Biomolekyylit ja aineenvaihdunta I

Luentorunko

Jarmo Niemi 2003-2007

1
Biomolekyylit ja aineenvaihdunta I
Luennot 6 op. (3 ov)

© 2003- 2007 Jarmo Niemi (jarmo.niemi@utu.fi)

Biokemian ja elintarvikekemian laitos, Arcanum
puh. 333 6877, 040 0789362

http://users.utu.fi/~jarnie/Biomolekyylit1.doc

Tavoitteet ja sisältö: Biomolekyylit ja aineenvaihdunta I -luentosarja

perehdyttää opiskelijat keskeisten biomolekyylien, kuten hiilihydraattien,
lipidien, proteiinien ja nukleiinihappojen rakenteisiin, toiminnallisiin
ominaisuuksiin ja biokemialliseen merkitykseen, biologisten membraanien
toimintaan ja signaalinvälitykseen.

Kirjallisuus: Nelson ja Cox: Lehninger Principles of Biochemistry, 4. painos,

kappaleet 1-10

http://bcs.whfreeman.com/lehninger/

Suoritustavat: Luentoihin ja oppikirjaan perustuva tentti.

Luentorunko

Tämä moniste on luentorunko, ei oppikirja! Se on tarkoitettu luentojen

seuraamisen ja kirjan lukemisen tueksi ja muistiinpanotarpeen
vähentämiseksi, ei yksinomaiseksi oppimateriaaliksi.

1. Maa-planeetan elämästä yleensä

♦ elolliset organismit ovat elottomiin kohteisiin verrattuna erittäin

monimutkaisia rakenteeltaan
♦ elolliset organismit käyttävät toimintaansa ympäristöstään saamaansa
energiaa: auringonvaloa tai ravintoaineita
♦ elolliset organismit pystyvät tuottamaan kopioita itsestään
♦ eliöillä on mekanismeja tunnistaa ympäristönsä muutoksia ja reagoida
niihin

Kaikki eliöt ovat perustoimintaperiaatteiltaan samanlaisia

♦ toimivat osat ovat makromolekyylejä, jotka rakentuvat suhteellisen

harvalukuisista “palikoista”, monomeerisistä alayksiköistä
♦ nukleiinihapot ovat kahdeksan eri rakenneosan, nukleotidin muodostamia
ketjuja
♦ proteiinit ovat kahdenkymmenen erilaisen aminohapon muodostamia
ketjuja

2
♦ kaikki eliöt käyttävät samoja nukleotidejä ja aminohappoja

¾ eliöt eivät ole kemiallisessa tasapainossa ympäristönsä kanssa

¾ eliöissä olevat yhdisteet ovat dynaamisessa vakaassa tilassa; niitä
tuotetaan ja hajotetaan yhtä paljon
¾ eliöt ottavat sekä ainetta, että energiaa ympäristöstään, ja käyttävät niitä
oman järjestyksensä rakentamiseen ja ylläpitoon

Termodynamiikan ensimmäinen pääsääntö:

Energia ei häviä.

Termodynamiikan toinen pääsääntö:

Entropia (epäjärjestys) lisääntyy

♦ Eliöt noudattavat kaikkia fysiikan ja kemian lakeja.

♦ Eliön järjestyneisyys voidaan saavuttaa vain ympäristön epäjärjestyksen

lisääntymisen kustannuksella

¾ Eliöt käyttävät hyväkseen ns. kytkettyjä reaktioita: energiaa vapauttavan

(eksergonisen) reaktion avulla saadaan energiaa sitova (endergoninen)
reaktio tapahtumaan

¾ Kytkentään käytetään korkeaenergisiä yhdisteitä, joista tavallisin on

adenosiinitrifosfaatti, ATP

¾ Reaktioita katalysoivat soluissa entsyymit, joista muodostuu reaktioteitä

Biologinen tiedonsiirto

Eliön toiminnan pohjana on geneettinen informaatio, jonka täytyy

ƒ kopioitua lähes virheettömästi uuteen eliösukupolveen

ƒ ilmentyä suhteellisen virheettömästi eliön toiminnassa

Kopioitumisen virheettömyys perustuu DNA:n kaksinauhaiseen,

komplementaariseen rakenteeseen

Kopioitumisessa tapahtuvat (harvat) virheet mahdollistavat evoluution

Ilmentyminen perustuu lineaarisen nukleiinihappomolekyylin translaatioon,

“kääntämiseen”, lineaariseksi proteiinimolekyyliksi

Lineaarinen proteiinimolekyyli omaksuu kolmiulotteisen rakenteen, joka

riippuu sen rakenneosien järjestyksestä, ja johon sen toiminta perustuu.

3
 1.1. Solujen rakenne

♦ Eliön perusyksikkö on solu. (yksisoluiset/monisoluiset)

♦ Kaikkia soluja ympäröi solukalvo (plasma membrane)
♦ Solukalvon sisäpuolella on solulima, sytoplasma
♦ Sytoplasmassa on erilaisia partikkeleita, sekä nestefaasi, sytosoli, joka on
olemukseltaan geelimäinen
♦ Kaikissa soluissa (pl. tumattomat) sytoplasmassa on ribosomeja, joissa
proteiinisynteesi tapahtuu
♦ Solun perimä, genomi on DNA:ta sisältävässä rakenteessa
♦ Aitotumallisilla (eukaryooteilla) tätä rakennetta kutsutaan tumaksi
(nucleus). Tuman erottaa solulimasta tumakalvo.
♦ Esitumallisilla (prokaryooteilla) käytetään nimitystä nukleoidi

Solujen koko

♦ Eläin- ja kasvisolut 5-100 µm, bakteerisolut 1-2 µm

♦ Pienimmät mykoplasmat 300 nm -> tilavuus 10-17 litraa
♦ Solun kokoa rajoittaa ravintoaineiden ja hapen saanti
♦ Nitella-levän solu on useita senttimetrejä pitkä !

Aitotumallinen, eukaryootti (eukaryote) Esitumallinen, prokaryootti (prokaryote)

Tuma (nucleus) Nukleoidi (nucleoid)

Mitokondrio (mitochondrion)

Solukalvo (plasma membrane)

COO-
OH CH2
CH2
COO-

Enz
COO-
CH
CH
COO-

Solulima, sytoplasma (cytoplasm)

Endoplasmakalvosto (endoplasmic reticulum, ER)

Lysosomi (lysosome)
Golgin laite (Golgi complex)

‘What is true for E. coli is true for elephants, only more so.’ -
Jacques Monod

4
Koska kaikki eliöt ovat perustoimintaperiaatteiltaan samanlaisia, voidaan
niiden tutkimisessa käyttää sellaisia koeorganismeja, joiden kasvattaminen ja
käsittely on mahdollisimman helppoa.

bakteeri, Escherichia coli

hiiva, yksinkertainen eukaryootti Saccharomyces cerevisiae
yksisoluinen kasvi, levä Chlamydomonas

Prokaryoottisolun evoluutio ja rakenne

Prokaryootit jakautuvat
ƒ eubakteereihin (“varsinaiset bakteerit”)
ƒ arkkeihin (Archaea, arkkibakteerit)
Kreikk. arche “alkuperä, alku”

Arkit ovat luultavasti vanhimpia jäljellä olevia solullisia eliöitä. Nykyään

tehokkaammat eubakteerit ovat syrjäyttäneet ne tavallisista olosuhteista, ja
arkkeja esiintyy ääriolosuhteissa. Me eukaryootit olemme läheisempää sukua
arkeille, kuin eubakteereille.

Prokaryoottien elinympäristöjä

Aerobinen
Anaerobinen (ei happea)

Eliöt saavat energiaa hapetus-pelkistysreaktioista, jotka voidaan tulkita

elektronien siirroksi. Aerobiset organismit siirtävät elektroneja hapelle.
Anaerobiset käyttävät elektronien vastaanottajina muita molekyylejä, kuten
nitraattia, rikkiä, hiilidioksidia. Useille anaerobisille organismeille happi on
myrkkyä.

Prokaryoottien energian ja ravinnon hankinta

Fototrofit saavat energiansa valosta

Kemotrofit saavat energiansa hapettamalla ravintoaineita

Autotrofit saavat tarvitsemansa hiilen hiilidioksidista

Heterotrofit saavat tarvitsemansa hiilen ravintoaineista

Litotrofit saavat energiansa hapettamalla epäorgaanisia ravintoaineita

Organotrofit saavat energiansa hapettamalla orgaanisia ravintoaineita

Escherichia coli on parhaiten tutkittu prokaryootti

E. coli on enimmäkseen harmiton ruoansulatuskanavan asukas.

Solu on n. 2 x 1 µm. Solua ympäröi soluseinä, joka koostuu
peptidoglykaaneista. E. colilla on kaksinkertainen solukalvo, jonka ulompi
kerros on peptidoglykaanikerroksen ulkopuolella (Gram-negatiivinen bakteeri).

5
Solun ulkopinnassa on piluksia, joilla solu tarttuu pintoihin, ja yksi tai useampi
flagella, jolla solu pystyy liikkumaan uimalla.

E. coli-solun sisällä on

ƒ n. 15 000 ribosomia
ƒ n. tuhatta erilaista entsyymiä kutakin tuhansia molekyylejä
ƒ pienimolekyylisiä orgaanisia yhdisteitä
ƒ epäorgaanisia ioneja
ƒ n. 2000 µm:n mittainen renkaanmuotoinen DNA-molekyyli, kromosomi
ƒ mahdollisesti pienempiä renkaanmuotoisia DNA-molekyylejä, plasmideja

Eukaryoottien alkuperästä

Eukaryootteja on ollut maapallolla n. 1,5 mrd. vuotta. Niiden esivanhempina

pidetään anaerobisia arkkeja.

ƒ Nykyeukaryoottien arvellaan syntyneen toisaalta anaerobisen arkin ja

toisaalta aerobisen eubakteerin ja kasvien osalta vielä syanobakteerin
symbioosina => ns endosymbionttiteoria.
ƒ Aerobisesta bakteerista ajatellaan muodostuneen nykyeukaryoottien
mitokondriot, ja syanobakteerista nykykasvien kloroplastit.
ƒ Sekä mitokondriolla, että kloroplastilla on edelleen omaa DNA:ta, jota
pidetään jäänteenä niiden elämästä erillisenä organismina.

Eukaryoottisen solun rakenteesta ja toiminnasta

Solukalvo sisältää kuljetus- ja reseptoriproteiineja

ƒ Solukalvo ei läpäise useimpia molekyylejä, joten niille on tehtävä aukko.

Aukot ovat erityisiä kalvon läpäiseviä proteiineja, jotka yleensä päästävät vain
yhtä tai harvaa molekyyliä lävitseen.

ƒ Kuljetusproteiini voi olla joko passiivinen kanava (molekyylit kulkevat

konsentraatiogradientin suuntaan) tai aktiivinen pumppu (käyttää ulkoista
energiaa)

ƒ Reseptori on proteiini, joka välittää informaatiota solukalvon yli

(ionikanava, entsyymi)

Endosytoosi ja eksosytoosi kuljettavat materiaalia solukalvon läpi

• Endosytoosissa sisäänotettava materiaali päätyy solukalvosta

kuroutuvan vesikkelin (endosomin) sisään.

• Endosomi kuljetetaan solun sisään, jolloin se voi sulautua jonkin toisen

kalvorakkulan (esim. lysosomin) kanssa.

6
 • Fagosytoosiksi nimitetään endosytoosia, jossa pieniä partikkeleja
otetaan solun sisään.

• Eksosytoosiksi puolestaan nimitetään sitä, kun solun sisältä tuleva

kalvorakkula sulautuu solukalvon kanssa, vapauttaen sisältönsä solun
ulkopuolelle.

• Huomattava, että endosytoosissa materiaali ei kulje solukalvon läpi.

Endoplasminen kalvosto (endoplasmic reticulum) on solun pinnalle ja

ulkopuolelle tulevien proteiinien ja lipidien valmistuspaikka

• Suuren osan eukaryoottisolusta täyttää mutkikas kalvoista koostuva

rakenne, jota kutsutaan endoplasmiseksi kalvostoksi.
• Karhea endoplasminen kalvosto (rough endoplasmic reticulum)
sisältää suuren määrän ribosomeja, jotka valmistavat erittyviä
proteiineja kalvoston sisäiseen tilaan.
• Sileä (smooth) endoplasminen kalvosto puolestaan on lipidien
biosynteesipaikka (jossa muun muassa valmistetaan lisää solukalvoa)

Golgin laite (the Golgi complex) prosessoi ja lajittelee proteiineja

• Endoplasmiseen kalvostoon liittyy Golgin laitteeksi kutsuttu

rakennelma, joka koostuu litistyneistä onteloista.
• Käsiteltävät proteiinit tuodaan kalvorakkuloissa ja ne siirtyvät Golgin
laitteen ontelosta toiseen samalla mekanismilla.
• Golgin laitteesta proteiineja sisältävät rakkulat ohjataan esim.
lysosomeihin tai ulos solusta.
• Golgin laitteessa proteiineihin lisätään erilaisia kemiallisia ryhmiä,
kuten hiilihydraatteja (glykosylaatio), sulfaattiryhmiä, lipidejä.

Hajotusreaktiot tapahtuvat lysosomeissa

• Lysosomeja on vain eläinsoluissa.
• sisältävät makromolekyylejä pilkkovia entsyymejä.
• solukalvo suojaa solua lysosomiin suljettujen hajottavien entsyymien
vaikutukselta.
• kun makromolekyyli on hajotettu monomeereikseen lysosomissa, ne
pääsevät solukalvon läpi.
• lysosomin pH on solulimaa (n. 7) selvästi alhaisempi (n. 5)

Kasvisolun vakuolin tehtävät

• hajottavien reaktioiden tapahtumispaikka (vrt. lysosomi)

• pigmenttien sijoituspaikka (kukkien väri)
• osmoottisen paineen avulla ylläpitää kasvisolun sisäistä painetta =>
pitää kasvia pystyssä

7
Peroksisomit ja glyoksisomit

• Jotkut hajotusreaktiot tuottavat vetyperoksidia H2O2, joka solussa olisi

erittäin vahingollinen hapetin.
• Tällaiset reaktiot tapahtuvat peroksisomeissa, joissa on vetyperoksidia
hapeksi ja vedeksi hajottavaa katalaasi-entsyymiä.

• Kasveissa on peroksisomeja, jotka sisältävät ns. glyoksylaattisyklin

entsyymejä; niitä kutsutaan glyoksisomeiksi.

• Lysosomeja, peroksisomeja ja glyoksisomeja kutsutaan mikrobodeiksi.

Tuma sisältää genomin

• Tumaa rajoittaa kaksinkertainen kalvo, joka on yhteydessä

endoplasmiseen kalvostoon
• Tumakalvossa on tumahuokosia (nuclear pore) joissa on proteiineista
koostuva monimutkainen rakenne, ja n. 90 nm halkaisijainen aukko
• Kun solu ei ole jakautumassa, tuman täyttää DNA:sta ja proteiineista
koostuva kromatiini
• Tumajyvänen (nucleolus) on tuman alue, jossa syntetisoidaan
ribosomaalista RNA:ta (rRNA)

• Solun jakautumista (cytokinesis) edeltää tuman jakautuminen, mitoosi

• Ennen mitoosia solun DNA on kahdentunut.
• Mitoosin yhteydessä se pakkaantuu kromosomeiksi, joissa on kaksi
kromatidia
• Sisarkromatidit erkanevat toisistaan tumasukkulan vetäminä, ja
kulkeutuvat solun eri päihin
• Kromosomien lukumäärä ja muoto on lajityypillinen ominaisuus
• Useimmissa soluissa kutakin kromosomia on kaksi kappaletta (diploidi
solu)
• Sukusoluissa kutakin kromosomia on vain yksi (haploidi solu)

• DNA (joka on negatiivisesti varautunut) kiertyy positiivisesti varattujen

histoni-nimisten proteiinien ympärille n. 1:1
• Edelleen histoni-DNA-kompleksi organisoituu nukleosomeiksi ja
kromatiinikuiduiksi
• Ihmissolussa on 2 metriä DNA:ta, mutta kromosomien yhteenlaskettu
pituus on vain 200 µm

Mitokondriot tuottavat suurimman osan aerobisen solun energiasta

• Mitokondriot ovat kaksinkertaisesta kalvosta muodostuvia organelleja

• Niiden muoto vaihtelee suuresti, mutta tyypillinen halkaisija on 1 µm
• Mitokondrion ulkokalvo on tasainen, mutta sisäkalvo muodostaa
cristoiksi kutsuttuja poimuja, jotka lisäävät sen pinta-alaa
• Sisäkalvon sisäpuolella olevaa, runsaasti proteiineja ja
aineenvaihdunnan välituotteita sisältävää ainesta kutsutaan matriksiksi

8
 • Mitokondriot hapettavat ravintoaineita ilman hapen avulla, tuottaen
hiilidioksidia, vettä ja ATP:tä

Kloroplastit muuttavat aurinkoenergiaa kemialliseksi energiaksi

ƒ Kasvit sisältävät mitokondrioiden ohella kloroplasteja

ƒ Kloroplastit talteenottavat auringon energiaa ja tuottavat
ƒ ATP:tä solun energiaksi
ƒ Pelkistyneitä hiiliyhdisteitä CO2:sta
ƒ Happea

ƒ Kloroplastien (ja kasvien) vihreä väri tulee klorofyllistä, joka on tärkein

fotosynteettinen pigmentti
ƒ Fotosynteesi tapahtuu tylakoideiksi kutsutuissa kalvorakenteissa

Solun tukiranka (cytoskeleton) tukee, järjestää ja liikuttaa

ƒ Eukaryoottisolussa on useista erilaisista proteiinikuiduista koostuva

sisäinen tukiverkosto
ƒ Tukirankaan kuuluu kolmentyyppisiä kuituja
ƒ Mikrotubulukset, 25 nm
ƒ Välikokoiset säikeet (intermediate filaments), 10 nm
ƒ Mikrofilamentit (actin filaments) 5-9 nm

Kukin tukikuiduista koostuu samankaltaisista proteiinialayksiköistä, joista

kasaantuu dynaamisesti tasapaksuja kuituja

ƒ Mikrofilamentit kasaantuvat aktiini-nimisestä proteiinista (myös

lihassäikeissä)
ƒ Fodriini ja filamiini – proteiinit sitovat mikrofilamentteja toisiinsa
ƒ Myosiiniproteiini mahdollistaa kohteiden, esim. soluorganellien
liikuttamisen mikrofilamentteja pitkin

ƒ Mikrotubulukset koostuvat tubuliiniyksiköistä

ƒ Dyneiini ja kinesiini mahdollistavat liikkeen mikrotubuluksia pitkin

Välikokoiset säikeet

ƒ Rakenteeltaan ja toiminnaltaan hyvin vaihteleva ryhmä, tehtävänä tukea

solun rakenteita ja lisätä solun kestävyyttä ulkoisia voimia vastaan
ƒ Esim.
ƒ Keratiinit toimivat hiusten ja kynsien muodostumisessa
ƒ Vimentiini muodostaa sytoplasmaan pysyviä säikeitä, jotka tukevat solun
muotoa

Sytoplasma on ruuhkainen, järjestäytynyt ja dynaaminen

Monisoluiset organismit ja solujen erilaistuminen

ƒ Monisoluisilla organismeilla solut ovat erilaistuneita

9
ƒ Kaikissa soluissa on kuitenkin sama genomi!
ƒ Eri soluissa genomista ilmennetään eri geenejä
ƒ Erilaistumiseen liittyy ”geneettinen ohjelma”

Solut ovat yhteydessä toisiinsa erilaisilla liitoksilla

- tiukka liitos
-desmosomi
-aukkoliitos (gap junction)
-plasmodesmit

Virukset: solunsisäisiä loisia

3. Biomolekyyleistä yleensä

Solu koostuu 99 %:sti alkuaineista C, H, N ja O

• pienikokoisia, atomipainot 12, 1, 14, 16
• eliöissä alkuaineiden osuus hyvin erilainen, kuin maankuoressa
keskimäärin => nämä 4 ovat valikoituneet ominaisuuksiensa perusteella
• kykenevät muodostamaan stabiileja yhdisteitä, joissa atomien välillä
kovalenttiset sidokset
• erityisesti kykenevät (varsinkin C) muodostamaan molekyyliketjuja
• kovalenttisen sidoksen energia 15-170 kcal/mol
• keskimääräinen terminen energia 37 C:ssa 0.6 kcal/mol => kovalenttiset
sidokset täysin stabiileja

Stereoisomeria

ƒ Kun atomiin (yleensä hiileen) on sitoutunut neljä erilaista ryhmää,

muodostuu kiraalinen keskus; ryhmät voivat olla sitoutuneina kahdella eri
tavalla, joita kutsutaan stereoisomeereiksi

ƒ Stereoisomeerit käyttäytyvät yleensä eri tavalla biologisissa systeemeissä,

ja biomolekyylit ovat tyypillisesti vain yhtä stereoisomeeriä

ƒ Molekyylit, jotka ovat toistensa peilikuvia, ovat enantiomeereja

ƒ Stereoisomeerit, jotka eivät ole peilikuvia, ovat diastereomeereja

Hapetus-pelkistysreaktiot

ƒ Solut saavat energiaa biomolekyylejä hapettamalla.

ƒ Atomi hapettuu menettäessään elektroneja.

ƒ Yleensä biologisessa hapettumisessa atomi menettää elektronien ohella

siihen sitoutuneita vetyjä.

10
4. Vesi vanhin voitehista

ƒ Vedellä on hyvin poikkeukselliset ominaisuudet, jotka enimmäkseen

johtuvat vesimolekyylien välisistä vetysidoksista ja vesiatomin
dipoliluonteesta

ƒ Vetysidos syntyy, kun elektronegatiiviseen atomiin kovalenttisesti

sitoutunut vety tulee lähelle toista elektronegatiivista atomia

ƒ Tyypillisen vetysidoksen voimakkuus on n. 1/20 kovalenttisen sidoksen

voimakkuudesta

ƒ Vetysidoksella on voimakas suuntavaikutus: elektronegatiivisten atomien

ja vetyatomien on oltava samalla suoralla, jotta sidos olisi
voimakkaimmillaan

ƒ Biologisissa makromolekyyleissä vetysidokset ovat hyvin tärkeitä, ja niitä

muodostuu happi- ja typpiatomien välille, kun ko. välillä on
jommankumman atomin kovalenttisesti sitoma vetyatomi

ƒ Vetysidoksista muodostuvan verkoston ansiosta vedellä on nesteeksi

epätavallisen paljon sisäistä rakennetta

Vesimolekyylit vuorovaikuttavat liuenneiden aineiden kanssa

ƒ Veteen liukenevat hyvin yhdisteet, joissa on polaarisia tai varattuja ryhmiä

=> pystyvät osallistumaan veden rakenteeseen. Tällaiset yhdisteet ovat
hydrofiilisiä

ƒ Suolat, kuten NaCl dissosioituvat vedessä ioneiksi. Vesimolekyylit

ympäröivät (hydratoivat) ionit

ƒ Ei-polaariset yhdisteet häiritsevät veden rakennetta => hydrofobisia

ƒ Vesi ”pakottaa” hydrofobiset aineet yhteen

Ns. ei-kovalenttiset, ”heikot” vuorovaikutukset molekyylien välillä

ƒ Makromolekyyliä pitävät yhdessä vahvat kovalenttiset sidokset, mutta

makromolekyylit liittyvät toisiinsa heikommilla nonkovalenttisilla
vuorovaikutuksilla:

ƒ • ionisidokset

ƒ • vetysidokset

ƒ • van der Waalsin sidokset

ƒ • hydrofobiset vuorovaikutukset (vettähylkivien molekyylien

yhteenliittyminen)

11
ƒ Nonkovalenttiset vuorovaikutukset pystyvät pitämään makromolekyylit
yhdessä lämpöliikkeestä huolimatta, vain jos niitä on monta =>
makromolekyylien on oltava komplementaarisia

Veden kolligatiiviset ominaisuudet

Kun veteen (tai mihin tahansa yhdestä molekyylilajista koostuvaan

nesteeseen) on liuenneena toista ainetta, tietyt fysikokemialliset ominaisuudet
muuttuvat tavalla, joka riippuu yksinomaan liuenneiden hiukkasten
(molekyylien, ionien…) lukumäärästä. Nämä ovat

ƒ höyrynpaine
ƒ kiehumispiste
ƒ sulamispiste
ƒ osmoottinen paine

ja niitä kutsutaan kolligatiiviksi ominaisuuksiksi

ƒ Kun kahta vesiliuosta erottaa kalvo, joka ei läpäise liuenneita aineita,

mutta läpäisee vettä (kuten solukalvo), vettä siirtyy kalvon läpi, kunnes
liuoksen osmolariteetti kalvon molemmilla puolilla on sama (liuokset
isotoniset) vrt. hypertoninen ja hypotoninen liuos

Veden ionisoituminen

ƒ Puhtaassakin vedessä tapahtuu vähäisessä määrin autoprotolyysiä:

ƒ
H2O ↔ H+ + OH−
ƒ
Vetyioni (protoni) esiintyy normaalisti hydroniumionina H3O+

ƒ Hydronium- ja hydroksidi-ionilla on epätavallisen suuri liikkuvuus vedessä

johtuen ”proton hopping”-ilmiöstä

ƒ Autoprotolyysireaktion tasapainovakio on

ƒ Keq =
[H +][OH −]
[H 2O ]
ƒ Koska veden konsentraatio on käytännössä vakio, voidaan
yksinkertaistaa:

Kw = [H+][OH-] = 1,0 * 10−14 M2

ƒ Puhtaassa vedessä

[H+] = [OH-] = 10−7 M

ƒ Merkitään

12
 pH = -log[H+]

ƒ Puhtaan veden pH = 7

pH + pOH =14

ƒ Heikon hapon (tai emäksen) vesiliuoksessa happo dissosioituu vain

osittain, johon pätee tasapainoyhtälö:

Keq = [H+][A−]/[HA] = Ka

pKa = -logKa

ƒ Titrattaessa heikko happo vahvalla emäksellä havaitaan, että kun happo

on puoliksi titrattu, pH = pKa

ƒ Heikon hapon ja sitä vastaavan emäksen seos vastustaa pH:n muutosta,

ja sitä kutsutaan puskuriliuokseksi

ƒ Jos halutaan laskea, mihin pH:hon tietty puskuri puskuroi, tarvitaan

Henderson – Hasselbalchin yhtälöä:

pH = pKa + log [A−]/[HA]

5. Aminohapot, peptidit ja proteiinit

Aminohapot

Proteiinit rakentuvat 20:sta α-aminohaposta

20 ns. proteiiniaminohappoa ovat universaaleja, kaikki maapallon eliöt
käyttävät proteiineissaan niitä

Näissä α-hiili (2-hiili) sitoo sekä karboksyyli- että aminoryhmää

ei-ionisoituneessa muodossa: H
R C COOH
NH2

pH7:ssä aminohappo esiintyy dipolaarisena ionina (zwitterion)

H
R C COO-
NH3+

13
Glysiiniä lukuun ottamatta α-hiili on kiraalinen keskus. Proteiiniaminohapot
ovat L-muotoa

D ja L kuvaavat konfiguraatioita vertaamalla niitä D- ja L-glyseraldehydiin

Aminohappojen funktion ratkaisee sivuketju R, jonka ominaisuuksien mukaan

aminohapot myös ryhmitellään.

Nonpolaariset, alifaattiset sivuketjut

Glysiini, Gly (G)

Glysiini on ainoa ei-kiraalinen aminohappo, jonka merkittävin ominaisuus on

sen pieni koko. Sitä esiintyy proteiineissa mutkakohdissa ja ahtaissa
paikoissa.

Alaniini, Ala (A)

Jossain mielessä “ominaisuudeton” aminohappo

Valiini, Val (V) Leusiini, Leu (L)

Isoleusiini, Ile (I)

Ns. haaraketjuiset aminohapot ovat proteiineissa usein vedettömissä

sisäosissa.

14
Metioniini, Met (M)

Toinen rikkiä sisältävistä aminohapoista. Useimmissa tapauksissa proteiinin

translaation aloittava aminohappo.

Aromaattiset sivuketjut

Fenyylialaniini, Phe (F) Ph=F

Tryptofaani, Trp (W) ”isoin kirjain”

Tyrosiini, Tyr (Y) tYrosiini

Aromaattiset aminohapot ovat hydrofobisia ja isoja, useimmiten proteiinien

sisäosissa. Tyrosiinilla on myös fenolinen hydroksyyli, joka voi osallistua
reaktioihin.

Negatiivisesti varatut (happamat) sivuketjut

Asparagiinihappo, Asp (D) “C:stä seuraava, C

niinkuin Carboksyylihappo”

Glutamiinihappo Glu (E) “D:stä seuraava,

koska pitempi hiiliketju”

Happamat sivuketjut vaikuttavat proteiinin varaukseen, ja osallistuvat

reaktioihin. Suomen kielellä käytetään usein suolan nimeä: aspartaatti ja
glutamaatti.

15
Polaariset, varauksettomat sivuketjut

Asparagiini, Asn (N) asparagiiNi

H2N O
H2 H2
C C C CH C

O OH
Glutamiini, Gln (Q) NH2 ???

Aspartaatin ja glutamaatin amidit. Ei varausta.

Seriini, Ser (S)

”Hydroksialaniini”. Usein katalyysiin osallistuva aminohappo

Treoniini, Thr (T)

Kysteiini, Cys (C)

”merkaptoseriini”. Tärkeä rikkisiltojen muodostajana proteiineissa.

Proliini, Pro (P)

Ainoa aminohapoista, joka ei ole aminohappo vaan iminohappo. Ei pysty

proteiinissa toimimaan vetysidoksen donorina, joten rikkoo
sekundäärirakenteita, erityisesti α-kierrettä.

Positiivisesti varatut (emäksiset) sivuketjut

Lysiini, Lys (K) “L:stä seuraava”

16
Arginiini, Arg (R) “aRginiini”

Arginiinissa oleva guanidiiniryhmä on voimakas emäs.

Histidiini, His (H)

Histidiini on heikko emäs, jonka pK on lähellä neutraalia, joten se pystyy
proteiineissa toimimaan sekä happona, että emäksenä. Se myös usein sitoo
metalli-ioneja proteiineissa.

Aminohappojen optiset ominaisuudet

Aromaattiset aminohapot absorboivat valoa, eniten tryptofaani

Proteiini voidaan havaita (ja sen konsentraatio mitata) 280 nm

aallonpituudella; kvantitatiivisen tuloksen saamiseksi täytyy tietää proteiinin
aromaattisten aminohappojen lukumäärä

Aminohappojen happo-emäsominaisuudet

Molekyyliä, jossa on sekä happamia, että emäksisiä ryhmiä, sanotaan

amfoteeriseksi tai amfolyytiksi.

Titrattaessa neutraalisivuketjuista aminohappoa, esim. glysiiniä, havaitaan

kaksi puskurointipistettä (=pK1 ja pK2) Niiden välissä on piste, jossa
molekyylin nettovaraus =0, isoelektrinen piste.

Aminohapossa sekä karboksyyli- että aminoryhmän pK-arvot ovat

tavanomaista alhaisemmat johtuen ryhmien vaikutuksesta toisiinsa.

Aminohapoilla, joiden sivuketjussa on titrautuva ryhmä, havaitaan kolme

puskurointipistettä. Isoelektristä pistettä ei saada suoraan pK-arvojen
keskiarvona.

Peptidit ja proteiinit

Peptidit ovat aminohappojen muodostamia ketjuja

Kaksi aminohappoa voi liittyä yhteen toisen karboksyyli- ja toisen

aminoryhmän muodostamalla peptidisidoksella, jolloin samalla eliminoituu
vettä

Peptidisidoksen muodostumisen tasapaino on voimakkaasti lähtöaineiden

puolella, joten karboksyyliryhmä täytyy kemiallisesti aktivoida, jotta reaktio
tapahtuisi

17
Koska peptidillä on edelleen amino- ja karboksyyliryhmä, voidaan
aminohappoja liittää lisää rajoittamattomasti.

Lyhyt peptidi on oligopeptidi, pitkä peptidi on polypeptidi, ja tarpeeksi pitkää

polypeptidiä nimitetään myös proteiiniksi.

Peptidin aminohappojärjestys ilmoitetaan alkaen aminopäästä, eli siitä

aminohaposta, jolla on vapaa α-aminoryhmä.

Toinen pää on vastaavasti karboksyylipää.

Peptidien happo-emäsominaisuudet

Peptidisidosten muodostuessa niihin osallistuvat amino- ja karboksyyliryhmät

”häviävät”. Peptidissä ionisoituvia ryhmiä ovat vain amino- ja karboksipää
sekä sivuketjujen ionisoituvat ryhmät

Ympäristö saattaa muuttaa varsinkin polypeptideissä sivuketjujen pK-arvoja

Peptidillekin on olemassa isoelektrinen piste, jota käytetään hyväksi

puhdistuksessa (pH:n ollessa pI:n yläpuolella peptidi on negatiivisesti
varautunut, ja päinvastoin)

Biologisesti aktiivisten peptidien ja polypeptidin koko vaihtelee suunnattomasti

(3 – 26000 aminohappoa)

Proteiini voi muodostua yhdestä tai useammasta polypeptidistä

(oligomeerirakenne)

Proteiineissa esiintyy myös muita ryhmiä, kuin aminohappoja

-lipidejä
-hiilihydraatteja
-fosfaattiryhmiä
-hemi (rautaporfyriini)
-flaviininukleotidit
-metalli-ionit

Prosteettinen ryhmä – vertaa koentsyymi

Proteiinin rakenteen järjestäytymistasot

Proteiinin rakennetta kuvataan neljällä eri tasolla

Primäärirakenne on proteiinin aminohappojärjestys

Sekundäärirakenne tarkoittaa eräitä erityisen stabiileja rakenteita (α-kierre ja

β-levy) joista suurin osa useimmista proteiineista koostuu

18
Tertiäärirakenne tarkoittaa yhden polypeptidin koko kolmiulotteista rakennetta

Kvaternäärirakenne tarkoittaa sitä, miten useasta polypeptidistä koostuva

proteiini rakentuu osistaan

Proteiinien puhdistus- ja tutkimusmenetelmät

Tärkeimmät proteiinien puhdistusmenetelmät perustuvat

ƒ kokoon
ƒ varaukseen ja hydrofobisuuteen
ƒ biologiseen aktiivisuuteen

Kokoon perustuvat kalvosuodatusmenetelmät ja geelisuodatuskromatografia.

Varaukseen ja hydrofobisuuteen perustuvat saostusmenetelmät (esim.
ammoniumsulfaattisaostus) ja adsorptiokromatografia. Biologiseen
aktiivisuuteen perustuvat erilaiset affiniteettikromatografiamenetelmät.

Jotta proteiini voitaisiin puhdistaa, on oltava jokin keino mitata sen määrää

-entsyymiaktiivisuus
-sitoutuminen johonkin kohdemolekyyliin
-antibodin (vasta-aineen) sitominen
-…

Proteiinien puhdistus

Proteiinit ryhmänä (ainakin liukoiset proteiinit) on suhteellisen helppo erottaa

muista solun molekyyleistä, mutta varsinainen ongelma tulee siinä vaiheessa,
kun on erotettava yksi proteiini muista.

Puhdistusprosessi on johdonmukaista jakaa vaiheisiin:

• raakauutteen teko
jossa solut hajotetaan, ei-liukoiset epäpuhtaudet poistetaan ja
proteiiniliuos esikäsitellään puhdistusta varten
• pääpuhdistus
jossa käytetään mahdollisimman harvoja, tehokkaita
puhdistusmenetelmiä, jotta suurin osa epäpuhtauksista saadaan
poistettua
• loppupuhdistus (polishing, “kiillotus”)
jossa preparaatin puhtaus nostetaan tarvittavalle tasolle

Pääosa puhdistuksessa on nykyään erilaisilla kromatografisilla menetelmillä:

• ioninvaihtokromatografia (anionin- tai kationinvaihto): proteiinit tarttuvat

vastakkaisen varauksen omaavaan kiintoaineeseen ja saadaan irtoamaan
siitä suolakonsentraatiota nostamalla. Eri pH:ssa eri proteiinit irtoavat
luonteenomaisessa suolakonsentraatiossa. Ioninvaihtokromatografia

19
 edellyttää alhaista suolapitoisuutta: näyte voi olla laimea, koska se
konsentroituu ioninvaihdossa

• hydrofobinen interaktiokromatografia (HIC): proteiinit tarttuvat hydrofobisilla

osillaan (esim. aktiivisen keskuksen “tasku”) kiintoaineeseen kiinnitettyihin
hydrofobisiin ryhmiin korkeassa suolapitoisuudessa, ja irtoavat
suolapitoisuutta laskettaessa

• affiniteettikromatografia perustuu proteiinin voimakkaaseen affiniteettiin

ligandinsa kanssa. Esim. substraattianalogi tai muu spesifisesti proteiiniin
sitoutuva molekyyli on liitetty kiinteään kantajaan; haluttu proteiini tarttuu
siihen kiinni. Irti se saadaan lisäämällä ligandia liukoisessa muodossa tai
esim. reversiibelisti denaturoivaa kemikaalia lisäämällä

• tavallisin viimeinen puhdistusvaihe on proteiinit koon mukaan erotteleva

geelisuodatus eli geeliekskluusiokromatografia

Proteiinien analysointi

Tavallisin proteiinien analyysimenetelmä on elektroforeesi. Siinä proteiinit

eroavat sähkökentässä kulkemalla eri nopeuksilla (pI:nsä yläpuolella proteiinit
ovat negatiivisesti varattuja ja kulkevat kohti positiivista napaa…)

Denaturoimalla proteiinit natriumdodekyylisulfaatilla (SDS) saadaan lähes

kaikki proteiinit kulkeutumaan molekyylipainonsa mukaisella nopeudella,
jolloin niiden molekyylipaino saadaan selville. Useammasta polypeptidistä
koostuvat proteiinit hajoavat alayksiköikseen

Isoelektrisessä fokusoinnissa käytetään erikoispuskuria (amfolyyttiseos), joka

muodostaa pH-gradientin. Kukin proteiini liikkuu, kunnes on pI:tään
vastaavassa pH:ssa (varaus, ja liikkuvuus sähkökentässä =0)

Kaksiulotteisessa elektroforeesissa suoritetaan ensin isoelektrinen fokusointi,

ja sitten SDS-geelielektroforeesi. Näin saadaan selville proteiinin pI ja
molekyylipaino.

Polypeptidin aminohappojärjestys ja sen selvittäminen

Proteiinin aminohappojärjestys määrää proteiinin kolmiulotteisen rakenteen ja

toiminnan

Monien perinnöllisten sairauksien osalta geneettinen vika on voitu paikantaa

yhden aminohapon vaihtumiseen yhdessä elimistön proteiinissa

Sirppisoluanemia oli ensimmäinen perinnöllinen sairaus, jonka osoitettiin

johtuvan aminohappomuutoksesta (hemoglobiinin β-ketjussa Glu-6 vaihtunut
valiiniksi)

20
Eri lajeilla samat proteiinit eroavat toisistaan aminohappojärjestykseltään;
aminohappojärjestysten perusteella voidaan laatia sukupuu

Peptidin aminohappojärjestys voidaan määrittää ns. Edman-hajotuksella

(Edman degradation), jossa peptidin aminopäästä saadaan joka syklillä yksi
aminohappo irtoamaan fenyylitiohydantoini(PTH-)-johdannaisena

ƒ PTH-aminohapot tunnistetaan nestekromatografialla (HPLC)

ƒ Hajotukseen ja tunnistukseen käytetään nykyään automaattilaitteita, joiden
herkkyys riittää polyakryyliamidigeeliltä eristettyjen “bändien” sekvenointiin
(muutama µg)
ƒ Laitteella pystytään määrittämään NH2-päästä max. 50 aminohappoa

Suurempien proteiinien aminohappojärjestys on määritettävä palasina.

Disulfidisidokset katkaistaan pelkistämällä tai asetyloimalla

Polypeptidi voidaan pilkkoa esim. spesifisten proteaasien tai kemikaalien,

esimerkiksi syanogeenibromidin, avulla.

Käytettäessä useampaa eri pilkkomistapaa saadaan koko sekvenssi koottua

päällekkäisyyksien avulla

Aminohapposekvenssi voidaan myös saada selville

ƒ sekvensoimalla vastaava geeni (nykyään tavallisin!)

ƒ massaspektrometrialla (pääasiassa proteiinitäplien tunnistukseen)

Aminohapposekvenssi antaa runsaasti tietoa proteiinin rakenteesta ja

toiminnasta. Tieto saadaan vertailulla rakenteeltaan ja funktioltaan tunnettujen
proteiinien kanssa.

Sekvenssiltään samankaltaiset proteiinit muodostavat proteiiniperheitä

Pieniä peptidejä ja proteiineja voidaan valmistaa synteettisesti

Ns. Merrifieldin synteesissä peptidi rakennetaan polystyreenihelmen pinnalle

aminohappo kerrallaan käyttäen aktivoituja ja suojattuja aminohappoja. Syklit
perustuvat siihen, että peptidisidoksen muodostuminen, ja suojaryhmien
poisto tapahtuvat eri olosuhteissa

Lopuksi peptidi irrotetaan hartsista hydrolyyttisesti ja puhdistetaan

kromatografisesti

Peptidisynteesiinkin on automaattisia laitteita saatavissa; lisäksi

peptidisynteesiä voi tilata palveluna

Pieniä biologisesti aktiivisia peptidejä ja niiden variantteja voidaan suoraan

syntetisoida tutkimusta varten

21
6. Proteiinien kolmiulotteinen rakenne

Puhdistetut proteiinit voidaan saada kiteytymään. Tämä osoittaa, että kaikki

samaa proteiinia olevat molekyylit ovat kolmiulotteiselta rakenteeltaan
samanlaisia.

Molekyylin atomien kolmiulotteista sijoittumista toistensa suhteen nimitetään

konformaatioksi.

Proteiinin stabiili konformaatio (natiivi konformaatio) on se, jolla on pienin

vapaa energia G

Purkautuneen (denaturoituneen) ja natiivin konformaation vapaan energian

ero on suhteellisen pieni, vain 20-65 kJ/mol vrt. kovalenttinen sidos 200-460
kJ/mol, ei-kovalenttinen sidos 4-30 kJ/mol

Natiivin konformaation määräävät lukuisat ei-kovalenttiset vuorovaikutukset

Hydrofobiset aminohapot muodostavat proteiinin sisuksen, joka ei ole

kontaktissa veteen

Proteiinin sisällä muodostuu mahdollisimman paljon vetysidoksia

Peptidisidos on tasomainen

Peptidisidoksessa C-N – sidoksella on osittainen kaksoissidosluonne.

Tämän seurauksena kiertyminen sidoksen ympäri on estynyt, ja sidos on

tasomainen

Peptidiketju voi kiertyä ainoastaan α-hiilen muodostamien C-N ja C-C

sidosten ympäri

Kiertokulmaa Cα-N sidoksen ympäri merkitään φ (fii)

.
Kiertokulmaa Cα-C sidoksen ympäri merkitään ψ (psii)

Proteiinin pääketjun konformaatio on periaatteessa täysin tunnettu, jos

kaikkien aminohappojen φ ja ψ -kulmien arvot tunnetaan

Peptidiketjun ja sivuryhmien steeristen esteiden vuoksi kaikki φ ja ψ -kulmien

yhdistelmät eivät ole mahdollisia.

Kuvaajaa, jossa on esitetty kunkin aminohappotähteen φ-kulma x-akselilla, ja

ψ-kulma y-akselilla kutsutaan Ramachandran’in kuvaajaksi. Kullakin
sekundäärirakenteella on oma paikkansa Ramachandranin kuvaajassa;
lisäksi kuvaaja toimii proteiinirakenteen selvittämisessä ”laaduntarkkailuna”.

22
 Oheisessa kuvaajassa on erään todellisen
proteiinin (lysotsyymin) Ramachandran’in
kuvaaja. Sinisellä merkityt alueet ovat ns.
”sallittuja alueita” joilla esiintyvillä φ ja ψ -
kulmien arvoilla useimmat aminohapot
mahtuvat esiintymään. Rasteilla on merkitty
muut aminohapot, neliöillä glysiinit.

Proteiinin sekundäärirakenteet

Sekundäärirakenteet ovat säännöllisiä ja yleisiä rakenteita proteiineissa.

Tärkeimmät ovat α-kierre ja β-levy

Sekundäärirakenteita stabiloivat peptidisidosten väliset vetysidokset.

α-kierre (α-helix)

• α-kierre syntyy, kun peptidiketju kiertyy spiraaliksi siten, että kunkin

aminohapon NH – muodostaa vetysidoksen neljän aminohapon päässä
olevan C=O – ryhmän kanssa

• kierteen nousu on 5,4 Å (0,54 nm), 3,6 aminohappotähdettä

• α-kierteeseen osallistuvien aminohappojen φ-kulma on -60° ja ψ-kulma

-45° − -50°

• α-kierre on teoriassa mahdollinen sekä oikea- että vasenkätisenä,

mutta vain oikeakätistä esiintyy luonnossa

• Proliini ei sovi α-kierteeseen, eikä myöskään pysty muodostamaan

stabilointiin tarvittavaa vetysidosta

• Myös glysiini on harvinainen α-kierteessä taipuisuutensa takia

23
 • Negatiivisesti varatut aminohapot kierteen aminopäässä, ja
positiivisesti varatut kierteen karboksipäässä stabiloivat kierrettä

β-levy (β-sheet)

β-levyssä vierekkäiset, suhteellisen suorat polypeptidiketjut sitoutuvat toisiinsa

vetysidoksin.

β-levy voi olla samansuuntainen (parallel) tai vastakkaissuuntainen

(antiparallel)

Lähekkäin oleviin β-levyihin mahtuvat parhaiten pienisivuketjuiset aminohapot

(Gly ja Ala)

β-käännös (β-turn)

Vastakkaissuuntaissa β-levyssä nauhojen välissä on usein β-käännös

Ketju kääntyy 180° neljän aminohapon matkalla, joista 2 keskimmäistä eivät

osallistu vetysidoksiin

Gly ja Pro ovat tavallisia β-käännöksissä

Proliinin harvinainen cis-konformaatio esiintyy β-käännöksissä

Sekundäärirakenteilla on luonteenomaiset kiertokulmat ja

aminohappokoostumus

24
Proteiinien tertiääri- ja kvaternäärirakenteet

Kuitumaiset ja globulaariset proteiinit

Kuitumaiset proteiinit ovat rakenteellisia komponentteja

Kuitumaiset proteiinit ovat liukenemattomia sekä kokonsa, että

hydrofobisuutensa takia

α-keratiini (hiukset, villa, kynnet, sarvikuonon sarvi…) rakentuu kahdesta

toistensa ympärille kiertyvästä α-kierteestä (coiled coil –rakenne)

Tällaisista yksiköistä koostuu protofilamentteja ja edelleen protofibrillejä

Kohdassa, jossa α-kierteet ovat kosketuksissa, on hydrofobisia aminohappoja

(Ala, Val, Leu…)

Keratiinin alayksikköjen välillä on disulfidisidoksia

Kollageenissa on poikkeuksellinen kolmen aminohappoketjun muodostama

kierteinen rakenne “collagen triple helix”

α-kierrettä loivempaa kierrettä kutsutaan α-ketjuksi

Kollageeni koostuu suurimmaksi osaksi aminohapoista Gly, Ala, Pro ja HyPro

(hydroksiproliini).

Glysiinit ovat kolmoiskierteen sisäpuolella

Kollageeni on poikkipinta-alaa kohden yhtä lujaa, kuin teräs.

Kollageenissa ketjujen välille tehdään kovalenttisia ristisidoksia

25
Nisäkkäillä on n. 30 erityyppistä kollageenia

Perinnölliset häiriöt kollageenin rakenteessa liittyvät eräisiin

sidekudossairauksiin.

Fibroiini koostuu tiiviisti pakkautuneista antiparalleelisista β-levykerroksista

Silkkiperhoset ja hämähäkit tuottavat tätä venymätöntä ja äärimmäisen lujaa

kuitua.

Globulaariset (pallomaiset) proteiinit

Globulaarisessa proteiinissa pitkä polypeptidiketju laskostuu kompaktiksi

rakenteeksi

Myoglobiini - ensimmäinen kolmiulotteiselta rakenteeltaan tunnettu

proteiini

Myoglobiini on lihaksen proteiini, jonka biologinen tehtävä on ilmeisesti toimia

hapen puskurivarastona.

Myoglobiini oli ensimmäinen proteiini, jonka kolmiulotteinen rakenne

selvitettiin röntgenkristallografialla.

Molekyylipaino 16700, 153 aminohappotähdettä

Prosteettisena ryhmänä hemi, rauta-porfyriinikompleksi

Kaskelotin myoglobiini kiteytyy helposti ja sitä oli (valaanpyynnin ollessa vielä

sallittua) runsaasti saatavissa.

Myoglobiini on hyvin kompakti proteiini; 45 X 35 X 25 Å.

26
Rakenne on n. 75%:sesti α-heliksiä. Heliksejä on proteiinissa 8.

Kolme helikseistä loppuu proliiniin (joka ei voi osallistua α-heliksiä ylläpitäviin

peptidiketjun sisäisiin vetysidoksiin).

Proteiinin sisäosa koostuu lähes kokonaan ei-polaarisista

aminohappopäätteistä, ja siellä on hyvin vähän tyhjää tilaa.

Ainoat polaariset aminohapot molekyylin sisäosissa ovat 2

sitoutumiskeskukseen kuuluvaa histidiiniä.

Hemi on sitoutuneena hydrofobiseen “taskuun”

Pelkkä hemi vesiliuoksessa ei sido happea, koska happi hapettaa sen raudan
ferromuotoon reaktiossa, johon liittyy kahden hemin ja happimolekyylin
muodostama hemi-happi-hemi -sandwich-kompleksi.

Hemin sitoutuminen myoglobiiniin estää tällaisen hapettumisen.

Proteiinin kolmiulotteisen rakenteen määrittäminen

Vaikka aminohapposekvenssi määrää kolmiulotteisen rakenteen, emme pysty

sitä laskemaan (vielä? ns. “folding problem”)

Kokeellisesti kolmiulotteinen rakenne määritetään röntgendiffraktiolla tai

NMR:llä (”ydinmagneettinen resonanssi”)

Röntgendiffraktiossa proteiini täytyy saada kiteytymään, mikä on usein

aikaavievää, eikä kaikille proteiineille onnistu lainkaan

Proteiinikiteessä on runsaasti vettä, joten rakenne ei paljonkaan poikkea

rakenteesta vapaassa nesteessä.

27
Kiteeseen kohdistetaan yksitaajuinen röntgen- tai synkrotronisäteily,
aallonpituudeltaan 0.7 – 1.5 Å (samaa suuruusluokkaa, kuin atomien välinen
etäisyys molekyylissä)

Röntgensäteily siroaa kiteestä ja muodostaa diffraktiokuvion

Ns. Fourier-analyysillä saadaan diffraktiokuviosta laskettua kolmiulotteinen ns.

elektronitiheyskartta, johon mallinnusohjelmalla sovitetaan proteiinin
rakennemalli

Yksi diffraktiokuvio ei riitä, vaan ns. vaiheongelman ratkaiseminen edellyttää,

että saadaan myös aikaan johdannainen, jossa proteiinikiteessä on
spesifisessä kohdassa proteiinia raskasmetalliatomi tai – atomeja

Pienten proteiinien tai proteiinidomeenien rakenne voidaan selvittää

myös NMR-tekniikalla

NMR tuottaa tietoa spinin omaavien atomien (1H, 13C) sijainnista toistensa
suhteen.

2-ulotteinen NMR tuottaa tietoa atomien keskinäisistä etäisyyksistä, joiden

perusteella voidaan ratkaista 3-ulotteinen rakenne

NMR-tekniikka tuottaa yleensä joukon lähisukuisia rakenteita, joiden voi

sanoa olevan “yhtä hyviä” likiarvoja todellisesta rakenteesta

NMR-rakenne on aito liuosrakenne.

Kun samojen proteiinien rakenteita on selvitetty röntgendiffraktiolla ja NMR:llä,

on havaittu niiden vastaavan hyvin toisiaan.

Jos aminohapposekvenssiltään samankaltaisen proteiinin kolmiulotteinen

rakenne tunnetaan, voidaan myös proteiinimallituksella (protein modelling)
tehdä suhteellisen luotettavia johtopäätöksiä

Muita pienten proteiinien tertiäärirakenteita

28
Sytokromi C on mitokondrion hengitysketjun osa, mp. 12400, 100 ah

Hemi prostettisena ryhmänä, kuten myoglobiinissa

α-kierrettä vain 39 %

Lysotsyymi on bakteerien soluseinää hajottava entsyymi, jota on runsaasti

mm. kananmunissa ja kyynelnesteessä

α-kierrettä 40 %, β-levyä 12 %

Ribonukleaasi on haiman erittämä ruuansulatusentsyymi, joka hajottaa

RNA:ta

α-kierrettä 26 %, β-levyä 35 %

Pienissä proteiineissa on usein kovalenttisia sidoksia vakauttamassa

rakennetta (cyt C:ssä hemi kovalenttisesti sitoutunut); erittyvissä proteiineissa
rikkisiltoja

Proteiineissa usein toistuvat rakenteet

Proteiini on helpompi hahmottaa, jos sitä ajatellaan sekundäärirakenne-

elementteinä ja niitä yhdistävinä jaksoina

29
(RdmC-proteiinin topologiakaavio)

Supersekundäärirakenteet, motiivit (motifs), foldit (folds) ovat usein toistuvia

sekundäärirakenteiden yhdistelmiä

Hairpin-β (RdmC:n β-nauhat β1 ja β2)

β-α-β -silmukka (RdmC:n β5, αC ja β6)

Monet isommat polypeptidit muodostavat useampia globulaarisia

alayksikköjä, joita sanotaan domeeneiksi (domains) Usein domeeni säilyttää
kolmiulotteisen rakenteensa silloinkin, kun se esim. proteolyyttisesti
katkaistaan irralleen muusta proteiinista.

Usein monidomeenisessa proteiinissa kukin biologinen funktio on yhden

domeenin toteuttama. Proteiinissa voi olla esimerkiksi substraatin tunnistava
domeeni ja katalyyttinen domeeni.

Motiivien yhdistelminä saadaan suurempia kokonaisuuksia. Esim. βαβ –

motiiveista voi rakentua TIM-tynnyri.

Proteiinien kolmiulotteisten rakenteiden luokittelu

Proteiinirakenteiden luokittelu perustuu sekundäärirakenteisiin, ja niiden

muodostamiin motiiveihin

SCOP (Structural Classification of Proteins) –tietokanta: neljä pääluokkaa, all

α, all β α/β ja α + β

30
Proteiinit, joilla on merkittävää sekvenssin samankaltaisuutta, muodostavat
proteiiniperheen. Proteiiniperheen jäsenet ovat evolutionaalisesti yhteistä
alkuperää.

Globulaaristen proteiinien kvaternäärirakenteet

Proteiinin koostumisella useista alayksiköistä saadaan etua

-kullekin alayksikölle voi olla oma geeninsä, joita säädellään tilanteen

mukaan, esimerkki: sikiöaikainen hemoglobiini
Varhaisella sikiöllä α-alayksikön tilalla on ζ (zeta) ja β-alayksikön
tilalla ensin ε, sitten γ joka vasta syntymän jälkeen korvautuu
β:lla

-alayksiköt voivat liittyä yhteen (assosioitua) ja irrota (dissosioitua)

tilanteen mukaan

-assosiaatiossa voidaan eliminoida ”huonot” alayksiköt; virheiden

korjaus

Protomeeri – monialayksikköisen proteiinin yksittäinen osa

Oligomeeri – muutamista protomeereistä koostuva proteiini
Multimeeri – lukuisista, jopa sadoista protomeereistä koostuva proteiini

Hemoglobiini koostuu neljästä (2 α, 2 β) myoglobiinin kaltaisesta happea

sitovasta alayksiköstä.

Samanlaisista alayksiköistä koostuvalla proteiinilla voi olla joko

kiertosymmetria (rotational symmetry) tai kierresymmetria (helical symmetry)

Kiertosymmetria voi olla syklistä tai dihedraalista

Hemoglobiinin kaksi αβ-paria ovat toistensa suhteen kiertosymmetrisessa C2

–asetelmassa

Virusten kuorissa löytyy monimutkaisempia rakennelmia, esim

ikosahedraalinen (20-tahokas)

Polypeptidiketjun kokoa rajoittaa geenin koko, ja proteiinisynteesikoneiston

virhefrekvenssi (n. 1/10 000 ah). Yleensä yli 100 000 daltonin proteiini
koostuu useista alayksiköistä

Proteiinien denaturaatio ja laskostuminen (folding)

Koska proteiinien rakennetta stabiloivat ei-kovalenttiset sidokset, olosuhteet ja

kemikaalit, jotka häiritsevät niitä, johtavat proteiinin rakenteen hajoamiseen,
denaturaatioon (Denaturoituessa polypeptidiketju siis pysyy ehjänä)

31
Lämpötilan nosto yleensä johtaa proteiinin denaturaatioon. Denaturaatio voi
tapahtua äkillisesti, kun ylitetään kynnyslämpötila, mikä osoittaa, että
kyseessä on ko-operatiivinen prosessi

Denaturaation aiheuttavat myös pH:n muutokset, orgaaniset liuottimet

(heikentävät hydrofobisia vuorovaikutuksia) tietyt suolat ja yhdisteet (joita
kutsutaan kaotrooppisiksi), detergentit (hydrofobiset vuorovaikutukset)

Denaturaation seurauksena proteiini menettää biologisen aktiivisuutensa

Joidenkin proteiinien (varsinkin puhtaiden) denaturaatio on reversiibeli

Renaturaatio osoittaa aminohapposekvenssin määräävän

kolmiulotteisen rakenteen

Proteiini, esim ribonukleaasi voidaan denaturoida konsentroidulla

urealiuoksella, johon on lisätty merkaptoetanolia pelkistämään rikkisillat

Kun urea ja merkaptoetanoli poistetaan hitaasti, proteiini palautuu

alkuperäiseen, entsymaattisesti aktiiviseen muotoonsa

Myös alkuperäiset rikkisillat muodostuvat

(Jos proteiinin rikkisiltojen annetaan muodostua poistamatta ureaa, ne

muodostuvat satunnaisesti, ja urean poistosta huolimatta ei aktiivista
konformaatiota enää löydy)

Sama koe on onnistuneesti tehty myös kemiallisesti syntetisoidulla

ribonukleaasilla.

Polypeptidit laskostuvat vaiheittain

Pelkästään todennäköisyyksiä ajatellen proteiinin oikean kolmiulotteisen

rakenteen löytyminen on mahdotonta! (Lewinthalin paradoksi)

Koska se kuitenkin tapahtuu (muutamassa sekunnissa), pelkkä

todennäköisyyksien arviointi on ilmeisesti virheellistä

Tietokonesimulaatioiden mukaan muodostuvat ensin sekundäärirakenteet.

Niiden muodostuminen on ko-operatiivista (yhden sidoksen muodostuminen
edistää seuraavan muodostumista)

Välimuotona on arveltu esiintyvän osittain laskostuneen, mutta vielä

epästabiilin rakenteen, josta on käytetty nimitystä “sula möykky” (molten
globule)

Jotkut mutaatiot saattavat aiheuttaa pikemminkin vian proteiinin

laskostumisprosessissa, kuin lopullisessa rakenteessa. Proteiini jää ikään
kuin “roikkumaan” virheelliseen rakenteeseen.

32
Todennäköisesti evoluutiossa valintapaine kohdistuu paitsi oikeaan
loppurakenteeseen (energiaminimi), myös nopeaan laskostumiseen, eli että
proteiini “löytää” lopullisen konformaationsa nopeasti!

Joitain proteiineja täytyy auttaa laskostumisessa

Monien proteiinien oikeaa ja nopeaa laskostumista auttavat soluissa

kaperoneiksi (molecular chaperones) kutsutut proteiinit

Kaperonit ovat oikeastaan proteiinien laskostumista katalysoivia entsyymejä.

Hsp70 – ryhmän proteiinit (Heat Shock Protein 70 000 dalt) sitoutuvat

laskostumattomien proteiinien hydrofobisiin alueisiin estäen niiden virheellisen
aggregoitumisen

Hsp70 – proteiinit edistävät proteiinien oikeaa laskostumista kuluttaen samalla

ATP:tä

Chaperoniinit (GroEL/GroES) puolestaan muodostavat monimutkaisen

koneiston, jonka sisään puutteellisesti laskostunut proteiini sitoutuu
“hierottavaksi”

7. Proteiinien toiminta

Ligandi

Kun proteiini sitoo reversiibelisti, yleensä ei-kovalenttisilla vuorovaikutuksilla,

toisen molekyylin, jälkimmäistä kutsutaan ligandiksi

Ligandi sitoutuu proteiinissa spesifiseen sitoutumiskohtaan, joka on ligandille

komplementaarinen, niin että mahdollisimman paljon vuorovaikutuksia voi
muodostua

Proteiinien suuri spesifisyys ligandien sitomisessa perustuu juuri

sitomiskohdan komplementaarisuuteen

Proteiinin kolmiulotteinen rakenne voi muuttua ligandin sitoutumisen

yhteydessä (“induced fit”)

Esimerkki ligandin sitoutumisesta: happea sitovat proteiinit

Happi voi sitoutua hemiin

• Pelkkä hemi vesiliuoksessa ei sido happea, koska happi hapettaa sen

raudan ferromuotoon reaktiossa, johon liittyy kahden hemin ja
happimolekyylin muodostama hemi-happi-hemi -sandwich-kompleksi.
• Hemin sitoutuminen myoglobiiniin estää tällaisen hapettumisen.

33
• Malliyhdiste “picket fence iron porphyrin”, jossa sandwich-kompleksin
muodostuminen on steerisesti estetty, sitoo happea yhtä hyvin, kuin
myoglobiini.

Myoglobiinin rakenne mahdollistaa hiilimonoksidin hylkimisen

• Hiilimonoksidi CO sitoutuisi eristetyyn hemiin 35 000 kertaa

voimakkaammin, kuin happi.
• Koska elimistössä esiintyy endogeenista CO:ta pieniä määriä (sitä syntyy
mm. hemin kataboliassa), se myrkyttäisi hemin kokonaan.
• Myoglobiinin rakenteeseen kuuluva proksimaalinen histidiini E7 pakottaa
sekä hapen, että hiilimonoksidin sitoutumaan vinoon asentoon, jolloin CO
sitoutuu “vain” 200 kertaa voimakkaammin, kuin happi. Tämä riittää
estämään myoglobiinin saturoitumisen endogeenisella CO:lla, mutta
ulkopuolinen CO pystyy silti myrkyttämään proteiinin.

Hemoglobiinin alayksiköt ovat myoglobiinin kaltaisia

• Hemoglobiinin yksittäiset alayksiköt ovat käytännöllisesti katsoen

samanlaiset kolmiulotteiselta rakenteeltaan toistensa ja myoglobiinin
kanssa.
• Yllättäen näillä kolmella samanrakenteisella polypeptidiketjulla on vain 24
konservoitunutta aminohappoa 141:stä.
• Globin fold on nimitys tälle hyvin konservoituneelle kolmiulotteiselle
rakenteelle.
• Tunnetaan yli 60 globin fold-rakenteista proteiinia; näissä vain 9
aminohappoa on hyvin konservoituneita.
• Molekyylin sisällä nonpolaariset aminohapot ovat vaihtuneet toisiin
nonpolaarisiin aminohappoihin.
• Molekyylin pinnalla olevat polaariset aminohapot vaihtelevat sangen
vapaasti toisiin polaarisiin aminohappoihin.

Hemoglobiinin rakenne muuttuu hapen sitomisen yhteydessä

• Oksihemoglobiinin konformaatiota nimitetään R-konformaatioksi ja

deoksihemoglobiinia T-konformaatioksi.
• Kun happi sitoutuu, hemin rauta siirtyy n. 0.4 Å lähemmäs porfyriinitasoa.
• Rauta vetää mukanaan siihen koordinoituneen histidiinin ja F-heliksin,
johon se kuuluu.
• Tästä seuraa konformaationmuutos, joka johtaa toisen αβ-
alayksikköpareista kiertymiseen toisen parin suhteen 15 astetta ja
siirtymiseen 0.8 Å
• Merkittävimmät muutokset tapahtuvat α1β2 ja α2β1 -kontaktipinnassa.

Hemoglobiini on allosteerinen proteiini

• Allosteerisessa proteiinissa ligandin sitoutuminen vaikuttaa toisen

samassa proteiinissa olevan sitoutumiskohdan ominaisuuksiin.

34
• Allosteerisen proteiinin kolmiulotteinen rakenne muuttuu ligandin
sitoutumisen johdosta
• Hapen sitoutuminen hemoglobiiniin on ko-operatiivista.
• Hemoglobiinin happiaffiniteetti riippuu pH:sta
• Hemoglobiini sitoo CO2:ta, ja CO2:n sitominen alentaa affiniteettia hapelle.
• Orgaaniset fosfaatit, kuten 2,3-bisfosfoglyseraatti, säätelevät hemoglobiinin
happiaffiniteettia
• Ko-operatiivista tilanmuutosta selitetään joko sekventiaalisella mallilla tai
MWC-mallilla (Monod, Wyman, Changeux); jälkimmäinen malli ilmeisesti
kuvaa todellisuutta paremmin, ja siinä proteiinin kaikki alayksiköt vaihtavat
tilaa samanaikaisesti.

Ko-operatiivisuus ja Hill’in kerroin

Merkitään Y:llä sitä osuutta hemoglobiinin kokonaismäärästä, joka on hapella

saturoitunutta (0≤Y≤1). Jos hapen sitoutumisen reaktioyhtälöksi oletetaan:

Hb(O2)n ↔ Hb + nO2

log (Y/(1-Y)) = n log pO2 + n log P50

Jos piirretään kuvaaja, jonka X-akseli on log (pO2) ja Y-akseli log (Y/(1-Y))
saadaan suora, jonka kulmakerroin = ko-operatiivisesti sitoutuvien
molekyylien lukumäärä. Myoglobiinille tämä Hill’in kerroin on 1;
hemoglobiinille 2.8.

• Hemoglobiinin hapen sitoutumisen ko-operatiivisuus tekee siitä tehokkaan

kuljettajan; keuhkoissa hemoglobiini saturoituu lähes kokonaan, kun taas
lihasten kapillaareissa siitä irtoaa lähes kaikki happi.

Bohrin ilmiö

• Hemoglobiini kuljettaa hapen lisäksi hiilidioksidia ja vetyioneja

• pH:n lasku alentaa hemoglobiinin happiaffiniteettia (Bohrin ilmiö).
• Hiilidioksidipitoisissa periferaalisissa kapillaareissa vallitseva alempi pH
johtaa hapen tehokkaampaan irtoamiseen hemoglobiinista.
• Myös hiilidioksidi (pH:sta riippumatta) alentaa happiaffiniteettia.
• Vastavuoroisesti korkea happipitoisuus keuhkoissa edistää vetyionien ja
hiilidioksidin dissosioitumista hemoglobiinista

Bisfosfoglyseraatti määrää hemoglobiinin hapensitomiskyvyn

• Punasoluissa on bisfosfoglyseraattia (BPG) molaarisesti suunnilleen yhtä

paljon, kuin hemoglobiinia.
• BPG nostaa hemoglobiinin P50:n 1 mmHg:sta 26 mmHg:hen

35
• BPG alentaa happiaffiniteettia sitoutumalla alayksikköjen keskellä
sijaitsevaan onkaloon.

8. Entsyymit

Entsyymit ovat biokemiallisia katalyyttejä

Poislukien muutamat katalyyttisesti aktiiviset RNA:t, entsyymit ovat proteiineja

Useissa entsyymeissä on ei-polypeptidirakenteisia katalyyttisiä ryhmiä,

kofaktoreja, joita kutsutaan koentsyymeiksi tai prosteettisiksi ryhmiksi

Prosteettinen ryhmä on tiukasti, jopa kovalenttisesti kiinni entsyymissä, eikä

irtoa normaalisti.

Kofaktorit ovat yleensä metalli-ioneja tai vitamiineista johdettuja orgaanisia

yhdisteitä

Entsyymien luokitus

1. Oksidoreduktaasit -elektronien siirto

2. Transferaasit -ryhmien siirto

3. Hydrolaasit -sidosten katkaiseminen liittämällä vesimolekyyli

4. Lyaasit -additio kaksoissidoksiin, tai kaksoissidosten muodostus

eliminaatiolla

5. Isomeraasit -ryhmien siirto molekyylin sisäisesti

6. Ligaasit -C-O, C-S, C-C ja C-N -sidosten muodostus ATP:hen

kytketyillä kondensaatioreaktioilla

Jokaisella entsyymillä on EC (Enzyme commission) –numero

(ks. esim. http://au.expasy.org/enzyme/enzyme-byclass.html)

Reaktiota

ATP + D-glukoosi → ADP + D-glukoosi 6-fosfaatti

katalysoiva entsyymi on siten EC 2.7.1.1, ATP:glukoosi-fosfotransferaasi eli

heksokinaasi.

Miten entsyymit toimivat

Katalyysi tapahtuu entsyymin pinnalla olevassa “taskussa”, josta käytetään

nimitystä aktiivinen keskus.

36
Sitoutumiskohdan muodostavat vain muutamat aminohapot, jotka voivat olla
aivan eri kohdissa proteiinin aminohapposekvenssissä.

Loppuosan proteiinista voi katsoa olevan ainoastaan väline näiden tärkeiden

aminohappojen tuomiseen yhteen tarkoin määrättynä rakennelmana.

Molekyyliä tai molekyylejä, jotka sitoutuvat aktiiviseen keskukseen, ja joiden

reaktiota entsyymi katalysoi, nimitetään substraatiksi/substraateiksi.

Entsyymit voivat nopeuttaa reaktioita, mutta eivät tee niitä

energeettisesti edullisemmiksi. Reaktion tasapainovakio ei voi muuttua.

• Entsyymi väistämättä nopeuttaa “taaksepäin” -reaktiota yhtä paljon kuin

“eteenpäin” -reaktiotakin
• Energeettisesti epäedullinen reaktio saadaan kuitenkin tapahtumaan
kytkemällä se ATP:n hydrolyysiin tai muuhun energeettisesti edulliseen
reaktioon

Reaktion tasapainovakio riippuu reaktion standardivapaaenergian

muutoksesta:

∆G’° = -RT ln K’eq

Huolimatta siitä, että reaktion tasapaino olisi voimakkaasti lopputuotteiden

puolella, ei reaktio välttämättä tapahdu havaittavalla nopeudella.

Reaktion nopeus riippuu “energiamuurista”, joka reagoivien yhdisteiden täytyy

ylittää, jotta reaktio voisi tapahtua. Tähän transitiotilaan liittyvää
vapaaenergian muutosta ∆G‡ nimitetään aktivaatioenergiaksi.

Katalyytit nopeuttavat reaktioita alentamalla aktivaatioenergiaa.

Yksinkertaiselle reaktiolle

S→P

reaktionopeus

V = k[S]

Transitiotilateorian mukaan

k = (kT/h)e-∆G‡/RT

(jossa k = Boltzmannin vakio ja h = Planckin vakio)

37
Entsyymien yleisiä toimintaperiaatteita

Entsyymi sitoo substraatin ei-kovalenttisilla vuorovaikutuksilla

Sitomisenergialla on suuri osuus aktivaatioenergian alentamisessa

Suurin sitoutumisenergia liittyy kuitenkin entsyymin ja transitiotilan väliseen

kompleksiin

Entsyymi stabiloi transitiotilaa siten, että sen sitoutuminen entsyymiin on

tiukempaa (sitoutumisvakio suurempi) kuin substraattien tai tuotteiden =>
aktivaatioenergia alenee

Voidaan laskea, että tyypillisen entsymaattisen reaktion nopeudenlisäyksen

saavuttaminen edellyttää transitiotilan sitomista 60 – 100 kJ/mol veroisesti

Tyypillisen ei-kovalenttisen sidoksen syntymiseen liittyvä vapaaenergian

muutos on 4–30 kJ/mol

Edelleen, katalyysin mekanismeihin kuuluvat

1) entropian vähennys; reagoivat yhdisteet sidotaan entsyymiin reaktion

tapahtumisen kannalta edullisessa asennossa
2) molekyyliä stabiloivan hydraatiokerroksen poistuminen
3) substraatin muodon muuttaminen
4) katalyyttisten ryhmien tuominen oikeaan orientaatioon reagoiviin sidoksiin
nähden

Spesifiset katalyyttiset ryhmät

ƒ Happo-emäskatalyysi
ƒ Kovalenttinen katalyysi
ƒ Metalli-ionien katalyysi

Vesi tai entsyymin hapan tai emäksinen ryhmä voi stabiloida varattua
välituotetta luovuttamalla tai ottamalla vastaan protonin (H+).
Entsyymin ryhmän toimiessa happo-emäskatalyyttinä puhutaan yleisestä
happo-emäskatalyysistä.

Protonin siirrot ovat tavallisimpia biokemiallisia reaktioita.

Kovalentissa katalyysissä substraatti muodostaa tilapäisesti sidoksen

entsyymin nukleofiilisen sivuketjun kanssa.

Metalli-ioni voi varauksensa ansiosta polarisoida substraattia, tai

hapettua/pelkistyä substraatin kustannuksella.

Lähes kolmasosa entsyymeistä tarvitsee metalli-ionin tai -ioneja ollakseen

katalyyttisesti aktiivisia

38
Entsyymikinetiikan perusteita

Entsyymikinetiikka tutkii entsyymin vuorovaikutusta ligandiensa kanssa

mittaamalla ligandien konsentraation vaikutusta entsyymin katalysoiman
reaktion nopeuteen.

Michaelis-Menten yhtälö

Tarkastellaan mahdollisimman yksinkertaista entsyymireaktiota, jossa

entsyymi muuttaa substraatin S tuotteeksi P (Kyseessä on siis isomeraasi...).
Ensimmäinen yksinkertaistus, joka tässä aina tehdään, on se, että mitataan
entsyymireaktion ns. alkunopeutta. Tämä tarkoittaa, että [P]=0:

Alkunopeuden käsitteestä

Käytännössä entsyymireaktion tuotteen muodostuminen voi

tapahtua esim. seuraavan käyrän mukaisesti:

Aluksi reaktio on epälineaarinen (burst- tai lag-vaihe) johtuen mm.

reagenssien sekoittumisesta, aktiiviseen keskukseen sitoutumisen
kinetiikasta y.m. Myöhemmin reaktio alkaa taas kaartua substraatin
konsentraation alenemisen ja tuotteen konsentraation
lisääntymisen johdosta. Alkunopeus on yllä olevassa kuvaajassa
esitetty katkoviivalla.

Alkunopeustilanteessa V= k3[ES]. Vakaassa tilassa (steady state) ES ei

muutu. Tällöin

k1[E][S]=(k2+k3)[ES]

39
Tämä on Michaelis -Menten yhtälö. Se on samanlainen kuin eräiden
muidenkin saturoituvien prosessien yhtälöt, merkittävimmin samanlainen kuin
Langmuir’in yhtälö, joka kuvaa aineen absorptiota kiinteän faasin pintaan

Jos [S] = KM , V= ½ Vmax . KM on siis substraattikonsentraatio, jolla

reaktionopeus on puolet maksimista.

Jos Michaelis-Menten kaavassa molemmista puolista otetaan käänteisarvo

saadaan Lineweaver-Burk’in kaava:

40
Tämän kaavan merkitys on siinä, että jos Michaelis-Menten kinetiikkaa
noudattavalla entsyymillä mitataan reaktionopeuksia eri
substraattikonsentraatioilla, ja piirretään kuvaaja, jossa X-akselilla on 1/[S] ja
Y-akselilla 1/V, saadaan suora, joka leikkaa Y-akselin kohdassa 1/Vmax ja X-
akselin kohdassa -1/KM:

(Käytännössä Lineweaver-Burk’in kuvaaja ei ole paras mahdollinen entsyymin

kineettisten parametrien määrittämiseen; suositeltavampaa on käyttää Eadie-
Hofstee’n tai Hanes’in kuvaajia.)

Jos k3 on paljon pienempi kuin k2 (kuten usein on) KM on ~ ES-kompleksin

dissosiaatiovakio. Se kuvaa siis substraatin sitoutumisen lujuutta aktiiviseen
keskukseen.

Jos määritellään yksinkertaisen entsyymin tapauksessa vakio

kcat =Vmax/ET

saadaan luku, joka kertoo kuinka monta substraattimolekyyliä yksi

entsyymimolekyyli muuttaa aikayksikössä (turnover number). Tyypillinen kcat
on esim. 1000/s.

Jos halutaan verrata kahden entsyymin katalyyttistä tehokkuutta,

käyttökelpoinen suure on suhde kcat/KM, jota toisinaan kutsutaan
spesifisyysvakioksi (specificity constant). Parhaiden entsyymien kcat/KM –
suhde on n. 108 M-1s-1, jolloin rajoittavana tekijänä on substraattimolekyylien
diffuusio.

Monisubstraattiset entsyymit

Kun entsyymi katalysoi useamman, kuin yhden molekyylin (yleensä kahden)

keskinäistä reaktioita, tilanne on paljon monimutkaisempi.

a) Reaktiossa syntyy ternäärikompleksi (molemmat substraatit sitoutuneet

yhtä aikaa entsyymiin)
-substraatit voivat liittyä mielivaltaisessa järjestyksessä
-substraattien on liityttävä määrätyssä järjestyksessä

41
b) Reaktiossa ei synny ternäärikompleksia
-ensimmäinen substraatti modifioi entsyymiä, joka sitten modifioi toista
substraattia
-ping-pong –mekanismi

Jos piirretään Lineweaver-Burk’in kuvaajat eri substraattikonsentraatioilla,

voidaan a) ja b) erottaa toisistaan.

Entsyymi-inhibitio ja kinetiikka

Monet molekyylit inhiboivat entsyymien aktiivisuutta. Tällainen inhibitio voi olla

• fysiologista (esim. metaboliateiden säätelyyn liittyvää)

• epäfysiologista (lääkeaineet, myrkyt)

Inhibitio voi olla irreversiibeliä tai reversiibeliä

• Irreversiibeli inhibitio perustuu siihen, että inhibiittori sitoutuu entsyymiin

hyvin tiukasti, joko kovalenttisesti tai ei-kovalenttisesti. Esimerkkinä seriini-
entsyymejä inaktivoiva di-isopropyylifluorofosfaatti, DIPF

• Reversiibeli inhibitio merkitsee sitä, että inhibiittori myös dissosioituu

entsyymistä nopeasti.

Kompetitiivinen (kilpaileva) inhibitio merkitsee, että inhibiittori sitoutuu

aktiiviseen keskukseen siten, että se estää substraatin sitoutumisen
samanaikaisesti. Tällaiset inhibiittorit ovat tyypillisesti substraattia
rakenteeltaan muistuttavia molekyylejä

Unkompetitiivinen inhibitio merkitsee sitä, että inhibiittori ja substraatti

voivat sitoutua entsyymiin samanaikaisesti, mutta entsyymi, johon on
sitoutunut inhibiittori, on katalyyttisesti inaktiivinen

Kun piirretään Lineweaver-Burk -kuvaajat eri inhibiittorikonsentraatioiden

läsnäollessa saadaan normaalisti selville inhibition tyyppi ja inhibitiovakio, eli
inhibiittorin sitoutumisvakio entsyymiin. Kun inhibiittori voi olla esim.
potentiaalinen lääkeaine, inhibitiovakion selvittäminen on tärkeä tieto
lääkekehityksessä.

Entsyymiaktiivisuus riippuu pH:sta

Kun sekä substraatin sitomiseen, että katalyysiin, osallistuu ionisoituvia

ryhmiä, ei ole yllättävää, että entsyymit toimivat optimaalisesti vain tietyllä pH-
alueella. Aktiivisuus-pH – käyrä antaa myös vihjeitä siitä, millaiset ryhmät
osallistuvat katalyysiin.

42
Esimerkkejä entsyymireaktioista

Kymotrypsiini

Kymotrypsiini on proteaasi, ruuansulatusentsyymi (M=25 000)

• Proteiini syntetisoidaan yhtenä ketjuna, entsymaattisesti inaktiivisena

kymotrypsinogeeninä, josta proteolyyttisesti syntyy aktiivinen entsyymi
(zymogeeniaktivaatio)
• Proteiinin rakenne koostuu pääasiassa β-levystä
• Kymotrypsiini katalysoi proteiinien hydrolyysiä aromaattisten ja suuren
hydrofobisen sivuketjun omaavien aminohappojen karboksipuolelta
• Kymotrypsiini toimii myös esteraasina hydrolysoiden erilaisia estereitä

Kovalenttinen välituote

• Jos kymotrypsiinillä hydrolysoidaan kromogeenistä (värillistä yhdistettä

tuottavaa) esteriä, esim p-nitrofenyyliasetaattia, havaitaan että reaktio
etenee aluksi lyhyen aikaa nopeasti (burst phase), mutta vakiintuu sitten
hitaammalle tasolle
• Ilmiö johtuu siitä, että reaktiossa muodostuu kovalenttisesti sitoutunut
välituote, jonka hydrolyysi on reaktion nopeutta rajoittava vaihe, mutta
esterin alkoholiosaa (jota mitataan) vapautuu aluksi nopeammin, kunnes
lähes kaikki entsyymi on asyloitu, ja saavutetaan vakaa tila (steady state)

E+S ES E -P 2 E

P1 P2
• Asyloitu entsyymi voidaan eristää, jolloin havaitaan asyyliryhmän olevan
esteröityneenä Ser-195:een
• Samaan, poikkeuksellisen reaktiiviseen seriiniin liittyy myös esim.
proteaasinestäjä di-isopropyylifluorofosfaatti DIPF; kymotrypsiinissä on 27
seriiniä, mutta vain tämä reagoi
• DIPF inhiboi myös trypsiiniä, elastaasia, trombiinia, subtilisiinia
(seriiniproteaaseja) ja asetyylikolinesteraasia (=> hermokaasuvaikutus)

Katalyyttinen triadi

• Seriini on normaalisti ei-reaktiivinen aminohappo, mutta

seriiniproteaaseissa seriinin, histidiinin ja asparagiinihapon muodostama
katalyyttinen triadi tekee sen poikkeuksellisen aktiiviseksi
• Histidiini pystyy ottamaan vastaan seriinin hydroksyylivedyn vetyionina,
jolloin happi pystyy toimimaan voimakkaana nukleofiilinä
• Aspartaatin negatiivinen varaus stabiloi näin syntyneen histidiinin
positiivisen varauksen

43
 Ser195
HO CH2

N
His57
CH2
N
H

-O Asp102
C CH2
O

Entsyymin seriinin asylaatio ja deasylaatio

Histidiinin vastaanottaessa seriinin protonin, seriini hyökkää nukleofiilinä

peptidisidoksen karbonyylihiileen

Syntyy lyhytikäinen negatiivisesti varautunut välituote, jota stabiloi

entsyymissä oleva ns. “oxyanion hole”

N-terminaalinen peptidi irtoaa entsyymistä, ja C-terminaalinen osa jää

esterisidokseen Ser195:een

Seuraavaksi vesimolekyyli hyökkää nukleofiilisesti karbonyylihiileen, ja

lopputuloksena C-terminaalinen peptidi hydrolysoituu irti entsyymistä.

Heksokinaasi

Heksokinaasi katalysoi reaktiota:

CH2OH
CH2OPO32-
H O H
H H O H
OH H H
Mg2+ . ATP + Mg2+ . ADP + OH H
OH OH
OH OH
H OH
H OH

Periaatteessa fosfaattiryhmän siirto glukoosin C-6 hydroksyyliin on

samanlainen reaktio, kuin fosfaattiryhmän siirto vedelle so. hydrolyysi.

Heksokinaasi fosforyloi kuitenkin 106 kertaa tehokkaammin glukoosia, kuin

vettä.

Heksokinaasin konformaatio muuttuu sen sitoessa glukoosin (induced fit) ja

ATP:n. ATP:n ja veden sitoutuessa tätä konformaatiomuutosta ei tapahdu,
aktiivinen keskus ei muodostu, eikä fosfaatin siirtoa vedelle tapahdu.

44
Jos glukoosi korvataan stereokemiallisesti samanlaisella, mutta ilman 6-hiiltä
olevalla xyloosilla, heksokinaasi alkaa hydrolysoida ATP:tä, koska xyloosi
yhdessä ATP:n kanssa muuttaa entsyymin aktiiviseen konformaatioon, mutta
ei ole fosforyloitavissa

Enolaasi

Enolaasi on yksi glykolyysin entsyymeistä (kuten heksokinaasikin), ja

katalysoi 2-fosfoglyseraatin dehydraatiota fosfoenolipyruvaatiksi:

O -
O O -
O
C
C
H C O PO32-
C O PO2-
3 + H2O
HO CH2
CH2

Enolaasissa on aktiivisessa keskuksessa kaksi Mg2+ -ionia, jotka polarisoivat

molekyyliä sitoutumalla karboksyyliryhmään. Lys345 vastaanottaa protonin
molekyylin 2-hiileltä ja Glu211 luovuttaa protonin poistuvalle vesimolekyylille.

Säädellyt ensyymit

Aineenvaihduntateiden säätelyyn osallistuu entsyymejä, joiden aktiivisuus

riippuu toisten molekyylien konsentraatioista.

Yleensä kyseessä ovat tällöin allosteeriset entsyymit

45
Allosteeriset entsyymit ovat keskeisessä asemassa metabolian säätelyssä;
entsyymissä on esim. reaktioketjun lopputuotteelle sitoutumiskohta, johon
sitoutuminen muuttaa entsyymin katalyyttisesti inaktiiviseen tilaan.
Sitoutumiskohta on erillään aktiivisesta keskuksesta.

Biosynteesireaktioiden ensimmäistä vaihetta katalysoiva entsyymi on usein

lopputuotteen inhiboima

Inhibitio on reversiibeli, turvaa nopean uudelleen käynnistyksen

Yleinen esim. aminohappojen biosynteesin säätelyssä

Allosteeriset entsyymit eivät noudata Michaelis-Menten -kinetiikkaa, vaan

reaktionopeuden riippuvuus substraattikonsentraatiosta on yleensä
sigmoidaalinen. Substraatin sitoutuminen entsyymiin on ko-operatiivista.

Entsyymien kovalenttinen modifikaatio säätelykeinona

Lukuisien proteiinien aktiivisuutta säädellään reversiibelin fosforylaation

avulla.

Sekä fosforylaatio -fosfaattiryhmän siirto kinaasin toimesta ATP:ltä- että

fosforylaation poisto -hydrolyysi fosfataasin toimesta- ovat solun olosuhteissa
irreversiibelejä rektioita.

• Fosforyyliryhmä lisää proteiiniin kaksi negatiivista varausta, jotka

mahdollistavat elektrostaattisten vuorovaikutusten muodostumisen
• Fosforyyliryhmä pystyy muodostamaan 3 vetysidosta
• Fosforylaatio ja defosforylaatio voivat olla äärimmäisen nopeita tai hitaita
reaktioita
• Fosforylaatioon voi liittyä suuri vahvistus, koska yksi ainoa aktivoitunut
proteiinikinaasi voi fosforyloida satoja kohdeproteiineja lyhyessä ajassa

Kinaaseja on sekä erittäin spesifisiä että epäspesifisiä

Proteolyyttinen aktivointi

Monet entsyymit syntetisoidaan inaktiivisina prekursoreina, joista syntyy

aktiivinen entsyymi vasta, kun niistä on katkaistu spesifisesti yksi tai useampi
peptidisidos. Tällaista prekursoria nimitetään zymogeeniksi tai proentsyymiksi,
ja tällaista ilmiötä zymogeeniaktivaatioksi.

1. Ruuansulatuksen proteaasit syntetisoidaan zymogeeneina mahalaukussa

ja haimassa
2. Veren hyytyminen perustuu toisiaan kaskadina aktivoiviin
proteaasizymogeeneihin
3. Eräät proteiinihormonit, kuten insuliini, ovat proteolyyttisen prosessoinnin
tuotteita

46
4. Kuitumainen kollageeni syntyy zymogeeniaktivaation kautta liukoisesta
prokollageenista
5. Yksilönkehitykseen kuuluu usein proteolyyttisten prosessien aktivoimia
vaiheita; esim. sammakon muodonvaihdoksessa prokollagenaasi
aktivoidaan kollagenaasiksi, joka hajottaa hännän kollageenikuidut.

Kymotrypsinogeeni

• Kymotrypsiini syntetisoidaan haimassa kymotrypsinogeeninä.

• Proteiini eritetään solun sisällä oleviin membraanin ympäröimiin
rakkuloihin, zymogeenigranuloihin, jotka hormonaalisen vaikutuksen
seurauksena tyhjentävät sisältönsä haimatiehyeeseen.
• Trypsiini katkaisee aminohappojen 15 ja 16 välillä olevan sidoksen, jolloin
syntyy entsymaattisesti aktiivinen π-kymotrypsiini.
• Kymotrypsiini itse poistaa vielä aminohapot 14-15 ja 147-148, jolloin syntyy
aktiivinen α-kymotrypsiini.
• Kymotrypsiinin aktiivisen keskuksen lopullinen konformaatio syntyy vasta
zymogeeniaktivaation seurauksena.

Ruuansulatusentsyymien aktivaatio

• Trypsiini aktivoi muut haiman ruuansulatusproteaasit; trypsiinin,

kymotrypsiinin, elastaasin ja karboksipeptidaasin
• Ohutsuolen tuottama enteropeptidaasi aktivoi ketjun alkuunpääsemiseksi
tarvittavan trypsiinin, joka sitten aktivoi lisää trypsiiniä, ja muita entsyymejä
• Pepsiini aktivoi itse itsensä alhaisessa pH:ssa.

9. Hiilihydraatit

monosakkaridit – disakkaridit - oligosakkaridit – polysakkaridit

Monosakkaridit (CH2O) 3-7

ƒ aldoosit (C=O –ryhmä ketjun päässä) vs ketoosit (C=O –ryhmä

useimmiten hiilessä 2)
ƒ heksoosit (6 hiiltä) vs. pentoosit (5 hiiltä)
ƒ pyranoosit (6-rengas) vs furanoosit (5-rengas)

Yksinkertaisin monosakkaridi on glyseraldehydi. 2-hiili on kiraalinen, joten on

olemassa D- ja L-glyseraldehydi:

47
 D-glyseraldehydi L-glyseraldehydi
Fischerin projektio
O H O H
C C
H C OH HO C H
CH2OH CH2OH

Perspektiivikuva
O H O H
C C
H C OH HO C H
CH2OH CH2OH

Muut monosakkaridit nimetään niin, että jos karbonyylihiilestä kauimpana

olevan hiilen konfiguraatio on sama, kuin D-glyseraldehydissä, molekyyli on
D-sarjaa, ja päinvastainen konfiguraatio L-sarjaa.

Fischerin projektiossa D-sarjassa hydroksyyli on oikealla.

Muiden hiilien konfiguraatio määrää monosakkaridin nimen. Näin ollen on

olemassa kaksi neljähiilistä (tetroosia) aldoosia (ja molemmista D- ja L-
muodot), neljä viisihiilistä (pentoosia), 8 kuusihiilistä (heksoosia)…

Ketooseissa on yksi kiraalinen hiili vähemmän.

Kaksi monosakkaridia, jotka eroavat vain yhden hiilen konfiguraation suhteen,

ovat toistensa epimeerejä.

Sykliset rakenteet

Useimmat monosakkaridit ovat enimmäkseen rengasmuodossa, joka syntyy

molekyylin karbonyyliryhmän reagoidessa saman molekyylin jonkin
hydroksyyliryhmän kanssa, jolloin muodostuu hemiasetaali tai hemiketaali.

Riippuen siitä, minkä hydroksyylin kanssa reaktio tapahtuu, muodostuu

viisirengas (furanoosi) tai kuusirengas (pyranoosi), joista kuusirengas on
stabiilimpi.

Rengasrakenteen muodostuessa syntyy yksi kiraalinen keskus lisää

(anomeerinen hiili); muodostuu kaksi stereoisomeeriä α ja β, jotka pystyvät
muuttumaan toisikseen avoketjuisen muodon kautta.

48
yleisin glukoosi: C6H12O6
CHO
H C OH CH2OH
HO C H H O H
H
H C OH
OH H
H C OH OH
OH
CH2OH H OH

Haworthin kaavio

Kuusirengas on todellisuudessa ei-tasomainen, tavallisesti

tuolikonformaatiossa, jolloin substituentit ovat aksiaalisia tai ekvatoriaalisia.

Tavallisimpia monosakkarideja:

ƒ glukoosi on aldoheksoosi
ƒ fruktoosi on ketoheksoosi
ƒ riboosi on aldopentoosi

Monosakkaridien johdannaiset

ƒ Aminosokerit ja niiden johdannaiset

ƒ Deoksisokerit
ƒ Sokerihapot (esim glukonihappo ja glukuronihappo)
ƒ Fosforyloidut sokerit

Pelkistävät sokerit

Monosakkaridit ja sellaiset polysakkaridit, joissa on vapaa 1-hiili voivat

hapettua vastaaviksi karboksyylihapoiksi. (Esim. Fehlingin reaktio)

Glykosidisidos

Hemiasetaalin muodostumisen jälkeen muodostunut hydroksyyliryhmä voi

reagoida toisen hydroksyylin kanssa, jolloin eliminoituu vesi, ja muodostuu
asetaali.

Asetaalin muodostuessa anomeerisen hiilen α tai β – konfiguraatio jää

pysyväksi (avoketjuinen muoto ei mahdollinen).

Jos molekyylissä on jonkin sakkaridiyksikön anomeerinen hiili on vapaana, on

kyseessä pelkistävä sokeri.

Disakkaridit

esim. sakkaroosi. C12H22O11

49
 CH2OH
H O H CH2OH H
O
H
OH H H OH
OH O
CH2OH
H OH OH H

β-D-fruktofuranosyyli(β2↔1α)α-D-glukopyranosidi

Koska sakkaroosissa anomeeriset hiilet ovat reagoineet keskenään, kyseessä

ei ole pelkistävä sokeri.

Polysakkaridit

eli glykaanit ovat monosakkaridien muodostamia polymeerejä

Polysakkaridit voivat koostua samanlaisista (homopolysakkaridit) tai erilaisista

(heteropolysakkaridit) sakkaridiyksiköistä.

Ketjut voivat olla suoria tai haaroittuneita. Polysakkaridien koko vaihtelee.

Ominaisuudet riippuvat yksiköiden tyypistä, määrästä ja sitoutumistavasta.

Tärkkelys ja glykogeeni

Tärkkelys ja glykogeeni ovat periaatteessa samanlaisia (α1→4)

glukoosipolymeerejä.

Tärkkelystä on kasveissa, sitä on kahta tyyppiä

ƒ Amyloosi koostuu pitkistä, haaroittumattomista ketjuista (muodostaa
spiraalin)
ƒ Amylopektiini on haaroittunutta; 24-30 glukoosiyksikön välein on (α1→6) –
sidoksellinen haarakohta

Glykogeeniä on eläimissä maksassa ja lihaksissa

ƒ (α1→6) –haaroja 8-12 yksikön välein

Molekyylissä vain yksi pelkistävä pää, mutta useita ei-pelkistäviä päitä

Molekyyliä hajotetaan ei-pelkistävistä päistä.

Selluloosa ja kitiini

Selluloosa on myös polyglukoosia, mutta sillä on aivan erilaiset ominaisuudet

Yksiköiden väliset sidokset (β1→4) –sidoksia

50
Yksiköiden välille muodostuu runsaasti vetysidoksia, jotka tekevät
molekyylistä liukenemattoman.

Selluloosa on massaltaan yleisin biomolekyyli.

Vain eräät mikrobit pystyvät tuottamaan selluloosaa hajottavaa entsyymiä

sellulaasia, kun taas tärkkelyksen ja glykogeenin hajotuskyky on erittäin
yleinen.

Hyönteisten tukirangan kitiini on N-asetyyli-D-glukosamiinin (β1→4) –

polymeeri. Kuten selluloosa, se on lujaa, liukenematonta ja vaikeasti
hajotettavaa.

Bakteerien soluseinän peptidoglykaanit

Bakteerien soluseinän runkona on polysakkaridi, jossa on vuorotellen N-

asetyyliglukosamiini- ja N-asetyylimuramiinihappoyksiköitä (β1→4)-sidoksilla
liitettynä.

Polysakkaridiketjuja yhdistää peptidiketju, jossa on myös D-aminohappoja.

Gram+ ja Gram- -bakteereilla peptidiketjun rakenteessa on eroa.

Soluväliaineen glykosaminoglykaanit

Solujen välissä olevassa tilassa on soluväliainetta “extracellular matrix”

tarjoten soluille kiinnittymispinnan. Soluväliaine koostuu kuitumaisista
proteiineista (kollageeni, elastiini, fibronektiini ja laminiini y.m.) sekä
polysakkarideista

Glykosaminoglykaanit koostuvat toistuvista disakkaridiyksiköistä, joissa toinen

sokeri on N-asetyyliglukosamiini tai N-asetyyligalaktosamiini.

Glykosaminoglykaanit liittyvät solunulkoisiin proteiineihin muodostaen

proteoglykaaneja.

Esim. silmän lasiaisessa ja nivelnesteessä on molekyylipainoltaan yli 106

daltonin hyaluronihappoa, joka koostuu glukuronihaposta ja N-
asetyyliglukosamiinista.

Muut glykosaminoglykaanit ovat pienimolekyylisempiä, ja kovalenttisesti

kiinnittyneitä proteiineihin (kondroitiinisulfaatti, kerataanisulfaatti,
dermataanisulfaatti, hepariini…)

Glykokonjugaatit

Ravintovarasto- ja rakenteellisten tehtäviensä ohella poly- ja oligosakkaridit

toimivat eräänlaisina molekylaarisina tunnuslippuina, jotka tunnistetaan mm.
solujen välisissä vuorovaikutuksissa, proteiinien ohjaamisessa oikeaan
kohteeseen, veren hyytymisessä, immuunivasteessa, haavojen
paranemisessa…

51
Tällöin sakkaridiyksikkö on yleensä kovalenttisesti kiinnittynyt toiseen
molekyyliin (glykokonjugaatti).

Proteoglykaaneissa glykosaminoglykaani (ks. ed.) on kovalenttisesti

liittyneenä erittyvään proteiiniin tai kalvoproteiiniin. Glykosaminoglykaani
käsittää yhdistelmästä suurimman osan, ja proteoglykaanit ovat yleensä
rakenteellisia osia.

Glykoproteiineissa proteiiniin on kiinnittyneenä yksi tai useampi oligosakkaridi,

jonka toiset proteiinit voivat tunnistaa.

Glykolipideissä vastaavasti solukalvon lipideihin on liittyneenä oligosakkaridi.

Proteoglykaanit

Tyypillisessä proteoglykaanissa on “ydinproteiini”, johon glykosaminoglykaani

liittyy. Ns. tyvikalvon (basal lamina) 20-40 000 daltonin ydinproteiiniin liittyy
useita kovalenttisesti kiinnittyneitä heparaanisulfaattiketjuja (hepariinia
muistuttava, mutta vähemmän sulfaattiestereitä sisältävä glykaani).

Jotkut proteoglykaanit muodostavat valtavia aggregaatteja.

Hyaluronihappomolekyyliin voi tarttua esim. sata aggrekaani-proteiinia (MW =
250 000), joista kuhukin on liittynyt kondroitiinisulfaatti- ja
kerataanisulfaattiketjuja. Koko yhdistelmän koko voi olla 2 x 108 daltonia.

Kuitumaiset proteiinit ja proteoglykaanit muodostavat verkkomaisen

rakenteen, joka antaa kudoksille lujuutta ja joustavuutta.

Glykoproteiinit

Glykosylaatio liittyy seriinien ja treoniinien hydroksyyleihin (O-linked) tai

asparagiinien amidityppeen (N-linked).

Oligosakkarideja liittyy proteiiniin esim. 1-16; hiilihydraattia on proteiinin

kokonaismassasta 1-70%

• Glykoforiini on erytrosyyttien (punasolujen) solukalvossa oleva

integraalinen kalvoproteiini, johon kuuluu huomattava määrä
glykosylaatiota; 60% glykoproteiinin massasta on hiilihydraattia.
• Glykoforiini kulkee solukalvon läpi: kalvon läpäisevän osan muodostaa
yksi hydrofobinen α-heliksi.
• N-terminaalinen osa on solun ulkopuolella, ja sisältää n. 100
sokeriyksikköä 16 ketjussa, joista 15 on O-linkattuja ja 1 N-linkattu.

Kalvoproteiinit ja erittyvät proteiinit ovat hyvin usein glykoproteiineja.

Glykosylaatio todennäköisesti vaikuttaa proteiinin liukoisuusominaisuuksiin.

Todennäköisesti glykosylaatio myös vaikuttaa siihen, miten glykoproteiini

vuorovaikuttaa muiden proteiinien kanssa, mutta tätä ei tunneta kovin hyvin.

52
Glykolipidit

Myös eräissä kalvolipideissä on kovalenttisesti kiinnittyneitä

hiilihydraattiryhmiä.

Gangliosideissä on monimutkainen, sialihappoa sisältävä glykosylaatio.

Gram-negatiivisten bakteerien lipopolysakkaridi (LPS) suojaa bakteeria

immuunijärjestelmältä (ja on antibodien tärkein maali). LPS on toksista
eläimille, ja osaltaan pahentaa gram - -infektioiden oireita.

Lektiinien ja oligosakkaridien vuorovaikutukset

Lektiinit ovat proteiineja, jotka sitoutuvat spesifisesti tiettyihin hiilihydraatteihin.

Lektiinit osallistuvat lukuisiin solujen välisiin tunnistus- ja tarttumisilmiöihin.

Esim. kuparia kuljettavan seruloplasmiini-proteiinin glykosylaatiossa

uloimpana on sialihapporyhmä. Sialidaasi-niminen entsyymi poistaa
tämän ryhmän “vanhoista” proteiineista, jolloin maksasolujen
asialoglykoproteiinireseptorit (lektiinit) sitoutuvat niihin, ja ne otetaan
maksasoluun hajotettavaksi.

Selektiinit ovat solukalvoissa esiintyviä lektiinejä, jotka välittävät solujen

välisiä tunnistusprosesseja. Esim. P, E ja L –selektiinit osallistuvat T-solujen
tunkeutumiseen kapillaarien seinämän läpi tulehdusreaktion yhteydessä.

Myös monet patogeenit tarttuvat lektiineillä solunpinnan hiilihydraatteihin,

esim. mahahaavan aiheuttaja Helicobacter pylori, influenssavirus,
koleratoksiini ja hinkuyskätoksiini.

10. Nukleotidit ja nukleiinihapot

Nukleotidien tehtävät

1) Nukleiinihappojen (DNA, RNA) rakenneosia

2) Energiansiirrossa,
ATP, GTP (UTP ja CTP) “korkeaenergiset sidokset”

3) Entsyymien kofaktorien osina

Aktiivisten ryhmien siirto biokemiallisissa reaktioissa

4) Signaalimolekyyleinä
Syklinen AMP, cAMP

Nukleotidit koostuvat
ƒ Typpipitoisesta, rengasrakenteisesta emäksestä
ƒ Pentoosisokerista

53
ƒ Fosfaattiryhmästä
emäkset:
puriinit: adeniini, A tai guaniini, G
NH2 O

N N N
HN

N N H2N N N
H H
A G

pyrimidiinit: sytosiini, C, tymiini, T tai urasiili, U

NH2 O O
CH3
N HN HN

O N O N O N
H H H

C T U

Nimeäminen

Emäs Nukleosidi Nukleotidi

Emäs + sokeri Emäs + sokeri +

fosfaatteja

Adeniini Adenosiini Adenylaatti

adenosiinimonofosfaatti,
AMP

54
AMP

NH2

N N

OH N N
HO P O CH2
O
O
H H
H H

OH OH

Deoksi-AMP (dAMP)

NH2

N
N

OH N N
HO P O CH2
O
O
H H
H H

OH

Nukleiinihapoissa fosfodiesterisidos yhdistää peräkkäisten nukleotidien 5’ ja 3’

– hiilet

55
 O CH2 Base
H O H
5'

H H
3'

{
O O H
P
O O CH2 Base
H O H

H H

{
O O H
P
O O CH2 Base
H O H

H H

{
O O H
P
O O

Nukleotidijärjestys ilmoitetaan alkaen siitä nukleotidistä, jossa on vapaa 5’ –

ryhmä (5’ → 3’)

Yleensä riittää ilmoittaa emästen tunnuskirjaimet (ACGT).

Fosfodiesterisidokset voivat hydrolysoitua erityisesti happamissa tai

emäksisissä olosuhteissa. Ribonukleiinihappo on herkkä hydrolysoitumaan
emäksisissä olosuhteissa reaktiossa, jossa välituotteena esiintyy 2’,3’-
syklinen monofosfaatti. DNA on paljon vaikeammin hydrolysoituva, koska 2’-
hydroksyylin puuttuminen estää tämän välituotteen syntymisen.

Oligonukleotidi – polynukleotidi

Emästen ominaisuuksien vaikutus nukleiinihappojen ominaisuuksiin

Nukleiinihappoemäkset absorboivat UV-valoa siten, että absorptiomaksimi

nukleiinihapoilla on n. 260 nm (vrt. proteiineilla 280 nm)

Emäkset ovat hydrofobisia, ja aromaattisina rakenteina ne sitoutuvat jossain

määrin päällekkäin (stacking interaction)

Emäkset pystyvät muodostamaan vetysidoksia, ja parit A-T ja G-C

muodostavat ns. Watson-Crick – emäsparit.

56
A=T

G≡ C

Nukleiinihappojen rakenne

Havainnot ennen DNA:n rakenteen keksimistä

Avery, MacLeod ja McCarty osoittivat, että puhdistettu DNA pystyy

muuttamaan ei-virulentin Streptococcus pneumoniae –kannan virulentiksi;
käsittely DNAasilla, DNA:ta pilkkovalla entsyymillä, hävitti tämän kyvyn.

Hershey ja Chase osoittivat, että bakteriofagin (bakteereja infektoivan

viruksen) kiinnittyessä soluun ainoastaan DNA, ei proteiini, tunkeutuu
infektoituvaan soluun.

Chargaff tutki eri DNA:iden emäskoostumuksia, ja havaitsi “Chargaff’in

säännöt”:

1) Eri lajien emäskoostumus on yleensä erilainen

2) Saman eliön eri kudoksissa on samanlainen emäskoostumus
3) Ikä, ravinto tai ympäristö ei vaikuta eliön DNA:n emäskoostumukseen
4) Kaikissa DNA-näytteissä adeniinin määrä on yhtä suuri, kuin tymiinin;
samoin guaniinin sama kuin sytosiinin

Franklin ja Wilkins osoittivat röntgensädediffraktiolla, että DNA on

rakenteeltaan kierteinen, ja rakenteessa on kaksi jaksollisuutta; 3.4 Å ja 34 Å.

57
Watsonin ja Crickin malli

Watson ja Crick kehittivät ennenkaikkea Chargaffin, Franklinin ja Wilkinsin

tulosten perusteella DNA:n kaksoiskierremallin:

Siinä kaksi vastakkaissuuntaista (antiparalleelia) polynukleotidiketjua kiertyy

toistensä ympäri siten, että emäkset ovat keskellä. Emäkset ovat aina
pareittain siten, että A pariutuu T:n kanssa ja G C:n kanssa (Chargaffin 4.
sääntö). Spesifiset vetysidokset voivat muodostua vain oikeiden, eli
komplementaaristen emäsparien välille. Emästen pinoutumisesta päällekkäin
seuraa havaittu 3.4 Å jaksollisuus; 34 Å jaksollisuus vastaa kierteen nousua.

Fosfodiesteriketjujen väliin jää kaksi kierteistä uraa, joista käytetään nimitystä

“major groove” ja “minor groove”. Uriin sitoutuvat proteiinit pystyvät
tunnistamaan tietyn emäsjärjestyksen kaksoiskierrettä avaamatta.

(http://www.nature.com/nature/dna50/watsoncrick.pdf). Rakenteesta voi

päätellä, että sen voi replikoida helposti erottamalla vastinnauhat toisistaan, ja
syntetisoimalla kummallekin uuden vastinnauhan (ns. semikonservatiivinen
replikaatiomalli).

DNA:n kolmiulotteisen rakenteen vaihtelu

Watsonin ja Crickin malli tunnetaan nykyään DNA:n B-muotona, ja se vastaa

parhaiten satunnaisen DNA:n rakennetta fysiologisissa olosuhteissa.

A-muoto vallitsee vedettömissä olosuhteissa; siinä emäkset ovat kallistuneet

kierteen akselin suhteen, ja se on muutenkin kompaktimpi.

Vasenkätinen Z-DNA ilmeisesti esiintyy luonnossa eräissä

säätelysekvensseissä. Vuorottelevat puriinit ja pyrimidiinit, erityisesti

58
vuorottelevat G:t ja C:t suosivat sen syntymistä.

A-DNA Z-DNA

Epätavalliset DNA-rakenteet

DNA:ssa esiintyy epätavallisia rakenteita, joista osalla on biologista

merkitystä.

Poly-A-sekvenssit aikaansaavat DNA-ketjun taipumista

Palindromiset sekvenssit saattavat ottaa “cruciform” rakenteen

Watson-Crick – emäspari voi sitoa vetysidoksilla kolmannen emäksen, jolloin

muodostuu Hoogsteenin pari. Tällöin voi muodostua kolmisäikeinen DNA-
molekyyli.

Neljä hyvin guanosiinirikasta DNA-ketjua voi muodostaa nelisäikeisen DNA-

molekyylin.

Messenger-RNA (mRNA)

Vastaavalla tavalla, kuin DNA replikoituu, voidaan DNA-nauhalle valmistaa

komplementaarinen RNA. RNA-molekyyliä, jonka emäsjärjestys käännetään
(transloidaan) proteiinin aminohappojärjestykseksi, nimitetään messenger-
RNA:ksi.

Prokaryoottien mRNA voi olla monokistroninen (koodaa vai yhtä polypeptidiä)

tai polykistroninen.

59
RNA:n kolmiulotteinen rakenne

RNA on yksinauhaista. Emäsjärjestyksestä riippuen komplementaariset jaksot

voivat liittyä yhteen muodostaen kaksoiskierteisiä jaksoja. Näiden
yhdistelminä voi syntyä hyvin monimutkaisia kolmiulotteisia rakenteita.

Kaksoiskierteet RNA:ssa ovat A-muotoa; riboosin 2-hydroksyyli estää B-

muodon syntymisen.

Samoin kuin proteiineilla, järjestys määrää kolmiulotteisen rakenteen, ja

joillain RNA-molekyyleillä on katalyyttisiä ominaisuuksia (“ribotsyymit”).

(RNA-maailmahypoteesi)

Nukleiinihappokemiaa

Kaksinauhainen DNA ja RNA voidaan denaturoida

Kaksinauhaisia nukleiinihappomolekyylejä pitävät yhdessä ei-kovalenttiset

voimat, ja samoin kuin proteiinit, nauhat voidaan erottaa (denaturoida)
kuumentamalla, ääri-pH:ssa ym.

Koska GC-pareja pitää yhdessä kolme vetysidosta AT-parien kahden

asemasta, on DNA sitä vaikeampi denaturoida, mitä enemmän siinä on G:tä
ja C:tä.

Lämmitettäessä DNA-liuosta denaturaatio voidaan havaita siitä, että valon

absorptio 260 nm:ssä kasvaa jyrkästi. Näin saadun sulamispisteen
perusteella voidaan laskea DNA:n GC-pitoisuus.

Hybridisaatio

Sopivissa olosuhteissa denaturoituneet DNA-nauhat liittyvät uudelleen

yhteen. Yhteenliittyminen tapahtuu myös silloin, kun emäsjärjestyksissä on
pieniä eroja, joten pystytään esim. arvioimaan eri eliöiden DNA:n
samankaltaisuutta.

Jos DNA-nauha (koetin, probe) leimataan esim. radioisotoopilla tai

fluoresoivalla kemikaalilla, ja kohde-DNA sidotaan kiinteään kantajaan,
voidaan komplementaarinen DNA havaita spesifisesti. Tämä on perustana
useille DNA:n havaitsemistekniikoille.

Nukleiinihappoja vahingoittavat reaktiot

Nukleiinihapoilla on useita hitaita reaktioita, jotka saattavat johtaa

emäsjärjestyksen muutoksiin eli mutaatioihin. Elävässä solussa on jatkuvasti
toiminnassa entsymaattisia korjausreaktioita, jotka pyrkivät korjaamaan
näiden reaktioiden vaikutukset.

60
Sytosiini voi deaminoitua, jolloin siitä tulee urasiili. DNA:ssa urasiilin paikalla
on tymiini, jolloin DNA:sta löytyvä urasiili voidaan virheellisenä poistaa ja
korvata sytosiinillä.

DNA:n puriininukleotideistä voi irrota emäs, erityisesti happamassa pH:ssa

(~3).

UV-säteily voi aihettaa vierekkäisten tymiinien liittymisen yhteen

kovalenttisesti. Samalla DNA:n rakenteeseen tulee mutka (jonka perusteella
korjausentsyymien on helppo havaita tymiinidimeeri ja poistaa se…).

Deaminaatioreaktioita edistävät kemikaalit tai alkyloivat kemikaalit voivat

muuttaa emäksiä sellaisiksi, että ne eivät enää pariudu normaalisti, jolloin
replikaation yhteydessä syntyy mutaatio.

Myös reaktiiviset hapen muodot vahingoittavat DNA:ta aiheuttaen mutaatioita.

Yleensä mutaatioita aiheuttavat kemikaalit tai vaikutukset lisäävät syövän

riskiä.

Metyloidut emäkset

Erityiset entsyymit metyloivat spesifisiä emäksiä DNA:ssa. Bakteereilla

metylaatio liittyy suojautumiseen bakteriofageja vastaan (oma DNA on
metyloitu, vieras ei, joten se tiedetään hajottaa.)

Miten DNA:n nukleotidisekvenssi määrää proteiinin

aminohapposekvenssin

DNA ja proteiini muodostuvat alayksiköiden lineaarisista sekvensseistä.

DNA:n nukleotidien järjestys vastaa proteiinin aminohappojärjestystä eli

sekvenssit ovat kolineaarisia

Miten aminohappojärjestys ohjautuu?

DNA-transkriptio; vastaa tapahtumana replikaatiota eli syntetisoidaan uutta

polynukleotidinauhaa mallin mukaisesti, mutta muodostuva nauha on RNA:ta

muodostuva RNA-nauha (messenger RNA eli mRNA) syntetisoidaan

koodaavalta alueelta, eli geeni transkriptoidaan

RNA:ssa geneettinen informaatio säilyy eli emäsjärjestys on

komplementaarinen mallinauhalle ja vastakkaisnauhan kanssa (+ strand)
identtinen

Muodostunut RNA ei emäspariudu vastinnauhan (DNA-juoste) kanssa vaan

DNA kaksoisheliksi sulkeutuu takaisin emäspariutumisella.

61
-> RNA-molekyylit ovat 1-nauhaisia

RNA-nauha on myös selvästi lyhyempi; DNA-ketjussa on tuhansia geenejä,

jotka transkriptoidaan mRNA:ksi

Yhdestä aktiivisesta geenistä saadaan tuhansia RNA transkriptejä/solun

jakautuminen

Geenien transkriptiota säätelevät säätelyproteiinit.

Muita RNA-molekyylejä: siirtäjä-RNA (tRNA), ribosomaalinen RNA (rRNA)

Prokaryoottien DNA toimii mallina transkriptiossa muodostuvalle mRNA:lle,

joka edelleen muunnetaan vastaavaksi aminohappojärjestykseksi
translaatiossa

Translaatio on proteiinisynteesi, jossa mRNA määrää kasvavan peptidiketjun

aa-järjestyksen. Monimutkaista proteiinikoneistoa, joka suorittaa translaation,
kutsutaan ribosomiksi.

Eukaryoottien RNA:ta muokataan transkription jälkeen (ns. splicing).

Eukaryooteilla geenien koodaavien alueiden (=eksonit) välissä on ei-

koodaavia alueita (=intronit). Intronien poisto tapahtuu splicing tapahtumana
“leikkaa-liimaa” -periaatteella useiden RNA:ta prosessoivien entsyymien
toimesta. Transkriptiossa muodostuneesta RNA-nauhasta käytetään nimitystä
primääritranskripti, josta splicingilla saadaan mRNA.

Eukaryootilla replikaatio ja transkriptio tapahtuvat tumassa, translaatio

sytoplasmassa.

Splicingin tarkoitus?
• Geenit voidaan transloida eri proteiineiksi, koska splicing voi osua eri
kohtiin primääritranskriptissä.

• Eksonit vastaavat usein proteiinien toiminnallisia osia. Koska

rekombinaatio osuu todennäköisimmin introniin, ehjät eksonit
rekombinoituvat.

Geneettinen koodi -ohjeet, miten geenin nukleotidijärjestys transloidaan

proteiinin aminohappojärjestykseksi

* Nukleotidit luetaan tripletteinä, kolmen nukleotidin sarjassa = kodoni

* Kodoni vastaa aina tiettyä aminohappoa

* mRNA:ssa 4 erilaista nukleotidia, jotka luetaan 3 jaksoissa eli 43 = 64

kodonia

62
* 20 aminohappoa proteiineissa, joten useampi kodoni /aa -> geneettinen
koodi on degeneroitunut (degenerate, matemattinen termi, ei tarkoita
”rappeutunut”)

* 3 kodonia on varattu translaation lopetukseen

* koodi on konservoitunut joitain poikkeuksia lukuunottamatta (esim.

mitokondriot)

* RNA:sta 3 mahdollista tapaa lukea koodi (DNA:sta 6) = lukukehyksiä

* yleensä vain yksi lukukehys saa aikaan toimivan proteiinin = avoin

lukukehys (ORF, Open Reading Frame)

* Lukukehyksen määrää translaation initiaatioproseesi, jossa etsitään oikea

aloituskohta

Yhteenveto:

DNA(+)
DNA(-)

mRNA(+)

tRNA(-)

aa-aa-aa-aa +
DNA:n emäsjärjestyksen määrittäminen

DNA:n emäsjärjestyksen määrittäminen on niin tehokasta, että esim.

aminohapposekvenssitieto on nykyään useimmiten peräisin vastaavan geenin
emäsjärjestyksestä.

Määritykseen käytetään Maxam-Gilbertin tai nykyään useimmiten Sangerin

menetelmää. Molemmat perustuvat siihen, että sekvenoitavasta DNA:sta
tuotetaan joukko yksinauhaisia molekyylejä, jotka alkavat kaikki samasta
kohtaa, ja loppuvat spesifisesti tiettyyn emäkseen.

Maxam-Gilbertin menetelmässä päästään radioaktiivisesti leimattu DNA -

molekyyli pilkotaan neljällä eri kemiallisella käsittelyllä, jotka pilkkovat DNA:n
selektiivisesti tietyn emäksen kohdalta.

Sangerin menetelmässä käytetään DNA:ta replikoivaa entsyymiä, DNA-

polymeraasia. Kun yksinauhaiseen DNA:han on hybridisoitunut
komplementaarinen aluke (synteettisesti valmistettu oligonukleotidi),
polymeraasi liittää uuden komplementaarisen nukleotidin aina molekyylin 3’-

63
päähän, kun entsyymille annetaan kaikkia neljää deoksinukleotiditrifosfaattia
(dNTP:tä).

Kerrallaan yhtä nukleotideistä lisätään myös dideoksinukleotidina, jolta

puuttuu 3’-hydroksyyli. Kun polymeraasi liittää tällaisen, se ei enää pysty
jatkamaan ketjua. Muodostuu joukko DNA-molekyylejä, jotka ovat eri pituisia,
mutta loppuvat kaikki tiettyyn emäkseen.

Molekyylit voidaan erottaa pituusjärjestykseen elektroforeesilla. Kun kaikki

neljä reaktiota fraktioidaan rinnakkain, voidaan DNA:n emäsjärjestys suoraan
lukea geeliltä.

Kerrallaan voidaan lukea n. 600 emästä. Isommat jaksot on pilkottava

palasiksi (esim. restriktioentsyymeillä, tai kloonaamalla satunnaisesti pilkottuja
DNA-jaksoja) Koko sekvenssi voidaan sitten koota päällekkäisyyksien avulla.

Pisin DNA-molekyyli, jonka emäsjärjestys tunnetaan, on ihmisen kromosomi

14; 87 410 661 emäsparia.

DNA:n synteesi

DNA:ta voidaan syntetisoida vastaavalla tavalla, kuin peptidejä Merrifieldin

menetelmällä; kiinteän kantajan pintaan rakennetaan oligonukleotidi nukleotidi
kerrallaan kayttäen aktivoituja ja suojattuja nukleotidejä.

Rutiinisti voidaan valmistaa 70–80 nukleotidin mittaisia oligonukleotidejä.

Proteiinia koodaava DNA voidaan valmistaa kokonaan synteettisesti. Tähän

tarvitaan joko oligonukleotidit geenin molemmille nauhoille, tai sarja
oligonukleotideja, jotka muodostavat “aukollisen” kaksinauhaisen
kokonaisuuden, jonka aukot sitten voidaan täyttää DNA-polymeraasilla.
Jälkimmäisessä tapauksessa tarvitsee syntetisoida vähemmän DNA:ta
kemiallisesti. Molemmissa tapauksissa liitetään nauhat yhtenäiseksi DNA:ksi
ligaasilla (entsyymi, joka paikkaa DNA:ssa yhden nauhan katkoksia).

Nukleotidien muut tehtävät

Nukleotidit kantavat kemiallista energiaa solussa

Nukleotidin 5’-fosfaattiin voidaan liittää lisää fosfaatteja

fosfoanhydridisidoksella. Tällaisen liittämisreaktion vapaan energian muutos
on suuri, ja vastaavasti hydrolysoitaessa fosfoanhydridisidos, reaktio on
vahvasti lopputuotteiden puolella (∆G~-30 kJ/mol)

Tärkein energian kantaja on adenosiinifosfaatti, ATP, mutta myös muut

trifosfaatit toimivat joissain reaktioissa.

64
Monissa entsyymien kofaktoreissa on adeniininukleotidi “kahvana”

Monien koentsyymien rakenteeseen kuuluu adenosiini, joka ei kuitenkaan

osallistu katalyysiin.

Adenosiinijohdannaisia ovat mm:

ƒ asyyliryhmiä kuljettava koentsyymi A (CoA)

ƒ hydridinkuljettaja nikotiiniamidi-adeniini-dinukleotidi (NAD+)
ƒ hydridinkuljettaja flaviini-adeniini-dinukleotidi (FAD)
ƒ metyyliryhmiä kuljettava S-adenosyylimetioniini (SAM)

Adenosiinia sitovan kohdan aminohappojärjestys (ja kolmiulotteinen

rakenne)on konservoitunut (säilynyt) evoluutiossa.

Jotkut nukleotidit osallistuvat säätelyyn ja viestintään

Useiden hormonien ja välittäjäaineiden vaikutus välittyy solun sisällä

toisiolähetin (second messenger) avulla. Tavallisin toisiolähetti on 3’, 5’-
syklinen AMP (cAMP) (ei sama, kuin RNA:n hydrolyysissä syntyvä 2’, 3’-
syklinen AMP).

Syklinen GMP osallistuu mm. näköaistin toimintaan.

Bakteereilla aminohappojen loppuessa ravinnosta syntyy

guanosiinitetrafosfaattia (ppGpp), joka mm. estää ribosomaalisen ja siirtäjä-
RNA:n synteesiä.

11. Lipidit

veteen liukenemattomia biomolekyylejä

rasvahappojohdannaiset
steroidit
polyisoprenoidit

Ravintovarastona toimivat lipidit

Varastolipidit ovat rasvahappojen johdannaisia.

Rasvahapot ovat hiilivetyjohdannaisia

O
C
O-

Rasvahapot ovat hiilivetyjen 1-karboksyylihappoja. Yleensä hiilivetyketju on

suora, siinä on 4-36 hiiltä, ja rasvahapon hiilten lukumäärä on parillinen.

65
Metyyli- tai hydroksyylisubstituentit hiilivetyketjussa ovat harvinaisia.

Hiilivetyketjussa voi olla yksi tai useampia kaksoissidoksia (tyydyttymättömät

rasvahapot).

Kaksoissidokset ovat luonnollisissa rasvahapoissa cis-konfiguraatiossa.

Jos kaksoissidoksia on useampia, niiden välissä on vähintään 1

metyleeniryhmä (kaksoissidokset eivät ole konjugoituneita).

Rasvahappo voidaan kuvata ilmoittamalla hiilten luku:kaksoissidosten luku

(kaksoissidosten paikka) esim.

18:1(∆9) öljyhappo (oleic acid): 18 hiiltä, 1 kaksoissidos hiilten 9 ja 10 välissä.

10 9 1
COO-

18:3(∆9,12,15) α-linoleenihappo:
16 15 13 12 10 9 1
COO-

Tämä on myös θ-3 (omega miinus kolme) – rasvahappo, koska kaksoissidos

on molekyylin lopusta katsoen kolmannen ja neljännen hiilen välissä.

Rasvahappojen sulamispisteet

100

80

60 0
1
40
C

2
20 3

0
10 15 20 25
-20
N:

Kaksoissidoksilla on dramaattinen vaikutus rasvahappojen sulamispisteisiin,

koska niitä sisältävät rasvahapot ovat “mutkallisia” eivätkä helposti pakkaudu
kiteiksi.

Rasvahapot ovat niukkaliukoisia veteen.

66
Rasvahappoja on selkärankaisilla jonkin verran verenkierrossa albumiiniin
sitoutuneina.

Triasyyliglyserolit (= tavallinen rasva)

Triasyyliglyserolissa kuhunkin glyserolin kolmesta hydroksyyliryhmästä on

esteröityneenä rasvahappo.

Mikäli kaikki kolme rasvahappoa ovat samanlaisia, molekyyli voidaan nimetä;

esim. tristeariini, tripalmitiini… Yleensä kuitenkin luonnon rasva on seos.

Triasyyliglyserolit ovat veteen liukenemattomia; tyydyttymättömimpiä

rasvahappoja sisältävät ovat öljyjä, muut rasvoja. Kaikki ovat vettä
kevyempiä.

Triasyyliglyserolit ovat soluissa erillisinä pisaramaisina partikkeleina. Eniten

rasvoja on rasvasoluissa (adiposyyteissä).

Lipaasit ovat esteraaseja, jotka hydrolysoivat triglyseridejä vapauttaen

rasvahapot ja glyserolin käytettäväksi ravintona

Rasvat ovat tehokkaita ravintovarastoja, koska

ƒ niiden hapettamisesta saatava energia on suurempi, kuin hiilihydraattien,
koska ne ovat pelkistyneempiä
ƒ ne eivät sido vettä, toisin kuin polysakkaridit

Merinisäkkäät käyttävät rasvoja lämmöneristyksenä, ja parantamaan

kelluvuuttaan.
Talvehtivilla karhuilla rasvat toimivat vararavintona, lämmöneristeenä ja
metabolisena veden lähteenä.

Ravinnossa olevat triglyseridit vaihtelevat rasvahappokoostumukseltaan;

useimmat kasvisrasvat sisältävät tyydyttymättömiä rasvahappoja, ja
lämminveristen eläinten rasvat tyydyttyneitä. Kaloissa on kuitenkin runsaasti
tyydyttymättömiä rasvahappoja.

Tyydyttymättömiä rasvahappoja sisältävät rasvat pilaantuvat herkemmin,

koska kaksoissidokset hapettuvat ilman hapen vaikutuksesta.

Vahat

Vahat ovat pitkäketjuisten rasvahappojen ja pitkäketjuisten 1-alkoholien

estereitä.

Planktoneliöt käyttävät vahoja varastoravintona.

Eläimet ja kasvit tuottavat vahoja pääasiassa pintansa suojaksi, höyhenten

tekemiseksi vettähylkiviksi, ja mehiläiset rakennusaineena.

67
Kalvojen rakenteelliset lipidit

Biologiset membraanit muodostuvat lipideistä joissa on toisaalta hydrofobinen

osa, toisaalta hydrofiilinen osa. Tällaiset molekyylit ovat
amfipaattisia(amfifiilisiä, vrt. amfolyytti, joka on aivan eri asia).

Tärkeimmät kalvolipidit ovat glyserofosfolipidejä, sfingolipidejä ja steroleja.

Fosfolipidit voivat olla glyserolipohjaisia tai sfingosiinipohjaisia

Glykolipidit ovat sfingosiinipohjaisia.

Glyserofosfolipidit ovat fosfatidihapon johdannaisia

Fosfatidihappo on molekyyli, jossa glyserolin 1 ja 2 – hiileen on

esteröityneenä rasvahappo ja 3-hiileen fosfaatti. Tavallisimmin 1-hiilessä
oleva rasvahappo on tyydyttynyt ja 2-hiilessä oleva tyydyttymätön.
O
CH2
O
O
CH2
O
-
CH2O PO3
Fosfatidihappo on kiraalinen yhdiste; kantayhdiste on L-glyseroli-3-fosfaatti.

Fosfatidihapon fosfaattiin on yleensä esteröityneenä polaarinen alkoholi, joka

voi olla:

etanoliamiini fosfatidyylietanoliamiini
koliini fosfatidyylikoliini
seriini fosfatidyyliseriini
glyseroli fosfatidyyliglyseroli
myo-inositoli-4,5-bisfosfaatti fosfatidyyli-inositoli-4,5-bisfosfaatti
fosfatidyyliglyseroli kardiolipiini

(fosfatidyylikoliini)
Eetterisidokselliset fosfolipidit

68
Eräissä fosfolipideissä toinen rasvahapoista on esterisidoksen sijasta
kiinnittynyt eetterisidoksella (eli se ei oikeastaan enää ole rasvahappo, vaan
pitkäketjuinen enoli tai alkoholi).

Esimerkiksi plasmalogeeniä, erästä eetterifosfolipidiä, on noin puolet

sydänlihaksen fosfolipideistä.

Verihiutaleita aktivoiva tekijä, “platelet activating factor” on välittäjäaine, joka

rakenteeltaan on eräänlainen eetterifosfolipidi.

Sfingolipidit

Sfingolipidien perusmolekyyli on pitkäketjuinen aminoalkoholi sfingosiini

3

CHOH
2

H2N CH
1

CH2OH
Sfingosiinin 2-hiileen sitoutuu amidisidoksella rasvahappo, jolloin syntyvä
molekyyli on ceramidi.

Kun ceramidin 1-hiileen esteröityy fosfokoliini, syntyy sfingomyeliini.

Glykosfingolipideissä ceramidin 1-hiileen liittyy asetaalisidoksella

monosakkaridi tai oligosakkaridi. Glykosfingolipidit esiintyvät normaalisti
solukalvon ulkopinnalla.

Monosakkaridin kyseessä ollessa molekyyli on cerebrosidi; hermosoluissa

sokeri on tyypillisesti galaktoosi, ei-hermosoluissa glukoosi.
Jos kyseessä on neutraali oligosakkaridi, molekyyliä kutsutaan globosidiksi.

Jos oligosakkaridiin kuuluu negatiivisesti varautunut sokeri N-

asetyylineuramiinihappo (siaalihappo) molekyyli on gangliosidi, jotka ovat
glykolipideistä monimutkaisimmat.

Sfingolipidit osallistuvat tunnistusreaktioihin

Sfingolipidien glykosylaatio osallistuu tunnistusreaktioihin; esim. ABO-

veriryhmät perustuvat punasolujen pinnassa olevien globosidien sokeriketjun
rakenteeseen.

Fosfolipidit ja sfingolipidit hajotetaan lysosomeissa

A-tyypin fosfolipaasit hajottavat glyserofosfolipidimolekyylin irrottamalla toisen

asyyliryhmistä, ja lysofosfolipaasit irrottavat jäljellä olevan asyyliryhmän.

69
Gangliosidien hajotukseen osallistuu joukko lysosomaalisia entsyymejä, jotka
parhaiten tunnetaan vakavista synnynnäisistä sairauksista, jotka niiden puute
aiheuttaa, ja jotka johtavat hajoamattomien sfingolipidien kertymisen
kudoksiin.

Steroleiden rakenteessa on neljä rengasta

Sterolit ovat kalvolipidejä, joita esiintyy useimmilla eukaryooteilla.

Niiden rakenteeseen kuuluu neljästä yhteensulautuneesta renkaasta koostuva

sterolirunko (3 kuusirengasta ja 1 viisirengas, nimeltään
perhydrosyklopentanofenantreeni).

Rengasrakenne on lähes tasomainen ja jäykkä.

Kolesteroli, yleisin steroli, on amfipaattinen molekyyli, koska sillä on

polaarinen hydroksyyliryhmä ja nonpolaarinen sterolirunko, johon liittyy
haaroittunut alkyylisivuketju.

Vastaavia kalvosteroleja ovat kasvien stigmasteroli ja sienien ergosteroli.

(Bakteerit eivät syntetisoi steroleja, mutta niillä on kalvoissaan samantapaisia

lipidejä, joita kutsutaan hopanoideiksi).

Kolesterolista tuotetaan sappihappoja, jotka auttavat rasvojen ruuansulatusta

emulsifioimalla ne.

Steroidihormonit ovat myös sterolijohdannaisia.

Lipidit signalointimolekyyleinä, kofaktoreina ja pigmentteinä

Kalvolipidejä on yleensä 5-10 % solun kuivapainosta.

Kalvolipidit toimivat passiivisina rakenneosina, mutta on myös aktiivisia,

signaalinvälitykseen, elektroninsiirtoon ja glykosylaatioon, sekä valon
absorptioon osallistuvia lipidejä.

Fosfatidyyli-inositolit toisiolähetteinä

Fosfatidyyli-inositoli-4,5-bisfosfaatti solukalvon sisäpinnassa toimii eräiden

solun tukirangan proteiinien kiinnittymiskohtana, mutta myös kahden tärkeän
signalointimolekyylin, solunsisäisen hormonin eli toisiolähetin, lähtöaineena.

70
Esimerkiksi kun vasopressiini-hormoni sitoutuu reseptoriinsa, reseptori aktivoi
erityisen lipaasin, fosfolipaasi C:n. Fosfolipaasi C hydrolysoi solukalvon
fosfatidyyli-inositoli-4,5-bisfosfaattia tuottaen kaksi tärkeää toisiolähettiä:
inositoli 1,4,5-trisfosfaatin (IP3) ja diasyyliglyserolin (DAG)

IP3 vaikuttaa nopeasti avaamalla ionikanavat, jotka vapauttavat Ca2+ -ionia

endoplasmisessa retikulumissa olevista varastoista

DAG vaikuttaa hitaammin yhdessä kohonneen Ca2+-tason kanssa

aktivoimalla proteiinikinaasi C:n (PKC).

PKC säätelee muiden proteiinien toimintaa fosforyloimalla niitä.

Myös ceramidi ja sfingomyeliini säätelevät proteiinikinaasien aktiivisuutta.

Eikosanoidit toimivat solujenvälisinä viestimolekyyleinä

Eikosanoidit ovat “lyhyen kantaman” hormoneja, jotka vaikuttavat paikallisesti,

mm. lisääntymisessä, tulehdus- ja kipureaktioissa, veren hyytymisreaktiossa,
verenpaineen säätelyssä, vatsahapon erityksen säätelyssä…

Eikosanoidien lähtöaineena on 20-hiilinen (eikosi =20) 20:4(∆5,8,11,14)

rasvahappo arakidonihappo.

Eikosanoidit ryhmitellään prostaglandiineihin, tromboksaaneihin ja

leukotrieeneihin.

Prostaglandiinien rakenteessa on viisirengas, joka muodostuu

arakidonihaposta syklo-oksigenaasi-entsyymin vaikutuksesta. “Aspiriini” ja
muut tulehduskipulääkkeet, NSAID:it (non-steroidal anti-inflammatory drugs)
vaikuttavat inhiboimalla tätä entsyymiä.

Prostaglandiinit säätelevät cAMP:in synteesiä, ja näin vaikuttavat hyvin moniin

soluihin.

Tromboksaanien rakenteessa on eetterisillan sisältävä kuusirengas, ne

osallistuvat verihyytymän muodostumiseen ja veren virtauksen säätelyyn.
Niidenkin biosynteesi on syklo-oksigenaasista riippuvainen.

Leukotrieenit supistavat sileitä lihaksia, ja mm. astmakohtaukset ja

anafylaktinen shokki liittyvät niiden epätarkoituksenmukaiseen tuottoon.

Steroidihormonit

Steroidihormoneilla on steroidirunko, mutta kolesterolin pitkä sivuketju

puuttuu; lisäksi hydrofiiliset substituentit tekevät niistä kolesterolia
polaarisempia.

71
Erikoista steroidihormoneissa on se, että ne pääsevät tunkeutumaan
kohdesolun tumaan, ja sitoutuvat siellä steroidireseptoriin, joka suoraan
säätelee steroideista riippuvien geenien transskriptiota.

Sukupuolihormonit, kortisoli ja aldosteroni ovat tärkeimmät steroidihormonit.

Myös monet tärkeät lääkeaineet ovat steroidirakenteisia.

A- ja D-vitamiinien johdannaiset

1900-luvun alkupuolella tunnistettiin vitamiinit – ravinnossa olevat orgaaniset

yhdisteet jotka, usein pieninä määrinä, ovat ihmiselle välttämättömiä.
Vitamiinit jaettiin vesiliukoisiin ja rasvaliukoisiin; rasvaliukoisia vitamiineja ovat
A, D, E ja K-vitamiinit.

Kaikki rasvaliukoiset vitamiinit ovat polyisoprenoideja; ne rakentuvat

viisihiilisistä, haaroittuneista isopreeniyksiköistä. (Kolesterolikin on
polyisoprenoidi).

D3-vitamiini, kolekalsiferoli, syntyy 7-dehydrokolesterolista ihossa auringon

UV-valon vaikutuksesta. Maksassa ja munuaisissa toimivat entsyymit
muuttavat sitä 1,25-dihydroksikolekalsiferoliksi, joka säätelee kalsiumin ottoa
ravinnosta, ja kalsiumpitoisuuksia munuaisissa ja luussa.

HO
D-vitamiinin puute aiheuttaa riisitautia (rickets), jossa luusto ei muodostu
kunnolla.

Lääkkeenä ja ravintolisänä käytetty D2-vitamiini (ergokalsiferoli) valmistetaan

UV-säteilyttämällä ergosterolia.

1,25-dihydroksikolekalsiferolilla on tumassa oleva reseptori, kuten

steroideillakin.

A-vitamiini, retinoli, on rengasrakenteen sisältävä pitkäketjuinen isoprenoidi.

CH3 CH3

OH

CH3

Retinoiinihappo on epiteelin kehitykseen ja kasvuun osallistuva hormoni, jolla

on tumassa toimiva reseptori.

72
Retinaali on silmän verkkokalvolla olevan rodopsiinin valoa absorboiva osa,
joka on näköaistin toiminnalle välttämätön.

Kasvien β-karoteeni on retinolin esiaste, jonka selkärankaisten metabolia

pystyy katkaisemaan.

E- ja K-vitamiinit ja lipidikinonit hapetus-pelkistys-kofaktoreina

Vitamiini E käsittää ryhmän myös tokoferoleiksi kutsuttuja polyisoprenoideja,

jotka toimivat antioksidantteina, ja hakeutuvat solukalvoihin.
CH3
HO CH3 CH3
(CH2)3CH(CH2)3CH(CH2)3CH(CH3
CH3 O CH3
CH3

Vitamiini K on naftokinoni; se voi helposti osallistua hapetus-

pelkistysreaktioihin. Tärkeä osuus sillä on aktiivisen protrombiinin
muodostuksessa; K-vitamiini on välttämätön veren normaalille
hyytymiskyvylle.
O
CH3
CH3 CH3 CH3
CH2CH C(CH2)3CH(CH2)3CH(CH2)3CH(CH3
O

Warfariini on lääkeaine, joka muistuttaa rakenteeltaan K-vitamiinia; sitä

käytetään sekä rotanmyrkkynä, että lääkkeenä estämään patologista veren
hyytymistä.

Ubikinoni (koentsyymi Q) ja plastokinoni ovat mitokondrioiden ja kloroplastien

kalvoissa olevia elektroninsiirtoketjun hapetus-pelkistys-kofaktoreja.

Dolikoli on pitkäketjuinen polyisoprenoidi, joka siirtää glykosylaatioryhmiä

glykoproteiinien ja glykolipidien biosynteeseissä.

73