự rửa giải khi tách
hỗn hợp toluene, benzen, etylacetat trong
n-hexan bằng cột OV-17 (phenylmetyl
siloxan)?
Ts,toluen = 110.6 0C
Ts,benzen = 80.1 0 C
Ts,etylacetat = 77 0 C
Ts,n-hexan = 69 0 C

n-hexan, etylacetat, benzen, toluen

 Bơm mẫu
1) Chuẩn bị mẫu:
Chiết pha rắn
Purge-and-trap
Headspace sampling
2) Bơm mẫu:

Sylanh bơm mẫu

Lượng mẫu:
Đối với cột nhồi: bơm trực tiếp thể tích mẫu 1 đến 20 µL.
Đối với cột mao quản: để tránh quá tải cần giảm thể tích mẫu, sau khi bơm
vào được chia dòng sao cho chỉ phần nhỏ của lượng mẫu ban đầu đi vào cột,
còn lại thoát ra ngoài, chỉ có 0,02 - 0,002µL đi vào cột sắc ký (10 - 100ng).

Bơm mẫu trực tiếp và bơm mẫu gián tiếp:

Bơm mẫu trực tiếp:
- Bơm mẫu trực tiếp bằng xy ranh.
- Ưu điểm:
+ Giữ nguyên thành phần mẫu ban đầu.
+ Mẫu không bị pha loãng bởi khí mang.
+ Mẫu không bị hấp phụ và phân hủy
trong injectơ.

Xy ranh bơm mẫu Van nhận mẫu

Bơm mẫu gián tiếp: có 2 cách

- Bơm chia dòng:

Để giảm qua tải cột người ta dùng kỹ thuật bơm chia dòng, mẫu sau khi
bơm được chia dòng sao cho chỉ phần nhỏ ban đầu đi vào cột
(khoảng 0,02- 0,002µL đi vào cột).

- Bơm không chia dòng:

Trường hợp lượng mẫu ít (nanogam) thì không cần chia dòng.

Bộ phận điều khiển van nhận mẫu

Điều khiển nhiệt độ – chương trình nhiệt độ

 Rất quan trọng đối với sắc kí khí

 Côt được đặt trong lò có thể thay đổi và điều khiển
nhiệt độ
 Chế độ đẳng nhiệt: nhiệt độ không đổi và thấp hơn
một chút so với nhiệt độ sôi của cấu tử tan.
 Chế độ chương trình nhiệt độ: trong trường hợp các
cấu tử có nhiệt độ sôi quá khác nhau. Ban đầu đặt
nhiệt độ không đổi với cấu tử có nhiệt độ sôi thấp sau
đó tăng nhiệt độ lên gần nhiệt đô sôi của cấu tử có
nhiệt độ sôi cao.
Các loại detector

Detector độ dẫn nhiệt (TCD)

Detector ion hóa ngọn lửa (FID)
Detector bẫy điện tử (ECD)
Khối phổ (MS)
Detector quang hóa ngọn lửa, detector hồng
ngoại chuyển hóa Fourier (FT-IR),…
Detector TCD
 Nguyên tắc:
 Khi có chất phân tích: độ dẫn nhiệt của pha động giảm,
điện trở suất tăng.
 So sánh với điện trơ suất của pha động không có chất
phân tích  thông tin về lượng chất phân tích.

Ưu điểm: áp dụng
được với tất cả
các chất
Nhược điểm: giới
hạn phát hiện
thấp
Detector FID
 Nguyên tắc:
 Các HC khi bị đốt cháy trong
ngọn lửa sẽ bị ion hóa tạo điện
tử và các ion.
 Đặt một điện trường đủ lớn 
tạo dòng điện, tỷ lệ với lượng
chất phân tích.
 Ưu điểm
 Làm việc được với hầu hết các
hợp chất hữu cơ
 Giới hạn phát hiện tương đối
thấp
 Thông dụng rẻ tiền
Detector ECD
 Nguyên tắc:
 Các electron trong detector ion hóa pha động  Tạo
dòng điện
 Chất phân tích có khả năng bắt giữ điện tử  giảm
nồng độ electron  giảm dòng điện

Ưu điểm:
- Rất nhạy với các hợp chất
có nhóm ái điện tử: halogen,
nitro.
-Giới hạn phát hiện thấp
Nhược điểm:
-Khoảng tuyến tính hẹp
Detector MS
 Nguyên tắc:
 Ion hóa chất phân tích thành
những mảnh nhỏ
 Tách các mảnh nhỏ bằng điện
trường hoặc từ trường

 Ưu điểm:
 Vừa định tính vừa định lượng
 Giới hạn phát hiện thấp
CƠ SỞ CỦA PHƯƠNG PHÁP MS – ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ
ThÝ dô 1

H×nh 2.21 Các mảnh: Ion ph©n tö cã m/z =122; M¶nh C6H6-C=O khối
lượng 105; M¶nh C6H5 khối lượng 77 ; M¶nh CO là28
ThÝ dô 2: n-butylbenzen

H×nh 2.22 Phæ khèi l­îng cña n-butylbenzen

 SẮC KÝ KHÍ-KHỐI PHỔ GC-MS
Computer

GC Interface MS

KhÝ mang ChØnh dßng K.tra D÷ liÖu Ghi

B¬m mÉu Cét t¸ch Interface Ion ho¸ T¸ch KL Detector

MÉu chuÈn Ch©n kh«ng

KhÝ p/­
MÉu trùc tiÕp

H×nh 2.13 S¬ ®å khèi cña hÖ GC-MS

 CƠ SỞ CỦA PHƯƠNG PHÁP MS
ION HÓA - PHÂN GIẢI - ĐÁNH GIÁ
Để chất phân tích theo phương pháp MS, chúng phải ở trạng thái ion. Một phân tử trung hòa
phái được chuyển thành các ion phân tử hay ion mảnh bằng các phương pháp khác nhau.
ABCD + e ABCD+ + 2e (95%)
ABCD++ + 3e (2.1)
ABCD-
Trong trường hợp dùng năng lượng bắn phá lớn, các ion mảnh nhiều hơn.
ABCD+ ABC* + D+
AB* + CD+
A+ + BCD* (2.2)
A* + BCD+
X* là gốc tự do, các ion sau khi hình thành được đưa sang bộ phận tách theo khối lượng. Tuỳ
thuộc vào cấu tạo của máy mà các ion được tách theo nguyên lý nào, tuy nhiên về nguyên tắc
có thể ghi nhận tất cả các ion từ khối lượng nhỏ tới khối lượng lớn, cả ion dương và ion âm sau
đó tín hiệu được khuyếch đại lên nhiều lần. Từ các tín hiệu thu được, dựa vào khối lượng ion
phân tử, dựa vào đồng vị, dựa vào các mảnh ion phân tử, dựa vào cơ chế tách và dựa vào ngân
hàng dữ liệu các ion và mảnh ion, người ta định tính và định lượng được chất phân tích một
cách chính xác.
 CƠ SỞ CỦA PHƯƠNG PHÁP MS - ION HÓA
a) Phương pháp va chạm electron
Dòng electron được sinh ra do một nguồn gồm có một sợi đốt ở phía catot, di chuyển
nhanh về phía anot nhờ một điện trường mạnh, trên đường đi, các electron gặp dòng
phân tử khí mẫu từ interface và vuông góc với nó trong điều kiện áp suất thấp cỡ 5. 10-
3
-10-4 torr, và nhiệt độ khoảng 200oC, để tạo thành các ion phân tử và ion mảnh.
Anot E1 E2 E3

Catot
Hình 2.15 Cấu tạo của buồng ion hoá
Để tao thành ion phân tử, cần năng lượng 6-15 eV; nếu ta dùng năng lượng cao hơn,
cỡ 70 eV để bắn phá, các ion mảnh nhiều hơn. Đối với các hợp chất thơm, do các
electron π linh động, chỉ cần một năng lượng nhỏ cũng đủ để làm bật electron ra còn
các hợp chất no, do các electron ít linh động hơn nên cũng cần năng lượng lớn hơn.
 CƠ SỞ CỦA PHƯƠNG PHÁP MS - ION HÓA

b) Ion ho¸ ho¸ häc

Ion ho¸ ho¸ häc lµ dïng mét dßng ph©n tö mÉu trung hoµ va ch¹m víi dßng c¸c ion ©m
hoÆc d­¬ng ®Ó biÕn c¸c ph©n tö trung hoµ thµnh c¸c ion ph©n tö hay ion m¶nh. Qu¸
tr×nh ion ho¸ b¨ng c¸ io d­¬ng x¶y ra theo hai b­íc:
B­íc 1 : Cho dßng electron mang n¨ng l­îng thÊp va ch¹m víi c¸c ph©n tö
trung hoµ (vÝ dô CH4 , isobutan, amoniac v.v) ®Ó trë thµnh ion nguån:
CH4 + e = CH4+ + 2e
CH4+ + CH4 = CH5 + CH3+ (2.3)
CH3+ + CH4 = C2H5+ + H2
B­íc 2 : C¸c ion nguån va ch¹m víi c¸c ph©n tö mÉu d¹ng khÝ ®Ó t¹o thµnh
c¸c ion ph©n tö vµ c¸c ion m¶nh.
CH5+ + MH = CH4 + MH2+
CH3+ + MH = CH4 + M+ (2.4)
CH4+ + MH = CH4 + MH+
Nh×n chung ion ho¸ ho¸ häc t¹o ra Ýt ion m¶nh h¬n, chØ cã c¸c ion ph©n tö vµ ion gÇn
gièng ion ph©n tö, cho nªn phæ khèi l­îng ®¬n gi¶n h¬n.
CHUẨN BỊ MẪU CHO SẮC KÍ KHÍ
Vi chiết pha rắn
 HẤP PHỤ BẰNG THANH KHUẤY
- Nguyên tắc giống với vi chiết pha
rắn, nhưng nhạy hơn nhiều lần
- Thanh khuấy từ, tráng một lớp
polydimethypolyxyloxane dày
khoảng 1mm
- Cho thanh khuấy vào dung dịch
chất phân tích, khuấy từ 30’ đến 1h
để các chất phân tích hấp phụ lên
thanh.
- Giải hấp vào bộ phận giải hấp
nhiệt, thu các chất phân tích đựoc
giải hấp rồi bơm vào máy sắc kí
khí.
Purge and trap (Thổi và bẫy khí)

-Thổi khí trơ (H2) qua dung dịch

mẫu đông thời nung nóng dung dịch
để các chất phân tích bay hơi
- Các chất phân tích bay lên và bị
hấp phụ ở cột hấp phụ
- Sau đó đảo chiều thổi khí từ B đến
A, nối cổng bơm (injection port) vào
máy sắc kí, tăng nhiệt độ để giải
hấp các chất phân tích từ cột hấp
phụ
-Có thể lấy được 100% chất phân
tích
Phát triển phương pháp

Xây dựng phương pháp dựa theo thứ tự

lựa chọn sau:
1. Mục đích phân tích
2. Quá trình xử lí mẫu
3. Chọn detector
4. Chọn cột
5. Chọn kĩ thuật bơm mẫu
Lượng mẫu bơm giới hạn với các cột sắc kí khác nhau và detector
khác nhau
Ứng dụng của GC
 Phân tích môi trường:
Khí nhà kính (CO2, CH4, NOx ..); thuốc trừ sâu;
trihalomethan trong nước
 Phân tích lâm sàng:
Các loại thuốc, alcohol trong máu.
 Thực phẩm:
Các hợp chất bay hơi trong gia vị và mùi hương; vết hữu
cơ trong rượu wiski, monomer trong sơn.
 Công nghiệp hóa dầu:
Độ tinh khiết của dung môi, thành phần của xăng, ..
Ứng dụng phương pháp sắc ký khí tách các hợp chất hydrocacbon theo chương
trình đẳng nhiệt và chương trình nhiệt độ:

Sắc đồ tách 32 thuốc trừ sâu cơ clo bằng phương pháp GC-ECD
Sắc đồ tách 32 thuốc trừ sâu cơ clo bằng phương pháp GC-ECD
Sắc phổ phân tích 17 axít béo
 Tính toán định lượng
 Nguyên tắc:
Diện tích pic (chiều cao pic) tỷ lệ với nồng độ chất phân tích
A (H) = kCa
 Dựng đường chuẩn: A ~ Ca
 Pha dãy mẫu chuẩn:
1 ppm; 5 ppm; 10 ppm; 25 ppm; 50 ppm
 Đo tín hiệu : diện tích pic:
2400; 12100; 24500; 59100; 118000
 Đo tín hiệu của mẫu phân tích: 62000

  Cx =?
 140000
y = 2352.9x + 397.5
120000
R2 = 0.9999
100000
Tín Hiệu

80000

60000

40000

20000

0
0 10 20 30 40 50 60
Nồng độ (ppm)

Ax = 6200  Cx = 25.8 ppm

Đánh giá phương pháp GC
 Phân tích được hàm lượng nhỏ các chất, lượng mẫu nhỏ
cỡ µL
 Độ đúng: tùy thuộc vào mẫu, dao động từ 1-25%.
 Độ chính xác: phụ thuộc vào quá trình lấy mẫu, xử lí mẫu
và thiết bị đo. Độ lệch chuẩn của thiết bị thường từ 1-5%.
 Độ nhạy: tùy thuộc vào từng loại detector.
 Độ chọn lọc: Rất cao
 Giá thành: từ vài ngàn $ cho đến vài chục ngàn $ và vài
trăm nghìn $ (GC-MS)
 Thời gian: từ vài phút cho đến vài giờ + thời gian xử lí
mẫu
Sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC)
Nguyên tắc

Mẫu ở dạng lỏng được bơm vào pha động

lỏng
Tách dựa trên sự phân bố khác nhau của
chất phân tích giữa pha tĩnh và pha động.
Cần áp suất cao để đẩy dung môi qua cột.
 Hệ thống HPLC Cột sắc ký (Pha tĩnh)
(có thể dùng bộ điều
Máy HPLC gồm các bộ phận cơ bản sau : nhiệt)

Column

Degasse Pump
Bơm cao
Bình chứa dung môi Bộ phận khử áp
pha động khí Bơm mẫu (bằng
tay hoặc tự động)

Detector
Detector
(nhận tín
In dữ liệu . hiệu)
Hệ thống máy tính gắn 81 phần mềm nhận tín hiệu, xử 3/31/2021

lý dữ liệu và điều khiển hệ thống HPLC.

Ưu điểm của kích thước hạt pha tĩnh nhỏ

Số đĩa lý thuyết lớn

 tăng độ phân giải
Thời gian phân tích
nhanh
Giới hạn phát hiện
thấp
Áp suất cao

Dung môi mạnh hơn

đấy chất nhanh hơn
Cột HPLC
Loại 1:
Ống thép không rỉ, đường kính 2.1 - 4.6 mm; chiều
dài: 30- 300 mm.
Bên trong nhồi hạt silica xốp, đường kính 3-10 µm.
Hiệu suất tách: 40 000 - 60 000 đĩa lý thuyết/m
Loại 2: Cột mao quản
Silica nung chảy, đường kính trong: 44-200 µm; chiều
dài: 50-250 mm.
Bên trong nhồi hạt silica xốp, đường kính hạt 3-5 µm.
Hiệu suất tách: 250 000 đĩa lý thuyết
(Tại sao hiệu suất tách của cột mao quản lại cao hơn
nhiều? Tại sao cột HPLC lại ngắn hơn nhiều so với
cột GC?)
Cột bảo vệ
 Hai yếu tố làm giảm thời gian sử dụng của cột
phân tích:
Chất tan gắn bất thuận nghịch với pha tĩnh, làm giảm
lượng pha tĩnh và giảm hiệu suất tách của cột.
Các hạt trong mẫu làm tắc cột tách.
 Giải quyết:
Sử dụng cột bảo vệ đặt trước cột phân tích.
Cột bảo vệ: tương tự cột phân tích nhưng ngắn hơn
và rẻ tiền hơn.
Các loại sắc kí trong HPLC

Sắc kí hấp phụ

Sắc kí pha thường
Sắc kí pha đảo
Sắc kí ion
Sắc kí rây phân tử
Sắc kí pha thường và sắc kí pha đảo
 Tùy thuộc vào gốc R pha tĩnh có thể có các tính
chất khác nhau.
 Nếu R chứa nhóm chức phân cực (cyano,
amino, diol,..)  pha tĩnh là phân cực, pha động
không phân cực hoặc ít phân cực: sắc kí pha
thường.
 Nếu R không phân cực (n-octyl C8 hoặc n-
octyldecyl C18)  pha tĩnh không phân cực,
pha động phân cực: sắc kí pha đảo.
 Sắc kí pha đảo được sử dụng phổ biến hơn
nhiều so với sắc kí pha thường.
 PHA TĨNH TRONG HPLC
Hiện nay người ta thường điều chế pha tĩnh trên nền sau đây:
-Pha tĩnh trên nền silica (SiO2)
-Pha tĩnh trên nền oxit nhôm (AL2O3)
-Pha tĩnh trên nền cao phân tử

a. Pha tĩnh trên nền silica: Có hai loại silica:trung tính và silica
alkyl hóa, sulfunic hóa, nitro hóa, amin hóa.
1. Silica trung tính: Đây là loại pha tĩnh dùng cho HPLC pha
thường
Người ta điều chế như sau:
 PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

Cấu tạo mạng lưới silica

- Trên bề mặt có nhóm OH, phân cực và ái nước

(LiChrosorb –Si40, -Si60, -Si100, hypersil).
- Dùng để tách các chất không phân cực, ít phân cực. Pha
động là những dung môi không phân cực hay ít phân cực,
dung môi đơn hay hỗn hợp hai hoặc ba dung môi không
trộn lẫn với nước.
 2. Silica alkylhóa :
- Dùng trong HPLC pha đảo
- Được điều chế từ các silica trung tính bằng cách alkyl hóa
nhóm OH trên mặt silica bằng các gốc alkyl –R (C2,C8,C18)
hay các gốc carbon vòng như nhân phenyl.
- Bề mặt không phân cực hay ít phân cực.
- Dùng để tách các chất không phân cực, ít phân cực và cả
chất phân cực , cả sắc ký cặp ion.
- Pha động là dung môi đơn, hỗn hợp , thậm chí nước. Ví
dụ: metanol, axetonitril- nước hay hỗn hợp các chất với
nhau.
3. Silica đã được sulfunic hóa hay nitro hóa: Đây là loại
silica đã thay bề mặt bằng các nhóm trao đổi ion - SO3H hay -
NO2H. Loại này là pha tĩnh có tính chất trao đổi cation
mạnh.Nếu thay bằng nhóm R–COOH thì thu được pha tĩnh
trao cation axit yếu.

4. Silica đã amin hóa: Silica trung tính thay nhóm OH bằng

các nhóm –NH2, -NH, -NR2,-NR3 ,N(CH3)3OH.Đây là loại pha
tĩnh có khả năng trao đổi anion.

Hiện nay có nhiều loại pha tĩnh trên nền silica, tuy nhiên loại
pha tĩnh silica alkyl hóa là loại được sử dụng nhiều hơn cả do
nó có nhiều tính chất ưu việt và dùng cho tách chất không
phân cực ít phân cực và cả phân cực.
 b. Pha tĩnh trên nền Al2O3:
-Có bề mặt phân cực và có hai trung tâm axít và trung
tâm bazơ.
-Tách tốt với các chất có tính axít do trung tâm bazơ trên
oxít nhôm mạnh hơn.
- Do bề mặt phân cực nên nước ảnh hưởng đến quá trính
tách.
- Dung môi pha động là dung môi không phân cực hay ít
phân cực.
- Pha tĩnh trên nền oxit nhôm ít được sử dụng do cho kết
quả tách không tốt và oxít nhôm có nhiều dạng thu hình,
chỉ có một dạng γ có tính sắc ký tốt.
c. Pha tĩnh trên nền các chất cao phân tử:

-Hiện chưa được sử dụng nhiều do nó có nhiều hạn chế.

- Tính chất không ổn định khi tiếp xúc với dung môi cũng
như khả năng làm việc dưới áp suất cao.
- Trên nền cao phân tử đựoc gắn các nhóm chức trao đổi
ion như: -SO3H, -NO2H, -R-COOH, -NH2, -NH, -
N(CH3)3OH…
- Pha tĩnh loại này có tính chất trao đổi ion Cation hay
Anion.
- Pha động: các dung môi nước, có chứa chất đệm pH, chất
tạo phức, dung môi hữu cơ tan trong nước, dung dịch axít ,
bazơ
Thứ tự rửa giải trong HPLC
 Thứ tự rửa giải trong HPLC được quyết định bởi độ
phân cực của chất tan.
 Sắc kí pha thường: pha tĩnh phân cực: chất có độ phân
cực nhỏ sẽ ra trước, chất có độ phân cực lớn sẽ ra sau.
 Sắc kí pha đảo: pha tĩnh ít phân cực: chất có độ phân
cực lớn sẽ ra trước, chất có độ phân cực sẽ ra sau.

 Vai trò của pha động là như thế nào???

Pha động trong HPLC
 Pha động: các dung môi không phân cực như benzen,
n-hexan, các dung môi phân cực như: nước, methanol,
acetonitril,…
 Với cùng một cột sắc kí, thời gian lưu của chất tan có
thể được thay đổi bằng cách thay đổi tính chất của pha
động.
 Sắc kí pha thường: thời gian lưu dài hơn khi pha động ít
phân cực hơn
 Sắc kí pha đảo: thời gian lưu dài hơn khi pha động phân
cực hơn.
 Độ phân cực của dung môi: được đánh giá bằng hệ số
phân cực (trong các bảng hệ số phân cực).
Biến đổi độ phân cực chất tan và pha tĩnh
 PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

*Trong săc ký pha thường pha động là dung môi kỵ nước

như n-hexan, n-heptan, benzen, cloroform,
tetrachlorocarbon. Nói chung pha động dung môi không
phân cực hay ít phân cực.Do hạn chế về tính kỵ nước
của hệ pha thường nên ít sử dụng trong thực tế.

*Trong sắc ký pha đảo, pha động là hệ dung môi phân

cực, nó là dung môi tan được trong nước, trong nhiều
trường hợp nước lại là một thành phần chính của pha
động.Dung môi phố biến trong hệ pha đảo là metanol,
axetonitril hay hỗn hợp metanol -nước, axetonitril –
nước,axeton-nước…
 PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
Do vậy hệ pha đảo dùng phố biến để tách nhiều loại
hỗn hợp mẫu từ vô cơ đến hữu cơ, chất phân cực đến
không phân cực, ít phân cực, cả chất cấu tạo ion.
Ngoài các dung môi chính nêu trên trong thành phần
pha động của nhiều trường hợp còn thêm chất đệm pH để
ổn định pH cho quá trình sắc ký, chất tạo phức, chất điện ly,
chất tạo cặp ion trong sắc ký cặp ion.

Ảnh hưởng thành phần pha động MeOH/H2O: (90/10; (80/20); (60/40);
(50/50)
 PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

*Trong sắc ký trao đổi ion: pha động là dung dịch nước của
các axit-bazơ hay dung dịch nước của các muối kim loại kiềm,
kiềm thổ, có chứa chất đệm pH chất tạo phức.

* Các vấn đề cần chư ý khi chọn pha động:

-Bản chất của dung môi để pha chế pha động
-Thành phần của các chất tạo ra pha động.Thay đổi thành
phần pha động là làm thay đổi kết quả tách có thể tốt lên cũng
có thể xấu đi.
-Tốc độ pha động.
-pH của pha động. Có ý nghĩa rất lớn đối với sắc ký trao đổi
ion và cặp ion.Các yếu tố nêu trên liên quan và ảnh hưởng
đến kết quả tách sắc ký của một hỗn hợp mẫu, ngoài ra nhiệt
độ cũng đóng góp thêm vào ảnh hưởng đến kết qủa tách.
 PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

Tối ưu hóa các điều kiện trong kỹ thuật HPLC:

Để tách tốt một hỗn hợp chất cần chú ý các yếu tố :
- Chọn pha tĩnh: loại pha tĩnh, cỡ hạt pha tĩnh
- Pha động: dung môi chính, các dung môi khác thêm vào,
thành phần, pH pha động, tốc độ pha động.
- Hệ thống trang bị để thực hiện quá trình sắc ký:loại
detector, van bơm mẫu vòng mẫu, hệ đường dẫn.
- Nhiệt độ cột sắc ký.
Tăng độ phân giải
1) Sử dụng các phản ứng hóa học: thay đổi pH, phản ứng
tạo phức,..
Ví dụ: với hỗn hợp các axit-bazơ yếu, bằng cách thay
đổi pH, thay đổi dạng tồn tại từ trung hòa sang ion 
thay đổi độ phân cực  tách được các chất.
2) Thay đổi dung môi.
Ví dụ: để tách acid benzoic ra khỏi hydroxybenzoic acid,
sử dụng dung môi là acetonitril thay cho tetrahydrofuran,
vì trong dung môi acetonitril benzoic acid bị rửa giải
nhanh hơn là p-hydroxybenzoic acid, trong khi trong
tetrahydrofuran, thời gian lưu của 2 chất này là gần bằng
nhau.
Bơm trong HPLC
 Muốn pha động chuyển động: cần có hệ thống bơm với
áp suất cao (bơm cao áp).
 Trước khi bơm dung môi vào cột: cần loại bỏ các bọt khí
có trong dung môi bằng thổi khí trơ qua dung môi; loại
các hạt bụi nhờ hệ thống lọc.
 Bơm cao áp: nén qua màng và nén bằng pittong.
 Sử dụng một hoặc nhiều bơm: thay đổi thành phần pha
động bằng cách thay đổi tốc độ bơm.
Bơm mẫu
 Không bơm trực tiếp vào
pha động, phải sử dụng
vòng bơm mẫu.

 Vòng bơm mẫu: thường

có 6 cửa, có vòng mẫu
dung tích khác nhau từ 5
– 50 µL.
- Van ở vị trí load: mẫu được đưa vào qua siranh hoặc
bơm mẫu tự động
- Xoay 600, van ở vị trí bơm: bơm đẩy dung môi qua
vòng mẫu, mang theo mẫu vào đầu cột.
Detector
 Detector quang: UV-VIS, huỳnh quang.
 Detector điện hóa: độ dẫn, điện lượng, đo
dòng,…
 Detector khối phổ MS: tương tự như ở GC, giới
hạn phát hiện: 1 – 10 pg.
 Detector hệ số khúc xạ (refractive index): có thể
áp dụng với mọi chất nhưng giới hạn phát hiện
cao: 100 ng – 1 µg.
Detector quang

Detector
UV-VIS.

- UV-VIS: Áp dụng với những chất có khả năng hấp

thụ quang; Giới hạn phát hiện: 100 pg- 1ng
-
- Huỳnh quang: Áp dụng với những chất có khả nang
phát huỳnh quang; Giới hạn phát hiện: 1 pg, độ chọn
lọc cao.
 Detector điện hóa

Detector đo dòng.

- Áp dụng tốt với những chất có khả năng oxi hóa hoặc khử.
- Giới hạn phát hiện: 10 pg - 1 ng.
Đánh giá phương pháp HPLC
Độ đúng, độ chính xác, độ nhạy, độ chọn lọc, giá
thành, thời gian: tương tự như phương pháp GC.
Dung lượng mẫu: lớn hơn so với GC.
Có thể áp dụng với đối tượng mẫu rộng hơn (cả mẫu
bay hơi lẫn không bay hơi).
Hiệu suất tách: số đĩa lý thuyết của HPLC ít hơn so
với GC.
Các loại sắc kí lỏng khác
 Sắc kí trao đổi ion: pha tĩnh là nhựa trao đổi ion,
phù hợp để xác định các anion và cation.
 Sắc kí rây phân tử: pha tĩnh là hạt silica xốp
hoặc polimer xốp, tách chất dựa trên sự khác
nhau về kích thước hạt, chủ yếu để xác định các
phân tử lớn và phân tử sinh học.
 Sắc kí điện di mao quản: tách chất dựa trên đô
linh động điện khác nhau của chất dưới tác
dụng của điện trường.
 PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG-HPLC
3.3 PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ TRAO ĐỔI ION
Phương pháp sắc ký trao đổi ion ra đời sớm, được sử dụng rộng rãi vào những
năm 1960, đóng góp vào việc tách và xác định các chất phân tích có tính chất ion.
3.4.1 Các loại ionit.
Ionit vô cơ hoặc hữu cơ thiên nhiên không đáp ứng được nhu cầu phân tích do
dung lượng trao đổi thấp và một điều rất không phù hợp khi áp dụng loại ionit này là
độ lặp lại của phép phân tích kém. Vì vậy ngày nay người ta chỉ còn sử dụng ionit
thiên nhiên trong sản xuất. Các ionit tổng hợp tỏ ra có ưu điểm rõ rệt do: dung lượng
trao đổi cao, độ bền lý học và hoá học tốt, độ lặp lại của phép tách sắc ký tốt. Có thể
chia các loại chất trao đổi ion thành 2 nhóm cơ bản theo nền của chất trao đổi ion:
- Các hạt polime xốp truyền thống mà ta vẫn gọi là nhựa trao đổi ion hay còn gọi
là nhựa ionit
- Các hạt silic có phủ lớp trao đổi ion truyền thống
- Các hạt silic xốp có gắn các nhóm trao đổi ion trên bề mặt
 PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG-HPLC
Bảng 3.9 Một vài loại cột ion có trên thị trường
Loại cột Nhóm chức Pha động Chất phân tích
Cationit
Shim pack IC-C1 Dung dịch đệm có pH xác Các kim loại Mg2+
(Shimadzu) -RSO3H định, có chất tạo phức Cu2+, Ln3+…
Nucleosil 5 SA -RSO3H Tartaric 4mmol citric Mg2+, Ca2+, Ba2+,
(Metrohm) 0,5mmol ethylendiamin 3 Sr2+, Fe2+ Co2+ Ni2+
4x125 mm, pH2-7 mmol acetone 5%; 1,5 ml/p Cd2+ Zn2+ Mn2+
Metrosep(Metrohm) SiO(CH2)3- tartaric axit 5 mmol Li+, K+, Na+, NH4+,
C1,4,6x125 COOH dipicolinic axít 1 mmol Mg2+, Ca2+
(6-1010-100)
Metrosep C2-100 SiO(CH2)3- tartaric axit 4 mmol Li+, K+, Na+, Rb2+,
Metrosep C2-250 COOH dipicolinic axít 7,5 mmol Cs2+, Mg2+, Ca2+,
(Metrohm) 4x100 Ba2+ …
Anionit
Shim pack IC-A1 Amin bậc4 Cl-, NO3-, SO42-,
(Shimadzu) HBO32-, HSiO42-
Metrosep A Supp 5- Amin bậc 4 Cl-, Br-, I-, ClO3-,
100 (5-150, 5-150) ClO2-, ClO4-, BrO3-
Ion pack AS11 Amin bậc 4 dung môi 1: 5mmol NaOH 38 anion hữu cơ và
dung môi 2: 10 mmol KOH vô cơ: Cl-, xitrat…
3.4.2 Cân bằng trao đổi ion
Quá trình trao đổi ion dựa trên cân bằng trao đổi giữa các ion trong dung
dịch và các ion trên bề mặt pha tĩnh. Cationit axit mạnh có nhóm –SO3H phản
ứng với cation trong dung dịch theo phương trình:
xRSO3H + Mn+ ⇌ (RSO3)xM + xH+
Anionit bazơ mạnh phản ứng với anion Ax- theo phương trình:
xRN(CH3)3OH + Ax- ⇌ [RN(CH3)3]xA + xOH-
Đối với cation B+ trao đổi với cationit axit mạnh có phản ứng:
RSO3H + B+ ⇌ (RSO3)B + H+
[ RSO3 B][ H + ]
Hằng số trao đổi Kex được viết như sau: K ex =
[ RSO3 H ][ B + ]
Hằng số phân bố được viết:
CS [ RSO3 B] [ RSO3 H ]
KD = = = K ex
CM [B+ ] [H + ]
PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG-HPLC
 PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG-HPLC
Pha động trong sắc ký trao đổi ion.
Trước hết ta nói về phản ứng trao đổi cơ bản trong sắc ký trao đổi ion
R-X + E = R-E + X
Trong phản ứng trên E là chất rửa giải hay pha động, X là nhóm trao đổi ion
trên pha tĩnh. Như vậy vai trò của chất rửa giải là cạnh tranh vị trí hấp thu vào pha
tĩnh (R-). Yêu cầu của pha động trong phương pháp sắc ký ion cũng không khác với
phương pháp sắc ký lỏng pha đảo và pha thường ở trên (có 4 yêu cầu, xem phần
3.2.3 pha động trong NP-HPLC). Có 4 căn cứ để lựa chọn pha động như sau:
Kiểu phát hiện chất phân tích; Độ phức tạp của mẫu phân tích; Loại chất phân tích
và Loại cột được sử dụng.
Thông thường, pha động là dung dịch đệm có pH xác định; Để tách các ion kim
loại, người ta thêm các chất tạo phức. Khi phân tích các anion, nếu hệ phát hiện là
detector độ dẫn, pha động hoặc là dẫn điện kém (các chất rửa giải là anion hữu cơ
như benzoat, phtalat…) có pH xác định hoặc là dung dịch phù hợp với cột loại trừ,
thí dụ cột loại trừ R-HCO3 kết hợp R-H thì pha động phải là dung dịch NaHCO3.
Phân tích môi trường (PT các anion Cl-, Br-, I-, NO3-, ...)
Hệ dẫn dung dịch rửa giải + cột tách trao đổi ion + cột loại trừ + detetor độ dẫn.
Biểu diễn công thức này trên ở hình 3.16 .Khi tách các halogenua, sử dụng NaHCO3 để rửa giải. Khi cho
NaHCO3 đi vào detector thì tín hiệu rất lớn, lấn át cả tín hiệu của các halogenua cần tách, vì vậy phải loại
trừ tín hiệu nền đi, sử dụng cationit dạng R-HCO3, các phản ứng như sau:
ở cột tách : R-HCO3 + X- + Na+ → R-X + Na+ + HCO3-
ở cột loại trừ: R-H + Na+ + HCO3- → R-Na + H2CO3

Hình 3.16: Sơ đồ hệ sắc ký ion.

1. Bình đựng dung dịch rửa giải
2. Bơm cao áp
3. Van bơm mẫu.
4. Cột tách.
5. Cột loại trừ.
6. Detector.
7. Máy ghi.

Như vậy là cả Na+ và X- không qua detector, chỉ có các ion halogenua cần tách đi qua và tín hiệu đo
được là của chúng. Đây là một phương pháp có cơ sở khoa học rõ ràng, tuy nhiên cũng có khó khăn khi
thực hành do phải chuẩn bị cột kỹ, hơn nữa phải tính toán sao cho Na+ không xuất hiện trước khi X- đi ra
khỏi cột hết. Điều này khó thực hiện do phải chọn được nồng độ chất rửa giải, pH ... phù hợp.
 Phân tích các ion kim loại
Hệ dẫn dung dịch rửa giải có độ dẫn điện kém + cột tách + detector độ dẫn (sơ
đồ 3.16). Sắc ký ion có thể dùng các chất rửa giải là các dung dịch đệm, với
thuốc thử phát hiện sau cột và detector UV-VIS, công thức của hệ này là: Hệ
dung dịch đệm + cột sắc ký trao đổi ion + thuốc thử + detector quang (sơ đồ
3.17). Hình 3.17: Sơ đồ hệ sắc ký ion
có phản ứng sau cột.
1. dung dịch rửa giải
2. Bơm pha động
3. Van bơm mẫu
4. Cột trao đổi ion
5. Bơm thuốc thử
6. Thuốc thử
7. Vòng phản ứng
8. Detector
Phương pháp điện di mao quản
Điện di mao quản (CE) là một kỹ thuật tách các
chất dựa trên cơ sở sự di chuyển khác nhau của
các phần tử chất (chủ yếu là các ion mang điện
tích) trong dung dịch chất điện ly có đệm pH và
trong tác dụng của một điện trường nhất định
sinh ra do thế đặt vào hai đầu mao quản.

- Kỹ thuật tách này lần đầu tiên được Tiselius (1937)

nghiên cứu và phát triển trên cơ sở nghiên cứu tách Ame Wilhelm Kaurin Tiselius (1902-1971)
Người Thụy Điển
và phân tích các hỗn hợp protein, amin, amino axit GiảI thưởng Nobel cho Hóa học năm 1948

bằng kỹ thuật CE thế thấp (110 - 220V), và ngày nay

được gọi là điện di cổ điển.
 Nguyên tắc
- Khi không có các ảnh hưởng khác, cation chuyển dịch về điện cực âm
(catot) và anion chuyển dịch về điện cực dương (anot).
- Các ion tích nhiều điện và ion có kích thước nhỏ, điện tích lớn sẽ
chuyển dịch nhanh hơn các ion có kích thước lớn có điện tích nhỏ.
- Các phần tử trung hòa về điện bị giữ lại ở trạng thái tĩnh, không chuyển
động
- Ở điều kiện thường, trong một thời gian ngắn, thậm chí các phần tử
trung hòa về điện và anion cũng chuyển dịch về phía catot.

Các ion tích điện trong điện trường chuyển dịch với tốc độ:
V = q.E/k
Trong đó: q là điện tích của ion
E là độ lớn của điện trường
k là hệ số đặc trưng tương tác giữa ion và dung môi
 Phân loại

Tùy theo cơ chế, bản chất, và đặc điểm của quá trình tách (điện di) xảy ra
trong ống mao quản  phân chia thành các loại hay các kiểu khác nhau

1. Điện di cổ điển
2. Điện di mao quản vùng (Capillary Zone Electrophoresis: CZE )
3. Sắc ký điện di mao quản điện động học Mixel (Micell),
(Micellary Capillary Electro-Kenetic Chromatogrphy: MEKC hay
MCEKC )
4. Sắc ký điện di mao quản Gel (rây phân tử) (Capillary Gel
Electrophoresis Chromatography: Gel-CEC )
5. Sắc ký điện di mao quản hội tụ đẳng điện (Capillary Iso-electric
Focusing Chromatography: CIEFC).
6. Sắc ký điện di mao quản đẳng tốc độ (Capillary Iso-Tacho-
Phoresis Chromatography: CITPC).
 So sánh giữa HPCE và HPLC
HPCE HPLC
Điên di đồ Sắc đồ
áp Điện thế Tốc độ dòng
Chất mang điện ly hoặc dung Chất rửa giải hoặc Pha động
dịch đệm
Các kiểu bơm mẫu (electrokinetic Bộ phận bơm mẫu
hoặc hydrodynamic)
Thời gian di chuyển Thời gian lưu
Độ linh động điện di Dung tích cột
Dòng điện di thẩm thấu -
Điện thế cao Bơm cao áp
Mao quản Cột tách
- Độ chính xác, độ nhạy, độ chọn lọc tương tự với GC và HPLC
- Lượng mẫu bơm vào cột mao quản nhỏ hơn đáng kể so với GC và HPLC (1 nL
so với 0,1uL trong GC và 1-100 uL đối với HPLC)
- Giới hạn phát hiện trong điện di mao quản kém hơn 100-1000 lần so với GC và
HPLC
 Điện di hiện đại: Điện di mao quản

Điện di mao quản là điện di xảy ra trong ống mao quản. Mẫu được đưa lên một đầu
của ống mao quản, các thành phần của nó được phân tách dưới tác dụng của điện
trường và đi ra khỏi cột với thời gian khác nhau. Phân tích định tính và định lượng
dựa trên điện di đồ thu được.

A Ca2+
40 mV
NH4+ Na+ Mg2+
Mao quản
K+
a
Điều khiển Detectơ Mn2+ Co2+
Fe2+ Zn2+
Cd2+
b

300 350 400 450 500 550 600

Dung dịch Dung dịch Thêi gian (s)
đệm Mẫu PT đệm
Nguồn điện
thế cao

- Nguồn điện thế cao : 15 – 50 kV

- Mao quản: thường dùng silica, đường kính 10-100 µm
- Detectơ: UV-Vis, MS, ESI-MS, điện hóa, huỳnh quang, độ dẫn….
Cơ sở lý thuyết

Tốc độ di chuyển (v) hay tốc độ điện di của các hạt tích điện
(ion chất phân tích) tỷ lệ thuận với cường độ điện trường (E):
v = µ.E
Trong đó, µ là hệ số, phụ thuộc vào độ linh động điện di của hạt
tích điện, gọi là độ điện di.
µ = v/E = q/(6.π.η.r)
Trong đó, q là điện tích của hạt tích điện, η là độ nhớt của dung
dịch, r là bán kính ion.
Từ công thức có thể thấy:
- Trong điện trường, hạt có kích thước nhỏ và điện tích lớn sẽ di
chuyển nhanh hơn và hạt trung hòa về điện (q=0) sẽ không
chuyển dịch.
- Điện trường có cường độ càng lớn thì hạt tích điện chuyển dịch
càng nhanh
 Mao quản
Mao quản chính là cột tách, một bộ phận quan trọng trong điện di mao quản. Đây là một
trong các yếu tố chính quyết định sự điện di của hỗn hợp chất mẫu. Vật liệu chế tạo mao
quản thường là silic, được gọi là mao quản silica. Trong một số trường hợp người ta cũng
dùng mao quản teflon, khi mao quản silica không phù hợp, ví dụ mẫu có ion F- và tách ở
pH thấp.
Mao quản trong CE thường có đường kính trong (ID) từ 25 đến 150 µm và có thành dày
từ 80-120 µm. Còn chiều dài của mao quản là tùy thuộc vào hỗn hợp chất mẫu cần tách.
Nhìn chung, hiện nay hay được dùng là các mao quản có tổng chiều dài (Ltot) từ 30 đến
120 cm, với chiều dài hiệu dụng (Leff) từ 20 đến 100 cm. Trong đó, chiều dài hiệu dụng
được tính từ điểm mẫu được nạp vào cho đến vị trí trung tâm phát hiện của detector mới
có ý nghĩa trong sự tách chất. Chiều dài hiệu dụng thường ngắn hơn chiều dài tổng (Ltot)
từ 5 đến 15 cm. Thể tích bơm Thể tích mao
Đường
mẫu (tính cho quản (tính
kính trong
1mm chiều cho 1m
(µm)
dài) chiều dài)
250 29,4 nL 49,4 µL

160 20,1 nL 20,1 µL

100 7,9 nL 7,9 µL

75 4,4 nL 4,4 µL

50 2,0 nL 2,0 µL

25 0,5 nL 0,5 µL
 Mao quản silica và dòng điện di thẩm thấu (EOF)

Đêtectơ

(A) ------------------ ----- cation anion

+ EOF - Phân tích cation
µanion
- - - - - - - - - - - - - - - -- - -- - -- -
(B) Phân tích anion
- EOF +
 thời gian phân tích dài
µanion

(C ) -+-+- +- +-+-+-+-+-+ -+ -+ -+ +- +- +- +- +- +-+- -+-+ -++--+ Thay đổi dòng EOF

- EOF +  Tăng hiệu quả phân
tích anion
 Mao quản silica và dòng EOF
Dung môi, nước là những phần tử trung hòa về điện sẽ không chuyển dịch
khi áp điện trường vào. Tuy nhiên, ở điều kiện bình thường vẫn thấy sự
chuyển dịch của chúng về phía catot, hiện tượng này được gọi là dòng
điện thẩm (dòng điện di thẩm thấu) – Electroosmotic flow (EOF). Dòng này
có được là do thành mao quản tích điện.

Dòng EOF được quyết định

bởi thế đặt vào hai đầu mao
quản, pH của dung dịch pha
động điện di, chất điện giải
(thành phần và nồng độ) và
bị ảnh hưởng bởi lớp điện
kép (hay thế zeta, Vzet), độ
nhớt của dung dịch pha động,
hằng số điện môi ε của pha
động, loại mao quản, và cả độ
xốp, cỡ hạt của chất nhồi
trong mao quản (nếu mao
quản có nhồi pha tĩnh).
 Các cách kiểm tra và khống chế dòng điện di thẩm thấu
Cách thức thay đổi Kết quả Nhận xét chung
Từ trường điện E Sự thay đổi tỷ lệ với dòng EOF + Độ phân giải và hiệu lực tách (Nef) sẽ giảm
(điện thế V) + Làm nóng mao quản
Giá trị pH của dung EOF sẽ giảm ở pH thấp và tăng + Thường được dùng
dịch đệm (pha động) ở pH cao + Cách tiện lợi để thay đổi EOF
điện di + Thay đổi được cả điện tích và cấu trúc của chất tan
Lực ion, hay nồng độ Làm giảm thế zeta và EOF khi + Lực ion lớn, tạo ra dòng điện cao và có hiệu ứng
dung dịch đệm tăng nồng độ đệm và lực ion nhiệt Jun lớn
+ Lực ion thấp xảy ra sự hấp phụ chất mẫu
+ Độ nét của pic bị ảnh hưởng
+ Hạn chế lượng mẫu nạp
Nhiệt độ Làm thay đổi độ nhớt (2 – 3%)/ Được dùng khi kiểm tra và khống chế nhiệt độ tự động
oC

Dùng các chất phụ Thay đổi thế zeta, độ nhớt,
gia, dung môi hữu cơ EOF cũng giảm
Các chất hoạt động Hấp thụ lên thành mao quản
bề mặt qua tương tác ionic hay hiệu
ứng kị nước
Dùng các chất polyme Hấp thụ lên thành mao quản
trung tính, ưa nước qua tương tác kị nước
Hoạt hóa bề mặt bằng Tạo liên kết hóa học mới lên
cách cộng hợp thành mao quản
+ Thay đổi phức, được xác định dễ dàng bằng thực
nghiệm
+ Có thể làm thay đổi độ chọn lọc
+ Chất hoạt động bề mặt là:
- Anion: làm tăng EOF
- Cation: làm giảm EOF, có thể
đổi chiều dòng EOF
+ Thay đổi độ chọn lọc
+ Làm giảm EOF qua sự thay đổi điện tích bề mặt
+ Làm tăng độ nhớt.
+ Có nhiều cách thay đổi như:
- kiểu ưa nước
- thay đổi điện tích
+ Làm bền bề mặt mao quản
 Các kiểu bơm mẫu trong CE Thñy ®éng lùc häc
A B
+ Kỹ thuật thủy động lực học dùng ¸p suÊt
xiph«ng

áp suất: dùng một áp suất thích hợp để

nén (đẩy) hoặc hút một lượng mẫu vào mÉu mÉu

đầu cột mao quản trong một thời gian nhất ch©n kh«ng

định. Áp suất thường dùng trong khoảng từ

100 - 300 mBar. Theo cách này thì lượng mÉu

mẫu nạp vào mao quản phụ thuộc vào áp ĐiÖn ®éng häc
C
suất, thời gian bơm mẫu, đường kính trong
và chiều dài của mao quản, độ nhớt của mÉu

dung dịch pha động điện di sử dụng.

+ Kỹ thuật thủy động lực học theo kiểu xiphông: dựa trên sự chênh lệch về chiều cao
của hai đầu ống mao quản đặt cao thấp khác nhau một khoảng là ∆H (hình 1.11B), để tạo ra một
áp suất làm cho mẫu đi vào ống mao quản trong một thời gian tn nhất định. Cách bơm mẫu này
có ưu điểm là đơn giản, không cần máy bơm nên thường được sử dụng. Tuy nhiên, cần phải
chú ý để các điều kiện bơm mẫu lặp lại và chính xác.
+ Kỹ thuật điện động học: dùng lực của dòng điện với một điện thế cao (5 - 10 kV) thích
hợp để đưa mẫu phân tích vào ống mao quản trong một thời gian nhất định. Kỹ thuật bơm mẫu
này nếu nạp mẫu trong thời gian dài sẽ không tốt, nhất là với các mẫu chứa các ion có điện tích
và kích thước khác nhau nhiều vì ngay trong quá trình bơm mẫu đã xảy ra sự điện di, làm sai
lệch thành phần mẫu bơm vào. Thực nghiệm cho thấy nếu nạp mẫu ở thế 5 kV, thời gian nhỏ
hơn 10 giây, thì ảnh hưởng này là không đáng kể. Trong kỹ thuật này, lượng mẫu nạp vào phụ
thuộc vào độ điện di của chất tan, thế nạp mẫu, nồng độ của chất mẫu, đường kính trong và
chiều dài của mao quản, thời gian nạp mẫu và khối lượng riêng của dung dịch mẫu.
Tùy theo trang thiết bị, đối tượng phân tích và mục đích phân tích khác nhau mà có
thể lựa chọn một kiểu bơm mẫu phù hợp.
Một số Detectơ thông dụng

Mao quản Dạng cuvet có Mao quản

Detectơ UV: A = ε.C.l dạng “bong độ nhạy cao hình chữ
bóng” Z

Các dạng mao quản “bong bóng” cùng

với minh họa về độ nhạy và độ phân giải
Một số Detectơ thông dụng

Detectơ Huỳnh quang Detectơ đo dòng

(Amperometry)
Một số Detectơ thông dụng

Hệ thiết bị CE kết nối detectơ ion Mô hình kết nối của hệ

hóa phun điện – khối phổ thiết bị CE-ESI-MS
(CE-ESI-MS)