Bệnh viện Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh

Trung tâm Đào tạo và Chẩn đoán Y Sinh học phân tử

***

KỸ THUẬT XÉT NGHIỆM

SINH HỌC PHÂN TỬ CƠ BẢN

Lưu hành nội bộ

TP. Hồ Chí Minh, 09/2022

 MỤC LỤC
CHƯƠNG 1 – MỘT SỐ KHÁI NIỆM CƠ BẢN ............................................................... 5
1.1. Mồi ......................................................................................................................... 5
1.2. Mẫu dò ................................................................................................................... 5
1.3. cDNA ..................................................................................................................... 6
1.4. Enzyme cắt giới hạn............................................................................................... 7
1.5. Enzyme nối ............................................................................................................ 7
1.6. Vector ..................................................................................................................... 8
1.7. Plasmid ................................................................................................................... 9
1.8. Sự đa hình kích thước các phân đoạn cắt giới hạn .............................................. 10
1.9. Lai phân tử ........................................................................................................... 10
1.10. PCR ................................................................................................................... 10
1.11. Giải trình tự gene .............................................................................................. 11
CHƯƠNG 2 – ACID NUCLEIC....................................................................................... 13
2.1. Cấu trúc hóa học của nucleic acid ....................................................................... 13
2.2. Sự nhân đôi DNA................................................................................................. 18
2.3. Sự phiên mã ......................................................................................................... 19
2.4. Dịch mã ................................................................................................................ 21
2.5. Sự điều hòa biệu hiện gene .................................................................................. 23
CHƯƠNG 3 – PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI ....................................................................... 26
3.1. Nguyên tắc ........................................................................................................... 26
3.2. Gel agarose........................................................................................................... 27
3.3. Đổ gel agarose...................................................................................................... 27
3.4. Chất nhuộm gel agarose ....................................................................................... 28
3.5. Thang kích thước chuẩn ....................................................................................... 28
3.6. Dung dịch nạp mẫu .............................................................................................. 28
3.7. Dung dịch điện di ................................................................................................. 29
3.8. Thao tác nạp mẫu ................................................................................................. 29
3.9. Trong quá trình điện di ........................................................................................ 30
3.10. Sau khi điện di xong ......................................................................................... 30
3.11. Một số chú ý khi điện di ................................................................................... 30
 3.12. Các biện pháp chống ngoại nhiễm.................................................................... 30
CHƯƠNG 4 – PHƯƠNG PHÁP ĐO MẬT ĐỘ QUANG................................................ 33
CHƯƠNG 5 - PCR VÀ CÁC BIẾN THỂ ......................................................................... 35
5.1. Phản ứng Polymerase Chain Reaction ................................................................. 35
5.1.1. Nguyên lý................................................................................................... 35
5.1.2. Một số kiểu PCR ........................................................................................ 35
5.1.3. Thành phần của phản ứng PCR ................................................................. 36
5.1.4. Chương trình phản ứng PCR cơ bản.......................................................... 36
5.2. Các biến thể của phản ứng PCR .......................................................................... 38
5.2.1. PCR điện di ................................................................................................ 38
5.2.2. Phản ứng phiên mã ngược ......................................................................... 39
5.2.3. Phản ứng PCR đa mồi................................................................................ 40
5.2.4. PCR bất đối xứng ....................................................................................... 41
5.2.5. Phản ứng PCR kích thước lớn ................................................................... 41
5.2.6. Nested PCR ................................................................................................ 42
5.2.7. PCR định lượng ......................................................................................... 42
5.2.8. Hot-start PCR............................................................................................. 43
5.2.9. Touchdown PCR ........................................................................................ 43
5.2.10. Assembly PCR ........................................................................................... 44
5.2.11. Colony PCR ............................................................................................... 45
5.2.12. Digital PCR ................................................................................................ 45
5.2.13. Suicide PCR ............................................................................................... 45
5.2.14. Inverse PCR ............................................................................................... 46
5.2.15. In Situ PCR ................................................................................................ 47
5.2.16. Allele Specific PCR ................................................................................... 47
CHƯƠNG 6 – PHƯƠNG PHÁP REAL-TIME PCR VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP NHÂN
BẢN ACID NUCLEIC KHÁC ......................................................................................... 48
6.1. Phương pháp real-time PCR ................................................................................... 48
6.1.1. Nguyên tắc ....................................................................................................... 48
6.1.2. Màu huỳnh quang ............................................................................................ 48
6.2. Một số khái niệm cơ bản của phản ứng real-time PCR định lượng ....................... 50
6.3. Phương pháp Ligase Chain Reaction (LCR) .......................................................... 51
 6.4. Các phương pháp nhân bản RNA qua trung gian phản ứng phiên mã ................... 52
6.5. Phương pháp bDNA ............................................................................................... 52
6.6. Phương pháp Hybrid capture .................................................................................. 53
CHƯƠNG 7 – QUY TRÌNH REAL-TIME PCR PHÁT HIỆN C. trachomatis VÀ N.
gonorrhoaeae (CT-NG)..................................................................................................... 54
7.1. Xử lý mẫu ............................................................................................................... 55
7.1.1. Đối với mẫu phết: ............................................................................................ 55
7.1.2. Đối với mẫu nước tiểu: .................................................................................... 55
7.2. Qui trình tách chiết DNA/RNA dùng dung môi hữu cơ (phenol/chloroform) ....... 55
7.3. Đặt phản ứng real-time PCR .................................................................................. 56
7.4. Hướng dẫn cài đặt máy real-time PCR Stratagene Mx3005P ................................ 56
7.5. Phân tích kết quả real-time PCR ............................................................................ 57
CHƯƠNG 8 – QUY TRÌNH REAL-TIME PCR PHÁT HIỆN VI KHUẨN H. pylori .. 59
8.1. Quy trình xử lý mẫu sinh thiết dạ dày .................................................................... 60
8.2. Quy trình tách chiết DNA theo phương pháp cột lọc ............................................. 60
8.3. Đặt phản ứng real-time PCR .................................................................................. 60
8.4. Hướng dẫn cài đặt máy real-time PCR Stratagene Mx3005P ................................ 61
8.5. Phân tích kết quả real-time PCR ............................................................................ 61
8.6. Xử lý các vấn đề gặp phải trong quá trình thao tác ................................................ 63
8.7. Quy trình real-time PCR sử dụng EvaGreen phát hiện H. pylori .......................... 63
CHƯƠNG 9 – QUY TRÌNH MULTIPLEX PCR PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH TÝP GENE
cagA VÀ vacA CỦA VI KHUẨN H. pylori ..................................................................... 65
9.1. Quy trình xử lý mẫu sinh thiết dạ dày .................................................................... 66
9.2. Quy trình tách chiết DNA theo phương pháp cột lọc ............................................. 66
9.3. Đặt phản ứng real-time PCR .................................................................................. 66
9.4. Phân tích kết quả multiplex PCR ........................................................................... 67
CHƯƠNG 10 – QUY TRÌNH REAL-TIME PCR PHÁT HIỆN VI KHUẨN
STREPTOTOCCUS NHÓM B (GBS).............................................................................. 69
10.1 . Quy trình xử lý mẫu phết âm đạo-trực tràng .................................................. 70
10.2. Quy trình tách chiết DNA theo phương pháp cột lọc ........................................... 70
10.3. Đặt phản ứng real-time PCR ................................................................................ 71
10.4. Phân tích kết quả real-time PCR .......................................................................... 71
CHƯƠNG 11 – MỘT SỐ CÂU HỎI TRẮC NGHIỆM ................................................... 74
 CHƯƠNG 1 – MỘT SỐ KHÁI NIỆM CƠ BẢN
1.1. Mồi
Mồi (primer) là một đoạn DNA mạch đơn, ngắn, được sử dụng trong phản ứng PCR.
Mồi đặc hiệu và giới hạn vùng gene được nhân bản trong phản ứng PCR. Thông thường
trình tự mồi dài khoảng 20 nucleotide (Hình 1)

Hình 1. Mồi PCR

1.2. Mẫu dò
Mẫu dò là đoạn DNA ngắn (20-100 bp) có trình tự đặc trưng được gắn với phân tử phát
tín hiệu. Có hai loại mẫu dò phổ biến: Mẫu dò đánh dấu phóng xạ ( 32P) có thể được phát
hiện khi sử dụng phim phóng xạ tự ghi (Autoradiograph). Mẫu dò đánh dấu huỳnh quang
sẽ phát ánh sáng khả kiến khi bị kích thích bởi ánh sáng tử ngoại không nhìn thấy. Mẫu dò
có thể phát sáng với nhiều màu khác nhau (Hình 2).
Mẫu dò thường là mạch đơn, có thể được làm từ DNA hoặc RNA. Nếu mẫu dò được
thêm vào một hỗn hợp nhiều phân đoạn DNA khác nhau (như các phân đoạn cắt giới hạn),
nó sẽ liên kết (theo nguyên tắc bổ sung) với bất kỳ trình tự DNA nào có chứa trình tự bổ
sung với nó. Khi đó, các phân đoạn này sẽ được đánh dấu và được phân biệt với các phân
đoạn DNA còn lại.

Hình 2. Mẫu dò
Mẫu dò DNA có thể được dùng trong sinh học phân tử hoặc kỹ thuật di truyền với
nhiều ứng dụng:
  Xác định các phân đoạn giới hạn chứa một gene đặc trưng từ hàng ngàn phân đoạn
cắt giới hạn trong thư viện bộ gene.
 Xác định các trình tự DNA ngắn, sử dụng trong công nghệ DNA fingerprinting.
 Xác định các gene từ một loài có trình tự tương tự với gene từ các loài khác. Ví dụ
một mẫu dò đối với một gene ở chuột sẽ có thể lai với cùng một gene tương tự trên
người. Điều này giúp cho sự nhận biết các gene có ở người.
 Xác định các khiếm khuyết di truyền. Mẫu dò DNA đã được tạo ra để phát hiện
nhiều trình tự gene bệnh ở người như chứng loạn dưỡng cơ hay xơ nang. Hàng trăm
mẫu dò có thể được gắn lên một phiến kính, hình thành một mạng lưới gọi là DNA
microarray hoặc DNA chip. Mẫu DNA người được thêm vào mạng lưới này và bất
kỳ trình tự nào mà bổ sung với bất kỳ mẫu dò nào trong mạng lưới sẽ bị giữ lại trên
phiến kính và được phát hiện. Điều này cho phép phát hiện nhanh nhiều khiếm
khuyết di truyền cùng một lúc.

1.3. cDNA
Complementary DNA (cDNA) là DNA được tổng hợp từ mRNA khi sử dụng enzyme
phiên mã ngược (reverse transcriptase). Enzyme này được tạo ra bởi nhóm retrovirus (bao
gồm cả HIV), giúp chúng xâm lấn tế bào. Trong kỹ thuật di truyền, enzyme phiên mã ngược
được sử dụng để tạo ra cDNA (Hình 3), dùng cho các ứng dụng khác như như nghiên cứu
biểu hiện gene.

Hình 3. Nguồn gốc của cDNA

cDNA giúp giải quyết nhiều vấn đề của kỹ thuật di truyền. Giúp dễ tìm gene hơn.
Có khoảng 70.000 gene trong bộ gene người, và tìm một gene quan tâm rất khó. Tuy nhiên,
tế bào chỉ biểu hiện một số gene nhất định, nên chỉ tổng hợp ra một số lượng các phân tử
mRNA khác nhau. Ví dụ tế bào B của tuyến tụy tạo insulin, vì thế sẽ tạo ra nhiều mRNA
mã hóa cho insulin. Các phân tử mRNA này được phân lập từ những tế bào tuyến tụy và
được sử dụng để tạo cDNA từ các gene insulin.
1.4. Enzyme cắt giới hạn
Enzyme cắt giới hạn là những endonuclease của vi khuẩn, dùng để cắt phân tử DNA tại
những vị trí nhận biết đặc biệt về trình tự. Các vị trí này thường từ 4 đến 8 nucleotide, gọi
là palindrome (xem bảng). Trình tự palindrome của acid nucleic là trình tự khi đọc theo
chiều 5’ đến 3’ trên mạch xuôi hay ngược đều giống nhau (Hình 4).

Hình 4. Vị trí cắt của enzyme cắt giới hạn

Enzyme cắt giới hạn tạo ra các đầu bằng hoặc đầu dính. Các đầu dính có thể liên kết
với nhau theo nguyên tắc bổ sung chỉ khi chúng bị cắt bởi cùng một enzyme cắt giới hạn.
Các đoạn DNA bị cắt bởi enzyme cắt giới hạn được gọi là các phân đoạn giới hạn. Có hàng
ngàn loại enzyme cắt giới hạn khác nhau đã được nhận biết với hàng trăm trình tự nhận
biết khác nhau đã được xác định. Enzyme cắt giới hạn được đặt tên theo loài vi khuẩn mà
chúng được thu nhận, như EcoR1 có nguồn gốc từ chủng E. coli R. Enzyme cắt giới hạn
được sử dụng như là hệ miễn dịch của tế bào vi khuẩn, nhận biết và cắt DNA ngoại lai,
không mang những đặc điểm của DNA tế bào vi khuẩn, như sự methyl hóa. Theo cách này,
enzyme cắt giới hạn sẽ bảo vệ DNA vi khuẩn khỏi sự nhiễm những DNA ngoại lai. Trong
phòng thí nghiệm, enzyme cắt giới hạn được sử dụng cùng với nhiều kỹ thuật sinh học
phân tử khác. Vì enzyme cắt giới hạn nhận biết những trình tự DNA đặc trưng tại vị trí cắt,
chúng được sử dụng để tạo ra những phân đoạn DNA theo ý muốn cho quá trình tạo dòng
gene và các kỹ thuật di truyền liên quan. Trong lâm sàng, enzyme cắt giới hạn được sử
dụng để nhận biết nhanh chóng và chính xác đột biến liên quan đến nhiều bệnh di truyền.

1.5. Enzyme nối

Enzyme nối (DNA ligase) có vai trò nối các DNA bị gãy bằng cách liên kết 2 nucleotide
trong một mạch DNA. Được sử dụng phổ biến trong kỹ thuật di truyền để nối các sản phẩm
của enzyme cắt giới hạn, là các phân đoạn giới hạn bổ sung với nhau (Hình 5).
 Hình 5. Hoạt động của enzyme nối
Đầu dính cho phép 2 phân đoạn giới hạn bổ sung cho nhau, bởi các liên kết hydrogen
yếu, có thể dễ bị gãy bởi sự gia tăng nhiệt độ. Nhưng mạch xương sống của chuỗi DNA
vẫn chưa hoàn thiện.

Enzyme nối hoàn thành xương sống DNA bằng cách hình thành liên kết cộng hóa trị.
Enzyme cắt giới hạn và enzyme nối vì thế được sử dụng cùng nhau để liên kết các đoạn
DNA từ nhiều nguồn khác nhau.

1.6. Vector
Trong sinh học, một vector là vật mang “cái gì đó” giữa các loài. Muỗi là vector mang
ký sinh trùng sốt rét cho người. Trong kỹ thuật di truyền, một vector là “thứ” mang đoạn
DNA có gene mà chúng ta muốn để đưa vào tế bào chủ. Một vector rất cần thiết vì bản
thân đoạn DNA chứa gene sẽ không thực sự làm gì cả trong tế bào chủ. Vì nó không phải
là một phần bình thường của bộ gene tế bào chủ, nó sẽ không được nhân lên khi tế bào
phân chia và sẽ không biểu hiện và sự thực nó sẽ bị phân cắt khá nhanh. Một vector sẽ giải
quyết các vấn đề này nhờ:

- Nó đủ lớn để giữ được gene cần chuyển

- Nó có dạng vòng, để nó sẽ khó bị phân cắt.
- Nó có trình tự kiểm soát, như trình tự promoter để phiên mã, để gene có thể được
nhân lên hoặc được biểu hiện.
- Nó chứa các gene tín hiệu “marker genes”, để tế bào chứa vector có thể được nhận
biết.
1.7. Plasmid
Plasmid là loại vector phổ biến nhất. Plasmid là DNA dạng vòng được tìm thấy tự
nhiên trong các tế bào vi khuẩn. Một plasmid điển hình chứa 3-5 gene và có khoảng 10 bản
sao của plasmid trong tế bào vi khuẩn. Plasmid được nhân lên khi tế bào nhân lên, vì thế
các gene trong plasmid được truyền cho thế hệ con cháu. Chúng cũng được sử dụng một
cách tự nhiên để trao đổi gene giữa các tế bào vi khuẩn. Bởi vì chúng rất nhỏ, chúng dễ
dàng được thao tác trong một ống nghiệm, và các DNA ngoại lai có thể dễ dàng được đưa
vào chúng khi sử dụng enzyme cắt giới hạn và enzyme nối.

Hình 6. Plasmid pBR322

Một trong những plasmid phổ biến nhất được sử dụng là plasmid R (hoặc pBR322).
Plasmid này chứa điểm khởi đầu cho quá trình nhân đôi (a replication origin), một vài trình
tự nhận biết bởi enzyme cắt giới hạn, như EcoRI, và hai gene chỉ thị, cho phép tế bào vi
khuẩn chứa plasmid này có khả năng kháng với các kháng sinh khác nhau (ampicillin và
tetracycline) (Hình 6).

Hình 7. Quá trình tạo plasmid tái tổ hợp

Hình 7 cho thấy cách mà các phân đoạn DNA được cộng hợp vào plasmid khi sử
dụng enzyme cắt giới hạn và enzyme nối. Enzyme cắt giới hạn được sử dụng ở đây (PstI)
cắt plasmid ở giữa một trong những gene chỉ thị (chúng ta sẽ thấy ý nghĩa của việc này
sau). DNA ngoại lai liên kết với plasmid và được enzyme nối nối lại để tạo thành vector
“lai” (a hybrid vector). Một vài sản phẩm khác cũng được hình thành: một vài plasmid sẽ
đơn giản là liên kết với chính chúng để tái tạo trở lại plasmid ban đầu, và một vài phân
đoạn DNA cũng sẽ tự liên kết để hình thành DNA dạng vòng. Những sản phẩm khác nhau
này sẽ không thể dễ dàng loại bị loại trừ, nhưng không thành vấn đề, khi những gene chỉ
thị được sử dụng sau đó để nhận biết vector lai “chính hiệu”.

1.8. Sự đa hình kích thước các phân đoạn cắt giới hạn
Sự đa hình kích thước các phân đoạn cắt giới hạn (RFLP) là kỹ thuật giúp phân biệt
những khác biệt trong trình tự DNA. Khi phân tích RFLP, DNA mẫu được cắt thành các
đoạn nhỏ bằng cách sử dụng các enzyme cắt giới hạn, và sau đó các đoạn DNA nhỏ tạo
thành được phân tách dựa trên kích thước bằng kỹ thuật điện di trên gel. RFLP là công
nghệ nghiên cứu đa hình DNA đầu tiên với chi phí thấp nên có thể được ứng dụng rộng
rãi. RFLP là công cụ quan trọng trong lập hồ sơ di truyền, lập bản đồ gene, định vị gene
gây rối loạn di truyền, xác định nguy cơ mang bệnh và xét nghiệm phả hệ.

1.9. Lai phân tử

Lai phân tử1 là sự lai hóa ứng dụng đặc tính của chuỗi xoắn kép DNA – sự bổ sung
trình tự của hai mạch. Hai mạch có thể được tách ra (bị biến tính) bằng nhiệt hoặc hóa chất.
Sau đó, DNA có thể được tái liên kết hoàn toàn từ các mạch tách biệt (có khả năng bổ sung
cho nhau). Sự liên kết xảy ra bởi vì các cầu nối hydro giữa các cặp base. Khi sử dụng lai
phân tử, trước tiên DNA phải bị biến tính. Một khi DNA đã biến tính, mẫu dò (mạch đơn)
đã đánh dấu huỳnh quang hoặc phóng xạ được dùng để xem liệu phân tử. DNA đã biến
tính có chứa trình tự bổ sung với mẫu dò. Các trình tự khác nhau về cấu trúc sẽ liên kết với
nhau thậm chí với tính tương đồng thấp. Ứng dụng để xác nhận sự hiện diện của gene,
nghiên cứu điều hòa biểu hiện gene, xác định mức độ tượng đồng của DNA từ nhiều nguồn
khác nhau.

1.10. PCR
PCR (Polymerase chain reaction) là phản ứng nhân bản các đoạn gene mong muốn
trong ống nghiệm khi kết hợp với máy luân nhiệt, hệ enzyme DNA polymerase chịu nhiệt
đặc trưng và thành phần phù hợp kèm theo gồm mồi, dNTP, Mg2+, dung dịch đệm và đoạn
DNA đặc trưng cần nhân bản. Các vùng DNA nhân bản được giới hạn bởi hai trình tự mồi,
để khởi động quá trình tổng hợp. DNA mạch đôi được gia nhiệt để tách mạch và sau đó hạ
nhiệt để mồi (là các trình tự nucleotide ngắn khoảng 15 – 20 base) gắn vào mỗi mạch đơn
DNA. DNA polymerase từ Thermus aquaticus (Taq polymerase) được sử dụng để tổng
hợp mạch DNA mới bắt đầu từ vị trí mồi đã gắn vào, hình thành 2 phân tử DNA mới. Quá

1
Molecular hybridization
trình được lập lại với nhiều chu kỳ, sau mỗi chu kỳ tạo ra số lượng các phân tử DNA gấp
đôi chu kỳ trước (theo quy luật hệ số nhân là 2) (Hình 8).

Hình 8. Quy trình PCR

1.11. Giải trình tự gene
Giải trình tự gene có nghĩa là đọc được trình tự base của một đoạn DNA. Một khi trình
tự gene được biết, trình tự amino acid của protein mà gene đó mã hóa sẽ được xác định khi
sử dụng bảng mã di truyền. Trình tự gene xác định được có thể so sánh với trình tự của các
cá nhân khác và những loài khác để tìm ra mối quan hệ.
Giải trình tự DNA dựa trên kỹ thuật được phát triển bởi Fred Sanger và phương
pháp này hiện nay được gọi là phương pháp Sanger. Đánh dấu 4 ống phản ứng là A, T, C
và G. Trong mỗi ống phản ứng thêm vào 1 mẫu DNA cần giải trình tự (chứa hàng triệu bản
sao phân tử DNA cần giải), một mồi đã được đánh dấu phóng xạ (để DNA có thể được
nhìn thấy sau này trên gel), 4 loại nucleotide và enzyme DNA polymerase.
Mỗi phản ứng thêm vào một lượng nhỏ các dideoxy nucleotide đã được biến đổi,
không thể hình thành cầu nối với nucleotide tiếp theo và vì thế quá trình tổng hợp DNA
không thể tiếp tục. Ống phản ứng A chỉ chứa dideoxy A (A*), ống phản ứng T chỉ chứa
dideoxy T (T*), ống phản ứng C chỉ chứa dideoxy C (C*), và ống phản ứng G chỉ chứa
dideoxy G (G*). Các dideoxy nucleotides chiếm khoảng 1% nồng độ các nucleotide bình
thường.
DNA polymerase sẽ tổng hợp nhiều bản sao của mẫu DNA. Theo thời gian, một
dideoxy nucleotide sẽ được thêm ngẫu nhiên vào chuỗi DNA đang được tổng hợp và khi
đó quá trình sẽ ngừng lại. Một dải các phân tử DNA được tổng hợp có chiều dài thay đổi,
từ các sản phẩm rất ngắn cho tới các sản phẩm có kích thước như sản phẩm cần giải. Điểm
quan trọng là trong ống phản ứng A, tất cả các phân đoạn đều ngừng tại nucleotide A.
Trong ống phản ứng T, tất cả các phân đoạn đều ngừng tại nucleotide T, và cứ như thế.
Sản phẩm của 4 ống phản ứng được chạy cạnh nhau trên gel điện di, và các vạch
DNA được nhìn thấy bằng phóng xạ tự ghi. Vì các phân đoạn được sắp xếp theo độ dài sau
khi điện di nên trình tự có thể được đọc dễ dàng bắt đầu từ những vạch sản phẩm có kích
thước nhỏ nhất (chỉ có 1 nucleotide) từ dưới lên trên (Hình 9).

Hình 9. Nguyên lý giải trình tự gene Sanger

Hiện nay có nhiều phiên bản cải tiến của phương pháp Sanger gọi là giải trình tự theo
chu kỳ, có thể được thực hiện hoàn toàn tự động. Các mồi không được đánh dấu phóng xạ,
nhưng thay vào đó là đánh dấu huỳnh quang cho 4 loại dideoxy nucleotide với các màu
khác nhau (A* xanh lá, T* đỏ, C* xanh biển và G* vàng). Phản ứng polymer hóa được
hoàn thành trong 1 ống phản ứng, sử dụng các chu trình nhiệt PCR để gia tăng tốc độ phản
ứng. Hỗn hợp sản phẩm được phân tách bằng điện di mao quản. Gel được đọc tín hiệu bằng
tia laser và trình tự các màu được mã hóa ngược lại thành trình tự DNA bằng chương trình
máy tính. Hàng ngàn gene đã được giải trình tự sử dụng phương pháp này và toàn bộ bộ
gene của một số sinh vật đã được giải bằng phương pháp tương tự. Dự án Bộ gene người
sử dụng phương pháp này để thực hiện và đã đưa ra các trình tự đầu tiên vào tháng 6/2000.
Bộ trình tự gene hoàn thiện bao gồm 3 tỷ nucleotide hoàn thành năm 2003. Thông tin này
cho chúng ta hiểu rõ về di truyền người và dẫn đến các cải tiến trong nghiên cứu khoa học
và y khoa.
 CHƯƠNG 2 – ACID NUCLEIC
2.1. Cấu trúc hóa học của nucleic acid
Nucleic acid gồm có deoxyribonucleic acid (DNA) và ribonucleic acid (RNA). Các
đơn phân cấu tạo nên DNA là deoxyribose nucleotide và đơn phân cấu tạo nên RNA là
ribose nucleotide (Hình 10). Cấu trúc hóa học của các đơn phân gồm 3 thành phần chính
như sau:

Hình 10. Hai loại đơn phân nucleotide

Thành phần khác biệt giữa các nucleotide chủ yếu là các base. Base được chia làm
hai loại purine (gồm có A và G) và pyrimidine (gồm có C, U và T) (Hình 11). Cấu trúc
các base của DNA và RNA như sau:

Hình 11. Purine và pyrimidine

Thông tin cần thiết để tạo nên một sinh vật sống hoàn chỉnh được lưu giữ trong một số
lượng các phân tử DNA tương đối nhỏ gọi là bộ gene (genome) của sinh vật đó. Trình tự nucleotide
của mỗi gene trên phân tử DNA chứa đựng thông tin cần thiết để mã hóa cho một protein tương
ứng. Sự đột biến (Mutation) là sự thay đổi thông tin di truyền (trình tự) mã hóa trong DNA, tạo
nên sự đa dạng của các sinh vật sống.
 Nucleotide liên kết với nhau tại phân tử phosphate của một nucleotide tại vị trí C5
với nhóm hydroxyl tại vị trí C3 của phân tử đường kế tiếp theo chiều dọc của thông qua
cầu nối phosphodiester (Phosphodiester linkage) (Hình 12). Đầu 5’ chứa nhóm phosphate
tự do. Đầu 3’chứa nhóm hydroxyl tự do.
Backbone Bases
O
5′ CH3
N
Thymine (T)
– H N O
O
O P O CH2
5′ O
–
O 4′ 1′
H H
H H
3′ 2′
NH2
H
N
N
Phosphodiester H Adenine (A)
linkage
O N N
O P O CH2
5′ O
–
O 4′ 1′
H H
H H
3′ 2′ NH2
H
H
N
Cytosine (C)
O H N O

O P O CH2
5′ O
–
O 4′ 1′
H H
H H Guanine (G)
3′ 2′
O
H
N H
N
H
O N N NH2

O PCH2 O
Single 5′ O
–
nucleotide O 4′ 1′
H H
Phosphate H H
3′ 2′
OH H
Sugar (deoxyribose)
3′

Hình 12. Liên kết phosphodiester

Mỗi nucleotide mang năng lượng riêng cho phản ứng tổng hợp DNA (Hình 13).
 Hình 13. Liên kết cao năng của ATP
DNA có cấu trúc 2 mạch xoắn kép đối song. Hai mạch DNA liên kết với nhau bằng
cầu nối hydro theo nguyên tắc bổ sung của các cặp basơ: Pyrimidine luôn luôn bắt cặp với
purine. Số lượng liên kết hydro trong cặp GC cao hơn cặp AT dẫn đến tính đặc hiệu trình
tự trong quá trình lai phân tử (Hình 14).

Hình 14. Liên kết hydro

DNA có nhiều mức độ cấu trúc khác nhau (Hình 15).
 Hình 15. Cấu trúc DNA
Sự methyl hóa là quá trình mà các base cytosine được gắn nhóm methyl (-CH3),
làm cho một số gene có thể bị bất hoạt. Dấu ấn di truyền (Genomic imprinting) là sự thay
đổi thông tin di truyền ở đời con tùy thuộc vào gene nhận được từ cha hay mẹ.

RNA có cấu trúc mạch đơn, nhưng thỉnh thoảng có cấu trúc mạch đôi (Hình 16).

Hình 16. Cấu trúc của RNA

Cấu trúc bậc 2 của DNA và RNA (Hình 17).
 Hình 17. Cấu trúc bậc hai
Cấu trúc của tRNA (Hình 18).

Hình 18. Cấu trúc tRNA

DNA, RNA và protein: sự phiên mã DNA thành RNA và dịch mã thành protein là
nền tảng cơ bản của học thuyết trung tâm (Central dogma ). Nhiều enzyme tham gia vào
quá trình này (Hình 19).

Hình 19. Sơ đồ học thuyết trung tâm

 Thí nghiệm chứng minh RNA là vật liệu mang thông tin di truyền ở virus TMV
gây bệnh cho cây thuốc lá.

Hình 20. Thí nghiệm chứng minh RNA là vật liệu di truyền
Thí nghiệm chứng minh DNA chính là phân tử làm thay đổi kiểu hình của tế bào
nhận.

Hình 21. Thí nghiệm chứng minh DNA là vật liệu di truyền
2.2. Sự nhân đôi DNA
Sự nhân đôi DNA (DNA replication): DNA sẽ trải qua quá trình tự nhân bản trước
khi tế bào phân chia. Hai mạch DNA tách ra, mỗi mạch đóng vai trò là mạch khuôn, để
tổng hợp mạch mới bổ sung với mạch khuôn nhờ enzyme DNA polymerase, tạo ra hai phân
tử DNA mới giống hệ phân tử DNA ban đầu, nhờ đó thông tin di truyền được bảo tồn qua
các thế hệ tế bào (Hình 22).

Hình 22. Sự nhân đôi DNA

DNA tự nhân bản bằng cách: đầu tiên hai mạch tách ra, sau đó enzyme đến và tạo
nên mạch bổ sung theo nguyên tắc bổ sung của các cặp basơ nitơ với mạch cũ. Sai sót trong
quá trình tổng hợp mạch mới: 1 trong 109 base. Thực tế, quá trình này có sai sót thấp hơn
nhiều vì DNA polymerase còn có hoạt tính kiểm tra và sửa sai nếu có một base không phù
hợp gắn vào.

Quá trình lai (Hybridization): DNA có thể bắt cặp với DNA/RNA theo nguyên tắc
bổ sung để hình thành các thể lai DNA:DNA hoặc DNA:RNA. Đây là nền tảng của kỹ
thuật lai phân tử. Một số kỹ thuật ứng dụng nguyên tắc lai phân tử bao gồm: microarray,
lai tại chỗ (in situ), lại tại chỗ huỳnh quang (FISH).

2.3. Sự phiên mã
DNA đóng vai trò là nơi lưu giữ thông tin di truyền; RNA đóng vai trò vận chuyển
thông tin di truyền. Các đơn phân cấu tạo nên protein: amino acid, có khoảng hơn 20 loại,
tạo nên nhiều loại phân tử protein đa dạng về cấu trúc và chức năng.

Quá trình phiên mã (Transcription): Quá trình tạo thành bản sao RNA mạch đơn từ
1 gene ban đầu, do enzyme RNA polymerase (Hình 23).
 Hình 23. Sự phiên mã
(A) Một mạch của DNA liên quan đến sự tổng hợp mạch RNA bổ sung với mạch DNA
gốc. (B) Enzyme RNA polymerase có vai trò trong quá trình phiên mã. Nó đọc phân tử
DNA và thu hút các đơn phân đến để tạo thành mạch RNA hoàn chỉnh dựa trên trình tự
DNA ban đầu.
Chỉ những vùng đặc trưng trên phân tử DNA (gọi là gene) mới được phiên mã thành
RNA. Vì thế kích thước của RNA rất nhỏ hơn so với DNA. Và trong khi DNA mang thông
tin mã hóa cho nhiều loại protein, mỗi RNA chỉ mang thông tin mã hóa cho một loại
protein. RNA thông tin (mRNA) là phân tử mang thông tin mã hóa trực tiếp cho một phân
tử protein tương ứng. Khi một gene được phiên mã thành mRNA và sau đó dịch mã thành
protein tương ứng, quá trình này gọi là sự biểu hiện gene.

Chỉ duy nhất một mạch của phân tử DNA được phiên mã thành RNA. Mạch DNA
đóng vai trò là mạch khuôn cho sự tổng hợp RNA, tự nó không mang thông tin mã hóa mà
là thông tin bổ sung. Mạch này được gọi là noncoding strand, anticoding strand hoặc
antisense strand. Trình tự còn lại, mạch DNA không đóng vai trò là mạch khuôn, tương
đồng với trình tự của RNA được tạo ra (T thay bằng U) gọi là sense strand. RNA
polymerase phiên mã mạch khuôn theo hướng 3’ đến 5’, vì thế mRNA được tạo thành theo
hướng 5’ đến 3’.

Bảng mã di truyền (Hình 24), trong đó các amino acid tương ứng với codon được
thể hiện cạnh nhau.
 Hình 24. Bảng mã di truyền
Khung đọc: Hình 25 cho thấy mạch mRNA có 3 khung đọc. Mỗi khung đọc bắt đầu
bằng một nucleotide tiếp theo (khác) tạo nên một phân tử protein hoàn toàn mới.

Hình 25. Khung đọc

2.4. Dịch mã
Quá trình tổng hợp protein từ mRNA được gọi là quá trình dịch mã.
 Hình 26. Cấu trúc ribosome
Cấu trúc của ribosome (Hình 26) cho thấy vị trí gắn của mRNA và 3 vị trí gắn của
tRNA.

Hình 27. Mô hình dịch mã

Mô hình đơn giản với 3 bước dịch mã (Hình 27), trong đó 4 amino acid được thêm
vào đầu C để tạo nên mạch protein. Những bước này được lập lại cho mỗi amino acid trong
phân tử protein.
 Hình 28. Cấu trúc tRNA
Cấu trúc tRNA (Hình 28) để thỏa mãn chức năng vật chuyển amino acid đến
ribosome cho quá trình dịch mã.

2.5. Sự điều hòa biệu hiện gene

Vị trí khởi đầu và kết thúc phiên mã ở prokaryote

RNA polymerase gắn vào trình tự đặc biệt trên phân tử RNA để bắt đầu quá trình
phiên mã. Tín hiệu khởi đầu cho quá trình phiên mã là một trình tự nucleotide ngắn mà
enzyme phiên mã gắn vào. Tín hiệu kết thúc của quá trình phiên mã là một trình tự
nucleotide ngắn, sẽ hình thành cấu trúc vòng, ngăn cản tổ hợp phiên mã tiếp tục quá trình,
do đó kết thúc nó (Hình 29).

Hình 29. Vị trí khởi đầu và kết thúc phiên mã ở prokaryote

Vị trí khởi đầu và kết thúc phiên mã ở eukaryote

Tất cả tín hiệu là những trình tự nucleotide ngắn mà tại đó các enzyme gắn vào,
liên quan đến một quá trình phức tạp (Hình 30).
 Hình 30. Vị trí khởi đầu và kết thúc phiên mã ở eukaryote
Quá trình cắt nối sau phiên mã ở eukaryote

Hình 31. Quá trình cắt nối sau phiên mã ở eukaryote

(A) Cấu trúc mạch thẳng của phân tử tiền mRNA với intron dược tô màu vàng. Vị
trí “cho” có trình tự dinucleotide bảo tồn GU tại vị trí khởi đầu của intron. Vị trí “nhận” có
trình tự dinucleotide bảo tồn AG tại vị trí kết thúc của intron. (B) Intron được cắt ra trong
1 quá trình gồm 2 giai đoạn: đầu tiên tạo nên một cấu trúc vòng, liên quan đến base adenine
(màu đỏ), theo sau là sự nối liền của 2 exon với nhau, giải phóng intron. Trong trường hợp
này, intron nằm trong codon AGG, đươc hình thành khi các exon được nối lại với nhau
(Hình 31).

Kiểm soát dịch mã

Phân tử mRNA chứa 3 vùng mã hóa cho protein khác nhau, từ đó tạo nên các protein
a, b g sau dịch mã. Phân tử mRNA chứa 3 vị trí gắn ribosome khác nhau (màu đỏ).

Hình 32. Kiểm soát dịch mã

Một số điểm cần nhớ
  Mô tả cấu trúc phân tử DNA và RNA và xác định những đặc điểm giống nhau và
khác nhau
 Hiểu được cấu trúc bên trong của mạch DNA và nguyên tắc bổ sung
 Sự nhân bản DNA; Sự tổng hợp RNA
 Vai trò DNA trong học thuyết trung tâm
 Một phân tử mang đặc tính di truyền cần có những chức năng gì?
 Những sinh vật nào sử dụng RNA như là vật liệu di truyền?
 Cấu trúc soắn kép của DNA
 Cấu tạo của một nucleotide?
 Phần nào của nucleotide phân biệt một nucleotide “A” khác với “G”, “C” và “T”?
 Nucleotide nào là pyrimidines và purines?
 Phần nào của nucleotide phân biệt nó là nucleotide của DNA hay RNA? Có thể
dùng chung một nucleotide?
 Trong một phân tử DNA (hoặc RNA), cầu nối nào là phosphodiester và hydro?
Đặc tính hóa học khác nhau là gì?
 Bao nhiêu cầu nối hydro tìm thấy trong cặp G:C hoặc A:T?
 Nhân tố quyết định đầu nào của mạch DNA sẽ là 5’ hay 3’?
 Cấu trúc cặp tóc hay palindrome là gì?
Chất mang thông tin di truyền tốt cần có những đặc tính gì? (1) Tương đối phức
tạp để biểu hiện tính đặc trưng với nhiều kiểu hình khác nhau: Tính trạng (mức độ cá thể);
Protein (mức độ phân tử). (2) Có thể truyền cho con cháu (được nhân bản để con cháu
giống cha mẹ). (3) Cho phép các đột biến xuất thiện theo Darwin. Sinh vật sống không
hoàn toàn giống nhau qua các thể hệ, không giống như đá hay lửa, sinh vật sống có thể tiến
hóa và thích nghi với sự thay đổi trong môi trường.
 CHƯƠNG 3 – PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI
Phương pháp điện di trên gel agarose dựa trên sự di chuyển khác nhau của những
trình tự DNA có kích thước khác nhau trong một giá thể bán rắn (gel agarose) dưới tác
động của điện trường. Từ một vị trí xuất phát, các trình tự DNA có kích thước càng nhỏ
càng di chuyển nhanh và ngược lại. Kết quả là sau một thời gian điện di trong gel agarose,
hỗn hợp các trình tự DNA có kích thước khác nhau sẽ phân tách thành nhiều nhóm kích
thước. Dựa vào một thang kích thước chuẩn, ta có thể suy đoán được kích thước của các
trình tự trong gel. Việc quan sát các trình tự DNA trong gel được tiến hành dưới đèn tử
ngoại – dưới tác động tia tử ngoại, ethidium bromide, tác nhân dùng để nhuộm DNA, sẽ
phát huỳnh quang và hiển thị vị trí của DNA trong gel (Hình 33).

Hình 33 Phương pháp điện di DNA trên gel agarose

3.1. Nguyên tắc
Nguyên tắc: Điện di là kỹ thuật phân tách các phân đoạn DNA/RNA với kích thước
khác nhau, di chuyển khác nhau trong cùng mạng lưới gel. Điện trường kích thích
DNA/RNA di chuyển về phía cực dương trên giá thể bán rắn gel agarose. Sau một khoảng
thời gian, ngắt dòng điện, các phân đoạn DNA/RNA trên gel được phân tích (Hình 34).
 Hình 34. Nguyên tắc điện di DNA trên gel agarose
3.2. Gel agarose
Khoảng cách các phân đoạn DNA di chuyển tỉ lệ nghịch với chiều dài của chúng. Các
phân tử có cùng thích thước sẽ tập trung thành một vạch trên gel. Nồng độ gel cao được
dùng để phân tách các phân đoạn DNA/RNA có kích thước nhỏ hơn (Hình 35).

Hình 35. Cấu trúc gel agarose

3.3. Đổ gel agarose
Khi chuẩn bị gel agarose, trước khi microwave, nên ngâm agarose trong đệm điện di
ít nhất 1 phút, để agarose ngấm no nước, giảm sự hình thành bong bóng khi đun. Phải đảm
bảo gel đúng nồng đồng độ mong muốn. Dùng dung dịch điện di mới (còn hạn sử dụng)
để đổ gel. Đảm bảo mạng lưới gel ổn định.
3.4. Chất nhuộm gel agarose
Các phân đoạn DNA/RNA kích thước khác nhau được nhìn thấy bằng phẩm nhuộm
huỳnh quang đặc hiệu, điển hình là EtBr. Mỗi vạch trên gel tương ứng với những nhóm
phân tử có kích thước và trọng lượng phân tử khác nhau

3.5. Thang kích thước chuẩn

Kích thước của các phân đoạn DNA/RNA được xác định bằng đơn vị bp hoặc kbp
dựa trên thang chuẩn (Hình 36).

Hình 36. Thang phân tử

3.6. Dung dịch nạp mẫu
 Thành phần dung dịch nạp mẫu:

 Phẩm nhuộm (Xylene cyanol, Cresol Red, Bromoophenol Blue, Orange G)

(Hình 37)

 Chất có tỉ trọng nặng (Ficoll, sucrose, glycerol)

 Hình 37. Chỉ thị kích thước của phẩm nhuộm
3.7. Dung dịch điện di
Phụ thuộc vào kích thước của các phân đoạn cần phân tách và loại ứng dụng, các dung
dịch đệm khác nhau có thể được sử dụng cho điện di bằng agarose electrophoresis.

 TAE (Tris Acetate EDTA) là loại phổ biến nhất. TAE có khả năng đệm thấp nhất
trong những loại đệm, tuy nhiên TAE tốt cho phân tách các DNA kích thước lớn và
đòi hỏi hiệu điện thế thấp và thời gian dài.

 TBE (Tris/Borate/EDTA) thường được sử dụng cho những phân đoạn DNA nhỏ
hơn (<500bp)

 SB (Sodium borate) là một loại đệm mới, tuy nhiên không hiệu quả khi phân tách
các phân đoạn lớn hơn 5kb. Thuận lợi của SB là khả năng dẫn điện/nhiệt kém, cho
phép dùng hiệu điện thế cao hơn (lên tới 35 V/cm). Điều này cho phép thời gian
phân tích ngắn hơn.

3.8. Thao tác nạp mẫu

Luôn phải chừa giếng để nạp thang kích thước chuẩn, chứng âm và chứng dương. Khi
nạp gel, tránh tràn dung dịch nạp qua các giếng bên cạnh, làm sai lệch kết quả. Lượng
DNA nạp vào ít thì kích thước band sản phẩm mịn và mảnh. Lượng DNA tối thiểu nhận
biết được trên gel dày 3 mm và giếng rộng 5 mm là 1 ng. Không nên nạp quá 50 ng DNA.
3.9. Trong quá trình điện di
Khi điện di lâu, gel quá nóng, có thể khiến DNA bị biến tính và gel bị mềm/chảy ra.
Khắc phục bằng cách thổi quạt trong quá trình điện di hoặc dùng phòng có máy lạnh.

Điện di đúng điều kiện: thời gian và cường độ/hiệu điện thế dòng điện như qui trình.
Nồng độ dung dịch điện di phải đúng và còn trong hạn sử dụng.

3.10. Sau khi điện di xong

Quan sát liền kết quả điện di dưới đèn UV. Có thể bảo quản DNA trong gel bằng
ethanol 700 trong thời gian dài

3.11. Một số chú ý khi điện di

1. Điện di đúng điều kiện: thời gian và cường độ/hiệu điện thế dòng điện như khuyến
cáo của qui trình kit

2. Khi nạp gel, tránh tràn dung dịch nạp qua các giếng bên cạnh, làm Sai lệch kết quả

3. Gel phải đạt tiêu chuẩn về nồng độ và mạng lưới gel ổn định

4. Luôn luôn phải chừa giếng để chạy thang kích thước chuẩn, chứng âm và chứng
dương

5. Nồng độ dung dịch điện di phải đúng và còn trong hạn sử dụng

3.12. Các biện pháp chống ngoại nhiễm

1. Tách riêng khu vực “tiền-PCR” dành cho xử lý mẫu, tách chiết nucleic acid, đặt
phản ứng PCR với khu vực “hậu-PCR” dành cho điện di
Các thiết bị, dụng cụ thao tác và dụng cụ cá nhân (áo blouse, găng tay, ...)
dành cho hai khu vực này cũng cần được tách riêng và cố định cho từng khu vực.
2. Sử dụng đèn tử ngoại để loại ngoại nhiễm trong khu vực “tiền-PCR”.
3. Sử dụng micropipette với đầu tip có phin lọc.
4. Sử dụng biện pháp hóa học như enzyme UNG (Uracyl-N-glycosylase) cùng với
dUTP.
Thực hành
1. Chuẩn bị mẫu: hút 5 µl dung dịch nạp mẫu (dung dịch màu xanh) cho vào ống
sản phẩm multiplex PCR và trộn đều
2. Nạp 20 µl hỗn hợp trên vào các giếng của gel agarose 5% theo thứ tự đã định
trước. Nhớ vị trí của giếng tương ứng với số thứ tự / tên mẫu.
Một giếng được sử dụng để nạp thang chuẩn 100 bp.
 3. Tiến hành điện di (100 V) trong khoảng 30-45 phút
4. Lấy gel agarose ra khỏi buồng điện di và quan sát trên bàn đèn tử ngoại.
Một số sự cố, nguyên nhân và cách giải quyết
SỰ CỐ
Không có băng DNA với
kích thước mong đợi ở cả
mẫu thử và mẫu chứng
dương
Có băng DNA ở mẫu chứng
dương và không có tín hiệu
nào trên mẫu thử
Có băng DNA với kích
thước mong đợi ở cả mẫu
thử và mẫu chứng âm
NGUYÊN NHÂN KHẮC PHỤC
- Lặp lại thí nghiệm với thành phần
phản ứng pha mới
Hóa chất tách chiết Hoặc sử dụng master mix (thành
hoặc PCR có sự cố phần pha sẵn) mới
- Trữ hóa chất theo đúng nhiệt độ
quy định (tủ lạnh, tủ âm)
- Kiểm tra chương trình đã chọn, khả
Phản ứng PCR có sự năng gián đoạn nguồn điện
cố - Kiểm tra hoạt động của thiết bị
PCR
- Kiểm tra gel agarose bằng cách
chạy điện di lại một sản phẩm PCR
Kết quả điện di có sự bất kỳ đã cho tín hiệu dương tính
cố - Kiểm tra hoạt động của hệ thống
điện di và thời gian điện di
- Thay mới dung dịch điện di
Mẫu có chứa chất ức Pha loãng dịch DNA và lặp lại phản
chế phản ứng ứng PCR
Mẫu bị hư hỏng hoặc
có chứa hàm lượng
Lặp lại bước tách chiết trên mẫu mới
quá thấp của trình tự
mục tiêu
Hóa chất bị ngoại
Thay lô hóa chất mới
nhiễm
Dụng cụ bị ngoại
- Sử dụng đầu tip có phin lọc
nhiễm

Có nhiều băng DNA thay vì
một hoặc có một dải tín hiệu
mờ
- Lau sạch dụng cụ (micropipette,
khay, ...) bằng cồn và chiếu tia UV
- Thay mới những vật dụng thay
được như ống eppendorf, đầu tip, ...
Khu vực làm việc bị Lau khu vực làm việc bằng cồn,
ngoại nhiễm chiếu tia tử ngoại
- Trữ mẫu trong tủ lạnh, trong thời
gian quy định
- Tránh đông và giải đông mẫu nhiều
Mẫu bị hư hỏng
lần
- Thực hiện lại phản ứng với mẫu
mới
Mẫu có hàm lượng Pha loãng mẫu và lặp lại phản ứng
quá cao PCR
 CHƯƠNG 4 – PHƯƠNG PHÁP ĐO MẬT ĐỘ QUANG
Nguyên tắc: Đo hàm lượng ánh sáng hấp thu (Hình 38) của mẫu tại một bước sóng
đặc trưng, từ đó có thể ước lượng nồng độ DNA và RNA. Nucleic acids có đỉnh hấp thu ở
~260nm (Hình 39).

Hình 38. Nguyên tắc đo mật độ quang

[dsDNA] ≈ A260 x (50 µg/mL)

[ssDNA] ≈ A260 x (33 µg/mL)

[ssRNA] ≈ A260 x (40 µg/mL)

Hình 39. Cực đại hấp thu của DNA

Mẫu tách chiết xong được đánh giá là sach như thế nào?

Tỉ lệ A260/A280 khoảng ~1.8 đ/v dsDNA, và ~2.0 đ/v ssRNA. Tỉ lệ thấp hơn 1.7
thường do nhiễm protein.

Tỉ lệ A260/A230 đ/v DNA và RNA nên gần tỉ lệ A260/A280 (và vì thế ≥ 1.8). Tỉ lệ thấp
hơn xác định sự nhiễm hợp chất hưu cơ (phenol, alcohol hoặc carbohydrates) (Hình 40).
Hình 40. Tương quan giữa tỷ số A260/A280 với % protein và % acid nucleic
 CHƯƠNG 5 - PCR VÀ CÁC BIẾN THỂ
5.1. Phản ứng Polymerase Chain Reaction

5.1.1. Nguyên lý
Phản ứng Polymerase Chain Reaction (PCR) là phương pháp nhân bản in vitro 1
đoạn trình tự DNA/RNA mục tiêu thành nhiều bản sao DNA giống nhau dựa vào 1 loại
enzyme DNA polymerase chịu nhiệt (Taq polymerase) có thể kéo dài 1 trình tự mồi
(primer) đã bắt cặp sẵn trên mạch khuôn DNA khi có sự hiện diện của các thành phần thiết
yếu như trình tự mồi đặc hiệu, dNTP, Mg, dung dịch đệm…trong điều kiện nhiệt độ thích
hợp.

PCR được ứng dụng rộng rãi trong rất nhiều lĩnh vực như chẩn đoán, xét nghiệm
các tác nhân vi sinh vật gây bệnh, tạo dòng gen và biểu hiện protein, tạo giống mới với các
đột biến định hướng, nghiên cứu sự tiến hoá của sinh vật ở mức độ phân tử, giải mã di
truyền, v.v…

5.1.2. Một số kiểu PCR

PCR cơ bản: là kỹ thuật dùng để nhân bản 1 đoạn DNA mục tiêu thành số lượng
lớn bản sao DNA giống DNA khuôn.

RT-PCR: là kỹ thuật sử dụng enzyme reverse transcriptase, có khả năng tổng hợp ra
mạch DNA bổ sung (cDNA, complementary DNA) từ mạch đơn RNA, do vậy bước RT
còn được gọi là bước tổng hợp cDNA.

PCR đơn mồi: là kỹ thuật PCR trong đó sử dụng chỉ 1 cặp mồi trong hỗn hợp PCR
để nhân bản một hay nhiều trình tự mục tiêu.

PCR đa mồi: là kỹ thuật PCR trong đó sử dụng từ 2 cặp mồi trở lên trong hỗn hợp
PCR để nhân bản một hay nhiều trình tự mục tiêu.

PCR định tính: là phương pháp PCR cho phép kết luận định tính, xác định có hay
không có trình tự mục tiêu trong hỗn hợp phản ứng.

PCR định lượng: là phương pháp PCR cho phép định lượng, xác định số lượng cụ
thể trình tự mục tiêu trong hỗn hợp phản ứng.

Ngoài ra còn nhiều kiểu PCR khác tùy theo thiết kế và mục đích sử dụng như: PCR
semi-nested, PCR nested, RFLP-PCR (Restriction fragment length polymorphism),
RAPD-PCR (Random Amplification of Polymorphic DNA), touchdown PCR, PCR khuẩn
lạc, PCR đẳng nhiệt, …
5.1.3. Thành phần của phản ứng PCR
Thành phần cơ bản của phản ứng PCR gồm: mạch khuôn DNA, ion Mg ++, DNA
polymerase, 4 loại nucleotide, 2 mồi, dung dịch đệm và nước.

Mạch khuôn: DNA sau tách chiết. Lượng mạch khuôn đề nghị cho một phản ứng
PCR chuẩn: 1-10 ng DNA vi khuẩn hoặc 0.1-1 ng DNA plasmid.

2 Mồi: để giới hạn vùng gene sẽ được nhân bản. Nồng độ tối ưu của mồi thường
trong khoảng 0.1-0.6 µM. Nồng độ mồi cao hơn thường gây bắt cặp sai, tạo sản phẩm
không đặc hiệu, nồng độ mồi thấp có thể làm giảm hiệu suất nhân bản của phản ứng PCR.

dNTPs: Để cung cấp năng lượng và các đơn phân cho quá trình tổng hợp DNA.
Nồng độ cân bằng của 4 loại dNTPs giúp hạn chế sai sót của enzyme DNA polymerase.
Nồng độ các dNTPs mất cân bằng sẽ giảm tính chính xác Taq DNA polymerase. Nồng độ
cuối cùng cho mỗi dNPT vào khoảng 50-500 µM. Thường được sử dụng trong phản ứng
với nồng độ 200 µM.

Hệ thống đệm: chứa enzyme MgCl2 và các muối khác. Cung cấp môi trường hóa
học phù hợp cho hoạt tính tối ưu và ổn định của DNA polymerase. Thường pH của đệm
phản ứng PCR vào khoảng 8.3-9.0 cho kết quả tối ưu. Nồng độ MgCl 2 tối ưu vào khoảng
1 – 5 mM. 1.5mM thường tối ưu cho nhiều trường hợp.

Enzyme: DNA polymerase. Nồng độ đề nghị khoảng 0.5 – 2.5 U / phản ứng V = 50
µl. Quá ít enzyme sẽ hạn chế sản phẩm phản ứng được tạo ra. Quá nhiều sẽ tạo ra những
sản phẩm không mong muốn và giảm tính đặc hiệu của phản ứng.

5.1.4. Chương trình phản ứng PCR cơ bản

Máy luân nhiệt điều khiển nhiệt độ phản ứng. Chương trình PCR gồm các bước
chính (Hình 41):

Biến tính ban đầu: 95oC – 15 phút

35-40 chu kỳ: 95oC – 30 giây; 55oC – 30 giây; 72oC – 30 giây

Chu kỳ cuối: 72oC – 6 phút

 Hình 41. Phản ứng PCR
Biến tính ban đầu: bước này duy trì nhiệt độ phản ứng ở điều kiện 94-95o C trong
khoảng 1-10 phút. Khoảng thời gian 2 phút ở nhiệt độ này đủ để biến tính toàn bộ DNA bộ
gene.

Mỗi chu kỳ lập lại bao gồm 3 bước nối tiếp nhau và thời gian cho mỗi chu kỳ khoảng
vài phút và thường cần tối thiểu 15-20 chu kỳ để tạo ra lượng sản phẩm mong muốn. Biến
tính: 1 đến vài phút ở 94-95o C. Làm cho DNA mạch đôi tách mạch hoàn toàn. Lai: 1 đến
vài phút ở 50-65o C. Khi đó mồi sẽ liên kết với mạch khuôn (bằng cầu nối hydro) theo
nguyên tắc bổ sung. Kéo dài: Nhiệt độ kéo dài tối ưu là 72o C. DNA polymerase sẽ gắn
vào và kéo dài mạch bổ sung, bắt đầu từ vị trí mồi với tốc độ tổng hợp khoảng 60 bp/giây.

Kéo dài cuối cùng và lưu: giai đoạn này thường kéo dài từ 5-15 phút để đảm bảo tất
cả các sản phẩm đều được hoàn thiện với kích thước như nhau; và sau đó lưu mẫu cho đến
khi điện di phát hiện kết quả (sản phẩm được nhân bản).

Số lượng chu kỳ phản ứng PCR: Số lượng chu kỳ tối ưu phụ thuộc vào lượng mạch
khuôn ban đầu. Ở điều kiện tối ưu: ít hơn 10 bản sao mạch khuôn có thể được nhân bản
trong tối đa 40 chu kỳ để tạo sản phẩm có thể nhận biết được trên gel agarose khi nhuộm
bằng EtBr hay các phẩm nhuộm mạch đôi tương ứng. Thường PCR có 15-35 chu kỳ. Khi
số chu kỳ gia tăng, các sản phẩm ký sinh sẽ tích lũy. Sau khoảng 20-40 chu kỳ, hơn 1 triệu
bản sao từ những phân tử DNA ban đầu.
 Hình 42. Các giai đoạn PCR
Phản ứng PCR gồm có 3 giai đoạn (Hình 42):

Pha lũy thừa: Chính xác theo quy luật nhận bản 1 thành 2, 2 thành 4 … (hiệu suất
100%). Phản ứng đặc hiệu và chính xác nhất.

Pha tuyến tính: Thành phần phản ứng đang bị tiêu thụ và giảm dần, phản ứng chậm
lại và sản phẩm có khuynh hướng bị phân hủy.

Pha bão hòa: Phản ứng ngừng lại, không còn sản phẩm được tạo ra và nếu đủ lâu,
các sản phẩm PCR sẽ bắt đầu bị phân hủy.

5.2. Các biến thể của phản ứng PCR

5.2.1. PCR điện di

Phương pháp PCR sử dụng phương pháp điện di trên gel có chứa chất nhuộm DNA
để phát hiện lượng sản phẩm PCR mới được tạo ra. Qui trình thường gồm 3 bước: Tách
chiết DNA/RNA, PCR/RT-PCR và điện di (Hình 43).

Hình 43. Quy trình PCR điện di

5.2.2. Phản ứng phiên mã ngược
RNA được phiên mã ngược thành cDNA khi sử dụng enzyme reverse transcriptase
(RT). Enzyme reverse transcriptase được biết như là một enzyme DNA phụ thuộc RNA.
Enzyme này phiên mã phân tử RNA mạch đơn thành DNA mạch đôi. Nhiệt độ sử dụng
vào khoảng 40°C - 50°C (Hình 44).

Lưu ý:

 Phải chọn lưa enzyme reverse transcriptase phù hợp nhất cho mục đích sử
dụng (RT: one-step PCR và two-step PCR)
 Enzyme reverse transcriptase hoạt động ở nhiệt độ cao thì tốt hơn.
 Họat tính RNAse H hay còn gọi là họat tính ribonuclease không đặc hiệu,
xúc tác quá trình thủy phân RNA trong phức hợp RNA:DNA, mà không phá
hủy DNA hoặc RNA tự do (không liên kết trong phức hợp DNA:DNA)
 Hoạt tính RNAse H bị làm giảm sẽ giúp tạo ra các cDNA dài hơn (> 5kp và
có thể lên tới 12kp).
 RT (tái tổ hợp) họat động ở nhiệt độ cao (lên tới 500 C), giảm hoặc hạn chế
sự bắt cặp không đặc hiệu, giúp tăng tính đặc hiệu và lượng cDNA nhiều
hơn.

Hình 44. Phản ứng phiên mã ngược

Thành phần phản ứng RT: Enzyme reverse transcriptase, dNTPs, khuôn mRNA,
đệm, mồi.
Ứng dụng của phản ứng RT: Phản ứng phiên mã ngược được ứng dụng trong nhiều
lĩnh vực của nghiên cứu khoa học về sự sống:
 Phương pháp RT-PCR có một độ nhạy cao trong việc phát hiện một hàm lượng rất
nhỏ các phân tử RNA ban đầu.
 Chẩn đoán các bệnh di truyền.
 Định lượng tương đối hàm lượng các loại RNA khác nhau trong tế bào trong mô khi
nghiên cứu biểu hiện của gene.
 Thành lập thư viện cDNA.
  RT-PCR được sử dụng trong nghiên cứu genome của virus có vật liệu di truyền là
RNA như influenzavirus A hoặc retrovirus như HIV.

5.2.3. Phản ứng PCR đa mồi

Sử dụng một vài cặp mồi lai với nhiều trình tự đích khác nhau. Điều này cho phép
phân tích nhiều trình tự đích cùng lúc trong cùng một phản ứng (Hình 45). Ví dụ trong
phân tích các đột biến di truyền, sáu hoặc hơn các vùng gen được kết hợp nhân bản trong
cùng một phản ứng. Trong qui trình phân tích “dấu ấn” di truyền (DNA fingerprinting),
các trình tự đích thường được nhân bản theo từng nhóm 3 hoặc 4.

Hình 45. Phản ứng PCR đa mồi

Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (or MLPA) cho phép nhiều trình
tự đích được nhân bản, khi sử dụng chỉ một cặp mồi, trách được giới hạn về độ nhạy của
phản ứng multiplex PCR. Multiplex PCR cũng được sử dụng trong phân tích các tiểu vệ
tinh di truyền (microsatellites) hoặc đa hình di truyền các nucleotide (SNPs)

Variable Number of Tandem Repeats (VNTR) PCR nhắm đến các vùng gene có đặc
tính đa hình về kích thước (Hình 46). Phân tích kiểu gen của mẫu thường liên quan đến
việc xác định kích thước của các sản phẩm được nhân bản bằng điện di trên gel agarose.
Phân tích các đoạn VNTR nhỏ hơn được gọi là Short Tandem Repeats (STRs) là nền tảng
của cơ sở dữ liệu về dấu ấn di truyền (DNA fingerprinting databases).

Hình 46. Phản ứng VNTR

Sự đa hình kích thước các trình tự lập lại (VNTR) của 6 cá nhân khác nhau.
5.2.4. PCR bất đối xứng
PCR bất đối xứng thường được sử dụng để nhân bản một mạch của DNA đích (Hình
47). Được sử dụng trong một số phương pháp giải trình tự và tạo mẫu dò cho quá trình lai
phân tử, sản phẩm là các phân tử DNA mạch đơn. Chu trình nhiệt được tiến hành như phản
ứng PCR, nhưng với các mồi giới hạn và mồi dư thừa. Khi mồi giới hạn bị hết, quá trình
nhân bản gia tăng thông qua sự kéo dài của các mồi dư thừa. Một biến thể của quá trình
này, là L'inear-After-The-Exponential-PCR (LATE-PCR), sử dụng một mồi giới hạn có
nhiệt độ lai (Tm) cao hơn mồi dư thừa để kiểm soát hiệu suất phản ứng vì nồng độ mồi giới
hạn sẽ giảm vào giữa phản ứng.

Hình 47. Phản ứng PCR bất đối xứng

5.2.5. Phản ứng PCR kích thước lớn

Phản ứng PCR kích thước lớn, nghĩa là hơn 5 kbp (thường là hơn 10 kbp) (Hình
48). Phản ứng PCR kích thước lớn chỉ hữu dụng khi nó thực sự chính xác. Vì thế, hỗn hợp
PCR đặc biệt cần được sử dụng, có sự phối hợp giữa Taq DNA polymerase và Pfu DNA
polymerase. Ứng dụng: để dòng hóa các gene lớn mà không thể thực hiện được với PCR
truyền thống.

Hình 48. Phản ứng PCR kích thước lớn

5.2.6. Nested PCR
Nested PCR được sử dụng để tăng độ đặc hiệu của quá trình nhân bản DNA (Hình
49). Hai bộ mồi được sử dụng trong 2 phản ứng liên tiếp. Phản ứng PCR đầu tiên, một cặp
mồi được sử dụng để tạo ra sản phẩm PCR, có thể chứa sản phẩm được nhân bản từ những
vùng không mong muốn. Sản phẩm từ phản ứng PCR đầu tiên sau đó là mạch khuôn trong
phản ứng PCR thứ hai, sử dụng một cặp mồi khác có vị trí bắt cặp nằm trong vùng sản
phẩm của phản ứng PCR thứ nhất, vì thế tăng tính đặc hiệu. Phản ứng Nested PCR thường
được sử dụng khi nhân bản các sản phẩm PCR dài hơn PCR truyền thống.

Hình 49. Nested PCR

5.2.7. PCR định lượng

qPCR được sử dụng để đo lượng DNA/RNA đích đặc trưng trong mẫu. Bằng cách
đo lượng sản phẩm nhân bản trong giai đoạn tăng theo cấp số mũ thực sự, lượng sản phẩm
được xác định phản ánh chính xác hàm lượng mạch đích ban đầu. Chu trình nhiệt đặc trưng
được sử dụng để theo dõi lượng sản phẩm tạo thành trong suốt quá trình nhân bản. Real-
Time PCR sử dụng phẩm nhuộm huỳnh quang, như SYBRGREEN hoặc mẫu dò DNA có
gắn huỳnh quang (TaqMan), để đo lường lượng sản phẩm nhân bản trong suốt quá trình
PCR (Hình 50).

Hình 50. Đường chạy real-time PCR

5.2.8. Hot-start PCR
Hot-start PCR là kỹ thuật được thực hiện bằng cách gia tăng nhiệt độ của hỗn hợp
phản ứng đến nhiệt độ nóng chảy DNA (95o C) trước khi cho enzyme polymerase vào.
Theo cách này, sự nhân bản của các sản phẩm không đặc hiệu ở nhiệt độ thấp sẽ bị giới
hạn. Một cách khác là sử dụng những thành phần đặc biệt kìm hãm hoạt tính polymerase
tại nhiệt độ phòng, bởi liên kết với kháng thể hoặc với các chất ức chế, mà liên kết này chỉ
bị phá vỡ sau bước hoạt hóa ở nhiệt độ cao. 'Hot-start/cold-finish PCR' đạt được khi sử
dụng polymerase thế hệ mới, bị bất hoạt ở nhiệt độ phòng và chỉ có hoạt tính khi nhiệt độ
tăng lên (Hình 51).

Hình 51. Cơ chế hoạt động của hot-start PCR

5.2.9. Touchdown PCR

Touchdown PCR sử dụng nhiệt độ lai được giảm từ từ trong những chu kỳ cuối.
Nhiệt độ lai trong những chu kỳ đầu thường cao hơn nhiệt độ lai tiêu chuẩn của mồi được
sử dụng từ 3-5 độ; trong khi ở những chu kỳ cuối, nhiệt độ lai thường thấp hơn từ 3-5 độ
so với nhiệt độ lai tiêu chuẩn. Nhiệt độ lai ban đầu cao hơn sẽ tạo nên sự đặc hiệu lớn hơn
cho việc liên kết với mạch khuôn của mồi, trong khi nhiệt độ lai thấp hơn sau đó cho phép
tạo ra sản phẩm nhân bản với hiệu suất cao hơn ở những chu kỳ cuối (Hình 52).
 Hình 52. Quy trình touchdown PCR

5.2.10. Assembly PCR

Assembly PCR hoặc Polymerase Cycling Assembly (PCA) là quá trình tổng hợp các
trình tự DNA lớn với hỗn hợp các oligonucleotide dài có các đoạn trùng lặp ngắn, để nối 2
hoặc nhiều hơn các đoạn DNA thành một đoạn lớn. Liên quan đến phản ứng PCR đầu tiên
với các mồi có vùng trùng lặp và một phản ứng PCR thứ hai sử dụng các sản phẩm PCR1
để làm mạch khuôn tạo ra các sản phẩm có chiều dài đầy đủ. Kỹ thuật này có thể thay thế
cho kỹ thuật PCR dựa trên enzyme nối (Hình 53).

Hình 53. Assembly PCR

5.2.11. Colony PCR
Trong PCR khuẩn lạc, các khuẩn lạc của vi khuẩn được sử dụng trực tiếp để PCR,
ví dụ, để đánh giá các cấu trúc vector DNA có chính xác hay không. Khuẩn lạc được thu
nhận với đầu tip tiệt trùng và một lượng nhỏ tế bào được chuyển vào hỗn hợp PCR. Để giải
phóng DNA khỏi tế bào, PCR được bắt đầu với nhiệt độ 95 °C với thời gian dài hơn bình
thường (Hình 54).

Hình 54. Colony PCR

5.2.12. Digital PCR

Digital PCR nhân bản đồng thời hàng ngàn mẫu, mỗi mẫu trong một phản ứng riêng
biệt. Digital PCR là phương pháp tiếp cận mới để định lượng tuyệt đối acid nucleic không
cần dựng đường chuẩn (Hình 55).

Hình 55. PCR kỹ thuật số

5.2.13. Suicide PCR

Suicide PCR điển hình được sử dụng trong di truyền khảo cổ học hay những nghiên
cứu khác đòi hỏi loại bỏ hoàn toàn dương tính giả và đảm bảo tính đặc hiệu của các phân
đoạn được nhân bản là ưu tiên cao nhất.

Phương pháp này sử dụng các cặp mồi được sử dụng chỉ một lần duy nhất, vì thế có
thuật ngữ “suicide”, chưa bao giờ được sử dụng trong bất cứ phản ứng PCR với mẫu chứng
dương trước đây, và mồi luôn luôn liên kết với vùng gene mà chưa bao giờ được nhân bản
trong PTN hay bởi những cặp mồi khác đã từng được sử dụng. Điều này đảm bảo không
có DNA ngoại nhiễm từ những lần PCR trước hiện diện trong PTN, mà có thể gây dương
tính giả.

5.2.14. Inverse PCR

Cho phép nhân bản DNA với chỉ một trình tự được biết. Giới hạn của phương pháp
PCR truyền thống là phải biết hai mồi ở hai đầu của vùng gene cần nhân bản, nhưng phương
pháp này cho phép PCR diễn ra với chỉ một trình tự mà từ đó các mồi có thể được thiết kế
(Hình 56).

Inverse PCR thường được sử dụng để xác định các vùng có trình tự chèn. Ví dụ, ở
nhiều retrovirus hay transposons thường ngẫu nhiện chèn vào DNA bộ gene. Để xác định
những vị trí mà chúng chèn vào, trình tự đã biết của tranposon hay virus “đã biết” thường
được dùng để thiết kế mồi để nhân bản một vùng nhỏ bao hai đầu vùng gene ngoại lai. Sản
phẩm nhân bản sau đó được giải trình tự và so sánh với ngân hàng dữ liệu DNA để xác
định vị trí của trình tự bị chèn.

Hình 56. PCR đảo ngược

5.2.15. In Situ PCR
Là phản ứng PCR diễn ra bên trong tế bào trong một lam kính. In Situ PCR có thể
được tiến hành trên các mô hay tế bào đã cố định. Ứng dụng nguyên lý lai phân tử của acid
nucleic. Cho phép phát hiện các chỉ thị tế bào “cellular marker”. In situ PCR có ưu điểm
phát hiện RNA hơn so với DNA, vì tính giới hạn của các bản sao gene/bộ gene trong một
tế bào (Hình 57).

Hình 57. PCR tại chỗ

5.2.16. Allele Specific PCR

Được sử dụng để phát hiện các đột biến hay SNP. Cần phải hiểu rõ vị trí đột biến
trong trình tự gene đích cần phát hiện. Sử dụng các mồi nhân bản mà đầu 3’ của mồi nằm
ngay vị trí đột biến. Tiến hành PCR dưới điều kiện khắc nghiệt để cho nếu có mismatch
giữa mồi và mạch khuôn thì sản phẩm không tạo thành. Phản ứng thành công khi mồi đặc
hiệu với đột biến cho sản phẩm nhân bản khi mạch khuôn thực sự có đột biến và ngược lại
(Hình 58).

Hình 58. PCR đặc hiệu đột biến

 CHƯƠNG 6 – PHƯƠNG PHÁP REAL-TIME PCR VÀ CÁC PHƯƠNG
PHÁP NHÂN BẢN ACID NUCLEIC KHÁC
Mục tiêu: Trình bày nguyên lý và một số đặc điểm của phương pháp real-time PCR
VÀ một số phương pháp nhân bản và định lượng nucleic acid khác như NASBA, bDNA,
TMA, hybrid capture.
Trong lĩnh vực chẩn đoán bệnh, do hàm lượng vật liệu di truyền của tác nhân gây
bệnh trong mẫu không cao nên phần lớn các phương pháp sinh học phân tử sử dụng để
xác định vật liệu di truyền của tác nhân bệnh đều dựa trên sự nhân bản, nhân bản trình tự
mục tiêu (target amplification) hoặc nhân bản tín hiệu (signal amplification). Trong kiểu
nhân bản thứ nhất, quá trình nhân bản sẽ tạo ra một lượng lớn bản sao của trình tự mục tiêu
(DNA, RNA), ví dụ như các phương pháp real-time PCR (polymerase chain reaction), SDA
(strand displacement amplification), LCR (ligase chain reaction), NASBA (nucleic acid
sequence-based amplification), TMA (Transcription-Mediated Amplification). Còn trong
kiểu thứ hai thì số lượng trình tự mục tiêu không tăng, chỉ có trình tự tín hiệu bắt cặp với
trình tự mục tiêu mới được nhân bản, ví dụ như các phương pháp bDNA (branched DNA),
hybrid capture.

6.1. Phương pháp real-time PCR

6.1.1. Nguyên tắc

Real-time PCR là một cải biên của phương pháp PCR dựa trên chức năng 5’-3’
exonuclease của Taq polymerase do Holland và cộng sự công bố năm 1991. Trong phản
ứng real-time PCR, người ta sử dụng các tác nhân phát huỳnh quang bao gồm tác nhân gắn
vào DNA mạch đôi (DNA binding dye) và tác nhân dùng đánh dấu mẫu dò đặc hiệu (FAM,
HEX, Cy5, ...).

6.1.2. Màu huỳnh quang

Tác nhân liên kết với mạch đôi DNA: Trong phản ứng, khi có sự nhân bản của trình
tự đích thì các tác nhân liên kết với DNA mạch đôi như SYBR Green I, Ethidium bromide
sẽ liên kết với các sản phẩm DNA mạch đôi vừa được tạo ra và bắt đầu phát tín hiệu huỳnh
quang. Loại tác nhân huỳnh quang này có thể sử dụng được cho mọi trình tự đích nên chi
phí sẽ thấp; nhưng độ đặc hiệu của sản phẩm phải được kiểm tra chặt chẽ thông qua một
bước phân tích bổ sung – Melting curve (phân tích nhiệt độ nóng chảy) – sau khi phản ứng
nhân bản kết thúc.

Tác nhân đánh dấu mẫu dò đặc hiệu: rất đa dạng như FAM, TAMRA, Texas Red,
Cy3, Cy5, …, được sử dụng với nhiều loại mẫu dò:
Mẫu dò lai (hybridization probe): gồm hai mẫu dò có vị trí bắt cặp gần nhau trên
mạch khuôn và một hoặc hai mồi (primer). Các mồi cho phép nhân bản trình tự đích trong
phản ứng PCR. Mẫu dò phía đầu có mang nhóm hùynh quang ở đầu 3’ còn mẫu dò phía
đuôi mang nhóm huỳnh quang đầu 5’. Khi 2 mẫu dò bắt cặp trên cùng một trình tự DNA,
nhóm hùynh quang “cho” (donor dye) và nhóm “nhận” (acceptor dye) trên 2 mẫu dò sẽ
gây ra hiệu ứng FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer). Hiệu ứng này được ghi
nhận mỗi khi có sự bắt cặp của mẫu dò 5’ và mẫu dò 3’ lên những trình tự mới được tạo
thành trong quá trình PCR (Hình 59).

Hình 59. Phương pháp real-time PCR với mẫu dò lai

Hình 60. Phương pháp real-time PCR với mẫu dò thủy giải (Taqman probe)

Mẫu dò thủy giải (Hydrolysis probe) với ví dụ thông dụng nhất là TaqMan probe
(còn gọi là thử nghiệm 5’ nuclease). Mẫu dò được đánh dấu đầu 5’ bằng nhóm phát huỳnh
quang (reporter dye), và đầu 3 bằng nhóm dập tắt huỳnh quang (quencher dye). Nhóm
“dập” sẽ ngăn sự phát huỳnh quang của nhóm “phát” khi mẫu dò ở trạng thái nguyên vẹn.
Trong quá trình tổng hợp mạch mới, hoạt tính 5’ exonuclease của Taq polymerase sẽ cắt
rời nhóm “phát” khỏi mẫu dò, khiến nó không còn chịu tác động của nhóm “dập”. Lúc đó
nhóm “phát” sẽ phát tín hiệu huỳnh quang và được ghi nhận (Hình 60).
Mẫu dò dạng “kẹp tóc” (hairpin probe) như “Molecular beacon”: bao gồm một trình
tự bổ sung đặc hiệu với trình tự đích nằm giữa hai trình tự lặp lại đảo ngược. Các nhóm
“phát” (reporter) và “dập” (quencher) được gắn vào hai đầu mút của mẫu dò. Do đó, sự
phát huỳnh quang không xảy ra khi mẫu dò ở dạng tự do (cấu hình “kẹp tóc”) trong dung
dịch. Khi mẫu dò bắt cặp với trình tự đích, nó sẽ duỗi dài khiến hai nhóm “phát” và “dập”
tách xa. Lúc đó, tín hiệu huỳnh quang được phát ra và ghi nhận (Hình 61).

Hình 61. Phương pháp real-time với mẫu dò dạng “kẹp tóc”
Trong mọi trường hợp vừa nêu, cường độ tín hiệu huỳnh quang tỉ lệ thuận với hàm
lượng sản phẩm đích đang được nhân bản trong phản ứng. Các tín hiệu huỳnh quang phát
ra sẽ được các đầu dò của máy luân nhiệt real-time thu nhận và xử lý. Khi cường độ tín
hiệu huỳnh quang của mẫu vượt qua đường tín hiệu huỳnh quang nền (base line) của phản
ứng thì mẫu được xem là dương tính và người ta lấy thời điểm vượt qua đó (biểu hiện qua
giá trị chu kỳ ngưỡng – Ct, Threshhold Cycle) để so sánh với một đường cong chuẩn
(standard curve) đã biết để suy ra nồng độ trình tự DNA đích trong mẫu thử nghiệm ban
đầu. Đường cong chuẩn được xây dựng từ chu kỳ ngưỡng của các mẫu chuẩn có chứa sản
phẩm đích đã biết trước nồng độ.
Định lượng nucleic acid là ứng dụng mạnh nhất của phương pháp này. Trong lĩnh
vực chẩn đoán bệnh, kỹ thuật real-time PCR được ứng dụng rộng rãi để phát hiện và định
lượng các tác nhân gây bệnh ở người như virus, vi khuẩn, nấm phục vụ cho chẩn đoán và
theo dõi điều trị. Nhiều bộ kit thương mại sử dụng mẫu dò thủy giải (Roche COBAS
Taqman HBV test, Artus RealArt HBV PCR), mẫu dò lai (Roche Diagnostics), mẫu dò
dạng “kẹp tóc” (molecular beacon) (RealArt kit – Cobett Research), HCV Quantitation
ASR (Abbott).

6.2. Một số khái niệm cơ bản của phản ứng real-time PCR định lượng
Đường nền (baseline): được định nghĩa là số chu kỳ PCR trong đó tín hiệu huỳnh
quang đặc hiệu tích lũy dần nhưng chưa đạt ngưỡng nhận biết của thiết bị. Theo mặc định,
đường nền được xác lập trong khoảng chu kỳ 3 đến 15 và có thể được thay đổi.
Ngưỡng (threshold): là một giá trị được xác lập một cách tùy ý, dựa trên đường nền.
Giá trị này được tính bằng 10 lần độ lệch chuẩn của tín hiệu trung bình giữa chu kỳ 3 và
15. Một tín hiệu huỳnh quang phát hiện trên ngưỡng được xem là tín hiệu đặc hiệu, và sẽ
được sử dụng để xác định chu kỳ ngưỡng.
Chu kỳ ngưỡng (cycle threshold – Ct): được định nghĩa là chu kỳ PCR ở đó tín hiệu
huỳnh quang đặc hiệu lớn hơn ngưỡng nhận biết của thiết bị. Nói khác đi, đó là số chu kỳ
PCR ở đó tín hiệu đặc hiệu vượt khỏi đường nền. Đây là khái niệm cơ bản của real-time
PCR và là yếu tố quyết định tính chính xác và lặp lại của kết quả. Số trình tự mục tiêu trong
mẫu ban đầu càng cao thì số chu kỳ cần để vượt ngưỡng phát hiện càng nhỏ, nghĩa là giá
trị Ct càng thấp (Hình 62).

Hình 62. Đồ thị phản ứng real-time PCR

Phương pháp định lượng tuyệt đối thông qua đường chuẩn (standard curve): Một
đường chuẩn được xây dựng với các nồng độ (pha loãng 5 đến 10 lần) của một trình tự
DNA chứng đã biết và các giá trị Ct tương ứng. Để định lượng trình tự mục tiêu ban đầu
có trong mẫu, người ta đo giá trị Ct của mẫu; giá trị này lắp vào đường chuẩn sẽ cho được
nồng độ trình tự mục tiêu có trong mẫu ban đầu. Đây là phương pháp thường được sử dụng
để định lượng hàm lượng vật liệu di truyền của tác nhân gây bệnh hiện diện trong bệnh
phẩm.

6.3. Phương pháp Ligase Chain Reaction (LCR)

Trong kỹ thuật này, hai oligonucleotide được thiết kế để bắt cặp trên hai trình tự sát
nhau của một vùng gene. Khi và chỉ khi hai oligonucleotide này bắt cặp hoàn toàn với trình
tự mục tiêu thì chúng mới có thể được nối lại để tạo ra một đoạn nucleotide dài. Đoạn này
sẽ trở thành khuôn cho sự bắt cặp hai oligonucleotide mới. Phản ứng được lặp đi lặp lại
nhiều lần để tạo ra một lượng lớn đoạn nucleotide nói trên, có thể phát hiện được bằng điện
di. Phương pháp LCR đặc biệt hữu dụng trong phát hiện đột biến điểm (Hình 63).
 Hình 63. Phương pháp LCR phát hiện đột biến trên gene -globin gây ra bệnh hồng
cầu hình liềm
6.4. Các phương pháp nhân bản RNA qua trung gian phản ứng phiên mã
Một số phương pháp được sử dụng đặc biệt để nhân bản RNA như NASBA (Nucleic
Acid Sequence-Based Amplification) (Hình 64) hay TMA (Transcription-Mediated
Amplification) tuy vẫn có thể được cải biên để nhân bản DNA. Đặc điểm của các phương
pháp này là phản ứng được tiến hành ở điều kiện đẳng nhiệt (41C-42C).
Hai phương pháp này nhân bản trình tự mục tiêu là RNA thành nhiều bản sao mới
nhờ hoạt động của một tổ hợp enzyme bao gồm reverse transcriptase (enzyme phiên mã
ngược), RNase H (enzyme thủy giải RNA), T7 RNA polymerase (enzyme tổng hợp RNA).
Trước tiên, trình tự RNA được phiên mã ngược thành cDNA mạch đơn nhờ một mồi
chuyên biệt, rồi thành cDNA mạch đôi nhờ một mồi khác có mang promoter. Enzyme T7
RNA polymerase trong phản ứng sẽ nhận biết promoter, gắn lên và tổng hợp một số lượng
lớn RNA mạch đơn từ cDNA mạch đôi. Đến lượt chúng các RNA mạch đơn này lại tiếp
tục được phiên mã ngược như ở bước đầu tiên. Kết quả là một số lượng rất lớn trình tự
mục tiêu được tạo ra.

Hình 64. Nguyên lý của phương pháp NASBA

Phương pháp NASBA và TMA khác nhau ở loại reverse transcriptase sử dụng. Các
phương pháp này được ứng dụng vào việc phát hiện RNA virus hoặc vi khuẩn sống.

6.5. Phương pháp bDNA

Đây là một phương pháp nhân bản tín hiệu. Mỗi trình tự mục tiêu được nhận biết
bởi nhiều trình tự mẫu dò; bản thân từng trình tự mẫu dò lại bắt cặp với nhiều trình tự mẫu
dò thứ cấp hình thành một cấu trúc cây với nhiều nhánh chính, phụ. Các trình tự mẫu dò
thứ cấp đến lượt chúng lại được gắn nhiều phân tử alkaline phosphatase (AP). Khi cho cơ
chất của AP vào phản ứng, cơ chất sẽ bị enzyme biến đổi thành sản phẩm phát quang được
ghi nhận. Như vậy một trình tự mục tiêu sẽ tương ứng với một số lượng lớn tín hiệu do các
phân tử AP tạo ra. Độ nhạy của phương pháp bDNA thường không cao bằng PCR (Hình
65).

Hình 65. Nguyên lý phương pháp bDNA

Phương pháp bDNA đã được phát triển để định lượng HCV nhằm theo dõi hàm
lượng virus trong quá trình điều trị. Công ty Bayer đã phát triển phương pháp này thành
một kit định lượng tự động hóa với thiết bị chuyên dụng với ưu điểm là ít phụ thuộc vào
thao tác của người sử dụng, tiến hành cùng lúc trên số lượng mẫu lớn.

6.6. Phương pháp Hybrid capture

Trong phương pháp này, trình tự DNA mục tiêu được biến tính và lai phân tử với
mẫu dò (probe) RNA tương ứng trong dung dịch. Các phân tử lai DNA-RNA sẽ được
kháng thể gắn trên một bề mặt rắn bắt giữ. Kháng thể này đã được cộng hợp với enzyme
alkaline phosphatase. Cơ chất được cho vào phản ứng sẽ bị enzyme thủy phân và tạo sản
phẩm phát sáng. Tín hiệu hóa quang sẽ được ghi nhận và xử lý để cho kết quả (Hình 66).

Hình 66. Phương pháp Hybrid capture

CHƯƠNG 7 – QUY TRÌNH REAL-TIME PCR PHÁT HIỆN C. trachomatis
VÀ N. gonorrhoaeae (CT-NG)

Mẫu nghi nhiễm Mẫu phết

CT-NG Mẫu nước tiểu

Mẫu phết: Giũ tế bào khỏi chổi

Xử lý mẫu Mẫu nước tiểu: Ly tâm lấy cặn

Các phương pháp tách chiết có thể dùng:

Tách chiết DNA
Tủa, Cột, Boom, Tự động

Thực hiện phản ứng Thiết bị có thể dùng: Roto-gene Q,

real-time PCR AriaMx, Stratagene, CFX96

Phân tích kết quả Dựa trên mẫu chứng dương và chứng âm
real-time PCR Xác định ngưỡng
7.1. Xử lý mẫu

7.1.1. Đối với mẫu phết:

Tăm bông phết mẫu được nhúng vào eppendorf chứa sẵn 500 μL TE. Xoay qua xoay
lại nhiều lần cho tế bào rớt ra khỏi tăm bông hoặc có thể vortex nhẹ trong vòng 10 giây.
Sau đó ép kiệt tăm bông và bỏ ra ngoài. Dung dịch còn lại khoảng 400 μL. Thêm vào 10
mg/μL proteinase K. Ủ ở 70oC trong 2 giờ hoặc 56oC qua đêm.

7.1.2. Đối với mẫu nước tiểu:

Ly tâm toàn bộ 15-50 mL nước tiểu ở 6000 vòng/phút trong 10 phút. Đổ bỏ dịch nổi,
để lại khoảng 500 μL cặn lắng. Voxtex trở lại cho cặn hòa tan và hút vào eppendorf mới.
Thêm vào 10 mg/μL proteinase K. Ủ ở 70oC trong 2 giờ hoặc 56oC qua đêm.

7.2. Qui trình tách chiết DNA/RNA dùng dung môi hữu cơ (phenol/chloroform)
Hay còn gọi là phương pháp tủa. Qui trình gồm các bước như sau:

1. Chuẩn bị các eppendorf 1,5 ml đánh số tương ứng với số mẫu. Bật bồn ủ nhiệt khô
ở 600C.
2. Cho vào mỗi eppendorf 900 l dung dịch 1 và 10 l chứng nội (IC)
3. Cho 100 l dung dịch mẫu vào mỗi ống. Vortex mạnh eppendorf trên máy vortex ít
nhất 5 giây cho tan hoàn toàn protein biến tính. Để yên 10 phút.
4. Cho 200 l dung dịch 2. Lắc trộn thật kỹ.
5. Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút ở nhiệt độ phòng.
6. Chuẩn bị các eppendorf 1,5 ml mới, đánh số tương ứng với số mẫu.
7. Chuyển 600 l dịch nổi sang ống eppendorf 1,5 ml mới.
8. Thêm 600 l dung dịch 3 (dung dịch 3 cần được trộn đều trước khi sử dụng).
9. Vortex nhẹ để trộn đều. Để yên 10 phút.
10. Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút ở nhiệt độ phòng.
11. Cẩn thận đổ bỏ dịch nổi, chỉ giữ lại cặn.
12. Thêm 900 l dung dịch 4.
13. Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 5 phút ở nhiệt độ phòng.
14. Cẩn thận đổ bỏ dịch nổi, chỉ giữ lại cặn.
15. Làm khô cặn trong 10 phút ở 60C trong bồn ủ nhiệt khô.
 Tránh để cặn DNA khô quá lâu, vì như thế sẽ gây khó khăn cho việc hòa tan lại
tủa sau này.
16. Hòa cặn trong 50 l dung dịch 5.
Nếu không tiến hành phản ứng PCR ngay trong ngày, bảo quản DNA tách chiết
ở 2-8C trong vòng 2-3 ngày, hoặc ở -20C trong vòng 6 tháng.

7.3. Đặt phản ứng real-time PCR

1. Chuẩn bị hỗn hợp real-time PCR, ghi mã số mẫu lên các ống chứa hỗn hợp phản
ứng, kể cả phản ứng cho mẫu chứng âm và chứng dương, ly tâm nhẹ (3000 rpm, 30
giây).
2. Trộn đều mẫu DNA sau tách chiết, mẫu chứng âm và chứng dương. Hút lần lượt
vào các ống phản ứng 5 μL DNA đã tách chiết tương ứng.
4. Ly tâm nhẹ các ống phản ứng (3000 rpm, 30 giây).

7.4. Hướng dẫn cài đặt máy real-time PCR Stratagene Mx3005P
Bước 1. Xác định vị trí mẫu trong Plate Setup
- Chọn vị trí giếng trên máy real-time PCR
- Chọn well type: unknown cho mẫu, NTC cho mẫu âm và PTC cho mẫu dương.
- Chọn màu tương ứng theo kit: FAM (CT), HEX (NG), Cy5 (IC)
- Nhấn chuột phải, chọn well information và đặt tên mẫu tương ứng.
Bước 2. Cài đặt chương trình nhiệt trong Thermal Profile Setup
- Thay đổi nhiệt độ và thời gian cho phù hợp với chương trình nhiệt của qui trình
đang sử dụng.
1 chu kì 950C – 15 phút
40 chu kì 950C – 20 giây
600C – 1 phút (Đọc tín hiệu)
Bước 3. Chạy mẫu
- Đặt các ống phản ứng vào máy đúng theo vị trí đã xác định.
- Nhấn Run để chạy máy.
- Lưu file vào vị trí folder phù hợp, để sau này có thể truy cập dễ dàng.
7.5. Phân tích kết quả real-time PCR
- Sau khi kết thúc PCR, chuyển sang chế độ thẻ Analysis để phân tích kết quả. Di
chuyển qua lại giữa hai cửa sổ Analysis Selection/Setup và Results để xem kết
quả của từng mẫu tương ứng.
- Xác định giá trị ngưỡng của phản ứng dựa trên tín hiệu của mẫu chứng dương
và chứng âm
- Kết quả thực tế (dương tính/âm tính) của mẫu được đọc tương ứng theo giá trị
ngưỡng đã xác định.
- Kết quả phát hiện CT-NG bằng real-time PCR được điền vào bảng sau:
Ct
Tên mẫu Kết luận
IC CT NG

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

8.

9.

10.

Ghi chú: Ghi giá trị Ct của các kênh màu vào ô kết quả tương ứng.

Kết luận: Với mỗi mẫu bệnh nhân, cần có kết luận là (1) phản ứng có ổn không dựa vào
giá trị Ct của IC, (2) mẫu dương tính hay âm tính với CT-NG và (3) có giải thích phù hợp
cho những kết quả bất thường (nếu có).
 CT+ NG+ IC
Tín hiệu dương tính với Tín hiệu dương tính với Tín hiệu dương tính với màu
màu FAM màu HEX Cy5
Hình 67. Đường chạy real-time PCR phát hiện CT-NG trên máy real-time PCR Roto-
gene Q.
CHƯƠNG 8 – QUY TRÌNH REAL-TIME PCR PHÁT HIỆN VI KHUẨN
H. pylori

Mẫu sinh thiết bệnh Mẫu sinh thiết được lấy qua nội soi và để
nhân nghi nhiễm Hp trong ống có 200 μL dung dịch bảo quản
(TE 1X)

Thêm vào ống chứa mẫu sinh thiết: 200 μL

Xử lý mẫu sinh thiết
TE 1X, 50 μL SDS 10%, 10 μL proteinase
K (10mg/μL). Dùng kéo vô trùng cắt nhỏ,
ủ 70oC trong 2h.

Các phương pháp tách chiết có thể dùng:

Tách chiết DNA
Cột, Boom, Tự động

Thực hiện phản ứng Thiết bị có thể dùng: Roto-gene Q,

Real-time PCR Stratagene, CFX96

Phân tích kết quả Dựa trên mẫu chứng dương và chứng âm
Real-time PCR Xác định ngưỡng
8.1. Quy trình xử lý mẫu sinh thiết dạ dày
1. Mẫu sinh thiết trong dung dịch bảo quản được bổ sung thêm 10 μl Proteinase K
(10 μg/μl) và 50 μl SDS 10%.
2. Dùng kéo vô trùng cắt nhuyễn mẫu trong dung dịch.
3. Ủ ở nhiệt độ 70oC trong 2 giờ. Trong quá trình ủ, thỉnh thoảng vortex để hỗ trợ
cho sự thủy giải mẫu.
4. Sau giai đoạn này, có thể tiến hành tách chiết DNA ngay hoặc giữ ở -20 0C cho đến
khi tách chiết.

8.2. Quy trình tách chiết DNA theo phương pháp cột lọc
1. Đặt một ống nước TE vào bể ủ nhiệt 700C
2. Hút 200 µl mẫu tương ứng vào ống 1.5ml. (ghi tên ống 1.5ml tương ứng với
mẫu)
3. Thêm 300 µl dung dịch ly giải (LB), vortex 5 giây. Ủ 20 phút ở 70 0C.
4. Thêm 200 µl dung dịch hỗ trợ (DS), vortex 5 giây.
5. Chỉnh pipette ở 700 µl. Đưa toàn bộ hỗn hợp vào trong cột (ghi tên mẫu trên nắp
cột). Đóng nắp và ly tâm 8000 v/1 phút. Bỏ dịch lọc.
6. Đặt cột vào ống 2 ml mới. Thêm vào 600 µl dung dịch rửa 1 (WB1). Ly tâm
8000 v/1 phút. Bỏ dịch lọc.
7. Đặt cột vào ống 2ml mới. Thêm vào 600 µl dung dịch rửa 2 (WB2). Ly tâm 8000
v/1 phút. Bỏ dịch lọc.
8. Đặt cột vào ống 2 ml mới. Ly tâm 13000 v/3 phút để loại bỏ hết dấu vết dung
dịch còn sót lại.
9. Đặt cột vào ống 1.5 ml mới. (Nhớ ghi tên ống 1,5ml giống với cột)
10. Thêm vào 100 µl TE ở 700C. Ủ 5-20 phút ở 700C
11. Ly tâm ngay tại 13000 v/3 phút để thu DNA
12. Bảo quản DNA ở -40C, -200C hay -700C tùy theo mục đích sử dụng.

8.3. Đặt phản ứng real-time PCR

1. Chọn số lượng phản ứng real-time PCR tương ứng với số mẫu, cộng thêm 1
chứng âm và 1 chứng dương.
2. Đặt phản ứng với 5 μl DNA tách chiết, chứng âm hoặc chứng dương.
 3. Spin down cho toàn bộ dung dịch xuống đáy ống.
4. Cài đặt chương trình trong máy real-time PCR tương ứng với chu trình nhiệt
yêu cầu như sau:

8.4. Hướng dẫn cài đặt máy real-time PCR Stratagene Mx3005P
Bước 1. Xác định vị trí mẫu trong Plate Setup
- Chọn vị trí giếng trên máy real-time PCR
- Chọn well type: unknown cho mẫu, NTC cho mẫu âm và PTC cho mẫu dương.
- Chọn màu tương ứng theo qui trình: FAM (H. pylori) và HEX (IC)
- Nhấn chuột phải, chọn well information và đặt tên mẫu tương ứng.
Bước 2. Cài đặt chương trình nhiệt trong Thermal Profile Setup
- Thay đổi nhiệt độ và thời gian cho phù hợp với chương trình nhiệt của qui trình
đang sử dụng.
1 chu kì 950C – 15 phút
40 chu kì 950C – 20 giây
600C – 1 phút (Đọc tín hiệu)
Bước 3. Chạy mẫu
- Đặt các ống phản ứng vào máy đúng theo vị trí đã xác định.
- Nhấn Run để chạy máy.
- Lưu file vào vị trí folder phù hợp, để sau này có thể truy cập dễ dàng.

8.5. Phân tích kết quả real-time PCR

Quan sát kết quả real-time PCR theo thứ tự mẫu chứng âm, mẫu chứng dương, và
mẫu bệnh phẩm. Các tín hiệu được quan sát theo thứ tự là IC và sau đó là H. pylori với
màu huỳnh quang tương ứng.
Kết quả thực hành:
- Sau khi kết thúc PCR, chuyển sang chế độ thẻ Analysis để phân tích kết quả. Di
chuyển qua lại giữa hai cửa sổ Analysis Selection/Setup và Results để xem kết
quả của từng mẫu tương ứng.
- Xác định giá trị ngưỡng của phản ứng dựa trên tín hiệu của mẫu chứng dương
và chứng âm.
 - Kết quả thực tế (dương tính / âm tính) của mẫu được đọc tương ứng theo giá trị
ngưỡng đã xác định.
- Kết quả phát hiện H. pylori bằng real-time PCR được điền vào bảng sau:
Ct
Tên mẫu Kết luận
IC H. pylori

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

8.

9.

10.

Ghi chú: Ghi giá trị Ct của các kênh màu vào ô kết quả tương ứng.

Kết luận: Với mỗi mẫu bệnh nhân, cần có kết luận là (1) phản ứng có ổn không dựa vào
giá trị Ct của IC, (2) mẫu dương tính hay âm tính với H. pylori và (3) có giải thích phù
hợp cho những kết quả bất thường (nếu có).

Kết quả mẫu

Mẫu chứng âm Mẫu chứng dương Mẫu bệnh phẩm dương

Chỉ lên tín hiệu chứng nội Lên tín hiệu chứng nội tính
(HEX) (HEX) và tín hiệu H. pylori Lên tín hiệu chứng nội
(FAM) (HEX) và tín hiệu H. pylori
(FAM)
8.6. Xử lý các vấn đề gặp phải trong quá trình thao tác
Khi có sự cố bất thường, cần kiểm tra ba yếu tố :
Mẫu: nguyên nhân có thể là do mẫu quá ít, bị hư hỏng, hoặc có chứa chất ức chế
phản ứng PCR. Các chất ức chế phản ứng PCR có thể đến từ hóa chất chống đông (EDTA,
heparin) hoặc từ hóa chất tách chiết chưa được loại bỏ hoàn toàn (phenol, chloroform,
ethanol, isopropanol, ...) hoặc đến từ bản thân mẫu (hemoglobin, lactoferrin, IgG, .. hiện
diện trong mẫu). Ví dụ mẫu bị tiêu huyết sẽ chứa một hàm lượng chất ức chế PCR rất cao.
Hóa chất tách chiết và hóa chất PCR: thiếu một hoặc nhiều thành phần phản ứng,
nồng độ không đúng, hóa chất bị hư hỏng, ...
Thiết bị: có thể do thiết bị hư hỏng hoàn toàn hay bán phần (chỉ một số giếng bị ảnh
hưởng), nguồn điện gián đoạn trong quá trình phản ứng, chọn nhầm chương trình, ...

8.7. Quy trình real-time PCR sử dụng EvaGreen phát hiện H. pylori
Quy trình real-time PCR sử dụng EvaGreen phát hiện H. pylori khác biệt với quy
trình với quy trình real-time PCR sử dụng TaqMan (ở trên) phát hiện H. pylori ở 2 nội dung
chính: (1) Chương trình real-time PCR có thêm giai đoạn phân tích nhiệt độ nóng chảy sản
phẩm; (2) Phân tích kết quả đặc hiệu sản phẩm / đối tượng dựa trên nhiệt độ Tm tương
ứng.
Chương trình real-time PCR phân tích nhiệt độ nóng chảy sản phẩm:

Hình 68. Chương trình real-time PCR có phân tích nhiệt độ nóng chảy sản phẩm
Phân tích kết quả real-time PCR và melting curve:
 Đường chạy nhân bản Đỉnh chảy sản phẩm
Hình 69. Phân tích kết quả real-time PCR có nhiệt độ nóng chảy sản phẩm bằng hệ
thống real-time PCR Roto-gene Q
CHƯƠNG 9 – QUY TRÌNH MULTIPLEX PCR PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH TÝP
GENE cagA VÀ vacA CỦA VI KHUẨN H. pylori

Mẫu sinh thiết bệnh Mẫu sinh thiết được lấy qua nội soi và để
nhân nghi nhiễm Hp trong ống có 200 μL dung dịch bảo quản
(TE 1X)

Thêm vào ống chứa mẫu sinh thiết: 200 μL

Xử lý mẫu sinh thiết
TE 1X, 50 μL SDS 10%, 10 μL proteinase
K (10mg/μL). Dùng kéo vô trùng cắt nhỏ,
ủ 70oC trong 2h.

Các phương pháp tách chiết có thể dùng:

Tách chiết DNA
Cột, Boom, Tự động

Thực hiện phản ứng Thiết bị có thể dùng: Roto-gene Q,

Multiplex PCR Stratagene, CFX96

Xác định kết quả mẫu chứng âm và chứng

Phân tích kết quả dương J99 và Tx30a
Multiplex PCR Đọc kết quả của mẫu bệnh phẩm tương
ứng
9.1. Quy trình xử lý mẫu sinh thiết dạ dày
1. Mẫu sinh thiết trong dung dịch bảo quản được bổ sung thêm 10 μl Proteinase K
(10 μg/μl) và 50 μl SDS 10%.
2. Dùng kéo vô trùng cắt nhuyễn mẫu trong dung dịch.
3. Ủ ở nhiệt độ 70oC trong 2 giờ. Trong quá trình ủ, thỉnh thoảng vortex để hỗ trợ
cho sự thủy giải mẫu.
4. Sau giai đoạn này, có thể tiến hành tách chiết DNA ngay hoặc giữ ở -20 0C cho đến
khi tách chiết.

9.2. Quy trình tách chiết DNA theo phương pháp cột lọc
1. Đặt một ống nước TE vào bể ủ nhiệt 700C
2. Hút 200 µl mẫu tương ứng vào ống 1.5 ml. (ghi tên ống 1.5 ml tương ứng với
mẫu)
3. Thêm 200 µl dung dịch ly giải, vortex 5 giây. Ủ 20 phút ở 700C.
4. Thêm 100 µl dung dịch hỗ trợ, vortex 5 giây.
5. Chỉnh pipette ở 600 µl. Đưa toàn bộ hỗn hợp vào trong cột (ghi tên mẫu trên nắp
cột). Đóng nắp và ly tâm 8000 v/1 phút. Bỏ dịch lọc.
6. Đặt cột vào ống 2 ml mới. Thêm vào 600 µl dung dịch rửa 1. Ly tâm 8000 v/1
phút. Bỏ dịch lọc.
7. Đặt cột vào ống 2 ml mới. Thêm vào 600 µl dung dịch rửa 2. Ly tâm 8000 v/1
phút. Bỏ dịch lọc.
8. Đặt cột vào ống 2 ml mới. Ly tâm 13000 v/3 phút để loại bỏ hết dấu vết dung
dịch còn sót lại.
9. Đặt cột vào ống 1.5 ml mới. (Nhớ ghi tên ống 1,5 ml giống với cột)
10. Thêm vào 50-100 µl TE ở 700C. Ủ 20 phút ở 700C
11. Ly tâm ngay tại 13000 v/3 phút để thu DNA
12. Bảo quản DNA ở -40C, -200C hay -700C tùy theo mục đích sử dụng.

9.3. Đặt phản ứng real-time PCR

1. Chọn số lượng phản ứng multiplex PCR tương ứng với số mẫu, cộng thêm 1
chứng âm và 2 chứng dương.
2. Đặt phản ứng với 5 μl DNA tách chiết, chứng âm hoặc chứng dương.
 3. Spin down cho toàn bộ dung dịch xuống đáy ống.
4. Cài đặt chương trình trong máy PCR tương ứng với chu trình nhiệt yêu cầu
như sau:
1 chu kì 950C – 15 phút
40 chu kì 950C – 20 giây
600C – 40 giây
720C – 40 giây
1 chu kì 720C – 6 phút
5. Đặt các ống phản ứng vào máy, nên theo thứ tự để sau này dễ kiểm soát.
6. Nhấn Run để chạy máy

9.4. Phân tích kết quả multiplex PCR

Quan sát kết quả multiplex PCR theo thứ tự mẫu chứng âm, 2 mẫu chứng dương,
và mẫu bệnh phẩm. Các tín hiệu được quan sát theo thứ tự là IC (200 bp) và sau đó là H.
pylori với vạch sản phẩm tương ứng từ dưới lên trên là vacA s1/s2 (259/286 bp), cagA+
(349 bp) và vacA m1/m2 (401/476 bp).
Kết quả thực hành:
- Kết quả phát hiện kiểu gene cagA và vacA của H. pylori bằng multiplex PCR
được điền vào bảng sau:
Thông tin Kết quả điện di
mẫu IC cagA vacA s1 vacA s2 vacA m2 vacA m2 Nhận xét
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
Ghi chú: Đánh dấu “+” vào ô có kết quả PCR dương tính và để trống ô không cho thấy sản
phẩm PCR trên gel.
Kết luận: Cần có kết luận là (1) mẫu dương tính hay âm tính với H. pylori, (2) kiểu gene
của mẫu và (3) có giải thích phù hợp cho những kết quả bất thường (nếu có)
Kết quả mẫu

Hình 70. Kết quả điện di phân tích kiểu gene vi khuẩn H. pylori
Câu hỏi:

- Các bạn thử xác định kiểu gene của các mẫu tương ứng trên hình?
CHƯƠNG 10 – QUY TRÌNH REAL-TIME PCR PHÁT HIỆN VI KHUẨN
STREPTOTOCCUS NHÓM B (GBS)
Mẫu phết âm đạo trực Mẫu phết âm đạo-trực tràng của thai phụ
tràng được lấy bằng que gòn (dài) và vận
chuyển về phòng xét nghiệm

Chuyển que phết vào falcon 15 mL, thêm

Xử lý mẫu phết vào 2 mL PBS 1X, vortex nhẹ trong vòng
15-30 giây, hút dịch tế bào vào Eppendorf
2 mL để lưu mẫu, sẵn sàng cho tách chiết.

Các phương pháp tách chiết có thể dùng:

Tách chiết DNA
Cột, Boom, Tự động

Thực hiện phản ứng Thiết bị có thể dùng: Roto-gene Q,

real-time PCR Stratagene, CFX96

Phân tích kết quả Dựa trên mẫu chứng dương và chứng âm
real-time PCR Xác định ngưỡng
10.1 . Quy trình xử lý mẫu phết âm đạo-trực tràng
1. Lấy mẫu phết âm đạo-trực tràng: Dùng que gòn tiệt trùng đưa vào âm đạo khoảng
2 cm, xoay 1-2 vòng lên niêm mạc âm đạo; dùng tiếp que gòn đó đưa vào trực tràng
khoảng 1 cm (qua cơ vòng hậu môn), xoay 1-2 vòng lên niêm mạc trực tràng. Bỏ
que gòn đã phết trở lại ống nhựa ban đầu và vận chuyển về phòng xét nghiệm.
2. Chuyển que gòn đã phết vào falcon 15 ml
3. Thêm vào 1-2 ml PBS 1X, vortex nhẹ trong vòng 15-30 giây
4. Hút dịch tế bào vào Eppendorf 2 ml để lưu mẫu, sẵn sàng cho tách chiết.

10.2. Quy trình tách chiết DNA theo phương pháp cột lọc
1. Đặt một ống nước TE vào bể ủ nhiệt 700C
2. Hút 200 µl mẫu tương ứng vào ống 1.5 ml. (ghi tên ống 1.5 ml tương ứng với
mẫu)
3. Thêm 300 µl dung dịch ly giải, vortex 5 giây. Ủ 5 phút ở 700C.
4. Thêm 100 µl dung dịch hỗ trợ, vortex 5 giây.
5. Chỉnh pipette ở 600 µl. Đưa toàn bộ hỗn hợp vào trong cột (ghi tên mẫu trên nắp
cột). Đóng nắp và ly tâm 8000 v/1 phút. Bỏ dịch lọc.
6. Đặt cột vào ống 2 ml mới. Thêm vào 600 µl dung dịch rửa 1. Ly tâm 8000 v/1
phút. Bỏ dịch lọc.
7. Đặt cột vào ống 2 ml mới. Thêm vào 600 µl dung dịch rửa 2. Ly tâm 8000 v/1
phút. Bỏ dịch lọc.
8. Đặt cột vào ống 2 ml mới. Ly tâm 13000 v/3 phút để loại bỏ hết dấu vết dung
dịch còn sót lại (phải tiến hành bước này riêng để đảm bảo độ tinh sạch của sản
phẩm DNA sau tách chiết).
9. Đặt cột vào ống 1.5 ml mới. (Nhớ ghi tên ống 1.5 ml giống với cột)
10. Thêm vào 50 µl TE ở 700C. Ủ 5 phút ở 700C
11. Ly tâm ngay tại 13000 v/3 phút để thu DNA
12. Bảo quản DNA ở -40C, -200C hay -700C tùy theo mục đích sử dụng.
10.3. Đặt phản ứng real-time PCR
1. Chọn số lượng phản ứng real-time PCR tương ứng với số mẫu, cộng thêm 1
chứng âm và 1 chứng dương.
2. Đặt phản ứng với 5 μl DNA tách chiết, chứng âm hoặc chứng dương.
3. Spin down cho toàn bộ dung dịch xuống đáy ống.
4. Cài đặt chương trình trong máy PCR tương ứng với chu trình nhiệt yêu cầu
như sau:

1 chu kì 950C – 15 phút

5 chu kỳ 950C – 10 giây

590C – 20 giây
40 chu kì 950C – 10 giây
590C – 20 giây (Đọc tín hiệu FAM và HEX/Cy5)
5. Đặt các ống phản ứng vào máy, nên theo thứ tự để sau này dễ kiểm soát.
6. Nhấn Run để chạy máy

10.4. Phân tích kết quả real-time PCR

Quan sát kết quả real-time PCR theo thứ tự mẫu chứng âm, mẫu chứng dương, và
mẫu bệnh phẩm. Các tín hiệu được quan sát theo thứ tự là IC và sau đó là GBS với màu
huỳnh quang tương ứng.
Kết quả thực hành:
- Sau khi kết thúc PCR, xác định giá trị ngưỡng của phản ứng dựa trên tín hiệu
của mẫu chứng dương và chứng âm.
- Kết quả thực tế (dương tính / âm tính) của mẫu được đọc tương ứng theo giá trị
ngưỡng đã xác định.
- Kết quả phát hiện GBS bằng real-time PCR được điền vào bảng sau:
 Ct
Tên mẫu Kết luận
IC GBS

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

8.

9.

10.

Ghi chú: Ghi giá trị Ct của các kênh màu vào ô kết quả tương ứng.

Kết luận: Với mỗi mẫu bệnh nhân, cần có kết luận là (1) phản ứng có ổn không dựa vào
giá trị Ct của IC, (2) mẫu dương tính hay âm tính với GBS và (3) có giải thích phù hợp cho
những kết quả bất thường (nếu có).

Kết quả mẫu

Chạy trên hệ thống real-time PCR Roto-gene Q (QIAGEN)
 0.5
0.5

0.4
0.4

0.3

Norm. Fluoro.
0.3

Norm. Fluoro.
0.2 0.2

0.1 0.1

0.0
0.0 Threshold

5 10 15 20 25 30 35 40 5 10 15 20 25 30 35 40
Cycle Cycle

Mẫu chứng âm
Chỉ lên tín hiệu chứng nội (HEX hoặc Cy5)
0.45
0.20

0.40

0.35
0.15
0.30

Norm. Fluoro.
Norm. Fluoro.

0.25
0.10
0.20

0.15

0.05 0.10

0.05

0.00 0.00

5 10 15 20 25 30 35 40 5 10 15 20 25 30 35 40
Cycle Cycle

Mẫu chứng dương

Lên tín hiệu chứng nội (HEX hoặc Cy5) và tín hiệu GBS (FAM)
0.25 0.7

0.6
0.20

0.5
Norm. Fluoro.

0.15
Norm. Fluoro.

0.4

0.10 0.3

0.2
0.05

0.1

0.00
0.0
5 10 15 20 25 30 35 40
Cycle 5 10 15 20 25 30 35 40
Cycle

Mẫu bệnh phẩm dương tính

Lên tín hiệu chứng nội (HEX hoặc Cy5) và tín hiệu GBS (FAM)
 CHƯƠNG 11 – MỘT SỐ CÂU HỎI TRẮC NGHIỆM

1. Giai đoạn biến tính đầu tiên (950C trong 3-15 phút) của các chu trình nhiệt của phản ứng PCR
có vai trò gì?
a. Biến tính DNA bộ gen
b. Hoạt hóa enzyme RNAse
c. Bất hoạt enzyme DNAse
d. Biến tính protein nếu có trong phản ứng PCR
e. Các câu trên đều đúng
2. cDNA là sản phẩm của quá trình:
a. Lai phân tử với mẫu dò đặc hiệu
b. PCR
c. Giải trình tự
d. Real-Time PCR
e. Phiên mã ngược RNA bởi enzyme reverse transcriptase
3. Cấu trúc phân tử DNA và RNA khác nhau ở một số điểm, ngoại trừ:
a. Mạch đơn và đôi
b. Đơn phân nucleotide
c. Phân tử đường 5C
d. Phân tử base
e. Phân tử phosphate
4. Trong điều kiện tối ưu, từ một bản sao của phân đoạn DNA mong muốn, sau 12 chu kỳ PCR,
có khả năng tạo ra:
a. 512 bản sao
b. 1024 bản sao
c. 2048 bản sao
d. 4096 bản sao
e. 8192 bản sao
5. Thành phần cơ bản của phản ứng PCR gồm:
a. Mạch khuôn DNA, DNA polymerase, 4 loại nucleotide, 2 mồi, dung dịch đệm, nước.
b. Mạch khuôn DNA, Ion Mg++, DNA polymerase, 4 loại nucleotide, dung dịch đệm, nước.
c. Mạch khuôn DNA, Ion Mg++, DNA polymerase, 4 loại nucleotide, 2 mồi, nước.
d. Mạch khuôn DNA, Ion Mg++, DNA polymerase, 4 loại nucleotide, 2 mồi, dung dịch đệm.
e. Mạch khuôn DNA, Ion Mg++, DNA polymerase, 4 loại nucleotide, 2 mồi, dung dịch đệm,
nước.
6. Bước phân tích nhiệt độ nóng chảy (melting curve analysis) là đặc trưng của qui trình:
a. PCR
b. Multiplex PCR
c. Real-time PCR sử dụng mẫu dò TaqMan
d. Real-time PCR sử dụng màu huỳnh quang chèn
e. Giải trình tự gen
7. Phẩm nhuộm nào sau đây không phải là phẩm nhuộm mạch đôi DNA:
 a. Ethidium Bromide
b. EvaGreen
c. SYBR Green I
d. Taq-Man
e. PicoGreen
8. Điều nào sau đây không đúng với khái niệm Ct:
a. Ct của mẫu càng nhỏ thì nồng độ của mẫu ban đầu càng lớn.
b. Xác định khi cường độ tín hiệu huỳnh quang của mẫu vượt qua đường tín hiệu huỳnh
quang nền (base line).
c. Khi nói đến real-time PCR là nói đến giá trị Ct.
d. Ct xác định thời điểm mẫu cho tín hiệu huỳnh quang cực đại.
e. Là số chu kì phản ứng mà tại đó tín hiệu của sản phẩm nhân bản vượt qua tín hiệu nền.
9. Một số khuyết điểm của phương pháp PCR cổ điển so với real-time PCR:
a. Độ nhạy kém
b. Không thể tự động hóa
c. Không thể định lượng
d. Độ đặc hiệu kém
e. Tất cả những ý trên
10. Trong phản ứng real-time PCR, giá trị Ct (chu kỳ ngưỡng) có ý nghĩa:
a. Tỉ lệ thuận với số bản sao ban đầu của đối tượng cần phát hiện trong mẫu
b. Tỉ lệ nghịch với số bản sao ban đầu của đối tượng cần phát hiện trong mẫu
c. Thể hiện tính hiệu quả của phản ứng real-time PCR
d. Thể hiện tính đặc hiệu của phản ứng real-time PCR
e. Thể hiện tính chính xác của phản ứng real-time PCR
11. Nguyên tắc hoạt động của chất nhuộm DNA mạch đôi, EvaGreen:
a. Chất nhuộm EvaGreen được phân cắt khi mạch đôi DNA được hình thành trong suốt quá
trình PCR
b. Chất nhuộm EvaGreen được hình thành trong suốt quá trình PCR, khi DNA polymerase
nhân bản mạch DNA đích
c. Trong suốt quá trình PCR, DNA polymerase và EvaGreen nhân bản mạch DNA đích, tạo
nhiều sản phẩm PCR
d. Chất nhuộm EvaGreen gắn vào mạch đôi DNA được hình thành trong suốt quá trình PCR
e. Nồng độ EvaGreen sẽ giảm dần sau mỗi chu kỳ phản ứng PCR
12. Enzyme Taq DNA polymerase có nguồn gốc từ vi khuẩn:
a. Desulfovibrio desulfuricans
b. Escherichia coli
c. Haemophilus influenza Rd
d. Thermus aquaticus
e. Acinetobacber baumannii
13. Đặc tính của mẫu dò TaqMan là :
a. Là 1 đoạn oligonucleotide, có khả năng bắt cặp với mạch khuôn.
b. Đầu 3’ bị khóa.
 c. Đầu 5’ có phân tử thông báo (Reporter), Đầu 3’ có phân tử dập tín hiệu (Quencher).
d. Hai trong 3 đặc tính trên.
e. Tất cả đặc tính trên.
14. Đặc điểm nào sau đây không đúng với mồi PCR :
a. Giới hạn vùng gene sẽ được nhân bản.
b. Tăng tính chính xác của Taq DNA polymerase.
c. Nồng độ tối ưu khoảng 0.1-0.6 µM.
d. Nồng độ mồi cao thường gây bắt cặp sai, tạo sản phẩm không đặc hiệu.
e. Nồng độ mồi thấp có thể làm giảm hiệu suất nhân bản của phản ứng PCR.
15. Các bazơ purin bao gồm :
a. Adenine (A) và Guanine (G)
b. Cytosine (C), Thymine (T)
c. Uracil (U), Adenine (A) và Guanine (G)
d. Uracil (U), Cytosine (C), Thymine (T)
e. Không câu nào đúng
16. Các màu huỳnh quang nào sau đây không dùng cho phản ứng real-time PCR sử dụng mẫu
dò Taq-Man :
a. FAM
b. TAMRA
c. Texas Red
d. Cy5
e. EvaGreen
17. Loại phản ứng PCR nào sau đây giúp gia tăng độ nhạy và đặc hiệu của phản ứng:
a. PCR đa mồi
b. Asymmetric PCR
c. Long range PCR
d. Nested PCR
e. Assembly PCR
18. Nguyên tắc bổ sung trong cấu trúc DNA (‘:’ đại diện cho 1 liên kết hydro):
a. A ::: T, G :: C
b. A :: T, G ::: C
c. A ::: G, T :: C
d. A :: G, T ::: C
e. A ::: U, G :: C
19. Nucleic acid sau khi tách chiết đạt yêu cầu khi:
a. Tỉ lệ A260/A280 khoảng ~1.8 đối với dsDNA, và ~2.0 đối với ssRNA
b. Tỉ lệ A260/A280 khoảng ~1.4 đối với dsDNA, và ~2.0 đối với ssRNA
c. Tỉ lệ A260/A280 khoảng ~2.0 đối với dsDNA, và ~1.4 đối với ssRNA
d. Tỉ lệ A260/A280 khoảng ~2.0 đối với dsDNA, và ~1.8 đối với ssRNA
e. Tỉ lệ A260/A280 khoảng ~2.0 đối với dsDNA, và ~1.4 đối với ssRNA
20. Loại hóa chất nào sau đây không được dùng trong phản ứng real-time PCR :
 a. TaqMan
b. Molecular Beacons
c. Bromophenol Blue
d. Scorpions
e. EvaGreen
21. Cho một dung dịch DNA sau tách chiết có giá trị OD là 1,8; Vậy nồng độ DNA của dung
dịch này là:
a. 90 μg/mL
b. 59,4 μg/mL
c. 72 μg/mL
d. 59 μg/mL
e. 74 μg/mL
22. Vai trò của mồi trong phản ứng PCR là:
a. Khởi đầu cho quá trình nhân bản
b. Giới hạn vùng trình tự được nhân bản
c. Đảm bảo tính đặc hiệu của phản ứng PCR
d. Hai trong ba lựa chọn nào ở trên đúng
e. Cả 3 lựa chọn đầu tiên đều đúng
23. RNA được phiên mã thành cDNA qua
a. Taq DNA polymerase
b. RNA polymerase II
c. Reverse transcriptase
d. Uracil-N-Glycosylase
e. Tất cả các câu trên đều sai
24. Yếu tố qui định tính đặc hiệu của phản ứng PCR
a. Trình tự mồi
b. Nhiệt độ lai
c. Nồng độ MgCl2
d. Nồng độ DNA
e. Tất cả các câu trên
 %ӊ1+9,ӊ1ĈҤ,+Ӑ&<'ѬӦ&7+¬1+3+Ӕ+Ӗ&+Ë0,1+
7581*7Æ0Ĉ¬27Ҥ29¬&+Ҭ1Ĉ2È1<6,1++Ӑ&3+Æ17Ӱ
1JX\ӉQ &Kt 7KDQK47KjQK SKӕ +ӗ &Kt 0LQK
(PDLO\VLQKKRFSKDQWX#JPDLOFRP


08/7,3/(;3&5
Ĉӎ1+.,ӆ8*(1(cagA 9¬vacA
&Ӫ$9,.+8Ҭ1Helicobacter pylori

1JX\ӉQ 7XҩQ $QK

ƒ  YLrP Gҥ Gj\

ƒ  ORpW Gҥ Gj\
ƒ  Fy WKӇ SKiW WULӇQ XQJ WKѭ Gҥ Gj\

‡ 8QJ WKѭ ELӇX P{ WX\ӃQ Gҥ Gj\

DGHQRFDUFLQRPD KRһF X 0$/7V X P{ EҥFK
KX\ӃW OLrQ TXDQ ÿӃQ QLrP PҥF Gҥ Gj\

‡ 1ăP  :+2 ÿm [ӃS YL NKXҭQ H. pylori

ƒ /j WiF QKkQ Vӕ  Jk\ XQJ WKѭ Gҥ Gj\
Vi khu̱n Helicobacter ƒ Nhóm lây nhi͍m ˱u tiên cao KLJK
pylori SULRULW\ JURXS RI LQIHFWLRQ NKL WtQK NKiQJ
WKXӕF NKiQJ VLQK ÿm WUӣ QrQ SKә ELӃQ Yj
Oj YҩQ ÿӅ FҫQ ÿѭӧF TXDQ WkP WURQJ ÿLӅX WUӏ

ŚƚƚƉƐ͗ͬͬƐĨůĐŶ͘ĐŽŵͬƚƌĞĂƚŵĞŶƚͲŽĨͲŚͲƉLJůŽƌŝͲŝŶĨĞĐƚŝŽŶͬ
 'ӎ&+7ӈ+Ӑ&

¾H.pylori ҧQK KѭӣQJ ÿӃQ NKRҧQJ QJѭӡL Fy WXәL GѭӟL Yj

QKӳQJ QJѭӡL WUrQ WXәL

¾H.pylori NK{QJ SKә ELӃQ ӣWUҿ HP

¾7uQK WUҥQJ NLQK WӃ [m KӝL NpP Gӵ ÿRiQ QKLӉP H.pylori

¾6ӵ GL Fѭ JLҧL WKtFK FKR QKӳQJ NKX YӵF WiFK ELӋW Fy WӍ OӋ SKә
ELӃQ H. pylori FDR ӣPӝW Vӕ TXӕF JLD &KkX ÆX
 7Ë1+3+Ә%,ӂ1&Ӫ$1+,ӈ0H. pylori
ϭϬϬ
ϵϬ
ĄĐ ŶӇӀĐ ĜĂŶŐ
ϴϬ ƉŚĄƚ ƚƌŝҳŶ
ϳϬ ĄĐ ŶӇӀĐ ƉŚĄƚ
1KLӉP ƚƌŝҳŶ
ϲϬ
ϱϬ
ϰϬ
ϯϬ
ϮϬ
ϭϬ
Ϭ
Ϭ ϭϬ ϮϬ ϯϬ ϰϬ ϱϬ ϲϬ ϳϬ ϴϬ

7XәL QăP
DĂƌƐŚĂůůĞƚĂů͘DĞĚůŝŶEŵϮϬϬϱ͖ϴϵ͗ϯϭϯʹϯϰϰ

7Ӹ/ӊ/Ѭ8+¬1+&Ӫ$9,.+8Ҭ1H. pylori 75Ç1

7+ӂ*,Ӟ,
‡ H. pylori QKLӉP ! GkQ Vӕ
WKӃ JLӟL
ƒ a  ӣ FiF QѭӟF SKiW
WULӇQ
ƒ !  ӣ FiF QѭӟF ÿDQJ
SKiW WULӇQ

‡ +LӋQ QD\ Wӹ OӋ OѭX KjQK FӫD H.

pylori Fy WKӇ OrQ ÿӃQ  ӣ
PӝW Vӕ TXӕF JLD ÿDQJ SKiW WULӇQ

‡ Ӣ 9LӋW 1DP Wӹ OӋ QKLӉP YjR

NKRҧQJ  Fy EiR FiR OrQ
ÿӃQ 

KWWSVZZZIURQWLHUVLQRUJDUWLFOHVIFLPE
IXOO
 7Î1++Î1+%ӊ1+81*7+Ѭ'Ҥ'¬<

dӏ ůҵ ƚӊ ǀŽŶŐ ĚŽƵŶŐ ƚŚӇ ĚҢ ĚăLJ ƚşŶŚ ƚƌġŶ ϭϬϬ͘ϬϬϬĚąŶ ĐӇ

ӂĐĄĐ ŶӇӀĐ ƚƌŽŶŐ ŬŚҺŝ ^E͕Ŷĉŵ ϮϬϬϴ

DĞƌĞů <ŝŵŵĂŶ͕ĞƚĂů;ϮϬϭϮͿ͘dŚĞƵƌĚĞŶŽĨĂŶĐĞƌŝŶDĞŵďĞƌŽƵŶƚƌŝĞƐŽĨƚŚĞƐƐŽĐŝĂƚŝŽŶŽĨ
^ŽƵƚŚĞĂƐƚƐŝĂŶEĂƚŝŽŶƐ;^EͿ͘ƐŝĂŶWĂĐŝĨŝĐ:ĂŶĐĞƌWƌĞǀ͕ϭϯ͗ϰϭϭͲϰϮϬ΀ĂŶĐĞƌƐŝĂ΁

6Ӕ&$81*7+Ѭ0Ҳ&0Ӟ,&Ӫ$9,ӊ71$0Ӣ
&Ҧ+$,*,Ӟ,*/2%2&$1
7ӌ/ӊ81*7+Ѭ7+(2*,Ӟ,Ӣ9,ӊ71$0
*/2%2&$1

7ӌ/ӊ0Ҳ&9¬7Ӱ921*81*7+Ѭ
Ӣ9,ӊ71$0
*/2%2&$1
 &È&3+ѬѪ1*3+È33+È7+,ӊ1H. pylori

3KѭѫQJ SKiS [kP KҥL 3KѭѫQJ SKiS NK{QJ [kP KҥL

1ӝL VRL &/2WHVW 1JKLӋP SKiS WKӣ

1ӝL VRL 1X{L Fҩ\ +X\ӃW WKDQK KӑF &,0

1ӝL VRL *LҧL SKүX EӋQK .KiQJ QJX\rQ Wӯ SKkQ

1ӝL VRL 3&5 .KiQJ WKӇ Wӯ QѭӟF WLӇX

*,Ҧ,3+Ү8%ӊ1+
KLVWRORJ\

%LӇX KLӋQ FӫD SKѭѫQJ

SKiS QKXӝP P{ SKiW
KLӋQ Helicobacter pylori
$*LHPVD FҧL ELrQ
%1KXӝP PLӉQ GӏFK
NKiQJ WKӇ NKiQJ H
pylori
&SKѭѫQJ SKiS 0F0XOOHQ
FҧL ELrQ
'3KѭѫQJ SKiS QKXӝP
EҥF H. Pylori +S66
ZŽƚŝŵŝKĞƚĂů͘:ůŝŶWĂƚŚŽůϮϬϬϬ͖ϱϯ͗ϳϱϲͲϳϱϵ
ŽƉLJƌŝŐŚƚΞďLJƚŚĞD:WƵďůŝƐŚŝŶŐ'ƌŽƵƉ>ƚĚΘƐƐŽĐŝĂƚŝŽŶŽĨůŝŶŝĐĂůWĂƚŚŽůŽŐŝƐƚƐ͘ůůƌŝŐŚƚƐƌĞƐĞƌǀĞĚ͘
 7(671+$1+85($6(
5DSLGXUHDVHWHVWRU&/2WHVW

 6ӵ ÿәL PjX FӫD FKҩW FKӍ WKӏ S+

 8UHDVH SKkQ FҳW XUH WKjQK &2 Yj
1+
 .ӃW TXҧ Fy WURQJ  JLӡ Fy WKӇ NpR
GjL ÿӃQ  JLӡ
 7Kӱ QJKLӋP NK{QJ QrQ GQJ YӟL FiF
EӋQK QKkQ ÿm GQJ 33, NKiQJ VLQK
KRһF ELVPXWK Yj ÿDQJ WURQJ SKiF ÿӗ
ÿLӅX WUӏ H. pylori

18Ð,&Ҩ<Ĉӎ1+'$1+9,.+8Ҭ1
%DFWHULDFXOWXUH

¾ H. Pylori Oj YL NKXҭQ NKy QX{L

Fҩ\

¾ 1X{L Fҩ\ WKѭӡQJ TXL WKѭӡQJ

NK{QJ ÿѭӧF WKӵF KLӋQ

¾ 7tQK NKiQJ WKXӕF FӫD FiF (WHVW 0HWURQLGD]ROH

ÿӕL YӟL H. pylori
FKӫQJ H. pylori NKLӃQ FKR YLӋF
6DX QJj\ QX{L Fҩ\ H.
QX{L Fҩ\ WUӣ QrQ FҫQ WKLӃW ÿӇ OjP
pylori WUrQ P{L WUѭӡQJ
NKiQJ VLQK ÿӗ WKҥFK PiX
 1*+,ӊ03+È37+Ӣ
8UHDVHEUHDWKWHVW

 %ӋQKQKkQXӕQJXUHFy&ÿiQK
GҩX7URQJEDRWӱXUHÿѭӧF
KRҥWWtQKXUHDVHSKkQKӫ\
WKjQK+&2 Yj1+
 +&2 ÿLÿӃQSKәLYj
 3KkQKӫ\WKjQK
 &2 ÿѭӧFGүQYjR
 'XQJGӏFKP0K\DPLQHÿӇ
QKұQELӃWVӵKLӋQGLӋQFӫD&
ÿiQKGҩX

7+Ӱ3+Æ1
VWRRODQWLJHQWHVW

¾ &iF [pW QJKLӋP NKiQJ QJX\rQ H.

pylori Wӯ SKkQ ÿm ÿѭӧF FKҩS QKұQ EӣL
)'$ FKR YLӋF FKҭQ ÿRiQ Yj WKHR G}L
ÿLӅX WUӏ
¾ /j SKѭѫQJ SKiS [pW QJKLӋP QKDQK
QKҥ\ ÿһF KLӋX Yj NK{QJ [kP OҩQ
¾4XL WUuQK WKӵF KLӋQ ÿѫQ JLҧQ tW WӕQ
F{QJ
¾ 7KtFK KӧS GQJ FKR WUҿ HP
 +8<ӂ77+$1++Ӑ&
VHURORJ\

¾ ;pW QJKLӋP KX\ӃW WKDQK (/,6$ SKiW

KLӋQ ,J* Uҿ WLӅQ Yj NK{QJ [kP OҩQ
¾ .K{QJ SKҧQ iQK WuQK WUҥQJ QKLӉP KRҥW
ÿӝQJ KD\ NK{QJ
¾ &KӍ QrQ GQJ ÿӇ WҫP VRiW WURQJ TXҫQ WKӇ
¾ 1KѭQJ NK{QJ ÿѭӧF GQJ FKR TXҫQ WKӇ
Fy WӍ OӋ OѭX KjQK H. pylori FDR
¾ .K{QJ GQJ ÿӇ [iF ÿӏQK WLӋW WUӯ H.
pylori
¾ .ӃW TXҧ GѭѫQJ WtQK QrQ ÿѭӧF NKҷQJ ÿӏQK
OҥL EҵQJ QJKLӋP SKiS WKӣ KRһF [pW QJKLӋP
NKiQJ QJX\rQ Wӯ SKkQ

&,0WHVW
6HURORJ\ &XUUHQW,QIHFWLRQ0DUNHUWHVW
$& ,&7
$%& ,&7Yj &,0
 &,0 3URWHLQ ÿһF KLӋX FӫD H. pylori 
 .KiQJ WKӇ ,J* ÿӕL YӟL NKiQJ QJX\rQ &,0 KLӋQ $ 1HJDWLYH
$ 9{ KLӋX
GLӋQ ӣ FiF EӋQK QKkQ QKLӉP H. pylori KRҥW ÿӝQJ $%& 9{ KLӋX
[iF ÿӏQK EӣL KѫQ  FiF SKѭѫQJ SKiS NKiF QKѭ
&/2 WHVW QX{L Fҩ\ VRL P{ Yj 8%7
 &,0 WHVW SKiW KLӋQ SURWHLQ ÿһF KLӋX &,0 FӫD H.
pylori
 &y WѭѫQJ TXDQ WӕW YӟL WLrX FKXҭQ YjQJ WURQJ SKiW
KLӋQ H. pylori KRҥW ÿӝQJ
 *Li WUӏ FKҭQ ÿRiQ GѭѫQJ WtQK 339 KѫQ 
 3KkQ ELӋW WuQK WUҥQJ QKLӉP H. pylori. &XUUHQW !
$FWLYH

,PPXQRFKURPDWRJUDSKLF
WHVW,&7
 &,0WHVW
6HURORJ\ &XUUHQW,QIHFWLRQ0DUNHUWHVW

&RQWUROOLQH &RQWUROOLQH
JRDWDQWLKXPDQ JRDWDQWLKXPDQ
,J* ,J*

&,0OLQH &,0OLQH
&SURWHLQ &SURWHLQ

7HVWOLQH 7HVWOLQH
&SURWHLQDQG$ &SURWHLQDQG$
SURWHLQ SURWHLQ

1KLӉP H. pylori Ĉm QKLӉP H. pylori

KLӋQ KӳX WURQJ TXi NKӭ

DŽŶŽƉůĞdžͬDƵůƚŝƉůĞdžWZ

DŽŶŽƉůĞdž WZ DƵůƚŝƉůĞdžWZ

3+ѬѪ1*3+È33+È7+,ӊ1H. PYLORI -CÓ N͠I SOI

3KѭѫQJSKiS ѬX ÿLӇP 1KѭӧF ÿLӇP

0{ KӑF Ĉӝ ÿһF KLӋX FDR FXQJ FҩS ĈҳW WLӅQ FҫQ Fѫ Vѫ YұW FKҩW
WK{QJ WLQ YӅ Vӵ EҩW WKѭӡQJ FӫD Yj QKkQ OӵF WӕW OkX Fy NӃW
PүX QӃX Fy TXҧ
&OR7HVW 5ҿ WLӅQ QKDQK Ĉӝ QKҥ\ JLҧP QKLӅX VDX
ÿLӅX WUӏ
1X{L Fҩ\ÿӏQKGDQK Ĉӝ ÿһF KLӋX UҩW FDR SKkQ ĈҳW WLӅQ NKy WKӵF KLӋQ ÿӝ
FKӫQJ Yj [iF ÿӏQK ÿѭӧF FKӫQJ QKҥ\ WKҩS tW QKҩW  QJj\
NKiQJ WKXӕF PӟL Fy NӃW TXҧ +LӋQ QD\
Vӱ GөQJ FKӫ \ӃX FKR
QJKLrQ FӭX Yj ÿiQK JLi
WtQK NKiQJ
3&5 Ĉӝ ÿһF KLӋX Yj ÿӝ QKҥ\ FDR 3KӭF WҥS FKѭD ÿѭӧF FKXҭQ
SKkQ FKӫQJ Yj [iF ÿӏQK ÿѭӧF KyD JLӳD FiF SKzQJ WKt
FKӫQJ NKiQJ WKXӕF QJKLӋP GQJ ÿӇ ÿiQK JLi
Vӵ [XҩW KLӋQ WUӣ OҥL KD\
QKLӉP PӝW FKӫQJ PӟL

&È&3+ѬѪ1*3+È33+È7+,ӊ1H. PYLORI
KHÔNG CÓ N͠I SOI

3KѭѫQJSKiS ѬX ÿLӇP 1KѭӧF ÿLӇP

7HVWKѫLWKӣ8%7 *77Ĉ' Yj *77Ĉ$ UҩW FDR &KL SKt FDR
;pW QJKLӋPNKiQJ
QJX\rQWURQJSKkQ
;pW QJKLӋPNKiQJ
WKӇ
[iF ÿӏQK WuQK WUҥQJ QKLӉP
WtFK FӵF ÿiQK JLi KLӋX TXҧ
ÿLӅX WUӏ QKDQK
*77Ĉ' Yj *77Ĉ$ UҩW FDR &KѭD ÿѭӧF FKXҭQ KyD
[iF ÿӏQK WuQK WUҥQJ QKLӉP
WtFK FӵF
5ҿ WLӅQ *77Ĉ$ UҩW FDR SKә *77Ĉ' SKө WKXӝF YjR
ELӃQ WҫQ VXҩW QKLӉP NK{QJ Vӱ
GөQJ ÿѭӧF VDX ÿLӅX WUӏ

ŚĞLJĞƚĂů͘ϮϬϬϳ͘ŵĞƌŝĐĂŶŽůůĞŐĞŽĨ'ĂƐƚƌŽĞŶƚĞƌŽůŽŐLJ'ƵŝĚĞůŝŶĞŽŶƚŚĞŵĂŶĂŐĞŵĞŶƚŽĨ,ĞůŝĐŽďĂĐƚĞƌƉLJůŽƌŝŝŶĨĞĐƚŝŽŶ͘
ŵ͘:͘'ĂƐƚƌŽĞŶƚĞƌŽů͕ϭϬϮ͗ϭϴϬϴͲϭϴϮϱ
0Ӝ76Ӕ1+Æ17Ӕ³ĈӜ&´&Ӫ$H. PYLORI

*HQHYDF$
9QJWtQKLӋX 9QJJLӳD
V P

6 P

*HQHFDJ$
FDJ$
*HQHYDF$
9QJWtQKLӋX 9QJJLӳD
Ϯϱϵ ϰϬϭ
V P

Ϯϴϲ ϰϳϲ
6 P

*HQHFDJ$ 
FDJ$

,& 
60$'

6ѪĈӖ48<75Î1+7+Ӵ&+,ӊ1
0үXVLQKWKLӃW &KXҭQEӏKӛQ
GҥGj\ KӧSSKҧQӭQJ

;ӱOêPүX

7iFKFKLӃW'1$
0XOWLSOH[3&5
H. pylori

3KkQ WtFK NӃW TXҧ

NLӇX JHQHFDJ$ Yj
YDF$
 48,75Î1+3+È7+,ӊ19¬Ĉӎ1+7é3H. PYLORI

‡ ;ӱOêPүXEӋQKSKҭPQJKLQKLӉPYLNKXҭQ
%ѭӟF  H. pylori

‡ 7iFK FKLӃW '1$H. pylori

%ѭӟF 

‡ 3KҧQ ӭQJ 0XOWLSOH[3&5

%ѭӟF 

‡ 3KkQ WtFK NӃW TXҧ WêS JHQHcagA Yj vacA

%ѭӟF 

&È&/2Ҥ,0Ү86,1+7+,ӂ7'Ҥ'¬<Ĉӆ/¬0
08/7,3/(;3&53+È7+,ӊ19¬Ĉӎ1+7é39,
.+8Ҭ1H. PYLORI
0үXVLQKWKLӃWGҥ 0үXVLQKWKLӃWGҥGj\ÿm 0үXVLQKWKLӃWGҥGj\
Gj\TXDQӝLVRL OjP&/2WHVW TXDSKүXWKXұW

ӔQJ ÿӵQJ PүX

Fy VҹQ GXQJGӏFK &iF PүX VDX NKL Oҩ\ [RQJÿӇ OҥQK “&Yj FKX\ӇQ ÿӃQ
EҧR TXҧQ SKzQJ [pW QJKLӋP WURQJ QJj\ ÿӇ WLӃQ KjQK [ӱ Oê
 ;Ӱ/é0Ү8

 0үX VLQK WKLӃW WURQJ GXQJ GӏFK EҧR TXҧQ ÿѭӧF Eә VXQJ
WKrP 3URWHLQDVH . Yj 6'6
 'QJ NpR Y{ WUQJ FҳW QKX\ӉQ PүX WURQJ GXQJ GӏFK
 Ӫ ӣ QKLӋW ÿӝ R& WURQJ  JLӡ 7URQJ TXi WUuQK ӫ WKӍQK
WKRҧQJ YRUWH[ ÿӇ Kӛ WUӧ FKR Vӵ WKӫ\ JLҧL PүX
 6DX JLDL ÿRҥQ Qj\ Fy WKӇ WLӃQ KjQK WiFK FKLӃW '1$ QJD\
KRһF JLӳ ӣ & FKR ÿӃQ NKL WiFK FKLӃW

7È&+&+,ӂ7'1$7+(23+ѬѪ1*3+È3&Ӝ7
 +~WȝOGӏFKP{ÿm[ӱOêYjRHSSP/
 &KRYjRȝOGXQJGӏFK/%.7&YRUWH[
 Ӫӣ&WURQJSK~W
 7KrPYjRȝO'6.&7YRUWH[
 +~WWRjQEӝKӛQKӧSEӓYjRFӝW
 /\WkPYzQJSK~WWURQJSK~W
 %ӓGӏFKOӑFTXDFӝW
 7KrPȝOGXQJGӏFK:%.7&
 /\WkPYzQJSK~WWURQJSK~W
 %ӓGӏFKOӑFTXDFӝW
 7KrPȝOGXQJGӏFK:%.&7
 /\WkPYzQJSK~WWURQJSK~W
 %ӓGӏFKOӑFTXDFӝW
 /\WkPYzQJSK~WWURQJSK~W
 %ӓFӝWYjRHSSP/PӟL
 7KrPȝO7(.7&
 Ӫ&WURQJSK~W
 /\WkPYzQJSK~WWURQJSK~W
 7KXGӏFK'1$WLQKVҥFKYjEҧRTXҧQ
 08/7,3/(;3&5

&KӑQFKѭѫQJWUuQKH. pylori
FKXNu &± SK~W
 &± JLk\
FKXNu  &± JLk\
 &± JLk\

FKXNu  &± SK~W

—OGӏFK '1$

Ĉұ\QҳSHSSHQGRUIWKұWNӻ
6SLQGRZQ
—OKӛQKӧSSKҧQӭQJ %ӓYjRPi\3&5
PXOWLSOH[3&5WURQJHSSHQGRUI
PO

<҃d>hѺE <҃dYhѵ ,jd,1,

;ϭͿ dŚĂŶŐƉŚąŶƚӊϭϬϬďƉ
dLJƉĞŐĞŶĞĐĂŐн ǀĂĐƐϭŵϭ ;ϮͿ ŚӈŶŐąŵ
;ϯͿ ŚӈŶŐĚӇҿŶŐ:ϵϵ͗ĐĂŐн ǀĂĐƐϭŵϭ
;ϰͿ ŚӈŶŐĚӇҿŶŐddžϯϬĂ͗ĐĂŐͲ ǀĂĐƐϮŵϮ
;ϱͿ DҧƵdžĠƚŶŐŚŝҵŵ
dLJƉĞŐĞŶĞĐĂŐн ǀĂĐƐϭŵϮ

dLJƉĞŐĞŶĞĐĂŐͲ ǀĂĐƐϭŵϮ ŵϭ ŵϮ ŵϮ ŵϭ ϰϬϭͬϰϳϲ

ǀĂĐ
ĐĂŐ н ͲƐϮ н н ϯϰϵ
ǀĂĐ Ɛϭ Ɛϭ Ɛϭ ϮϱϵͬϮϴϲ
/ ϮϬϬ

dLJƉĞŐĞŶĞĐĂŐͲ ǀĂĐƐϮŵϮ

<ŚƀŶŐƉŚĄƚŚŝҵŶƚLJƉĞŐĞŶĞ
ĐĂŐǀăǀĂĐƚƌŽŶŐŵҧƵ
ďҵŶŚƉŚҦŵ
0Ӝ76Ӕ.ӂ748Ҧ