SVEUČILIŠTE U ZAGREBU

FARMACEUTSKO-BIOKEMIJSKI FAKULTET
ZAVOD ZA KEMIJU PREHRANE

Skripta za vježbe iz kolegija

BIOKEMIJA PREHRANE
SADRŽAJ

1. VITAMINI U NAMIRNICAMA 1
1.2. METODE ODREĐIVANJA VITAMINA U NAMIRNICAMA 3
1.2.1. Biološke metode 5
1.2.2. Mikrobiološke metode 5
1.2.3. Fizikalno kemijske metode 6
1.2.4. Usporedba metoda 9
2. RIBOFLAVIN 10
2.1. STRUKTURA, IZVORI, STABILNOST I BIOISKORISTIVOST 10
2.2. METODE ODREĐIVANJA RIBOFLAVINA 12
2.2.1. Biološke metode 12
2.2.2. Mikrobiološke metode 12
2.2.3. Fizikalno-kemijske metode 13
3.2.3.1. Kromatografske metode 13
3.2.3.2. Spektrofluorometrijske metode 14
3.2.3.3. Ostale metode 15
3. VITAMIN C 16
3.1. STRUKTURA, IZVORI, STABILNOST I BIOISKORISTIVOST 16
3.2. METODE ODREĐIVANJA VITAMINA C 19
3.2.1. Biološke metode 19
3.2.2. Mikrobiološke metode 19
3.2.3. Fizikalno-kemijske metode 19
3.2.3.1. Titrimetrijske metode 19
3.2.3.2. Spektrofotometrijske metode 20
3.2.3.3. Spektrofluorometrijske metode 22
3.2.3.4. Kromatografske metode 22
4. KAROTENOIDI 23
4.1. -KAROTEN 26
4.1.1. STRUKTURA, IZVORI, STABILNOST I BIOISKORISTIVOST 26
4.1.2. METODE ODREĐIVANJA KAROTENA 28
4.1.2.1. Kromatografske metode 28
4.1.2.2. Spektrofotometrijske metode 29
5. ENZIMI KOJI SUDJELUJU U RAZGRADNJI ŠKROBA 30
6. TRIPTOFAN 32
7. PROPISI ZA VJEŽBE 34
7.1. ODREĐIVANJE RIBOFLAVINA U NAMIRNICAMA 36
7.2. ODREĐIVANJE L-ASKORBINSKE KISELINE U VOĆNIM SOKOVIMA 39
7.3. ODREĐIVANJE KAROTENA U VOĆU I POVRĆU 41
7.4. ODREĐIVANJE INHIBICIJE α-AMILAZE 44
7.5. ODREĐIVANJE INHIBICIJE α-GLUKOZIDAZE 46
7.6. ODREĐIVANJE TRIPTOFANA 47
 1. VITAMINI U NAMIRNICAMA

Vitamini su organske tvari, koje su zbog svojih metaboličkih funkcija (koenzimi ili
prostetske skupine enzima, stabilizatori membrane, donori/akceptori H+/e- ili hormoni) u
malim količinama neophodne za normalan rad i razvoj organizma, a ljudski ih organizam ne
može sintetizirati, već je upućen na vanjske izvore i to prvenstveno uravnoteženom
prehranom.
Izuzetak je amid nikotinske kiseline (vitamin B3) kojeg organizam može sintetizirati iz
triptofana (esencijalna aminokiselina koju se također mora unijeti hranom) i vitamin D3, koji
se sintetizira u koži iz 7-dehidrokolesterola pod utjecajem Sunčevih zraka. Međutim, te
količine nisu dovoljne da bi bile zadovoljene sve metaboličke potrebe. pa je ove vitamine
poželjno unositi hranom. Potrebe za vitaminom K može zadovoljiti intenzivna intestinalna
mikrobna sinteza, dok je upitno u kojoj je količini za ljudski organizam bioiskoristiv biotin
(vitamin H), koji sintetiziraju mikroorganizmi gastrointestinalnog trakta, iako istraživanja
pokazuju da je količina tako sintetiziranog veća od unesenog hranom.
Budući da biljke imaju mogućnost sinteze pretežito svih vitamina (izuzetak vitamin
B12), namirnice biljnog porijekla (voće, povrće, grahorice i žitarice) glavni su izvori vitamina.
U biljkama, kao i u namirnicama životinjskog porijekla, vitamini se većim dijelom nalaze u
obliku estera fosforne kiseline i u kompleksima s proteinima.
Neki vitamini (A, D) mogu se nalaziti u biljnim namirnicama u obliku provitamina ( -
karoten, -karoten, steroli, itd.), spojeva koji nemaju vitaminska svojstva, ali u organizmu
metaboličkim procesima prelaze u vitamin. Općenito, većina vitamina mora proći neku vrstu
metaboličke aktivacije pri kojoj može doći do promjene kemijske strukture ili do vezanja u
neke funkcionalne oblike.
U humanoj prehrani namirnice životinjskog porijekla (meso, jaja, mlijeko i mliječni
proizvodi) također mogu biti dobri izvori pojedinih vitamina, iako se životinjsko tkivo
obogaćuje vitaminima posredno, preko hrane.
Količina vitamina prisutnog u nekoj namirnici nije ovisna samo o njezinom porijeklu,
već i o svojstvima samog vitamina kao što su topljivost, stabilnost, odnosno osjetljivost
(podložnost) na vanjske činitelje (temperatura, svjetlost, pH itd.)
S obzirom da je vitamine, kao heterogene spojeve, nemoguće podijeliti prema
njihovim kemijskim svojstvima, a zbog njihove specifičnosti nije moguća ni fiziološka
podjela, uobičajena je podjela na vitamine topljive u vodi (hidrosolubilne) i vitamine topljive
u mastima (liposolubilne). Takva podjela, prema samo jednom fizičkom svojstvu, ima

1
značenje samo ukoliko pokazuje u kojoj vrsti namirnica možemo naći veće koncentracije
pojedinih vitamina međutim, određuje djelom uvjete apsorpcije i transporta u organizmu.

Vitamini topljivi u vodi Vitamini topljivi u mastima

Vitamini B-kompleksa Vitamin A
Tiamin - B1 provitamin A (- karoten)
Riboflavin - B2 Vitamin D
Niacin - B3 Vitamin E
Pantotenska kiselina – B5 Vitamin K
Piridoksin – B6
Biotin – vitamin H
Folna kiselina
Vitamin B12 – cijanokobalamin
i
Vitamin C

Analiza vitamina u hrani i različitim biološkim materijalima ima važnu ulogu u

kontroli dnevnog unosa vitamina potrebnih za normalnu funkciju organizma. Štoviše, u svrhu
procjene primjerenosti, kao i poboljšanja humane prehrane, potrebno je poznavanje točnog
unosa ovih za metabolizam izuzetno važnih spojeva. To je jedan od razloga zašto je potrebno
provoditi pouzdane analize koje omogućuju točan uvid u kakvoću pojedine namirnice. Pri
tome treba također uzeti u obzir da je u organizmu djelovanje vitamina topljivih u vodi kraće
od vitamina topljivih u mastima koji se pohranjuju na dulje vrijeme. Stoga je stalna, može se
reći svakodnevna, zastupljenost vitamina C i vitamina B-kompleksa u prehrani donekle
važnija od vitamina A, E, D ili K.
Osim saznanja o udjelu vitamina primarno prisutnih u hrani potrebna je i kontrola
količine vitamina dodanih u svrhu obogaćivanja industrijskih proizvoda i poboljšanja njihove
biološke vrijednosti, odnosno kakvoće.
Kako današnja prehrana i moderan način života uključuju i različite tehnološke
procese pripremanja, čuvanja i konzerviranja hrane, nužno je, osim u svježim namirnicama,
koncentracije vitamina određivati i u tako obrađenim namirnicama. Pri tome su osobito
korisni podaci o sadržaju vitamina u zamrznutoj, sušenoj i blanširanoj hrani jer su to postupci
koji se danas svakodnevno koriste kako u industriji tako i u kućanstvima.

2
 S obzirom na složenost sastava hrane, da bi se mogle provesti zadovaljavajuće analize,
razvijen je niz različitih metoda za određivanje vitamina koje su primjenjive za pojedinu vrstu
namirnica.

1.2. METODE ODREĐIVANJA VITAMINA U NAMIRNICAMA

Za određivanje vitamina u namirnicama koriste se različite metode koje se mogu

svrstati u tri glavne skupine:
 biološke metode
 mikrobiološke metode
 fizikalno- kemijske metode

S obzirom na jednostavnost izvođenja ovih metoda, ali ne nužno s obzirom na točnost

i preciznost, ova podjela može imati i drugačiji redoslijed. Iz tog razloga, biološke metode su
čak i kod rutinskih određivanja ograničene samo na one vitamine za koje nema
zadovoljavajućih drugih metoda, a želi se odrediti i biološka aktivnost i bioiskoristivost
pojedinog vitamina (koriste se kod određivanja vitamina D i B12).
Kriterij odabira pojedine metode ovisi o nizu činitelja, uključujući potrebe za točnošću
i preciznošću, ali isto tako i o opremljenosti laboratorija. Također se mora uzeti u obzir i
primjenjivost pojedine metode za određenu namirnicu. Mnoge predložene AOAC
(Association of Official Analytical Chemists) standardne metode ograničene su u smislu
primjenjivosti na određenu namirnicu (npr. metoda za određivanje nekog vitamina samo u
mlijeku ili metoda za određivanje tog istog vitamina samo u žitaricama i proizvodima od
žitarica), te se ne mogu primijeniti na ostalu hranu bez manjih ili većih modifikacija ili se ne
mogu uopće primijeniti.
Osim pravilnog odabira metode, za određivanje pojedinog vitamina potrebna je i
dobra predobradba uzorka namirnice (priprema uzorka i po potrebi ekstrakcija vitamina iz
analizirane namirnice) koja također može utjecati na rezultate analize.

Priprema uzorka
Tijekom analitičkog postupka, zbog osjetljivosti nekih vitamina na uvjete okoliša kao
što su svjetlost, kisik, pH, temperatura itd., trebaju se provesti mjere opreza da bi se spriječila
razgradnja, odnosno bilo kakva promjena uzorka bez obzira koja se metoda koristi. Kod
bioloških analiza takve mjere opreza moraju se provoditi i sa testiranim životinjama tijekom

3
perioda hranjenja. Mjere opreza potrebne su i kod mikrobioloških i fizikalno-kemijskih
metoda za vrijeme analitičkog postupka, a osobito tijekom ekstrakcije vitamina iz uzorka.
Kao i kod svake analitičke metode pravilno uzimanje uzoraka, kao i priprema
homogenog uzorka kritične su faze postupka određivanja vitamina, jer se početne greške
odražavaju na krajnji rezultat. Uzorak mora biti reprezentativan (osobito treba paziti kod
sirovih namirnica) i što je izuzetno važno, masa uzorka mora biti takva da se koncentracija
određivanog vitamina u mjernoj otopini kreće unutar granica detekcije metode kojom se
vitamin određuje. Podaci o približnim količinama vitamina u pojedinoj namirnici, koji su u tu
svrhu potrebni, mogu se naći u različitim prehrambenim tablicama.

Postupci ekstrakcije
Analize vitamina, u većini slučajeva, prije samog postupka određivanja uključuju
ekstrakciju vitamina iz namirnice i njihovo oslobađanje iz vezanih oblika. Iznimke su neki
biološki pokusi. Metode ekstrakcije, ovisno o potrebi, uključuju jedan ili više postupaka
obradbe namirnice: toplinom, kiselinom, lužinom, otapalom i/ili enzimom.
Općenito, postupci ekstrakcije su specifični za svaki vitamin i pri tome treba paziti da
ne dođe do razgradnje vitamina koji se određuje. U nekim se slučajevima određeni postupci
mogu primijeniti za ekstrakciju više od jednog u vodi topljivog vitamina (npr. paralelna
ekstrakcija tiamina i riboflavina) ili kod pojedinih u mastima topljivih vitamina.

Tipični ekstrakcijski procesi su:

Vitamin C hladna ekstrakcija metafosfornom kiselinom/octenom kiselinom

kiselinska hidroliza (autoklaviranje ili vruća vodena kupelj)

Vitamin B1, B2 i B6
enzimska hidroliza (inkubacija u termostatu )

. kiselinska hidroliza (autoklaviranje ili vruća vodena kupelj)

/namirnice koje nisu na bazi žitarica/
Vitamin B3
lužnata hidroliza (autoklaviranje)
/proizvodi od žitarica/

Vitamini A, E ili D ekstrakcija organskim otapalima, saponifikacija, reekstrakcija

s organskim otapalima (kod ovih se nestabilnih vitamina
rutinski dodaju antioksidansi kako bi se spriječila oksidacija).

Analize vitamina topljivih u mastima mogu zahtijevati primjenu saponifikacije na

sobnoj temperaturi preko noći ili pomoću refluksiranja pri temperaturi od 70 oC.

4
1.2.1. Biološke metode

Određivanje vitamina biološkim metodama izvodi se pretežito s laboratorijskim

životinjama. Ovisno o vitaminu koji se određuje najčešće se koriste miševi i štakori (vitamin
D), zamorci (vitamin C), pilići (vitamini A i D), golubovi (vitamin B1) itd. Takvim pokusima
utvrđuje se djelovanje vitamina na funkcije pojedinih organa, odnosno cijelog organizma.
Međutim, ova određivanja su skupa i dugotrajna (uzgoj i prehrana životinja, uvježbano
osoblje itd.).
Osim toga, pri radu sa životinjama, treba uzeti u obzir niz faktora (npr. individualne
osobine životinja, uvjete pod kojima žive, kako se hrane i uzgajaju). Za ispitivanje vitamina
potrebno je uzeti za svaku dozu vitamina po 10 i više životinja uz isti broj kontrolnih životinja
kroz period od nekoliko tjedana. Dobiveni rezultati opterećeni su velikim greškama (često
više od 25 %) i teško su ponovljivi (nisu reproducibilni).
Razlikuju se profilaktične i kurativne metode određivanja. Profilaktičnom metodom
utvrđuje se najmanja količina vitamina potrebna za sprečavanje pojave simptoma bolesti, tj.
životinja za vrijeme ispitivanja mora ostati potpuno zdrava. Kurativnom metodom određuje se
minimalna količina vitamina koja je potrebna da nestanu simptomi bolesti u životinje.
Osim za određivanje bioiskoristivosti vitamina, biološke metode koriste se danas samo
za određivanje vitamina B12 i D (npr. za D vitamin je preporučena standardna AOAC metoda
936.14 poznata kao „line test“ koja se osniva na kalcifikaciji kostiju).

1.2.2. Mikrobiološke metode

Mikrobiološke metode su ograničene u primjeni na vitamine koji su topljivi u vodi

(pretežito vitamini B kompleksa). Vrlo su osjetljive i specifične za svaki vitamin. Te metode
su vremenski kraće od bioloških metoda, ali je potrebno strogo pridržavanje analitičkog
protokola da bi se dobili točni rezultati.
Rast mikroorganizama proporcionalan je njihovim potrebama za pojedinim
vitaminima. Na taj se način u mikrobiološkim analizama rast određenog mikroorganizma u
ekstraktu uzorka, koji sadrži vitamin, uspoređuje s rastom tog mikroorganizma u prisutnosti
poznatih količina tog vitamina. Kao test organizmi koriste se bakterije, kvasci ili protozoe.
Rast se može mjeriti:
 praćenjem zamućenja (turbiditet)
 mjerenjem količine staničnog dušika (respiracije)

5
  količine produkata metabolizma određenog mikroorganizma (npr. mliječne kiseline,
CO2 i sl.)
 gravimetrijski (iz mase osušenih stanica).

Kod bakterija i kvasaca najčešće se koristi metoda mjerenja zamućenja kod koje se
uspoređuje zamućenost uzoraka i standardnih ekstrakata. Što se tiče duljine inkubacije,
metode mjerenja zamućenja su kraće od ostalih analiza.
Princip mikrobioloških analiza vitamina u namirnicama temelji se na činjenici da
podloga za rast mikroorganizama mora sadržavati sve hranjive tvari osim one koja se
određuje, odnosno vitamina koji se određuje. Hranjive podloge za razvitak mikroorganizma
sadrže dušik, mineralne soli, ugljikohidrate i vitamine B kompleksa (ako se koji određuje
onda ga se treba izuzeti iz hranjive podloge) i purinske baze. Vitamin se određuje u
odgovarajuće pripremljenom ekstraktu analizirane namirnice. Standardna krivulja za
izračunavanje načini se s onim vitaminom koji se određuje i nije sadržan u hranjivoj podlozi.
Pri radu je potrebno primijeniti mikrobiološke tehnike, tj. sterilizaciju, inokulaciju,
inkubaciju itd. Kao mikroorganizmi mogu se, već prema tome koji se vitamini B-kompleksa
određuju, primijeniti razni sojevi: Lactobacillus, Leuconostoc mesenteroides, Leuconostoc
citrovorum ili Streptococcus faecalis.
Iako su mikrobiološke metode znatno dulje i nisu toliko precizne kao instrumentalne,
odlikuju se velikom osjetljivošću i specifičnošću. Njihova točnost može se povećati
primjenom prikladnih postupaka čišćenja ekstrakta od tvari koje mogu smetati (npr.
primjenom tankoslojne kromatografije ili ionskih izmjenjivača).

1.2.3. Fizikalno-kemijske metode

Ovisno o vitaminu koji se određuje, kao i o vrsti namirnice u kojoj se određuje

pretežito se koriste:
 kromatografske metode
 spektrofotometrijske metode
 spektrofluorometrijske metode
 oksido-redukcijske (titrimetrijske) metode

Od kromatografskih metoda, za određivanje vitamina u namirnicama, najčešće se

koristi tekućinska kromatografija visoke djelotvornosti (HPLC) i to tekućinska kromatografija

6
obrnutih faza s UV ili fluorescentnom detekcijom. Ove metode su vrlo prikladne, osobito za
rutinska određivanja (u laboratorijima za kontrolu kvalitete namirnica), jer su brze i lako
izvedive. Točne su, reproducibilne, mogu se odrediti vrlo niske koncentracije pojedinih
vitamina (naročito fluorescentnom detekcijom koja je znatno selektivnija), koristi se relativno
mala masa uzorka i što je izuzetno važno imaju visoku sposobnost odjeljivanja. Neke od njih
predložene su i za istodobno (simultano) određivanje više vitamina (najčešće vitamina B
kompleksa – tiamina, riboflavina, niacina itd.) što znatno ubrzava analizu namirnice. Imajući
u vidu navedeno, HPLC se trenutno smatra metodom izbora za određivanje vitamina u
namirnicama. S obzirom na vitamin koji je potrebno odrediti, kao i vrstu namirnice u kojoj se
određuje, predložen je niz različitih postupaka koji se međusobno razlikuju po primijenjenoj
ekstrakciji vitamina iz namirnice, korištenoj kromatografskoj koloni (različite pokretne i
nepokretne faze) odnosno vrsti reagensa koji se u tu svrhu koristi. Općenito, HPLC metode
se, s obzirom na uporabu manje toksičnih otapala, u odnosu na ostale kromatografije kao npr.
tankoslojnu kromatografiju (TLC), smatraju najprihvatljivijim jer znatno manje onečišćuju
okoliš.
Koncentracija vitamina izračunava se na temelju visine pika uzorka u usporedbi s
pikom standarda vitamina koji se određuje i koji je podvrgnut istom analitičkom postupku kao
i uzorak. Greške do kojih može doći kod HPLC određivanja pretežito potječu iz predobradbe
uzorka prije samog kromatografskog postupka, što uključuje:
 uzorkovanje (ako nije izuzet reprezentativni uzorak hrane)
 nehomogenost uzorka
 nepotpunu ekstrakciju
 fizičke gubitke vitamina (npr. tijekom odjeljivanja i ispiranja te zbog
adsorpcije na staklene stijenke spremnika)
 izomerizaciju
 oksidaciju vitamina tijekom analize.

Od ostalih metoda najčešće se koriste spektrofotometrijske i spektrofluorometrijske

metode koje se temelje na mjerenju apsorbancije, odnosno flourescencije spojeva ili
kompleksa nastalih reakcijom određivanog vitamina s odgovarajućim reagensom pri
određenim uvjetima. Budući da su ove metode jednostavne, točne, reproducibilne i relativno
brze, a ne koriste se skupi instrumenti, predložene su velikim dijelom kao AOAC standardne
metode za određivanje vitamina u različitim namirnicama i koriste se u laboratorijima za
kontrolu nutritivne vrijednosti namirnica.

7
 Osim, već kod kromatografskih metoda spomenutih grešaka pri pripremi uzoraka i
ekstrakciji vitamina iz namirnica i kod spektrofotometrijskih i spektrofluorometrijskih metoda
treba također obratiti pažnju na čišćenje ekstrakta od supstancija koje bi mogle interferirati
apsorpcijom svjetla, odnosno fluorescencijom pri istoj valnoj duljini kao i određivani spoj. U
tu se svrhu mogu koristiti kromatografska odjeljivanja na različitim adsorbensima i/ili
postupak s “unutarnjim standardom”.
Kada metoda ne uključuje čišćenje ekstrakta ili ono nije potpuno, a zbog niza
kompleksnih reakcija i fizičkih procesa moguće su greške zbog utjecaja matriksa (reakcije
nisu 100 %), uveden je paralelni postupak s dodatkom standarda vitamina koji se određuje.
Nakon ekstrakcije (kiselinska hidroliza, enzimska hidroliza itd.) paralelnom alikvotu uzorka
dodaje se poznata količina standardne otopine vitamina koji se određuje, približne
koncentracije koja se očekuje u alikvotu probe, koji se dalje obrađuje na isti način kao i proba
samog uzorka. Time se povećava specifičnost ovih metoda.
Točnosti metode pridonosi i slijepa proba koja je potrebna da bi se izbjegle greške
zbog mogućih interferirajućih čestica. Osim slijepe probe, koja uključuje samo one reagense
koji se koriste prije samog mjerenja uzorka, može se koristiti i “prava slijepa proba” kod koje
je pod određenim uvjetima provedena razgradnja određivanog vitamina bez narušavanja
cjelovitosti (integriteta) uzorka.
Iako se i kod spektrofotometrijskih i spektrofluorometrijskih metoda mora paziti na
utjecaj specifičnih stranih tvari koje smetaju pri reakcijima, spektrofluorometrijske „hvataju”
znatno manje prisutnih interferirajućih čestica, selektivnije su i osjetljivije. Osim toga
problem “bojenih reakcija” je i u tome što mogu obuhvaćati samo pojedine funkcionalne
skupine (npr. kod vitamina B6 reagiraju samo fenolne hidroksilne skupine).
Kod analiza namirnica nepoznatog sastava preporuča se paralelna uporaba kemijskih i
bioloških metoda, jer se na taj način dobije najtočniji uvid, ne samo u udio vitamina u nekoj
namirnici, već i o njegovoj bioiskoristivosti iz te namirnice. Također, za određivanje vitamina
B-kompleksa preporuča se korištenje mikrobioloških metoda kao referentnih metoda.

8
1.2.4. Usporedba metoda

Svaka metoda ima svojih prednosti i nedostataka pa zato pri odabiru metode za
određivanje vitamina treba obrati pažnju na glavne uvjete koje ta metoda treba zadovoljiti, a
to su:
 potrebna preciznost i točnost metode
 postoji li potreba za podatkom o bioiskoristivosti vitamina
 vremensko trajanje i sredstva za provođenje analize
 tip biološkog matriksa (vrsta namirnice) koji se analizira
 broj uzoraka koje treba analizirati
 postoji li potreba za službeno propisanom metodom (standardna metoda)

Biološke analize su dugotrajne i njihovo korištenje je općenito ograničeno na one

slučajeve gdje ne postoji druga metoda ili u slučajevima u kojima se želi odrediti
bioiskoristivost vitamina, posebno ako se već nisu koristile druge metode. Prednost bioloških
metoda je u tome što ponekad nije potrebno pripremiti ekstrakt i na taj način je isključena
neželjena razgradnja vitamina tijekom postupka pripreme ekstrakta.
Mikrobiološke i fizikalno kemijske metode zahtijevaju ekstrakciju vitamina. Općenito,
rezultati tih metoda daju uvid u ukupnu količinu određenog vitamina u specifičnom
biološkom matriksu kao što je to hrana, ali ne nužno i njegovu biološku dostupnost za ljude.
Primjena mikrobioloških analiza ograničena je na vitamine topljive u vodi. Usprkos
tome što nešto dulje traju, općenito ih se može koristiti za analizu relativno široke palete
bioloških matriksa bez velikih prilagodbi.
Zbog njihove relativne jednostavnosti, točnosti, preciznosti i brzine fizikalno-kemijske
metode, i to posebice kromatografske metode (HPLC), mogu se preporučiti za određivanje
vitamina. Iako HPLC metode uvjetuju znatne materijalne troškove, njihova je prednost u tome
što su primjenjive i za različite vitamine (u nekim slučajevima i za istovremene analize većeg
broja vitamina i/ili izomera vitamina) kao i za različite vrste namirnica.

9
2. RIBOFLAVIN (Vitamin B2)

2.1. STRUKTURA, IZVORI, STABILNOST I BIOISKORISTIVOST

Riboflavin je derivat aloksazina, a izgrađen je od pteridinskog prstena, koji je

kondenziran benzenski prsten, dok je pobočni lanac ribitol (peteročlani polihidroksi-lanac)
(slika 1).

OH
HO
OH
HO

H3C N N O

NH
H3C N
O
Slika 1. Strukturna formula riboflavina

Čisti riboflavin je narančasto-žute boje (koju mu daju kromoformne azometinske

skupine), a neutralne vodene otopine riboflavina imaju intenzivnu žuto-zelenkastu
fluorescenciju koja nastaje dodatkom lužina ili mineralnih kiselina. Na ovim se svojstvima
temelje metode za određivanje riboflavina u namirnicama i vitaminskim preparatima.
Riboflavin je široko rasprostranjen u namirnicama, gotovo uvijek vezan na proteine
(iznimka su mlijeko i jaja u kojima je prisutan u znatnim količinama kao slobodan riboflavin)
i to pretežito kao biološki aktivni oblik flavin-mononukleotid (FMN) i flavin-adenin-
dinukleotid (FAD) (slika 2). Sva tri oblika mogu zadovoljiti potrebe za ovim vitaminom.
Zeleno lisnato povrće bogato je riboflavinom, međutim glavni izvori u humanoj
prehrani su meso i mliječni proizvodi (osobito mlijeko koje čini polovicu od ukupnog
dnevnog unosa ovog vitamina) (tablica 1).

10
 NH2
O
O O N N
O P OH
HO O P O P N
OH HO N
OH OH OH
OH
HO
HO
HO OH
H3C N N O H3C N N O

NH NH
H3C N H3C N
O O
FMN FAD

Slika 2. Strukturne formule flavin-mononukleotida (FMN) i flavin-adenin-

dinukleotida (FAD)

Riboflavin je relativno stabilan na povišenim temperaturama tako da sterilizacija,

konzerviranje i kuhanje ne utječu znatno na njegov udio u namirnicama. Podložan je
djelovanju x-, - i UV- zračenja. Izloženost svjetlu (npr. sušenje na Suncu, pohranjivanje u
prozirnim staklenim bocama, kuhanje u otvorenoj posudi) može rezultirati značajnim
gubitkom riboflavina s obzirom na njegovu osjetljivost i brzu razgradnju pod utjecajem
svjetlosti. Zračenjem hrane stvaraju se reaktivni kisikovi slobodni radikali koji razaraju
riboflavin. Tako se u mlijeku izloženom jedan dan Sunčevoj svijetlost u prozirnoj staklenoj
boci može izgubiti više od polovice ukupnog riboflavina. Procesi pasterizacije, isparavanja
(evaporacije) ili kondenzacije imaju mali učinak na njegov sadržaj u mlijeku. Kratkim
steriliziranjem mesa γ- zračenjem udio riboflavina se smanjuje za 10-15 %.

Tablica 1. Udio vitamina B2 u pojedinim namirnicama

Povrće Voće
0.04 - 0.20 mg/100g 0.01 - 0.07 mg/100g
krumpir brokula jabuka jagoda

Žitarice Meso
0.01 - 0.11 mg/100 g 0.19 - 3.5 mg/100g
riža pšenica (puno zrno) piletina jetra

Ribe Ostale namirnice

0.09 - 0.26 mg/100g kvasac (suhi) 5.4 mg/100g
mlijeko 0.17 mg/100g
jaja 0.30 mg/100 g

11
 Iako će se dio riboflavina naći u sokovima mesa i vodi u kojoj se meso kuhalo,
riboflavin je relativno slabo topljiv u vodi tako da su gubitci u namirnicama tijekom kuhanja
znatno manji nego kod ostalih vitamina topljivih u vodi. Stabilan je u namirnicama za vrijeme
pohranjivanja ukoliko nisu izložene visokim temperaturama.
U zrnu žitarica riboflavin se nalazi najviše u klicama, odnosno u skutelumu tako da ga
se preradom izgubi više od trećine. Zato se proizvodi žitarica, kod kojih se ne koristi puno
zrno žita, obogaćuju ovim vitaminom. Često, tako obogaćeni proizvodi imaju znatno više
vitamina nego osnovne sirovine. Kod prerade riže također dolazi do gubitka i to oko polovice
prisutnog vitamina, međutim riža se obično ne obogaćuje da bi se izbjeglo obojenje ovim
intenzivno žutim vitaminom.
Budući da je apsorpcija riboflavina iz životinjskog tkiva znatno bolja (žučne soli
pojačavaju apsorpciju - mehanizam nepoznat) nego iz biljnog (flavinski kompleksi u biljnom
tkivu otporniji su na digestiju), bioiskoristivost ovog vitamina veća je iz namirnica
životinjskog porijekla.

2.2. METODE ODREĐIVANJA RIBOFLAVINA

2.2.1. Biološke metode

Biološke metode kod koji se pretežito koriste štakori i pilići kao pokusne životinje su
skupe, dugotrajne i nereproducibilne te se rijetko koriste.

2.2.2. Mikrobiološke metode

Prve metode koje su se koristile za određivanje riboflavina bile su mikrobiološke

metode. Nakon pripreme uzorka namirnice i provedene ekstrakcije (kiselom i enzimskom
hidrolizom oslobađanje vezanih oblika) riboflavin se određuje nekim od standardnih
mikrobioloških postupaka (praćenjem porasta mikroorganizama iz osušenih stanica,
određivanjem zamućenja itd.). Dobri rezultati postignuti su sa Lactobacillus casei i
Leuconostoc mesenteroides pa se oni koriste kod standardnih mikrobioloških određivanja
riboflavina.

12
2.2.3. Fizikalno - kemijske metode
Ove metode mogu se podijeliti na četiri glavne skupine:
 kromatografske metode
 spektrofluorometrijske metode
 spektrofotometrijske metode
 polarografske i voltametrijske metode

U analitici namirnica za određivanje riboflavina pretežito se koriste kromatografske i

spektrofluorometrijske metode. Međutim, kako se u namirnicama riboflavin nalazi gotovo
isključivo u vezanom obliku kao ester fosforne kiseline i vezan na proteine (izuzetak mlijeko i
jaja), mora se prije određivanja provesti ekstrakcija u obliku kiselinske i enzimske hidrolize.
Reagensi, vrijeme i temperatura hidrolize i inkubacije propisani su odabranom metodom.

2.2.3.1. Kromatografske metode

Za određivanje riboflavina u namirnicama najčešće se koriste HPLC adsorpcijska

tekućinska kromatografija i kromatografija obrnutih faza s UV ili fluorescentnom detekcijom.
Metode su brze, točne i reproducibilne, a mogu se određivati i vrlo niske koncentracije
riboflavina. Neke od tih metoda predložene su i za istodobno (simultano) određivanje i ostalih
vitamina B- kompleksa (tiamina, niacina, piridoksina, pantotenske i folne kiseline) te
vitamina C.
HPLC metoda je preporučena za određivanje riboflavina u mlijeku ukoliko su prisutni
tetraciklini (rezultat prevencije ili liječenja mastitisa u krava). Istraživanja su pokazala da se
zbog fluorescencije ovih spojeva u istom valnom području (ekscitacija tetraciklina od 310-
420 nm i emisija od 420-590 nm, a ekscitacija riboflavina od 325-405 nm i emisija od 320-
590 nm), ne mogu koristiti fluorometrijske metode.
Tankoslojna kromatografija se rjeđe koristi. Za čišćenje i separaciju tri najčešća
flavinska oblika (FAD, FMN i riboflavin) kao nepokretna faza koristi se silikagel G. Otapalo
je vodena otopina Na2HPO4 x H2O (w = 0.05), a pokretna faza je otopina metanola (w = 0.5),
te se sušenje odvija pri sobnoj temperaturi

13
2.2.3.2. Spektrofluorometrijske metode

Osnovne razlike predloženih spektrofluorometrijskih metoda za određivanje

riboflavina u namirnicama su u tome mjeri li se prirodna karakteristično žuto-zelena
fluorescencija riboflavina ili se mjeri fluorescencija lumiflavina, odnosno lumikroma, spojeva
koji nastaju osvjetljavanjem (fotooksidacijom) riboflavina u lužnatom, odnosno neutralnom
mediju (odcjepljenje riboze).
S obzirom da se u namirnicama biljnog porijekla nalaze flavini koji ometaju izravno
određivanje riboflavina jer fluoresciraju pri istim ili bliskim valnim duljinama, lumiflavin- ili
lumikrom-postupkom postiže se pomak od valnih duljina pri kojima apsorbiraju ostali flavini
te se na taj način mogu izbjeći interferencije.

Metode se međusobno razlikuju obzirom na:

kiselinska hidroliza (HCl ili H2SO4, c = 0.1 mol/L)

● ekstrakciju uzorka
enzimska hidroliza (različiti enzimi i vrijeme inkubacije)

uklanjanje pratećih obojenih tvari oksidacijom s KMnO4

● pročišćavanje ekstrakta
pored oksidacije s KMnO4 i adsorpcija na aktivnoj zemlji

razgradnja riboflavina dodatkom natrijeva pirosulfita

(kod metoda sa djelomičnim pročišćavanjem filtrata)
● slijepu probu
smjesa samo onih reagensa koji su prisutni u mjernoj
otopini

Standardne AOAC fluorometrijske metode

Za određivanje riboflavina u namirnicama i vitaminskim preparatima koriste se

standardne AOAC fluorometrijske metode koje se temelje na mjerenju fluorescencije
riboflavina (valna duljina ekscitacije kreće se oko 440 nm, a emisije oko 565nm) nakon
ekstrakcije uzorka i pročišćavanja filtrata oksidacijom s kalijevim permanganatom.
Slijepa proba priprema se dodatkom natrijeva pirosulfita, čime se postiže potpuna
razgradnja riboflavina, bez narušavanja integriteta uzorka.

14
Modificirana lumiflavin metoda

Za određivanje riboflavina u hrani koristi se modificirana spektrofluorometrijska

metoda, odnosno modificirani lumiflavin postupak koji su predložili Hausher i sur. Nakon
ekstrakcije uzorka kiselinskom hidrolizom (H2SO4 c = 0.1 mol/L u autoklavu na 105–110 oC,
15 min.), enzimskom hidrolizom (klaraza, pH 4.5, u termostatu 20 min pri 45 oC) i oksidacije
dijela interferirajućih komponenti s kalijevim permanganatom uključuje i uklanjanje ostalih
balastnih tvari adsorpcijom na aktivnoj zemlji (Frankonit). Time mjerenje ne ometaju drugi
fluorescirajući spojevi, a primjenom metode "unutarnjeg standarda" (paralelno se radi uzorak
s dodatkom standardne otopine riboflavina koncentracije koja se očekuje u uzorku) postiže se
veća specifičnost i otklanjaju greške u radu.
S obzirom na dobar postupak čišćenja ekstrakta kao slijepa proba može se koristiti
smjesa otapala (etanol + kloroform) koja se koristi i kod mjerne otopine uzorka.
Mjerenje fluorescencije lumiflavina provodi se na spektrofluorometru pri valnoj
duljini ekscitacije 440 nm i emisije 505 nm.
Kako je riboflavin vrlo osjetljiv na svjetlo, potrebno je postupak izvoditi kod
prigušenog dnevnog svjetla uz primjenu smeđeg staklenog suđa, pogotovo što se kod
toplinske obrade uzorka povećava mogućnost razgradnje riboflavina.

2.2.3.3. Ostale metode

Ostale predložene metode (fotometrijske, polarografske i voltametrijske)

primijenjuju se samo za određivanje riboflavina u farmaceutskim i vitaminskim preparatima.

Spektrofotometrijska metoda
Spektrofotometrijska metoda koja se temelji se na mjerenju intenziteta žute boje
riboflavina ima određena ograničenja jer mogu smetati ostali obojeni spojevi stoga su bolje
one metode kod kojih se stvaraju narančasto obojeni kompleksi riboflavina (npr. s bakrovim
trifenilfosfinom). Reakcija je specifična i ništa ne smeta apsorpciji pri 460-465 nm, ali se ne
preporuča za određivanje riboflavina u kompleksnim materijalima kao što je hrana.

15
3. VITAMIN C (askorbinska kiselina)

3. 1. STRUKTURA, IZVORI, STABILNOST I BIOISKORISTIVOST

Pod nazivom C vitamin podrazumijeva se L-askorbinska kiselina i njezin oksidirani

oblik L-dehidroaskorbinska kiselina. Oba oblika su široko rasprostranjena i u biljnom i u
životinjskom tkivu.

OH OH
HO HO
O O
O O

HO OH O O

L-askorbinska kiselina L-dehidroaskorbinska kiselina

Slika 3. Strukturna formula C vitamina

L-askorbinska kiselina je optički aktivna jer su atomi C-4 i C-5 kiralni. Za biološku
aktivnost važna je konfiguracija na C-4 atomu. Prisutnost enolnih hidroksilnih skupina na C-2
i C-3 atomu daje kiselinska svojstva i jako izraženu reduktivnu sposobnost L-askorbinske
kiseline.
Prirodni izomer je L- askorbinska kiselina, dok ostale izomere ne sintetizira živa
stanica s tim da D-askorbinska kiselina pokazuje svega 1/10 aktivnosti L-izomera.
Osim, vjerojatno, svih zelenih biljaka i mnoge više životinjske vrste mogu sintetizirati
vitamin C, tako da za većinu sisavaca askorbinska kiselina nema značenje vitamina jer je
mogu sami sintetizirati.
Askorbinska kiselina je, pored vitamina B-kompleksa, najšire zastupljen vitamin u
namirnicama biljnog i životinjskog porijekla. Glavni prirodni izvori su svježe voće i zeleno
povrće, odnosno biljke općenito. Najviše je ima u lišću, a tijekom razvitka biljke sintetizira se
kako u zelenim, tako i u stanicama u kojima nema klorofila. Najveći dio askorbinske kiseline
u biljkama nalazi se u reduciranom obliku, oko 95 %, dok se 5 % nalazi u oksidiranom obliku,
odnosno kao dehidroaskorbinska kiselina.
Zastupljenost askorbinske kiseline u pojedinim biljkama i njihovim dijelovima zavisi
od utjecaja niza činitelja kao što su kvaliteta zemljišta, klima, uvjeti prehrane, stupanj zrelosti
i stadij razvitka. Jedan od najboljih izvora askorbinske kiseline su plodovi šipka. Naročito je

16
ima je u paprici, limunu, naranči, trešnji, rajčici i kupusu. Krumpir ima relativno malo
askorbinske kiseline, ali je ipak važan izvor s obzirom da je visoko zastupljen u ljudskoj
prehrani. Dobri izvori mogu biti i neke namirnice životinjskog podrijetla kao što su to npr.
jetra i bubrezi, dok samo meso ima niske koncentracije (tablica 2).

Tablica 2. Sadržaj vitamina C u pojedinim svježim namirnicama

Voće povrće
10 - 1000 mg/100g 10 - 150 mg/100g
banana šipak krumpir kelj
višnja
Namirnice životinjskog podrijetla
Meso 0 – 2 mg/100 g
jetra, bubreg 10 – 40 mg/100g
mlijeko 1 – 2 mg/100 g
mlijeko (hum.) 3 – 6 mg/100 g

Jedino je čista, kristalna L-askorbinska kiselina u suhom stanju i u čistim otopinama u

odsutnosti oksidacijskih sredstava i pod posebnim uvjetima stabilna i postojana. Otopine L-
askorbinske kiseline su nestabilne jer podliježu razgradnji u prisutnosti oksidacijskog
sredstva, a pogotovo molekulskog kisika. Oksidacijom L-askorbinska kiselina prelazi u L-
dehidroaskorbinsku kiselinu koja zadržava vitaminska svojstva, a daljnjom oksidacijom i
prelaskom u 2,3 diketogulonsku kiselinu gubi se vitaminska aktivnost.
Oksidaciju L-askorbinske kiseline potiču svjetlo, reakcije u lužnatom mediju i teški
metali (Fe, Cu, Ag). Povišene temperature također pospješuju razgradnju. Oksidaciju u
biološkom materijalu kataliziraju i razni enzimi, osobito tijekom dugotrajnog i/ili
neadekvatnog pohranjivanja. Oksidacija može biti posredna preko polifenol-oksidaznog
sustava ili neposredna s molekulskim kisikom djelovanjem oksidaze L-askorbinske kiseline.
Kod povišene temperature najstabilnija je peroksidaza pa inaktivacija ovog enzima toplinom
osigurava inaktivaciju ostalih enzima koji oksidiraju L-askorbinsku kiselinu i time se
osigurava njezina stabilnost.
Stabilizacija otopina L-askorbinske kiseline može se postići i dodatkom organskih i
mineralnih kiselina, aminokiselina koje sadrže sumpor, flavonoida, pektina i fitinske kiseline
(kompleksno vežu ione metala). Na njenu stabilnost također pozitivno utječu monosaharidi
(osobito fruktoza) i disaharidi. Ovi ugljikohidrati u otopini povećavaju viskozitet čime se
smanjuje difuzija kisika.

17
 S obzirom da oksidacijom L-askorbinske kiseline nastaju inaktivni spojevi, koji ne
posjeduju vitaminsko djelovanje, tijekom obrade hrane potrebno je paziti na uvjete rada i time
maksimalno smanjiti njezinu razgradnju.
Kako je L-askorbinska kiselina termolabilna supstancija, povišenje temperature
također pospješuje razgradnju. Do razgradnje dolazi kuhanjem namirnica pri visokim
temperaturama, pogotovo u bakrenim posudama ili posudama od nekih drugih metala (koji
mogu djelovati katalitički). Gubitak vitamina znatno se smanjuje skraćivanjem vremena
kuhanja i kuhanjem u što manje vode jer je vitamin C u vodi lako topljiv. Vodu nakon
kuhanja ne treba bacati jer sadrži vitamine otopljene iz hrane tijekom kuhanja.
Prilikom pohranjivanja može doći do razgradnje L-askorbinske kiseline s tim da su
gubici to manji što je temperatura pohrane niža i vrijeme pohranjivanja kraće (tablica 3). Zato
je voće izuzetno dobar izvor vitamina C budući da se pretežito koristi sirovo pa se izbjegava
gubitak preradom.

Tablica 3. Gubitak C vitamina u namirnicama pohranjenim 2 dana

Namirnica Gubitak pri 4 oC, % Gubitak pri 20 oC, %

Grah 33 53
Cvjetača 8 26
Salata 36 42
Peršin 13 70
Grašak 10 36
Špinat 32 80
Špinat (zimski) 7 22

18
3.2. METODE ODREĐIVANJA VITAMINA C

3.2.1. Biološke metode

Biološke metode su bile prve metode koje su se koristile za određivanje vitamina C, a
temelje se na sprečavanju (profilaktički test) ili liječenju (kurativni test) skorbuta u svinja.

3.2.2. Mikrobiološke metode

Mikrobiološke metode se nisu razvile jer nije nađen mikroorganizam koji bi imao
apsolutnu potrebu za vitaminom C.

3.2.3. Fizikalno – kemijske metode

Ove se metode mogu podijeliti na:
 titrimetrijske metode (oksidoredukcijske metode)
 spektrofotometrijske metode
(enzimatsko-spektrofotometrijske metode)
 spektrofluorometrijske metode
 kromatografske metode

Mnoge od ovih metoda, budući da nisu dovoljno specifične, pretežito se koriste kod
određivanja vitamina C u čistim otopinama, farmaceutskim i vitaminskim preparatima.

3.2.3.1. Titrimetrijske metode

Oksidoredukcijske titracije se temelje na jakim redukcijskim svojstvima endiolne
skupine, odnosno na redukciji primijenjenog reagensa za titraciju i oksidaciji L-askorbinske
kiseline u dehidroaskorbinske kiselinu. Kao oksidacijsko sredstvo može se koristiti 2,6-
diklorfenol-indofenol, jod, jodat, metilensko modrilo, kloramin i dr. Metode su jednostavne i
brze, ali nisu strogo specifične jer s navedenim reagensima uz L-askorbinsku kiselinu mogu
reagirati i mnogi drugi prirodni spojevi.
U analizi namirnica, prvenstveno u voćnim sokovima i raznim napitcima, za
određivanje askorbinske kiseline, koristi se jedino oksidoredukcijska titracija s 2,6-
diklorfenol-indofenolom po Tillmans-u koja je i standardna AOAC metoda za određivanje L-
askorbinske kiseline u vitaminskim preparatima i sokovima.

19
Određivanje L-askorbinske kiseline oksidoredukcijskom titracijom s 2,6-diklorfenol-
indofenolom

Oksidoredukcijska titracija s 2,6-diklorfenol-indofenolom (Tillmans-ova metoda) je

jednostavna i brza metoda za određivanje L-askorbinske kiseline koja daje relativno dobre
rezultate, a temelji se na reduktivnim osobinama L-askorbinske kiseline.
L-askorbinska kiselina se titrira s 2,6-diklorfenol-indofenolom u metafosforno-,
oksalno- ili octeno- kiseloj otopini (radi stabilizacije), pri čemu se L-askorbinska kiselina
oksidira u L-dehidroaskorbinsku kiselinu, a 2,6-diklorfenol-indofenol se reducira u leuko-spoj
uz promjenu boje otopine. Titracija traje do promjene boje u svijetlo ružičastu boju, stabilnu 1
min.
Kod titracija s 2,6-diklorfenol-indofenolom nije potrebno koristiti indikator jer on sam
mijenja boju promjenom pH ili redoks stanja (u lužnatoj i neutralnoj sredini oksidirani oblik
je tamno ljubičaste boje, u kiseloj je ružičaste boje, a reducirani oblik je bezbojan). Međutim,
neposredno prije titracije s ovim reagensom, potrebno je odrediti njegov titar obzirom da se
stajanjem mijenja. Titar se može definirati kao količina L-askorbinske kiseline koja reagira sa
1 mL 2,6-diklorfenol-indofenola.
Ova metoda je jednostavna i brza, ali nije potpuno specifična jer mogu reagirati i drugi
u namirnici prisutni reduktoni. Osim toga, obuhvaća samo L-askorbinsku kiselinu dok se
prisutna L-dehidroaskorbinska kiselina može odrediti tek nakon redukcije sa
sumporovodikom (H2S).
Interferirati mogu organski sulfhidrili (glutation), reduktoni i reduktivne kiseline, SO2,
Fe2+, Cu2+ i Sn2+.
Završna točka titracije s redoks-indikatorima može se odrediti i elektrokemijskim
metodama ili fotometrijski. One pokazuju, u odnosu na Tillmans-ovu metodu, izvjesne
prednosti, ali ne isključuju sve interferencije.

3.2.3.2. Spektrofotometrijske metode

Spektrofotometrijske metode za određivanje vitamina C pokazale su se kao vrlo brze,

jednostavne i primjenjive u rutinskim analizama namirnica. Temelje se na mjerenju
intenziteta boje kondenzacijskih spojeva koji nastaju reakcijom L-askorbinske i/ili L-

dehidroaskorbinske kiseline s nekim reagensima.

20
Određivanje ukupnog vitamina C s 2,4-dinitrofenilhidrazinom

Određivanje ukupnog vitamina C (L-askorbinska i L-dehidroaskorbinska kiselina) s

2,4-dinitrofenilhidrazinom po Roe i Oesterling-u temelji se na oksidaciji L-askorbinske
kiseline u metafosfornoj kiselini (ekstrakcijsko sredstvo) s bromom u L-dehidroaskorbinsku
kiselinu. Nastala i u namirnici već prisutna L-dehidroaskorbinska kiselina kondenziraju s 2,4-
dinitrofenilhidrazinom u sumporno-kiseloj sredini i nastaje dinitrofenilhidrazon, crveno
obojeni osazon čiji intenzitet boje se mjeri spektrofotometrijski pri 540 nm.
Termostatiranje, koje se provodi tijekom određivanja, mora biti strogo kontrolirano,
obzirom da kod većih koncentracija šećera, osobito ukoliko su u uzorku prisutne glukoza i
fruktoza, može doći do pozitivne greške ukoliko se termostatiranje provodi pri višim
temperaturama (nakon inkubacije pri 100 oC pozitivna greška je znatna, a pri 38 oC i niže
praktički nema smetnji).

Određivanje L-dehidroaskorbinske kiseline

Fotometrijskom metodom s 2,4-dinitrofenilhidrazinom može se odrediti i samo

primarno u namirnici prisutna L-dehidroaskorbinska kiselina ukoliko se cijeli postupak
provede bez prethodne oksidacije L-askorbinske kiseline s bromom.

Određivanje udjela ukupnog vitamina C

Poznavanjem količine L-dehidroaskorbinske kiseline u uzorku određene

fotometrijskom metodom s 2,4-dinitrofenilhidrazinom i količine L-askorbinske kiseline
određene oksidoredukcijskom titracijom s 2,6-diklorfenol-indofenolom dobiva se podatak o
ukupno prisutnom vitaminu C. Prednost ovakvog pojedinačnog određivanja u odnosu na
direktno određivanje ukupnog vitamina C s 2,4-dinitrofenilhidrazinom je u tome što se dobiva
uvid ne samo o udjelu ukupnog vitamina C, već i udjelu pojedinog oblika ovog vitamina
prisutnog u analiziranoj namirnici.

21
3.2.3.3. Spektrofluorometrijske metode

Poluautomatska mikrofluorometrijska metoda za određivanje ukupnog vitamina C u

različitim namirnicama temelji se na oksidaciji L-askorbinske kiseline u L-
dehidroaskorbinsku kiselinu, koja u reakciji s o-fenilendiaminom daje visokofluorescirajući
fluorofor. Intenzitet fluorescencije nastalog spoja proporcionalan je koncentraciji i mjeri se pri
valnoj duljini ekscitacije oko 350 nm i emisije oko 430 nm.
Metoda se koristi za određivanje mikrogramskih količina L-askorbinske i L-
dehidroaskorbinske kiseline i pokazuje visoki stupanj specifičnosti kada se primjenjuje na
farmaceutske i vitaminske preparate te specijalne dijetalne namirnice.

3.2.3.4. Kromatografske metode

Za određivanje vitamina C koriste se brze, jednostavne i osjetljive HPLC metode koje

isključuju djelovanje interferirajućih tvari te imaju znatno višu specifičnost u odnosu na druge
metode. Postupci su razrađeni za određivanje vitamina C u različitim namirnicama (voću,
povrću, napitcima, multivitaminskim preparatima itd.). Ekstrakcija L-askorbinske i L-
dehidroaskorbinske kiseline (kod nekih postupaka i njihovih izomera) iz namirnice koja se
analizira pretežito se provodi sa metafosfornom kiselinom.

22
4. KAROTENOIDI

Karotenoidi su pigmenti koje sintetiziraju biljke, ali i neke gljivice i bakterije, odnosno
organizmi sa sposobnošću fotosinteze. Međutim, u različitim koncentracijama i nijansama
žute, narančaste i crvene boje nalaze se ne samo u biljkama već i u ostalim organizmima koji
ih unose hranom (npr. kod životinja karotenoidi su odgovorni za boju dlake, perja, ptičjeg
kljuna itd.).
Po svom kemijskom sastavu karotenoidi su tetraterpenoidi (sadrže 40 ugljikovih
atoma). Centralni dio molekule građen je od dugog niza konjugiranih dvostrukih veza,
najčešće od osam izoprenskih jedinica, a krajevi lanaca su otvoreni ili su na njih vezani
jononski prstenovi (, , ) ili je jedan kraj otvoren, dok se na drugom nalazi prsten. S
obzirom na takvu nezasićenu strukturu karotenoidi su visoko reaktivni, podložni
autoaksidaciji, termički osjetljivi, intenzivne su boje i imaju karakterističan apsorpcijski
spektar u području od 400-500 nm. Rezultat promjena u konfiguraciji je i niz stereoizomera (u
biljkama su većinom prisutni all-trans izomeri, sa svim dvostrukim vezama u trans–položaju,
a u otopinama i pod utjecajem svjetlosti i povišene temperature prelaze djelomično u cis-
stereoizomere). Netopljivi su u vodi, a topljivi u mastima i organskim otapalima.

Karotenoidi se dijele na dvije velike skupine:

 Karoteni (-karoten, -karoten, -karoten, likopen itd.)
 Ksantofili (lutein, zeaksantin, astaksantin, –kriptoksantin itd.)

Karoteni su nepolarni karotenoidi, dok su ksantofili polarni s hidroksilnim skupinama

vezanim na jononske prstene u para–položaju prema dugom lancu.
Istraživanja su pokazala da oko 10 % karotenoida (npr. -karoten, -karoten, -
karoten, likopen itd.), od 600 do danas identificiranih ima provitaminska svojstva, odnosno uz
15, 15' -karoten-dioksigenazu mogu se u jetri i tankom crijevu prevesti u vitamin A (trans-
retinol).

23
 OH

HO

zeaksantin

likopen
OH

HO

lutein

ehinenon

OH

-kriptoksantin

OH

-kriptoksantin

Slika 4. Strukture nekih karotenoida

24
 Najvažniji karotenoidi su karoteni od kojih je -karoten kao biljni pigment s najjačom
vitaminskom aktivnošću.

-karoten

- karoten

-karoten

Slika 5. Strukture -, - i -karotena

U biljkama karotenoidi mogu biti prisutni u različitim strukturama kao npr. u lipidnim
kapljicama (plastoglobulima), nakupinama tubula, koncentrično raspoređenim membranama
ili kao kristali obavijeni membranom. Vrlo su rasprostranjeni u listu, kori, cvijetu i plodu.
Koristeći biljne namirnice u prehrani (osobito povrće i voće), ljudi svakodnevno unose
karotenoide, djelomično kao provitamine, a djelomično za druge zaštitne funkcije u
metabolizmu.

25
4.1. -KAROTEN (provitamin A)

4.1.1. STRUKTURA, IZVORI, STABILNOST I BIOISKORISTIVOST

-Karoten je polimer izoprena s 11 dvostrukih konjugiranih veza u lancu. Za krajeve

lanca vezani su -jononski prstenovi. Izoprenska struktura odgovorna je za pojavu cis-trans
izomerije (slika 6). Promjenom konfiguracije mijenja se i biološka aktivnost, all-trans izomeri
imaju najjaču biološku aktivnost kao provitamini A.

all-trans--karoten

9-mono-cis--karoten

Slika 6. Struktura all-trans--karotena i 9-mono-cis- -karotena

U vrlo različitim koncentracijama -karoten je široko rasprostranjen u namirnicama (u

količini od oko 15 % često ga prati i α-karoten). Kao bogati izvori mogu se smatrati “obojene
namirnice“ – voće i povrće (tablica 4), a osobito mrkva iz koje je prvi puta izoliran (karoteni
su i dobili naziv kao žuti pigmenti iz mrkve Daucus carota). Prirodni -karoten prisutan u
namirnicama najčešće je all-trans- i 9-cis-izomer dok je sintetski -karoten, koji se dodaje
namirnicama najčešće zbog poboljšanja organoleptičkih svojstava (bojenje namirnica), uvijek
samo all-trans.

26
Tablica 4. Udio karotena u pojedinim namirnicama

Vrsta namirnice Karoteni Vrsta namirnice Karoteni

g/100g g/100g
Povrće lisnato Povrće mahunasto
blitva 1577 grašak 300
kelj lisnati (raštika) 5520 mahune zelene (mlade) 245
peršin list 3680 mahune žute (zrele) 180
radić zeleni 1315
salata zelena 1165 Povrće stabljičasto
špinat 4980 koleraba 240
šparoge divlje 932
Povrće plodasto šparoge vrtne 81
kukuruz slatki (u klipu) 240
paprika zelena 236 Povrće korjenasto
rajčica 600 mrkva 6000
tikvice zelene 373
Voće
Povrće cvjetasto borovnice 130
artičoka (mladi cvjetovi) 109 brusnice 20
cvjetača (listovi i cvijet) 30 jagode 30
mandarina 100
Povrće konzervirano naranča (žuto-narančasto meso) 50
paprika kisela 134 naranča (crveno meso) 426
rajčica-ketchup 600 grožđe crno 23
rajčica ukuhana (konc. 38-30 %) 1980

U organskim otapalima kao što su petroleter, heksan, kloroform i aceton, ß-karoten je

dobro topljiv, dok je u metanolu i etanolu znatno slabije, a u vodi gotovo netopljiv. Brzo se
razgrađuje na zraku, povišenoj temperaturi i ako je izložen svjetlosti i to osobito ako je u
otopinama. Nije optički aktivan, a kao i ostali karoteni, sklon je autooksidaciji koju
kataliziraju metali Cu, Zn, Fe i Al te ga treba stabilizirati ne samo u otopinama, već i u suhom
materijalu. Kao stabilizatori upotrebljavaju se hidrokinoni, fenoli, naftoli, aminofenoli i
tokoferol kao vrlo djelotvoran prirodni antioksidans.
Udio -karotena u namirnici se smanjuje zagrijavanjem, međutim razgradnjom
staničnih membrana karoteni se oslobađaju pa je njihova apsorpcija olakšana i bioiskoristivost
povećana. Budući da se -karoten najbolje apsorbira u uljnoj otopini, mast iz hrane
poboljšava njegovu apsorpciju, a time i bioiskoristivost.
Bioiskoristivost -karotena iz namirnice koja je siromašna mastima (npr. povrće)
može se povećati ukoliko se ona unosi u organizam zajedno s uljima ili mastima odnosno
namirnicama bogatim ovim komponentama.

27
4.1.2. METODE ODREĐIVANJA KAROTENA

Metode za odjeljivanje karotena od ostalih pigmenata i njihovo kvantitativno

određivanje temelji se na njihovim određenim fizikalnim i kemijskim svojstvima. Topljivi su
u mastima, uljima i otapalima za masti, dok su netopivi u vodi. U organskim otapalima
(petroleter, heksan i dr.) su obojeni, apsorbiraju u UV i vidljivom dijelu spektra, pri čemu je
intenzitet apsorpcije proporcionalan koncentraciji karotena u otopini. Iz petroleterskih otopina
mogu se adsorbirati na različite praškaste adsorbense pa se na ovim svojstvima temelje
različiti postupci izolacije i razdvajanja karotena iz namirnica.
Kod određivanja karotena u namirnicama koje sadrže veće količine masti kao što su
životinjske masti, mlijeko i punomasni mliječni proizvodi, jaja, palmino ulje, različite
mahunarke (npr. soja koja sadrži oko 20 % masti) itd., prethodno se mast mora saponificirati
budući da bi ometala adsorpciju na stupcu adsorbensa. S obzirom da se karoteni dobro otapaju
u mastima, ona bi se ponašala kao sredstvo za eluiranje.
Budući da su karoteni osjetljivi na svjetlo, da bi se spriječila njihova razgradnja svi se
postupci trebaju provoditi u zamračenoj prostoriji i u tamnom laboratorijskom posuđu.
Prije samog određivanja karotena, neovisno o tome koja se metoda koristi, potrebno je
provesti dobru ekstrakciju pigmenata iz namirnice, a potom i razdvajanje odnosno odjeljivanje
ekstrahiranih pigmenata.
Za određivanje karotena u namirnicama predložen je niz različitih metoda koje se
međusobno razlikuju u načinu ekstrakcije i razdvajanja karotena od ostalih prisutnih
pigmenata, odnosno ovisno o kompleksnosti namirnice koja se analizira, a mogu se svrstati u
dvije osnovne skupine:
 kromatografske metode
 spektrofotometrijske metode

4.1.2.1. Kromatografske metode

HPLC je najčešća metoda za određivanje karotena u namirnicama. Brza je, točna,

selektivna (razdvajanje stereoizomera), reproducibilna, mogu se odrediti i vrlo niske
koncentracije i zbog toga je istisnula tankoslojnu kromatografiju (TLC) i kromatografiju
na papiru (papir sadrži aluminijev oksid) kojima se također mogu odrediti karoteni. Ovisno o
vrsti namirnice koja se analizira (voće, povrće, mlijeko, jaja, ulja, sokovi itd.) koriste se
odgovarajući postupci ekstrakcije s ili bez saponifikacije te različite kromatografske kolone uz
različitu detekciju.
28
4.1.2.2. Spektrofotometrijske metode

Usprkos svim prednostima HPLC metoda, za određivanje karotena često se koriste

spektrofotometrijske metode koje su i AOAC standardne metode. Te se metode temelje na
ekstrakciji karotena iz uzorka, kromatografskom odjeljivanju i spektrofotometrijskom
određivanju karotena mjerenjem apsorbancije eluata pri 450 nm.
Odabir metode ovisi o vrsti i složenosti namirnice koja se analizira, a razlikuju se u
primijenjenoj ekstrakciji (sa i bez saponifikacije estera, različita otapala) i razdvajanju
(različite kolone i adsorbensi).

Modificirana Booth-ova metoda

Modificirana Booth-ova metoda je brza i jednostavna metoda kojom se postižu

zadovoljavajući rezultati. Ekstrakcija karotenoidnih pigmenata iz uzorka provodi se sa
smjesom petroleter:aceton (1:1; v/v) u kojoj petroleter služi kao otapalo, a aceton za
denaturaciju proteina. Prije adsorpcije na kromatografskoj koloni sa smjesom Al2O3 i
bezvodnog Na2SO4, radi odvajanja karotena od ostalih pigmenata, iz ekstrakcijske je smjese
potrebno ukloniti aceton koji smeta adsorpciji (kontinuiranim ispiranjem s vodom preko
lijevka za odjeljivanje). Nakon eluiranja -karotena i α-karotena koji prati -karoten (na
koloni se nalazi ispod -karotena) sa smjesom acetona u petroleteru (w = 0.02), apsorbancija
petroleterskog ekstrakta se mjeri na spektrofotometru pri 450 nm. Obzirom da se postiže
potpuno uklanjanje interferirajućih čestica za slijepu probu može se koristiti samo otapalo
(petroleter) koji se koristi i za nadopunjavanje kod mjerne otopine.

29
5. ENZIMI KOJI SUDJELUJU U RAZGRADNJI ŠKROBA

Šećerna bolest (diabetes mellitus) je metabolički poremećaj karakteriziran kroničnom

hiperglikemijom uslijed smanjenja/prestanka lučenja inzulina i/ili njegovog djelovanja,
odnosno kombinacije navedenog. Prevalencija dijabetesa je u porastu te se procjenjuje se da
trenutno u svijetu od njega boluje oko 415 milijuna ljudi uz prognoze da će do 2040. godine
taj broj porasti na čak 642 milijuna. U Hrvatskoj, prema registru CroDiab, u 2016. godini
zabilježeno je 284 185 osoba sa šećernom bolešću s tim da uz procjenu da preko 40 %
slučajeva još nije dijagnosticirano.
Naročito je izražen je trend porasta učestalosti tipa 2 ove bolesti (neovisan o inzulinu)
koji se uobičajeno javlja kod odraslih, no s obzirom na spuštanje dobne granice sve se više
dijagnosticira adolescenata i djece. Tako dijabetes predstavlja jedan od vodećih
javnozdravstvenih problema i globalnu epidemiju suvremenog društva uzrokovanu
promjenama načina života u obliku smanjenja tjelesne aktivnosti te konzumiranjem
visokokalorične i procesuirane hrane.
Adekvatna kontrola glikemije neophodna je u liječenju svih oblika dijabetesa imajući
u vidu kako akutne (hipo- i hiperglikemija) tako i kronične komplikacije (neuropatija,
nefropatija, retinopatija, angiopatija) s dugoročnim posljedicama. Agensi koji smanjuju
postprandijalnu hiperglikemiju imaju ključnu ulogu u liječenju dijabetesa i predijabetičkih
stanja čime se smanjuje razvoj kroničnih komplikacija. Terapija dijabetesa tipa 2 uključuje
poticanje sekrecije endogenog inzulina, povećanje osjetljivosti ciljnih stanica na inzulin te
inhibiciju enzima koji razgrađuju ugljikohidrate. Enzimi koji razgrađuju škrob i glikogen do
glukoze su α-amilaza i α-glukozidaza, a inhibicija njihove aktivnosti smanjuje količinu
glukoze raspoložive za apsorpciju te predstavlja učinkovit način smanjenja postprandijalne
hiperglikemije, odnosno kontrole dijabetesa.
Probava ugljikohidrata počinje u ustima uz salivarnu α-amilazu koju luče žlijezde
slinovnice pri čemu se razgradi oko 5 % ukupnih ugljikohidrata. U želucu, aktivnost amilaze
je inhibirana zbog niskog pH, no ulaskom hrane u tanko crijevo želučani sadržaj je
neutraliziran bikarbonatima koji luči pankreas. U acinarnim stanicama pankreasa sintetizira se
α-amilaza i luči pankreasnim sokom u dvanaesnik gdje slabo alkalna sredina pogoduje
njegovoj aktivnosti, odnosno razgradnji škroba i glikogena do oligosaharida. Na površini
četkastog epitela tankog crijeva nalazi se α-glukozidaza koja dovršava razgradnju
oligosaharida do monosaharida koji se prenose portalnom cirkulacijom do jetre.

30
 U terapiji dijabetesa tipa 2 koriste se brojni lijekovi s učinkom inhibicije navedenih
enzima, kao što su akarboza, miglitol i vogliboza, s tim da oni nisu hipoglikemici u punom
smislu riječi jer ne smanjuju izravno koncentraciju glukoze u plazmi već je njihov učinak
posredovan smanjenom apsorpcijom glukoze iz tankog crijeva. Akarboza kompetitivno i
reverzibilno, ovisno o dozi, inhibira i pankreatičnu α-amilazu i α-glukozidazu čime usporava
hidrolizu škroba, odnosno hidrolizu oligosaharida i disaharida do monosaharida čime se
usporava njihova apsorpcija nakon obroka, a time odgađa i smanjuje postprandijalni porast
koncentracije glukoze i inzulina u krvi. Kao rezultat djelovanja akarboze smanjuju se
fluktuacije razine glukoze u krvi tijekom dana, a opada i prosječna koncentracija glukoze u
krvi. Primjenom akarboze kod oboljelih od dijabetesa tipa 2 postiže se smanjenje glikemije
natašte, smanjenje postprandijalne koncentracije glukoze u krvi te smanjenje HbA1C od 0,4 do
0,9 % uz redukciju postprandijalne koncentracije inzulina u krvi. Liječenje akarbozom
ublažava reaktivnu hipoglikemiju, a kod starijih osoba može i poboljšati inzulinsku
osjetljivost. Kod osoba s oštećenom tolerancijom glukoze akarboza dovodi do redukcije
velikih kardiovaskularnih događaja i arterijske hipertenzije, kao i progresije u šećernu bolest.
Danas se sve više istražuju ekstrakti biljaka koji su važan izvor sastojaka kao što su
polifenoli i glikoproteini s učinkom na inhibiciju enzima koji sudjeluju u razradnji škroba od
kojih neki imaju aktivnost usporedivu s akarbozom.

31
6. TRIPTOFAN

Triptofan je esencijalna aminokiselina koju su otkrili F. G. Hopkins i S. W. Cole 1901.

godine. Posjeduje čitav niz različitih funkcija, kao što su poticanje rasta i sinteze proteina u
brojnim tkivima te regulacija brojnih fizioloških mehanizama. Tako triptofan služi kao
prekursor neurotransmitera serotonina (5-hidroksitriptamin) te ima važnu ulogu u
funkcioniranju mozga. Također predstavlja i prekursor nikotinske kiseline, a ima utjecaj i na
san, percepciju boli, ponašanje te stimulira sekreciju inzulina i hormon rasta. Kod osoba s
prekomjernom tjelesnom težinom, kao i kod osoba oboljelih od dijabetes melitusa,
serotonergična stimulacija u mozgu preko oralno uzetog 5-hidroksitriptofana normalizira
prehrambene navike, a kao posljedica se javlja gubitak na težini. Konverzija triptofana u
niacin varira ovisno o tipu triptofana (slobodan, mali peptid, protein) i smjese aminokiselina,
a ženski spolni hormoni, posebno u trudnoći inhibiraju njegovu sintezu iz triptofana.
Triptofan se razgrađuje primarno u jetri, a prvi korak katabolizma je oksigenacija koja
otvara peteročlani prsten indolne jezgre pri čemu nastaje N-formilkinurenin. Ova reakcija je
katalizirana triptofan dioksigenazom (triptofan pirolaza), jetrenim enzimom koji sadrži hem, a
ima vrlo kratko vrijeme poluživota i visoko reguliranu aktivnost. Tako glukagon i drugi
hormoni kao što su glukokortikoidi povisuju količinu enzima, a visoke razine koenzima
nikotinamidskih nukleotida mogu inhibirati enzim. Dok je triptofan dioksigenaza prisutna u
jetri i uključena u glavne puteve katabolizma triptofana, enzim indolamin 2,3-dioksigenaza je
ubikvitarna u nejetrenim tkivima kao što su placenta, pluća i crijeva te također katalizira
konverziju triptofana u N-formilkinurenin. Indolamin 2,3-dioksigenaza je aktivirana
proupalnim citokinom interferonom γ tako da prilikom aktivacije staničnog imunog odgovora
dolazi do degradacije triptofana. Smanjena koncentracija cirkulirajućeg triptofana može
rezultirati smanjenjem proizvodnje serotonina što može doprinjeti razvoju anksioznosti i
depresije kod pojedinaca s kroničnim bolestima te žena u prvim tjednima nakon porođaja.
Indolamin dioksigenaza je prisutna u leći oka gdje se kataboliti triptofana, kinunerin i 3-
hidroksiurenin glukozid vežu za proteine leće i stvaraju žute i fluorescentne spojeve koji su
odgovorni da leća starenjem požuti.

Triptofan u hrani
Većina hrane industrijski se obrađuje, skladišti i kuha prije konzumiranja, a tijekom
takvih tretmana proteini, odnosno aminokiseline mogu reagirati s drugim komponentama
hrane ili kemijskim aditivima. Ove reakcije mogu dovesti do formiranja boje i arome, gubitka

32
nutritivne vrijednosti i do stvaranja potencijalno toksičnih komponenti. Stabilnost slobodnog
ili vezanog triptofana tijekom proizvodnje i skladištenja ovisi o visini temperature i
prisutnosti kisika ili drugih oksidirajućih agensa, posebno lipidnih peroksida i zračenja.
Relativno je stabilan tijekom toplinskih tretmana, kao što su industrijsko ili kućno kuhanje ili
pri sterilizaciji parom. Takvi tretmani mogu smanjiti nutritivnu iskoristivost triptofana jedino
ako dođe do formiranja unakrsih veza proteina i/ili izomerizacije L- u D-triptofan.
Degradacija triptofana tijekom proizvodnje hrane, posebno tijekom termičkih
postupaka može imati nutritivnu i toksikološku važnost jer mogu nastati razni derivati s
mogućim antinutritivnim i toksičnim svojstvima. U prisustvu karbonilnih spojeva i/ili visoke
temperature (iznad 200°C) stvaraju se α-, β- i γ-karbolini koje nalazimo u mesu i ribi
pečenima na roštilju, prženima na ulju i u ostalim vrstama hrane podvrgnutim viskom
temperaturama. Najaktivnijim komponentama (β-karbonlinima) koji nastaju pirolizom
proteina, odnosno tijekom prženja mesa i ribe dokazana je mutagenost koja dobro korelira s
trajanjem pirolize.

33
7. P R O P I S I ZA VJEŽBE

34
 OPASKA

U analitici namirnica primjenjuju se kvantitativne metode određivanja pa svi

postupci podliježu pravilima rada u kvantitavnom analitičkom laboratoriju1 .
Kao i u svim kemijskim laboratorijima i rad u analitičkom laboratoriju za
kontrolu namirnica uključuje određeni stupanj rizika i zahtjeva strogo pridržavanje
pravila ponašanja kako bi se postigla potrebna sigurnost rada u laboratoriju i izbjegle
slučajne nezgode.
Obavezno je korištenje zaštitnih naočala i kute za cijelo vrijeme boravka u laboratoriju.
Zabranjeno je unositi u laboratorij hranu i piće, piti iz laboratorijskog posuđa i pušiti.

1
Skoog, D.A., West, D.M., Holler,F.J., Osnove analitičke kemije, str. 769-807, Školska knjiga , Zagreb,
1999.

35
 7.1. ODREĐIVANJE RIBOFLAVINA U NAMIRNICAMA
Modificirana fluorometrijska metoda (I.Vedrina Dragojević i B.Šebečić, 1986.)

Princip
Kiselinskom i enzimskom hidrolizom ekstrahirani riboflavin se fotooksidacijom pod
određenim uvjetima prevodi u lumiflavin. Flourescencija lumiflavina u kloroformnom
ekstraktu mjeri se spektrofluorometrijski.

Ekstrakcija riboflavina
Ekstrakcijom se postiže oslobađanje riboflavina vezanog za proteine (kiselinska
hidroliza) i vezanog u obliku estera fosforne kiseline (enzimska hidroliza). Namirnicu u kojoj
se vrši određivanje potrebno je prethodno usitniti i dobro homogenizirati.
U odmjernu tikvicu od 250 mL odvaže se 15 g (±0.05 g) homogenog uzorka, odnosno
općenito toliko uzorka da je konačna koncentracija riboflavina 0.2 - 1.2 g/mL. Doda se 125
mL H2SO4 (c = 0.1 mol/L) i dobro promućka da se uzorak kompletno navlaži. Zatim se doda
1 mL parafinskog ulja (za spriječavanje pjenjenja tijekom autoklaviranja), grlić tikvice zatvori
alu-folijom i autoklavira 15 min pri 105-110 oC. Nakon autoklaviranja doda se 20 mL otopine
natrijevog acetata (c = 2.5 mol/L), promućka (pH otopine mora biti 4.5 - optimalan pH za
enzimatsku hidrolizu) i pod tekućom vodom sadržaj tikvice se ohladi na 45 oC. Potom se doda
0.5 g klaraze i ponovno promućka, nakon čega se tikvice ostave stajati u termostatu (u tami)
20 min pri 45 oC. Nakon termostatiranja sadržaj tikvice se ohladi na sobnu temperaturu, doda
ponovno 20 mL natrijevog acetata (pH suspenzije 5.5), nadopuni tikvica s destiliranom
vodom do oznake i filtrira preko naboranog filter papira. Prvih 15 mL filtrata ponovno se
filtrira.

Postupak

Čišćenje filtrata

Odpipetira se po 15 mL filtrata u dva cilindra s ubrušenim čepom od 100 mL i označi ih

se s B (uzorak) i C (unutarnji standard).
U cilindar B doda se 2 mL destilirane vode, a u cilindar C 2 mL standardne otopine
riboflavina 2 (10 µg/mL). Dodana količina standarda mora biti reda veličine koja odgovara
očekivanom sadržaju tiamina u 15 mL filtrata.

36
 U oba cilindra doda se 0.3 mL H2SO4, (w = 0.3) dobro promućka, potom doda 0.6 mL
otopine KMnO4, (w = 0.03) ponovno promućka i ostavi stajati 2 min. Suvišak KMnO4
ukloniti dodatkom kap po kap vodikovog peroksida (w = 0.03) do obezbojenja. Obezbojene
otopine mućka se 30 sekundi s 15 mL kloroforma i centrifugira 2 min na 2000 o/min.
Od vodene faze odpipetira se 10 mL u epruvete za centrifugiranje, doda 1 g aktivne
zemlje (frankonit), začepi kivete gumenim čepom i snažno mućka 30 sekundi (adsorpcija
riboflavina na aktivnu zemlju) te centrifugira 2 min. Tekućine nad talogom se odliju i odbace.
(Kod vrlo niskog sadržaja riboflavina potrebno je sedimentima aktivne zemlje dodati još po
10 mL vodene faze, opet dobro promućkati i centrifugirati, tekućine nad talogom ponovno
odliti i odbaciti). Talozi se isperu s po 20 mL H2SO4, (c = 0.1 mol/L) centrifugiraju, a
tekućine nad talogom ponovno odbace.
Svakom talogu doda se 15 mL NaOH, (c = 0.5 mol/L) dobro promiješa štapićem 30
sekundi (eluiranje riboflavina) i centrifugira 5 min na 2500 o/min.

Lumiflavin-test

Od bistrih otopina nad talogom odpipetira se po 10 mL u zdjelice za kristalizaciju i

jednolično ih se osvijetli 10 min na udaljenosti od 25 cm od izvora svjetla. Potom se doda u
svaku zdjelicu 2 mL ledene octene kiseline i sadržaj prebaci u kivete za centrifugiranje.
U svaku kivetu doda se po 15 mL kloroforma, zatvori gumenim čepom, snažno mućka 1
min i centrifugira 3 min na 2500 o/min.
Od kloroformskog sloja odpipetira se (suha pipeta!) 10 mL u suhe odmjerne tikvice od
25 mL, dopuni etanolom do oznake i dobro promućka.

Mjerenje fluorescencije lumiflavina i izračunavanje udjela riboflavina

Udio riboflavina odredi se mjerenjem fluorescencije lumiflavina na spektrofluorometru

kod valne duljine ekscitacije 440 nm i emisije 505 nm.
Kao slijepa proba (A) koristi se smjesa 10 mL kloroforma i 15 mL etanola.
Udio riboflavina u 100 g namirnice izračunava se na osnovi razlike fluorescencije
lumiflavina u uzorku (B) i fluorescencije lumiflavina u uzorku sa dodatkom poznate količine
standarda riboflavina (C) umanjenih za fluorescenciju pratećih komponenata - slijepa proba
(A) prema izrazu:

37
 100 . d . b
Udio riboflavina (g/100g) =
(a - b) . c

a = fluorescencija uzorka sa dodatkom riboflavina (C-A)

b = fluorescencija uzorka (B-A)
c = odvaga uzorka u alikvotu (g)
d = količina dodanog riboflavina (g)

Reagensi:
1. H2SO4 (c = 0.1 mol/L)
2. Klaraza 900 (preparat je potrebno prije uporabe ispitati na sadržaj riboflavina)
3. Otopina natrijevog acetata (c = 2.5 mol/L)
4. H2SO4 (w = 0.3)
5. Otopina KMnO4 (w = 0.03)
6. Otopina H2O2 (w = 0.03)
7. Ledena octena kiselina
8. NaOH (c = 0.5 mol/L)
9. Kloroform
10. Adsorbens (Frankonit)
11. Etanol ( = 0.95)
12. Parafinsko ulje
13. Priprema standardne otopine riboflavina:
Standardna otopina 1
100 mg riboflavina, koji je prethodno sušen 1 sat u vakuumu pri 60 oC, otopi se u 20 mL
otopine NaOH (c = 1 mol/L)i odmah zakiseli sa 15 mL octene kiseline, (w = 0.1), a sa H2SO4
(c = 0.1 mol/L) razrijedi do 1000 mL (100 g/mL). Otopina je stabilna mjesec dana ako se
čuva u tamnoj boci pri 0 - 4 oC.
Standardna otopina 2
Razrijedi se potrebna količina standardne otopine 1 sa destiliranom vodom da se
dobije otopina riboflavina koncentracije 10 g/mL. Otopina je stabilna tjedan dana ako se
čuva u tamnoj boci pri 0 - 4 oC.

38
 7.2. ODREĐIVANJE L-ASKORBINSKE KISELINE
U VOĆNIM SOKOVIMA
Oksidoredukcijska titracija po Tillmans-u

Princip
Metoda se temelji na reduktivnim osobinama L-askorbinske kiseline, a reakcija se
izvodi sa 2,6-diklorfenolindofenolom u kiselom mediju, pri čemu se boja reducira u leuko-
oblik, dok se L-askorbinska kiselina oksidira u L-dehidroaskorbinsku kiselinu.

Postupak
10 mL voćnog soka odpipetira se u odmjernu tikvicu od 100 mL, doda 10 mL octene
kiseline (w = 0.1) i nadopuni destiliranom vodom do oznake.
25 mL razrijeđenog uzorka odpipetira se u Erlenmeyerovu tikvicu od 250 mL, doda
oko 75 mL destilirane vode i titrira s otopinom 2,6 p-diklorfenolindofenola (D) do svijetlo
ružičaste boje, koja ostaje stabilna oko 1 minute.
Istovremeno se radi i slijepi pokus sa 100 mL destilirane vode uz dodatak 2 mL octene
kiseline (w = 0.1).

Određivanje titra otopine diklorfenol-indofenola

2 mL standardne otopine askorbinske kiseline odpipetira se u Erlenmeyer-ovu tikvicu

od 250 mL, doda 25 mL vode, zakiseli sa 0.5 mL 10 %-tne octene kiseline i titrira sa 2,6-
diklorfenolindofenolom.
Istodobno se napravi i slijepi pokus.

a
Titar (D) =
potrošak (D)

a = mg L-askorbinske kiseline u 2 mL standardne otopine

39
Izračunavanje udjela L-askorbinske kiseline

potrošak (D) . titar (D)

Udio L-askorbinske kiseline (mg/100g) = . 100
mL voćnog soka u alikvotu

Reagensi
1. Otopina diklorfenolindofenola: 260 mg diklorfenolindofenola odvagne se u čašu od 100
mL, doda 80 mL vode i zagrije uz stalno miješanje do vrenja. Kada se otopina ohladi
prenese se u odmjernu tikvicu od 500 mL i nadopuni destiliranom vodom do oznake.
Otopina se mora čuvati na tamnom i hladnom mjestu.
2. Standardna otopina L-askorbinske kiseline: odvagne se 100 mg L-askorbinske kiseline,
otopi u 2-3 mL otopine metafosforne (w = 0.2) ili octene kiseline (w = 0.1) i dopuni vodom
u odmjernoj tikvici do 100 mL. Otopina je stabilna samo nekoliko sati i mora se uvijek
pripremiti neposredno prije rada.
3. Octena kiselina (w = 0.1)

40
 7.3. ODREĐIVANJE KAROTENA U VOĆU I POVRĆU
Spektrofotometrijska metoda (Van der Meer i sur. 1987.)
Modificirana metoda*

Princip
Nakon ekstrakcije pigmenata smjesom petroletera i acetona provodi se odjeljivanja
biološki aktivnih od ostalih karotenoidnih pigmenata u ekstraktu, pomoću specifičnog
adsorbensa sa različitim afinitetom za različite pigmente. Apsorbancija eluiranog -karotena u
petroleterskom ekstraktu mjeri se spektrofotometrijski.

Postupak

Ekstrakcija pigmenta

U čašu od 50 mL odvaže se 0.5 - 2 g usitnjenog uzorka (ili više ovisno o koncentraciji

karotena), doda se jednaka količina kvarcnog pijeska (ne više) i 8-10 mL smjese otapala
petroleter:acetona (1:1, v/v) i sa staklenim štapićem dobro promiješa i izmrvi. Dobiveni
ekstrakt ostavi se stajati dok se čvrsti djelići ne slegnu i potom otapalo pažljivo dekantira u
lijevak za odjeljivanje od 250 mL, u kojem se nalazi oko 50 mL vode. Vlažnom talogu
ponovno se doda 8-10 mL smjese otapala petroleter:acetona (1:1, v/v) i postupak mrvljenja i
dekantiranja ponavlja tako dugo dok se još ekstrahira karoten (do obezbojenja). Za većinu
namirnica dovoljno je 5-8 ekstrakcija.

Ispiranje acetona
Budući da aceton i u tragovima onemogućava adsorpciju karotena na koloni mora ga
se potpuno ukloniti iz petroletera. To se postiže pomoću posebne aparature s lijevcima za
odjeljivanje.
Pipac gornjeg lijevka podesi se tako da propušta 100-200 kapi vode u minuti. Višak
vode otiče noseći aceton i druge supstance otopljene u vodi ostavljajući karotene u
petroleterskom sloju. Ispiranje je završeno kada vodeni sloj ostaje bistar nakon dokapavanja
vode. Kada je ispiranje gotovo (obično je potrebno 1-1.5 mL vode), donji vodeni sloj se
ispusti u čašu i odbaci, a gornji obojeni petroleterski sloj prenese preko gornjeg dijela lijevka
na kromatografsku kolonu.

* Postupak modificiran za potrebe Praktikuma

41
Pročišćavanje petroleterskog ekstrakta

Staklena cijev za kromatografiju napuni se adsorbensom u visini oko 8 cm i ispere

petroleterom. Kroz kolonu se zatim propusti dobiveni petroleterski ekstrakt, koristeći ako je
potrebno i slab vakuum. Sve obojene supstance, uključujući i karotene, adsorbiraju se na vrhu
kolone. Pošto se tekućina koja je prošla kroz kolonu odbaci, karoteni se elauiraju sa 10-25 mL
(ili prema potrebi) acetona u petroleteru (w = 0.02), dovoljno da se elauiraju karoteni, a ne
pokrenu ostali pigmenti. Kolona mora biti cijelo vrijeme zasićena otapalom da bi se spriječio
pristup zraka. Eluat se skuplja u odmjernu tikvicu od 25 mL (ili prema potrebi 50 mL) i kada
je eluiranje gotovo tikvica se nadopuni petroleterom do oznake.

Mjerenje absorbancije i izračunavanje udjela -karotena

Obzirom da je provedeno potpuno pročišćavanje ekstrakta za slijepu probu može se

koristiti čisti petroleter.
Apsorbancija petroleterskog ekstrakta mjeri se pri 450 nm, a koncentracije očitaju iz
standardne krivulje.
Ako je standardna krivulja izražena u g -karotena /mL onda je:

V
Udio -karotena (g/100g) = 100 . c
A

V = konačni volumen eluata (mL)

A = odvaga (g)
c = koncentracija -karotena u g/mL očitana iz baždarnog dijagrama za izmjerenu vrijednost
apsorbancije

42
Standardna krivulja
Za izradu standardne krivulje koristi se čisti -karoten ili smjesa od 90 % - i 10 % α-
karotena otopljenog u petroleteru.
Odvaže se 10 g -karotena i otopi u 100 mL petroletera (100 g/mL). Iz ove
standardne otopine priredi se serija razrjeđenja slijedećih koncentracija: 0.5, 1.0, 2.0, 3.0, 4.0 i
5.0 g karotena/mL. Apsorbancija pojedinih koncentracija izraženih u g/mL mjeri se
spektrofotometrijski pri valnoj duljini 450 nm.

Reagensi
1. Adsorbens - smjesa jednakih dijelova Al2O3 i bezvodnog Na2SO4, aktiviran zagrijavanjem
pri 150 oC za vrijeme 12-16 sati.
2. Petroleter tv 40 - 70 oC
3. Aceton
4. Smjesa petroleter-aceton (1:1, v/v). Na 1 litru smjese doda se 1 g hidrokinona.
5. Otopina acetona u petroleteru (w = 0.02)
6. Kvarcni pijesak
7. Standard -karotena

43
 7.4. ODREĐIVANJE INHIBICIJE α –AMILAZE

Princip

Reakcijom glukoze (reducirajući šećer) s 2,3-dinitrosalicilnom kiselinom uz

zagrijavanje nastaje 3-amino-5-nitrosalicilna kiselina pri čemu se boja reakcijske smjese
mijenja iz žute u narančasto-smeđu. Intenzitet nastalog obojenja proporcionalan je
koncentraciji glukoze i određuje se spektrofotometrijski na 540 nm.
Djelovanjem inhibitora α-amilaze dolazi do smanjenog otpuštanja glukoze iz molekule
škroba što rezultira smanjenjem intenziteta obojenja reakcijske smjese. Učinkovitost
inhibicije enzima je obrnuto proporcionalna obojenju.

Postupak

U Falcon epruvetama od 15 mL vrši se predinkubacija 1 mL uzorka (ekstrakta)

različitih koncentracija s 1 mL fosfatnog pufera (pH 6,9) koji sadrži pankreasnu α-amilazu
tijekom 10 minuta na 25°C. Nakon predinkubacije doda se 1 mL 1% topljivog škroba i
reakcijska smjesa se ponovo inkubira 10 minuta na 25°C. Potom se reakcija zaustavlja s 2 mL
DNS obojenog reagensa, epruvete inkubiraju u ključaloj vodi tijekom 5 minuta nakon čega se
ohlade na sobnu temperaturu. Apsorbancija reakcijske smjese se mjeri na 540 nm.
Slijepa proba mjeri apsorbanciju uzoraka kad je enzimska otopina zamijenjena
puferom.
Kontrola predstavlja 100 %-tnu enzimsku aktivnost i priprema se zamjenom uzorka
(ekstrakta) s destiliranom vodom.

Izračunavanje

Auz = apsorbancija uzorka (ekstrakta)

Akont = apsorbancija kontrole (bez testnog sastojka, odnosno ekstrakta)

Reagensi
1. α-amilaza (0,5 mg/mL)
2. fosfatni pufer (0,02 M, pH 6,9)

44
3. topljivi škrob (1 %)
4. DNS reagens obojeni reagens (96 mM)
priprema DNS obojenog reagensa:
Polagano otopi 2,18 g 3,5-dinitrosalicilne kiseline (DNS) u 80 mL NaOH (0,5 M)
miješanjem i zagrijavanjem do 70°C. Potom dodaj 30 g Na K tartarata i promiješaj dok se ne
otopi. Ohladi na sobnu temperaturu i namjesti na 100 mL. U tamnoj boci na sobnoj
temperaturi reagens je stabilan 6 mjeseci.

45
 7.5. ODREĐIVANJE INHIBICIJE α –GLUKOZIDAZE

Princip

Inhibitornim djelovanjem na α-glukozidazu dolazi do smanjene razgradnje supstrata p-

nitrofenil-α-D-glukopiranozida, odnosno smanjenog oslobađanja p-nitrofenola čiji se
intenzitet obojenja mjeri na 405 nm. Učinkovitost inhibicije enzima je obrnuto proporcionalna
intenzitetu obojenja.

Postupak

U mikrotitarskoj pločici (96 jažica) inkubira se 100 μL uzorka (ekstrakta) različitih

koncentracija s 50 μL α-glukozidaze tijekom 10 minuta na 37°C. Nakon inkubacije, u
reakcijsku smjesu doda se 50 μL supstrata p-nitrofenil-α-D-glukopiranozida i
spekrofotometrijski mjeri otpuštanje p-nitrofenola pri 405 nm nakon 5-minutne inkubacije.
Slijepe probe za pojedine koncentracije uzorka se pripremaju zamjenom supstrata s 50
μL pufera u svrhu korekcije apsorbancije pozadine.
Kontrolni uzorak sadrži 100 μL destilirane vode umjesto uzorka (ekstrakta).

Izračunavanje

Auz = apsorbancija uzorka (ekstrakta)

Akont = apsorbancija kontrole (bez testnog sastojka, odnosno ekstrakta)

Reagensi
1. α-glukozidaza (1,0 U/mL, priprema se s 0,1 M fosfatnim puferom, pH 6,8)
2. fosfatni pufer (0,1 M, pH 6,8)
3. p-nitrofenil-α-D-glukopiranozid (5 mM, priprema se s 0,1 M fosfatnim puferom, pH 6,8)

46
 7.6. ODREĐIVANJE TRIPTOFANA
(modificirana metoda po Batesu)

Princip

Reakcijom triptofana s p-dimetilaminobenzaldehidom nastaje bezbojni kondenzacioni

produkt¸ čijom oksidacijom se razvija plavo obojenje. Intenzitet nastalog obojenja
proporcionalan je koncentraciji triptofana i odredi se spektrofotometrijski kod 590 nm.

R R
O

+ HC N(CH3)2 CH N(CH3)2
N N

H H
N R

R
oksidacija
leuko spoj
(-H2) C N(CH3)2
N
H
N R

obojeni spoj

Reagensi

1. 0.2 % otopina NaOH

2. 1.75 % otopina želatine u 0.1 % NaOH
3. 2.5 % otopina p-dimetilaminobenzaldehida u 10 % H2SO4
4. 2 % otopina NaNO3
5. 50 % etanol
6. metanol
7. HCl konc.
8. standardna otopina triptofana:
10 mg L- ili DL-triptofana otopi se u smjesi jednakih dijelova 0.2 % otopine
NaOH i metanola i nadopuni do 100 mL istom smjesom.

47
Postupak

0.5 g (±0.0001) prethodno osušenog i s eterom ekstrahiranog uzorka odvagne se u

Erlenmeyer-ovu tikvicu od 50 mL, doda se 12.5 mL 0.2 % NaOH i promiješa da se sadržaj
dobro navlaži. Tikvice se zatvore i autoklaviraju kod 121°C (15 atm) 20 min. Nakon
autoklaviranja u ohlađeni uzorak se doda 12.5 mL metanola, sadržaj tikvice se dobro
promiješa i filtrira preko gustog filter papira.

Za određivanje triptofana uzme se 5 mL filtrata (ili supernatantne otopine) u

Erlenmeyer-ovu tikvicu od 300 mL i ispari na vodenoj kupelji do suha. U ohlađenu tikvicu
doda se 1 mL otopine želatine, tikvica se zatvori i zagrijava u termostatu na 50 °C kroz 10
minuta. Ohlađenoj probi doda se 0.25 mL otopine p-dimetilaminobenzaldehida, promiješa te
doda 0.1 mL otopine natrij nitrata i 14 mL koncentrirane HCl.
Ovako obrađene probe ostave se stajati na sobnoj temperaturi 30 min i u tom vremenu
se potpuno razvije boja. Zatim se doda 35 mL etanola, promiješa i izmjeri apsorbancija na
590 nm. Mjerenje se vrši uz slijepu probu koja se priprema s istim količinama reagenasa, po
istom postupku, ali bez uzorka.

Baždarni dijagram

Od standardne otopine triptofana odpipetira se 0.5, 1.0, 1.5, i 2.0 mL u Erlenmeyer-

ove tikvice od 300 mL i ispari na vodenoj kupelji do suha. Dalje se postupa na isti način kako
je opisano kod određivanja triptofana u uzorku. Dobivene vrijednosti apsorbancije
odgovarajućih koncentracija triptofana unose se na uobičajen način u koordinatni sustav.

Izračunavanje

A
g triptofana u 100 g uzorka = ----- x 100
B

A = g triptofana očitani iz baždarnog dijagrama za dobivenu vrijednost apsorbancije uzorka

B = g uzorka u alikvotnom dijelu otopine

48