Guidance Validation Confirmatory v1!1!211125 Tieng Viet

Machine Translated by Google
Liên minh Châu Âu

Phiên bản 1.1, ngày 25 tháng 11 Phòng thí nghiệm tham
năm 2021 Tài liệu hướng dẫn EURL chiếu được hỗ trợ bởi
về xác thực phương pháp xác nhận
Tài liệu Hướng dẫn EURL về
Xác nhận Phương thức Xác nhận
Nội dung
1. Phạm vi................................................. ...................................................... ............................................ 2
2. Định nghĩa ................................................... ...................................................... ....................................... 2
2.1. Số lượng mẫu ... ...................................................... ............. 2
2.2. Lô hàng................................................. ...................................................... ................................. 2
2.3. Biệt đội ... ...................................................... ............................... 2
2.4. Thiết kế thử nghiệm ................................................ ...................................................... .......... 2
2.5. Kế hoạch thực nghiệm: ................................................... ...................................................... .............. 2
2.6. Hệ số................................................. ...................................................... ................................ 2
2.7. Yếu tố tiếng ồn ... ...................................................... ........................ 3
2.8. Yếu tố thiết kế ... ...................................................... ...................... 3
2.9. Mức độ yếu tố ... ...................................................... ........................ 3
2.10. Hiệu ứng giai thừa ... ...................................................... ............... 3
2.11. Chạy thử nghiệm ... ...................................................... ............ 3
2.12. Chức năng nguồn ... ...................................................... ............... 3
3. Nhận xét chung ............................................. ...................................................... .............................. 3
4. Thực tiễn triển khai .............................................. ...................................................... ................. 5
4.1. Phương pháp xác nhận thông thường .............................................. ........................................ 5
4.1.1. Thử nghiệm xác nhận và tính toán .............................................. ............................. 7
4.2. Phương pháp xác nhận thay thế ...................................................... .......................................... 11
4.2.1. Lựa chọn chất phân tích và khoảng nồng độ ............................................ ................. 11
4.2.2. Thiết kế các thí nghiệm............................................... ...................................................... .... 13
4.2.3. Thử nghiệm xác nhận .................................................................. ...................................................... 15
4.2.4. Nghiên cứu xác nhận và các mẫu thử nghiệm .............................................. .......................................... 16
4.2.5. Tính toán tham số ... ...................................................... .. 19
4.2.6. Giải thích kết quả ............................................... ...................................................... . 19
4.2.7. Dịch vụ EURL ... ...................................................... ............... 24
5. Tập thể dục có mục đích ............................................. ...................................................... ......................... 25
Phụ lục................................................. ...................................................... ...................................................... 27
1

1 Phạm vi
Tài liệu này đóng vai trò như một hướng dẫn để hỗ trợ các phòng thí nghiệm kiểm soát chính thức trong việc hoạch định phương pháp
nghiên cứu xác nhận và sẽ đóng góp vào việc hài hòa các phương pháp kiểm soát chính thức. Các phòng thí nghiệm
hoạt động theo Quy chế thực hiện của Ủy ban (EU) 2021/808 không có nghĩa vụ tuân theo quy định này
hướng dẫn chi tiết; các cách tiếp cận khác nhau có thể chấp nhận được nếu chúng cung cấp cùng mức độ và chất lượng
thông tin. Tài liệu hướng dẫn bổ sung Quy chế thực hiện của Ủy ban (EU)
2021/808 liên quan đến việc xác nhận các phương pháp xác nhận định lượng, nhưng cũng có thể được sử dụng cho
xác nhận các phương pháp sàng lọc định lượng (bán). Sau này có thể được xác nhận theo cách tương tự
được nêu trong tài liệu này cho các phương pháp định lượng mà không yêu cầu xác định đầy đủ
theo 1.2.3, 1.2.4 và 1.2.5 của Quy định thực hiện của Ủy ban (EU) 2021/808.
2. Định nghĩa
Đối với mục đích của tài liệu hướng dẫn này, các định nghĩa được đưa ra trong Triển khai Ủy ban
Áp dụng Quy định (EU) 2021/808. Các định nghĩa sau đây cũng sẽ được áp dụng:
2.1. Số lượng mẫu

Là một bộ đếm cho tất cả các chiết / ống / mẫu riêng lẻ trong một loạt phân tích.
2.2. Lô hàng
Là một thuật ngữ có nghĩa là một vật liệu ma trận riêng lẻ. Ví dụ, 7 đợt cơ bắp bò có nghĩa là 7
mẫu cơ từ 7 loài bò khác nhau.
2.3. Aliquot
Là một thuật ngữ xác định một phần trọng lượng của một và cùng một lô.
2.4. Thiết kế thử nghiệm

Là một thuật ngữ ở đây bao gồm việc lập kế hoạch của nghiên cứu xác nhận bao gồm việc lựa chọn các yếu tố và
mức nhân tố cũng như kết quả (ngẫu nhiên) kế hoạch thực nghiệm.
2.5. Kế hoạch thử nghiệm

Là một cái nhìn tổng quan về các thí nghiệm (xác nhận) cần được tiến hành.
2.6. Hệ số
Là một biến số có thể ảnh hưởng đến kết quả phân tích. Có thể đánh giá tối đa bảy yếu tố bằng cách sử dụng
kế hoạch thiết kế thí nghiệm trực giao được mô tả trong tài liệu này.
2

2.7. Yếu tố tiếng ồn
Là một biến không thể kiểm soát được trong phân tích thông thường nhưng có thể ảnh hưởng đến kết quả, ví dụ
điều kiện lấy mẫu, hàm lượng chất béo, cho ăn, điều kiện vận chuyển, điều kiện bảo quản, các lô cột HPLC khác
nhau, các lô hộp mực SPE khác nhau, các dụng cụ khác nhau (nếu có).
2.8. Yếu tố thiết kế
Là một đặc điểm của phương pháp được phát triển có thể được đặt ra e. g. trong một mô tả phương pháp
và có thể ảnh hưởng đến kết quả. Yếu tố có phải là yếu tố thiết kế hay không phụ thuộc vào
các yêu cầu quy định trong quy trình thao tác chuẩn của phương pháp phân tích. Nếu không có
các quy định trong mô tả phương pháp liên quan đến đặc tính liên quan, có thể giả định rằng nó
thay đổi ngẫu nhiên trong phân tích thông thường và do đó phải được coi là một yếu tố nhiễu.
2.9. Mức độ yếu tố
Là một biến thể của một yếu tố. Số lượng các mức yếu tố có thể có thường là hai, chúng được chỉ định trong
thiết kế thử nghiệm.
2.10. Hiệu ứng giai thừa
Là ảnh hưởng được tính toán đến kết quả phân tích phát sinh từ sự thay đổi từ một cấp độ nhân tố sang
nữa.
2.11. Chạy thử nghiệm
Là một phân tích đơn lẻ sử dụng các mức nhân tố được chỉ định trong phương án thực nghiệm ngẫu nhiên.
2.12. Chức năng nguồn
Là đồ thị của xác suất sai số 1-β so với nồng độ mà từ đó nồng độ tới hạn CCα
và CCβ có thể được xác định bằng đồ thị.
3. Nhận xét chung
Chương 2 của Phụ lục I về Quy định Thực hiện của Ủy ban (EU) 2021/808 mô tả
các yêu cầu đối với việc xác nhận các phương pháp phân tích để xác định hoạt tính dược lý
các chất1 . Theo tài liệu này, các phương pháp phân tích có thể được phân thành năm trường hợp khác nhau
dựa trên hình thức phân tích (sàng lọc, xác nhận) và phương thức xác định chất phân tích (định tính, bán định
lượng, định lượng). Đối với mỗi sự kết hợp có thể, khác nhau
các đặc điểm hoạt động có tầm quan trọng như được đưa ra trong Bảng 5 của Ủy ban Thực hiện
Quy định (EU) 2021/808 (phiên bản được thông qua vào ngày 22 tháng 3 năm 2021). Tất cả các thông số liên quan cần
được xác nhận và giải quyết trong báo cáo xác nhận. Ngoài ra, các đặc điểm của đường chuẩn phải được
được xác định và phạm vi phân tích của phương pháp tương ứng phải luôn được đưa vào báo cáo xác nhận.
1 Phạm vi cụ thể được quy định trong CIR 2021/808.
3

Phiên bản 1.1, ngày 25 tháng 11
Phòng thí nghiệm tham
năm 2021 Tài liệu hướng dẫn EURL
chiếu được hỗ trợ bởi
Các phương pháp xác nhận định tính nghiêm ngặt là một trường hợp rất đặc biệt, hiện đang mang tính lý thuyết nhiều hơn
tầm quan trọng, vì hầu hết các phương pháp phát hiện phù hợp để xác nhận đều cho phép đánh giá dữ liệu bán định lượng
đến một mức độ nào. Do đó, phương pháp xác nhận định tính, trong thời điểm hiện tại, có thể được hiểu là
phương pháp xác nhận định lượng không đáp ứng tất cả các yêu cầu đối với các phương pháp như vậy được nêu trong
Quy định Thực thi của Ủy ban (EU) 2021/808. Xác thực một phương pháp xác nhận định tính nghiêm ngặt
đối với các hợp chất không được phép sẽ yêu cầu số lượng mẫu rất lớn để đáp ứng các yêu cầu liên quan đến sai số β và do đó
thường không được coi là khả thi (về mặt kinh tế) trong thực tế.
Đối với thiết kế của nghiên cứu xác nhận, tình trạng pháp lý của một chất (được ủy quyền, không được phép) cần phải
được xem xét. Trong trường hợp các chất được cho phép, mức dư lượng tối đa (MRL) 2 và mức tối đa
cấp (ML) 3 là tham chiếu cho bất kỳ xác nhận nào. Đối với các chất trái phép, điểm tham chiếu cho hành động (RPA) 4 cung cấp
điểm chuẩn cho nỗ lực xác nhận. Nếu một yêu cầu về hiệu suất phương pháp tối thiểu (MMPR) 5 đã được thiết lập cho một chất trái
phép, thì việc xác nhận có thể
được tiếp cận theo cách tương tự như đối với các chất trái phép. Vì RPA chỉ được thiết lập cho
các chất bị cấm, việc xác nhận sự hiện diện của chúng ở bất kỳ mức nồng độ nào sẽ kích hoạt một cuộc điều tra tiếp theo. Cả RPA
và MMPR không được hiểu là các giá trị giới hạn và do đó phân tích
các phương pháp được thiết kế để xác nhận các chất mà RPA hoặc MMPR đã được thiết lập phải được xác nhận ở các mức nồng độ thấp
đến mức có thể đạt được một cách hợp lý6 .
Các chất trái phép không tồn tại các giá trị nêu trên cần được xác nhận
dựa trên mức hiệu chuẩn thấp nhất (LCL), có nghĩa là chúng phải được xác nhận cho các nồng độ
thấp nhất có thể đạt được một cách hợp lý. Với các phương pháp đa chất hiện nay, rất có thể sự kết hợp của
các chất được phép và không được phép phải được xác nhận trong một nghiên cứu. Vì vậy, để xác nhận chung
các thủ tục được mô tả trong tài liệu hướng dẫn này, không có sự phân biệt giữa được ủy quyền và
các chất trái phép hoặc các chất được liệt kê trong Nhóm A hoặc Nhóm B của Phụ lục I của Chỉ thị Hội đồng 96/23 / EC7 . Nhưng
tất nhiên các yêu cầu liên quan đến mức nồng độ để được xác nhận cần phải
được xem xét tùy thuộc vào tình trạng pháp lý của dư lượng.
Để đảm bảo hiệu suất đầy đủ của phương pháp, việc phát triển và xác nhận các phương pháp sử dụng các tài liệu tham khảo phát
sinh là điều thuận lợi. Tuy nhiên, là vật liệu chuẩn có chứa tất cả các dư lượng có liên quan ở
mức nồng độ cần thiết không có sẵn, các thí nghiệm xác nhận thường được thực hiện
trên vật liệu trắng được tăng cường chất phân tích quan tâm. Liên quan đến sự thể hiện có thể chấp nhận được của
các biến thể ma trận xuất hiện tự nhiên có thể ảnh hưởng đến hiệu suất của phương pháp e. g. bằng cách triệt tiêu ma trận hoặc
các thành phần ma trận đồng rửa giải, nhiều vật liệu nền (trắng) khác nhau (lô) như
2 Quy định của Ủy ban (EU) 37/2010

3 Danh sách tài liệu tham khảo được cập nhật thường xuyên có sẵn từ EURL Berlin.
4 Quy định của Ủy ban (EU) 2019/1871
5 Hướng dẫn EURL về các yêu cầu thực hiện phương pháp tối thiểu (MMPR) đối với các chất có hoạt tính dược lý cụ thể trong nền động
vật cụ thể, tháng 9 năm 2020
6
So sánh phần 1.2.1 của Quy định thực hiện của Ủy ban 2021/808
7 Giai đoạn chuyển tiếp kết thúc vào năm 2022; các thay đổi được thảo luận trong phụ lục của SANTE 11987: 2017
4

Phiên bản 1.1, ngày 25 tháng 11
năm 2021 Tài liệu hướng dẫn EURL
khả thi nên được đưa vào nghiên cứu xác nhận, bất kể phương pháp tiếp cận phương pháp đã chọn
Thẩm định. Mức tối thiểu được đề xuất của các vật liệu nền khác nhau cho mỗi cách tiếp cận xác nhận phương pháp là
được đưa ra trong các phần tương ứng. Tuy nhiên, điều quan trọng vẫn là xác minh tính phù hợp
của các phương pháp được phát triển và xác nhận bằng cách sử dụng vật liệu nền tăng cường bằng cách phân tích tham chiếu ma trận phát sinh
vật chất. Ngoài ra, tất cả các phương pháp phân tích cần được đánh giá liên tục bằng cách sử dụng tham chiếu ma trận
vật liệu (nếu có thể mua được) sau khi xác nhận phương pháp như một biện pháp kiểm soát chất lượng liên tục. Đối với những
mục đích, EURL cung cấp nhiều loại tài liệu tham khảo nội bộ được đặc trưng trong các bài kiểm tra trình độ để
các phòng thí nghiệm đủ điều kiện.
Bất kể cách tiếp cận được lựa chọn để xác nhận giá trị phương pháp, tất cả các chi tiết liên quan của quy trình phân tích
cần được điều tra và xác định trong phần mô tả phương pháp trước khi thực hiện các thí nghiệm xác nhận thực tế. Ngoài các
yêu cầu về phương pháp cơ bản, cũng cần phải kiểm tra xem
Việc định lượng cần phải được thực hiện bằng cách sử dụng một loạt hiệu chuẩn được tăng cường chất nền hoặc một dãy hiệu chuẩn phù hợp với chất nền,
bổ sung tiêu chuẩn8 hoặc nếu việc định lượng bằng cách sử dụng các dung dịch tiêu chuẩn là đủ. Nếu thí nghiệm sơ bộ
truyền đạt rằng ảnh hưởng của ma trận nhất định chỉ có thể được bù đắp bằng các hiệu chuẩn ma trận cụ thể (e. g.
Không thể định lượng mẫu cơ thịt lợn bằng cách sử dụng hiệu chuẩn ma trận được chuẩn bị từ cơ thịt lợn)
chúng phải được sử dụng trong toàn bộ nghiên cứu xác nhận và đương nhiên, thực hành này cần phải
được tiếp tục áp dụng thường xuyên phương pháp này.
Các phương pháp phân tích đã được xác nhận trước đây phù hợp với các yêu cầu của Quyết định của Ủy ban
2002/657 / EC cần được xem xét về việc đáp ứng các yêu cầu của Ủy ban
Quy chế thực hiện (EU) 2021/808. Trong nhiều trường hợp, chỉ một số thử nghiệm hạn chế có thể
được yêu cầu để thu thập tất cả các dữ liệu cần thiết cho một phương pháp phân tích được xác nhận phù hợp với
với CIR (EU) 2021/808. Cân nhắc về điều này được đưa ra trong Phụ lục của hướng dẫn EURL này
tài liệu.
4. Thực tế triển khai
4.1. Phương pháp xác nhận thông thường
Mục 2.2.1 của Phụ lục I về Quy định Thực hiện của Ủy ban (EU) 2021/808 đề cập đến
xác nhận giá trị của các phương pháp phân tích bằng cách sử dụng phương pháp xác nhận thông thường, yêu cầu cá nhân
thử nghiệm cho mọi thông số được xác thực, cũng như cho mỗi thay đổi lớn trong phương pháp
điều này sẽ ảnh hưởng đến các đặc tính hiệu suất. Tuy nhiên, có thể và khuyến nghị giảm
tổng số mẫu yêu cầu bằng cách kết hợp các thí nghiệm xác nhận nhất định. Bản thiết kế của một
Nghiên cứu xác nhận thông thường được trình bày trong tài liệu hướng dẫn này kéo dài ba loạt phân tích một cách lý tưởng
được tiến hành trong vài tuần và bao gồm một cuộc điều tra về độ chắc chắn. Trong trường hợp tuyệt đối
8 Phương pháp tiếp cận mẫu để xác nhận phương pháp xác nhận sử dụng định lượng bằng cách bổ sung chất chuẩn sẽ
được thảo luận và đưa vào các phiên bản tương lai của Tài liệu hướng dẫn này.
5

sự phục hồi và hiệu ứng ma trận phải được xác định, có thể cần một loạt xác nhận thứ tư.
Thông tin về hiệu ứng ma trận một phần cũng có thể được thu thập từ các thí nghiệm sơ bộ.
Cần tối thiểu 21 lô khác nhau để xác nhận đầy đủ theo đề xuất
cách tiếp cận xác nhận mẫu (Bảng 1).
Bảng 1: Tổng quan về các lô được yêu cầu cho mỗi loạt xác nhận trong cách tiếp cận xác nhận thông thường được đề xuất.
Loạt kiểm chứng 1: 7 lô cho tính đặc hiệu và tăng cường + 1 lô cho đường chuẩn9
Kiểm chứng loạt 2: 7 lô cho tính đặc hiệu và tăng cường + 1 lô cho đường chuẩn 9,10
Kiểm chứng loạt 3: 7 lô cho tính đặc hiệu và tăng cường + 1 lô cho đường chuẩn 9,10 và độ chắc chắn11
Có thể sử dụng các mẫu gộp, ví dụ như cho đường chuẩn. Tuy nhiên, số lượng tối thiểu
các lô được bao gồm trong quá trình xác nhận cần phải được tôn trọng. Các trường hợp ngoại lệ chỉ có thể được chấp nhận cho
ma trận bất thường.
Tất cả các lô này, ngoại trừ lô được sử dụng cho đường chuẩn, cần được tăng cường chất phân tích.
quan tâm đến mức tối thiểu của các mức tăng cường cho trong Bảng 1; nồng độ chính xác phụ thuộc vào
tình trạng pháp lý của chất tồn dư được đề cập. Các mẫu cũng sẽ cần được củng cố bằng tiêu chuẩn nội bộ
giải pháp, nếu có. Xem 4.1.1 để biết loạt xác nhận bắt buộc.
Bảng 2: Các mức tăng cường cần thiết trong một nghiên cứu xác nhận thông thường như được đưa ra trong Quy định thực hiện của Ủy
ban 2021/808 (phiên bản được thông qua vào ngày 22 tháng 3 năm 2021).
Phần còn lại Cấp độ 1 Cấp độ 2 Cấp 3
Không được phép với RPA12 0,513 RPA 1.0 RPA 1.5 RPA
Không được ủy quyền14 1,0 LCL 2.0 LCL 3.0 LCL
Được ủy quyền 0,115 MRL / ML 1,0 MRL / ML 1,5 MRL / ML
9 Lô đường cong hiệu chuẩn có thể là một trong 7 lô cho tính đặc hiệu / bổ sung.
10 Đối với đường chuẩn: sử dụng một lô khác nhau cho mỗi loạt xác nhận.
11 Để có độ chắc chắn, có thể sử dụng lô tương tự như đối với đường chuẩn.
12 Các mức nồng độ được đưa ra ở đây đối với các chất RPA được hiểu là các mức nồng độ mẫu. Các phương pháp phân tích để xác
nhận các chất mà RPA đã được thiết lập phải được xác nhận ở nồng độ thấp nhất có thể đạt được một cách hợp lý.
13 Trong trường hợp 0,5 RPA không thể đạt được một cách hợp lý, mức này có thể được thay thế bằng mức thấp nhất có thể đạt được một cách hợp lý
nồng độ từ 0,5 RPA đến 1,0 RPA.
14 Có thể áp dụng cách tiếp cận tương tự cho các chất mà MMPR đã được thiết lập.
15 Trong trường hợp không thể đạt được 0,1 MRL / ML một cách hợp lý, mức này có thể được thay thế bằng nồng độ hợp lý
thấp nhất có thể đạt được giữa 0,1 và 0,5 MRL / ML.
6

4.1.1. Thử nghiệm xác thực và tính toán
Thử nghiệm xác thực
Đoạn này hiển thị chuỗi xác thực cá nhân được yêu cầu để xác nhận đầy đủ.
Chuỗi kiểm chứng 1: 7 lô, 28 mẫu nền (không bao gồm hiệu chuẩn tăng cường chất nền,
định lượng với hiệu chuẩn chuẩn) hoặc 33 mẫu nền (bao gồm cả hiệu chuẩn tăng cường chất nền);
Chuỗi xác thực 2: 7 lô khác với lô được sử dụng cho chuỗi xác thực 1, 28 mẫu ma trận (không
bao gồm hiệu chuẩn được tăng cường chất nền, định lượng với hiệu chuẩn tiêu chuẩn) hoặc 33 mẫu nền (bao gồm
hiệu chuẩn tăng cường chất nền);
Các lô xác thực 3: 7 lô khác với các lô được sử dụng cho các lô xác thực 1 và 2, 34 mẫu ma trận (không
không bao gồm hiệu chuẩn tăng cường nền, định lượng với hiệu chuẩn chuẩn) hoặc 39 mẫu nền (bao gồm hiệu chuẩn tăng cường
chất nền);
Chuỗi kiểm chứng 4: 20 lô, 32 mẫu nền, ít nhất 33 phép phân tích (chỉ cần thiết trong trường hợp tuyệt đối
thu hồi và hiệu ứng ma trận tương đối phải được xác định).
Độ thu hồi tuyệt đối phải được xác định khi không sử dụng chất chuẩn nội hoặc không sử dụng hiệu chuẩn tăng cường chất nền.
Các hiệu ứng nền tương đối phải được xác định khi các hiệu ứng này chưa được đánh giá sơ bộ.
thí nghiệm (các đoạn 2.9 và 2.10 trong Phụ lục I của Quy định Thực hiện của Ủy ban (EU)
2021/808).
Tính toán
Sau khi phân tích, nồng độ, thời gian lưu và tỷ lệ ion được sử dụng để tính toán hiệu suất
đặc điểm sử dụng phần mềm thống kê. Các tính toán có thể dựa trên phương pháp phân tích phương sai (ANOVA) để xác định độ
đúng, độ lặp lại và độ tái lập trong phòng thí nghiệm và
phải tôn trọng các yêu cầu của ISO 11843-1: 1997 (nồng độ tới hạn). Ngoài ra, tính toán
có thể dựa trên ISO 5725-2: 2019 và Codex CAC / GL 59-2006. Bất kỳ phần mềm hoặc bảng tính nào được yêu cầu
đối với những tính toán này cần phải đáp ứng các tiêu chí của ISO 17025: 2017. Những công cụ này có thể được phát triển trong nhà,
nhưng cũng có sẵn trên thị trường và từ EURL.
Tổng độ không đảm bảo đo
Theo Quy định Thực hiện của Ủy ban (EU) 2021/808, khả năng tái tạo trong phòng thí nghiệm
và độ đúng cần được xem xét đối với tổng độ không đảm bảo đo. Mặc dù các phương pháp tiếp cận để bao gồm cả hai khía cạnh
đã được đề xuất16, nhưng không có khái niệm được chấp nhận chung. Phương pháp kể từ
các nghiên cứu xác nhận thường được thực hiện trên vật liệu nền trắng được củng cố, tính đúng đắn của phương pháp góp phần
đến tổng độ không đảm bảo đo theo thiết kế. Do đó, khả năng tái lập trong phòng thí nghiệm có thể là
16 Magnusson và Elisson (2008), Hậu môn. Bioanal. Chèm. 390, 201-213.
7

được coi là một ước lượng tốt về tổng độ không đảm bảo đo nếu tất cả các yếu tố liên quan đã được tính đến
tài khoản trong quá trình nghiên cứu xác nhận.
số 8

Bảng 3: Các thử nghiệm cần thiết cho loạt xác nhận 1 của phương pháp tiếp cận mẫu để xác nhận hoàn chỉnh, thông thường.
Xác thực loạt 1 Cấp độ củng cố # Chiết xuất Đặc tính hiệu suất
5 phần của 1 lô, được tăng cường trước khi chiết xuất (nếu có) năm cấp độ khác nhau bao gồm 0 5 đường chuẩn
1 phần của 7 lô trống khác nhau, không có bổ sung không có sự củng cố 7 tính cụ thể
1 phần của 7 lô trắng khác nhau (giống như được sử dụng cho tính đặc hiệu) được củng cố trước khi chiết xuất cấp độ 1 7
CCα, sự thật,
1 phần của 7 lô trắng khác nhau (giống như được sử dụng cho tính đặc hiệu) được củng cố trước khi chiết xuất cấp độ 2 7 độ lặp lại *,
1 phần của 7 lô trắng khác nhau (giống như được sử dụng cho tính đặc hiệu) được củng cố trước khi chiết xuất cấp 3 7 khả năng tái tạo trong phòng thí nghiệm
Bảng 4: Các thử nghiệm cần thiết cho loạt đánh giá xác nhận 2 của phương pháp lấy mẫu để xác nhận hoàn chỉnh, thông thường.
Xác thực loạt 2 Cấp độ củng cố # Chiết xuất Đặc tính hiệu suất
5 phần của 1 lô, được tăng cường trước khi chiết xuất (nếu có) năm cấp độ khác nhau bao gồm 0 5 đường chuẩn
1 phần của 7 lô trống khác nhau không có sự củng cố 7 tính cụ thể
1 phần của 7 lô trắng khác nhau (giống như được sử dụng cho tính đặc hiệu) được củng cố trước khi chiết xuất cấp độ 1 7
CCα, sự thật,
1 phần của 7 lô trắng khác nhau (giống như được sử dụng cho tính đặc hiệu) được củng cố trước khi chiết xuất cấp độ 2 7 độ lặp lại *,
1 phần của 7 lô trắng khác nhau (giống như được sử dụng cho tính đặc hiệu) được củng cố trước khi chiết xuất cấp 3 7 khả năng tái tạo trong phòng thí nghiệm
9

Bảng 5: Các thử nghiệm cần thiết cho chuỗi xác nhận 3 của phương pháp lấy mẫu để xác nhận hoàn chỉnh, thông thường.
Xác thực chuỗi 3 Cấp độ củng cố # Khai thác Đặc tính hiệu suất
5 phần của 1 lô, được tăng cường trước khi chiết (nếu có) 1 phần của năm cấp độ khác nhau bao gồm 0 5 đường chuẩn
7 lô trắng khác nhau 1 phần của 7 lô trắng khác nhau (giống như được không có sự củng cố 7 tính cụ thể
sử dụng cho tính đặc hiệu) được củng cố trước khi chiết 1 phần của 7 lô trắng khác nhau (giống như đã sử cấp độ 1 7 CCα, sự thật,
dụng đối với tính đặc hiệu) được tăng cường trước khi chiết 1 phần của 7 lô trắng khác nhau (giống như cấp độ 2 7 độ lặp lại *,
được sử dụng cho độ đặc hiệu) được tăng cường trước khi chiết 6 phần của 1 lô (giống như được sử dụng cho cấp 3 7 khả năng tái tạo trong phòng thí nghiệm
đường chuẩn) để lặp lại 3 lần thay đổi phương pháp ** cấp độ 2 6 độ chắc chắn
*
Tầm quan trọng của độ lặp lại đối với đặc tính của phương pháp phân tích, cũng như tính toán của nó hiện đang được thảo luận, cũng tính đến định nghĩa cho điều kiện lặp lại.
đo lường được cung cấp trong Từ vựng Quốc tế về Đo lường17. Trong tài liệu này, các điều kiện đo lặp lại được định nghĩa là “một tập hợp các điều kiện bao gồm cùng một quy trình đo, cùng một người vận hành, cùng một hệ
thống đo, cùng một điều kiện hoạt động và cùng một vị trí, và lặp lại các phép đo trên cùng một hoặc các đối tượng tương tự trong một khoảng thời gian ngắn ”. Cần lưu ý rằng trái ngược với độ tái lập, độ lặp lại không
phải là thông số liên quan để xác định nồng độ tới hạn.
**
Để đảm bảo độ chắc chắn, phương pháp tiếp cận Youden (xem phần 2.4 của Phụ lục I về Quy định thực hiện của Ủy ban (EU) 2021/808) có thể được sử dụng, nhưng cũng là một phương pháp thay thế. Chọn ví dụ 3 thay đổi đối với
phương pháp và xử lý các mẫu trùng lặp.
Bảng 6: Các thử nghiệm cần thiết cho loạt đánh giá xác nhận 4 của phương pháp lấy mẫu để xác nhận hoàn chỉnh, thông thường.
Xác thực loạt 4 Cấp độ củng cố # Khai thác Đặc tính hiệu suất
1 phần của 6 lô trắng khác nhau, được tăng cường trước khi chiết cấp độ 2 6
phục hồi tuyệt đối
1 phần trong số 6 lô trắng khác nhau (giống như được sử dụng cho dòng trên), được tăng cường sau khi bằng cấp 2 6
chiết 1 phần của 20 lô trắng khác nhau, được tăng cường sau khi chiết bằng cấp 2 20
hiệu ứng ma trận tương đối
1 giải pháp tiêu chuẩn bằng cấp 2
17 Từ vựng quốc tế về đo lường - Các khái niệm cơ bản và chung và các thuật ngữ liên quan (VIM), xuất bản lần thứ 3 , Tổ chức nội bộ về đo lường pháp lý (OIML), 2007.
10

4.2. Phương pháp xác nhận thay thế

Nguyên tắc của cách tiếp cận dựa trên thiết kế thử nghiệm để xác nhận được mô tả trong phần 2.2.2 của
Phụ lục I về Quy định Thực hiện của Ủy ban (EU) 2021/808. Một ví dụ cho một giải pháp thay thế
cách tiếp cận sử dụng kế hoạch thiết kế thực nghiệm trực giao giai thừa được đưa ra chi tiết trong hướng dẫn này
tài liệu. Cách tiếp cận giai thừa nhằm mục đích thiết lập dữ liệu đo lường và độ chính xác đáng tin cậy bằng cách
sự thay đổi có kiểm soát của tối đa bảy yếu tố đã chọn, có thể có ảnh hưởng đến kết quả phân tích
kết quả. Đồng thời, cách tiếp cận này cũng yêu cầu số lượng mẫu ít hơn để có cùng chất lượng
dữ liệu hiệu suất của phương pháp so với các phương pháp tiếp cận thiết kế không thử nghiệm do sự phân tầng
của thiết kế trực giao. Các nghiên cứu xác thực giai thừa được thiết kế theo cách sao cho độ chính xác, độ phục hồi
(dựa trên các mẫu tăng cường), độ nhạy, độ không đảm bảo đo và nồng độ tới hạn có thể được xác định đồng
thời. Ngoài ra, khái niệm này cho phép đánh giá tác động tổng hợp của
ảnh hưởng giai thừa cũng như ảnh hưởng ngẫu nhiên đến hiệu suất của phương pháp. Thiết kế thử nghiệm cũng
bao gồm việc khảo sát độ chắc chắn của phương pháp phân tích và xác định
Độ lệch chuẩn tái lập nội bộ qua các lô và ma trận khác nhau18, có thể được coi là một ước lượng tốt về độ
không đảm bảo đo nếu các yếu tố ảnh hưởng được lựa chọn đúng cách. Sự ổn định
các thử nghiệm không được bao gồm trong cách tiếp cận mô hình để xác nhận giai thừa được trình bày trong hướng dẫn này
tài liệu và cần được tiến hành riêng theo các yêu cầu nêu trong phần 2.5 của
Phụ lục I về Quy định Thực hiện của Ủy ban (EU) 2021/808.
Nói chung, thủ tục xác nhận phương pháp giai thừa kế tiếp sự phát triển phương pháp là
sau:
1. Thiết kế của nghiên cứu
một. Lựa chọn các chất phân tích có liên quan
b. Lựa chọn các mức nồng độ liên quan
c. Lựa chọn các yếu tố và mức độ yếu tố
d. Tạo kế hoạch thử nghiệm ngẫu nhiên
2. Tiến hành chạy thử nghiệm
3. Đánh giá thống kê và tính toán các thông số phương pháp
4.2.1. Lựa chọn chất phân tích và phạm vi nồng độ
Các chất phân tích và khoảng nồng độ của phương pháp xác nhận định lượng được xác nhận là
được chọn theo loại mẫu dự kiến và mục đích, yêu cầu của phương pháp.
Ngoài ra, các yêu cầu của Quy định thực hiện của Ủy ban (EU) 2021/808 cần phải
hài lòng.
18 Nếu các ma trận khác nhau được bao gồm như một yếu tố trong thiết kế thử nghiệm.
11

Đối với mục đích xác nhận, mức hiệu chuẩn thấp nhất trong nghiên cứu xác nhận chủ yếu phải được chọn
sao cho một tín hiệu đáng tin cậy được đảm bảo. Việc đáp ứng các tiêu chí nhận dạng (số lượng bắt buộc của
các điểm nhận dạng cho các phương pháp xác nhận như đã nêu trong Phụ lục I về Ủy ban Thực hiện
Quy định (EU) 2021/808) phải được đánh giá riêng như mô tả bên dưới.
Cách tiếp cận xác nhận thay thế cũng có thể được sử dụng cho các phương pháp sàng lọc định lượng (bán). Trong này
trong trường hợp phương pháp thử được áp dụng không cần có khả năng xác nhận rõ ràng danh tính của chất phân tích. Phương
pháp thử nghiệm là đủ để tạo ra các tín hiệu đề cập đến thời gian lưu xác định.
và / hoặc độ dài / khối lượng / tần số sóng tương ứng, v.v. Do đó, mức thấp nhất
có thể sử dụng nồng độ mang lại tín hiệu đáng tin cậy (ví dụ: xung quanh giới hạn định lượng cổ điển)
như một điểm khởi đầu.
Không giống như trong cách tiếp cận xác nhận thông thường, với cách tiếp cận xác nhận thay thế, nồng độ
phạm vi được xác nhận thay vì các mức nồng độ rời rạc. Do đó, không cần thiết phải củng cố
mẫu được sử dụng để xác nhận ở các mức nồng độ chính xác được đưa ra trong Phụ lục I của Ủy ban
Quy chế thực hiện (EU) 2021/808. Tuy nhiên, các mức nồng độ cần thiết phải được bao phủ
đầy đủ theo dải nồng độ đã được xác nhận đã chọn. Ở mức tối thiểu các khoảng nồng độ đã cho
trong Bảng 7 cần được xác nhận.
Bảng 7: Mức độ củng cố trong một nghiên cứu xác thực giai thừa như được đưa ra trong Quy định thực hiện của Ủy ban 2021/808
(phiên bản được thông qua vào ngày 22 tháng 3 năm 2021).
Phần còn lại Phạm vi nồng độ
RPA19 0,520 · - 1,5 RPA
Không được ủy quyền21 1,0 · - 3,0 LCL
Được ủy quyền 0,122 · - 1,5 MRL / ML
Tốt hơn là xác định phạm vi nồng độ được xác nhận trước khi quyết định các yếu tố
được bao gồm trong nghiên cứu xác nhận, bởi vì phạm vi nồng độ cực đoan có thể tăng cường hoặc làm giảm
tầm quan trọng của một số yếu tố thường được đưa vào các nghiên cứu xác nhận giai thừa.
Cần xem xét tối thiểu năm mức nồng độ khác nhau (bao gồm cả mức trống, nếu có)
thích hợp để bao phủ các khoảng nồng độ này. Đối với nhiều phương pháp bao gồm một số lượng lớn chất phân tích
và có thể cũng có một số ma trận mà các giới hạn pháp lý khác nhau đã được thiết lập cho cùng một
chất, có thể cần phải xác nhận cho một phạm vi nồng độ mở rộng. Điều này thường yêu cầu
19 Phạm vi nồng độ được đưa ra ở đây cho các chất RPA được hiểu như một ví dụ. Các phương pháp phân tích để xác nhận các
chất mà RPA đã được thiết lập phải được xác nhận ở nồng độ thấp nhất có thể đạt được một cách hợp lý.
20 Trong trường hợp không thể đạt được 0,5 RPA một cách hợp lý, mức này có thể được thay thế bằng nồng độ hợp lý thấp nhất có thể
đạt được giữa 0,5 RPA và 1,0 RPA.
21 Có thể áp dụng cách tiếp cận tương tự cho các chất mà MMPR đã được thiết lập.
22 Trong trường hợp không thể đạt được 0,1 MRL / ML một cách hợp lý, mức này có thể được thay thế bằng nồng độ hợp lý
thấp nhất có thể đạt được giữa 0,1 và 0,5 MRL / ML.
12

Phiên bản 1.1, ngày 25 tháng 11 năm Phòng thí nghiệm tham
2021 Tài liệu hướng dẫn EURL về xác chiếu được hỗ trợ bởi
thực phương pháp xác nhận
bao gồm các cấp độ bổ sung bổ sung trong nghiên cứu xác nhận và do đó, tuyến tính
của việc hiệu chuẩn cần được đánh giá trước khi bắt đầu nghiên cứu xác nhận phương pháp. Trong vài trường hợp,
nó có thể là lựa chọn tốt hơn để xác nhận phương pháp một cách riêng biệt cho các phạm vi nồng độ khác nhau.
Các mức hiệu chuẩn và mức nồng độ xác nhận không cần phải bằng nhau.
Tuy nhiên, các mức nồng độ tăng cường cần được đánh giá trong quá trình xác nhận cần phải được đề cập trong
tiêu chuẩn và / hoặc phạm vi hiệu chuẩn ma trận. Nói chung, việc hiệu chuẩn chất chuẩn / chất nền phải trải dài trong một phạm
vi lớn hơn các mức nồng độ cần xác nhận. Một ví dụ về nồng độ đã chọn
mức độ xác nhận của một phương pháp phân tích để xác định metronidazole (MNZ) trong huyết tương
và huyết thanh được đưa ra trong Bảng 8.
Bảng 8: Ví dụ về mức tăng cường (CL) đối với metronidazole (MNZ) (MMPR = 1,0 µg / kg) để xác nhận phương pháp trong
huyết tương và huyết thanh. Lưu ý rằng đối với các hợp chất mà MMPR đã được thiết lập thì không có giá trị cố định
các yêu cầu liên quan đến dải nồng độ đã được xác nhận. Chỉ cần xác nhận nồng độ dưới MMPR là đủ.
Sự củng cố CL01 CL02 CL03 CL04 CL05 CL06
mức độ
Phân tích
Bộ Y Tế 0,05µg / kg 0,10 µg / kg 0,20 µg / kg 0,40 µg / kg 0,80 µg / kg 1,20 µg / kg
4.2.2. Thiết kế các thí nghiệm
Lựa chọn các yếu tố và mức độ yếu tố
Thiết kế thử nghiệm của nghiên cứu xác nhận thường dựa trên tối đa bảy yếu tố khác nhau
ở hai cấp độ trong nghiên cứu xác nhận. Yếu tố là bất kỳ thông số nào trong quy trình phân tích
có thể ảnh hưởng đến kết quả phân tích. Yếu tố nào cần đánh giá trong quá trình xác nhận phương pháp phụ thuộc vào
phương pháp được đề cập và do đó luôn luôn là một quyết định theo từng trường hợp. Thông tin có giá trị về các yếu tố
với một tác động lớn đến hiệu suất của phương pháp có thể đạt được trong quá trình phát triển phương pháp.
Các yếu tố đại khái có thể được phân loại là “yếu tố thiết kế” (chủ yếu là theo phương pháp cụ thể) và “yếu tố tiếng ồn” (chủ yếu
mẫu cụ thể). Nói chung, các yếu tố thiết kế là các tham số có thể được xác định trong phương pháp
sự mô tả. Chỉ các yếu tố thiết kế không thể được nghiên cứu trong quá trình phát triển phương pháp hoặc
cần một sự linh hoạt nhất định trong phân tích thường xuyên nên được đưa vào nghiên cứu xác nhận. Tất cả các thiết kế khác
các yếu tố cần được đánh giá và cố định trước khi xác nhận phương pháp. Đối với nghiên cứu xác nhận, tất cả các cấp độ yếu tố
nên được lựa chọn dựa trên kinh nghiệm của nhà phân tích hoặc các ràng buộc cụ thể đối với phòng thí nghiệm. Một không
Tổng quan đầy đủ về các yếu tố có thể xảy ra và mức độ yếu tố được đưa ra trong Bảng 9.
Nếu nhà phân tích đã có đủ kinh nghiệm về phương pháp này và đã thử nghiệm các loài hoặc chất nền khác nhau
trong quá trình phát triển phương pháp mang lại kết quả khả quan, những yếu tố đó cũng có thể
bao gồm các mức yếu tố. Tuy nhiên, không nên đưa quá nhiều ma trận và / hoặc loài vào
nghiên cứu xác thực 8 lần chạy ban đầu.
13

Bảng 9: Tổng quan không đầy đủ về các yếu tố có thể có và ví dụ về các mức yếu tố để xem xét trong giai thừa
nghiên cứu xác nhận phương pháp.
Các nhân tố Giải thích / ví dụ cho các mức nhân tố

Ma trận
các loài bò, heo, noãn

động vật lớp ma động vật có vú, gia cầm
trận hàm lượng thận, cơ, gan
chất béo
điều kiện mẫu sản tươi, tươi đông lạnh, đông khô
xuất nông nghiệp thông thường, hữu cơ
Đo đạc
định lượng pha hiệu chuẩn tiêu chuẩn, hiệu chuẩn ma trận
loãng
dung tích thuốc tiêm

dụng cụ
khối lượng hoàn nguyên
Nhà điều hành
nhà điều hành quen thuộc, không quen thuộc với phương pháp
Chuẩn bị mẫu
số lượng mẫu lượng mẫu đã cân
Tác nhân tạo dẫn xuất các lô hoặc nhà sản xuất khác nhau
bước khử béo bước ly có, không, tốc độ ly tâm

tâm pha SPE có, không, các phương pháp khác nhau
Tốc độ rửa giải SPE

thời gian chiết xuất có, không, các phương pháp khác nhau
phân hủy bằng enzym
khối lượng khai thác
dung môi chiết xuất
lọc
vật liệu lọc
thủy phân
độ pH
khối lượng hoàn nguyên
Lưu trữ mẫu

điều kiện bảo quản -25 ° C, +4 ° C, +25 ° C
bảo quản chiết xuất không, qua đêm ở +4 ° C, 2-3 ngày ở +4 ° C
Các yếu tố kỹ thuật
nhà sản xuất hộp mực

rất nhiều hộp mực
Nhiệt độ bay các lô khác nhau, các cột tương tự của các nhà sản xuất khác nhau
hơi cột HPLC
Thí dụ
Phương pháp xác định nitroimidazol phải được xác nhận. Trong quá trình phát triển phương pháp và
từ các nghiên cứu xác nhận phương pháp trước đó, đã có đủ bằng chứng cho thấy phương pháp mới được phát triển
thích hợp cho các loài lợn và gà tây và huyết tương và huyết thanh ma trận. Do đó, các yếu tố
ma trận (I) và loài (II) được đưa vào như các yếu tố trong nghiên cứu xác nhận (Bảng 10). Trong ứng dụng
thông thường, dự kiến rằng các phân tích sau quy trình sẽ phải được thực hiện bởi
nhân sự quen thuộc và không quen thuộc với phương pháp. Do đó, một yếu tố "toán tử" cũng được bao gồm trong
nghiên cứu xác nhận (III). Lượng chất nền, tức là lượng mẫu mỗi lần phân tích (IV) cũng có thể thay đổi
vì có thể cần sử dụng lượng mẫu lớn hơn cho các mẫu chỉ chứa nồng độ thấp của chất phân tích cần quan tâm.
Nếu lượng mẫu lớn hơn được sử dụng, có thể cần
lọc dịch chiết cuối cùng để loại bỏ các hạt lơ lửng (VI) hoặc để sử dụng một thể tích dung môi lớn hơn cho
14

hoàn nguyên mẫu (VII) để bù đắp ảnh hưởng của chất nền. Thường thì nó không thể được đảm bảo
rằng dịch chiết mẫu được phân tích ngay sau quy trình chuẩn bị mẫu, như phép đo
công cụ có thể không có sẵn ngay lập tức. Do đó, thực hành tốt là bao gồm cả yếu tố tiếng ồn
“Lưu trữ phần chiết xuất cuối cùng” (V) với các mức yếu tố “không lưu trữ” và e. g. "Bảo quản 2-3 ngày ở +4 ° C" trong
nghiên cứu xác nhận phương pháp.
Bảng 10: Các yếu tố được chọn để nghiên cứu xác nhận phương pháp xác định nitroimidazol trong huyết tương và huyết thanh lợn và gà tây.
Hệ số Cấp độ A Cấp độ B
Tôi ma trận huyết tương huyết thanh
II
loài lợn Gà tây
3 nhà điều hành không quen Quen biết
IV lượng ma trận 2 g 1 g
V lưu trữ của chiết xuất cuối cùng 2-3 ngày bảo quản ở +4 ° C phân tích ngay lập tức
Lọc VI không ai 100 kDa
Tập cuối cùng của VII 250 µL 150 µL
4.2.3. Thử nghiệm xác thực
Sau khi tất cả các yếu tố và mức độ yếu tố đã được chọn, kế hoạch thử nghiệm có thể được tạo ra bằng cách
sử dụng mẫu EURL Excel hoặc một phần mềm có sẵn trên thị trường (một kế hoạch thiết kế chung là
cho trong Bảng 11). Mỗi dòng của bảng đại diện cho một thử nghiệm xác thực (“chạy”)
bao gồm sự kết hợp cụ thể của các cấp độ yếu tố. Lưu ý rằng mọi cấp độ yếu tố xuất hiện bốn lần
trong suốt tất cả các lần chạy. Điều này cho phép tính toán sự thay đổi trong khôi phục khi chuyển từ
mức nhân tố này với mức nhân tố khác. Thứ tự của các lần chạy thử nghiệm này được ngẫu nhiên hóa để giảm thiểu
ảnh hưởng của các hiệu ứng có thể có hệ thống. Ví dụ về một kế hoạch thử nghiệm cho một phương pháp xác nhận
để xác định nitroimidazol trong huyết tương và huyết thanh thịt lợn và gà tây được đưa ra trong Bảng 12.
Các thử nghiệm xác thực sẽ được thực hiện theo thứ tự ngẫu nhiên này, tức là trong các thử nghiệm ví dụ đã cho
sẽ bắt đầu với lần chạy 04 (chuỗi xác thực 1), sau đó sẽ là lần chạy 08 (chuỗi xác thực 2), chạy 01
(xác thực loạt 3), v.v. Đối với loạt bài phân tích đầu tiên của nghiên cứu xác nhận (chạy 04),
Các thí nghiệm sẽ được thực hiện trên 1 g huyết tương gà tây bởi một người điều hành quen thuộc với phương pháp này.
Các mẫu sẽ không được lọc và sẽ được hoàn nguyên trong 250 µL dung môi trước khi phân tích
ngay lập tức. Để có được một tập dữ liệu thực tế giải thích cho các sai lệch ngẫu nhiên và mang lại kết quả tốt hơn
đại diện cho độ chính xác trung gian của phòng thử nghiệm, không quá hai lần chạy mỗi tuần. Một lô ma trận khác phải
được sử dụng cho mỗi lần chạy.
15

Phiên bản 1.1, ngày 25 tháng 11 Phòng thí nghiệm tham chiếu
năm 2021 Tài liệu hướng dẫn EURL được hỗ trợ bởi
Bảng 11: Ví dụ về kế hoạch thiết kế thử nghiệm trực giao với 7 yếu tố (I - VII) khác nhau ở hai cấp độ (A / B) trong một nghiên
cứu xác nhận với tám lần chạy (kết hợp cấp độ nhân tố).
Hệ số Tôi II III IV TRONG CHÚNG TÔI VII
chạy 01 Một Một Một Một Một Một Một
chạy 02 Một Một B Một B B B
chạy 03 Một B Một B Một B B
chạy 04 Một B B B B Một Một
chạy 05 B Một Một B B Một B
chạy 06 B Một B B Một B Một
chạy 07 B B Một Một B B Một
chạy 08 B B B Một Một Một B
Bảng 12: Ví dụ về một kế hoạch thực nghiệm ngẫu nhiên cho một nghiên cứu xác nhận phương pháp để xác định nitroimidazoles
trong huyết tương và huyết thanh.
Chuỗi xác Chạy Ma trận Toán tử loài Số lượng ma trận Lưu trữ chiết xuất Lọc tập cuối cùng
thực
1 chạy 04 plasma Gà tây Quen biết 1 g phân tích ngay lập tức không
250 µL
2 chạy 08 huyết thanh Gà tây Quen biết 2 g 2-3 ngày bảo quản ở +4 ° C không 150 µL
3 chạy 01 plasma lợn không quen thuộc 2 g 2-3 ngày bảo quản ở +4 ° C không 250 µL
4 chạy 07 huyết thanh lợn gà không quen thuộc 2 g phân tích tức thì phân Vâng 250 µL
5 chạy 02 plasma tây lợn Quen biết 2 g tích ngay lập tức 2-3 Vâng 150 µL
6 chạy 06 huyết thanh Quen biết 1 ngày bảo quản ở +4 ° C có 2-3 ngày bảo 250 µL
7 chạy 03 plasma Gà tây g không quen thuộc 1 g quản ở +4 ° C có 150 µL
số 8 chạy 05 huyết thanh lợn không quen thuộc 1 g phân tích ngay lập tức không
150 µL
4.2.4. Nghiên cứu xác nhận và các mẫu
Nghiên cứu xác nhận bao gồm tám lần chạy theo kế hoạch thử nghiệm (xem Bảng 12 để làm ví dụ)
và các kết hợp mức yếu tố được đưa ra cho mỗi lần chạy cần phải được tuân thủ nghiêm ngặt. Trong thực tế, một vật liệu trống
được tăng cường đến các mức nồng độ mong muốn và được phân tích theo các điều kiện quy định cho mỗi lần chạy
trong kế hoạch thực nghiệm. Việc định lượng các mẫu xác nhận được thực hiện bằng cách sử dụng
đường cong hiệu chuẩn tiêu chuẩn, một ma trận (khác) hoặc đường cong hiệu chuẩn phù hợp với ma trận, hoặc một phần bổ sung tiêu chuẩn
cách tiếp cận. Cũng có thể sử dụng nhiều cách tiếp cận định lượng trong quá trình nghiên cứu xác nhận
và tìm ra cách tiếp cận phù hợp nhất cho các phép đo thường quy trong tương lai từ dữ liệu xác nhận. Trong
ngoài việc đánh giá định lượng, việc đáp ứng các tiêu chí xác định (số lượng bắt buộc của
các điểm nhận dạng cho các phương pháp xác nhận như đã nêu trong Phụ lục I về Ủy ban Thực hiện
Quy định (EU) 2021/808) phải được đánh giá cho từng cấp độ củng cố trong mỗi lần chạy.
Các ma trận (trống) khác nhau nên được sử dụng cho mỗi lần chạy. Ngoài ra, ma trận được sử dụng cho ma trận hoặc ma trận
hiệu chuẩn phù hợp (nếu có) cần phải khác với mẫu nền được sử dụng cho lần chạy của ngày hôm đó. Nếu
Các lô vật liệu trắng khác nhau không dễ dàng mua được, có thể sử dụng một lô duy nhất cho tất cả
16

các hiệu chuẩn ma trận cần thiết trong một nghiên cứu xác nhận. Điều này có nghĩa là từ 9 đến 16 lô khác nhau
được yêu cầu cho tổng số nghiên cứu xác nhận. Bộ mẫu kiểm tra chất lượng thông thường cho mỗi lần chạy cũng là
khuyến khích. Chúng có thể được sử dụng thuận tiện để đánh giá tính cụ thể và hiệu ứng ma trận (tương đối).
Hướng dẫn về các mẫu QC có thể được tìm thấy trong “Hướng dẫn về Hiệu suất Phương pháp Đang thực hiện
Xác minh".
Bảng 13 minh họa lượng mẫu tối thiểu cho một lần chạy thử nghiệm. Trong tám lần chạy, tổng số lượng mẫu tối
thiểu sẽ là 104 (144). Độ lặp lại có nguồn gốc từ các
mức độ tập trung của mỗi lần chạy thử nghiệm và không cần thực hiện thêm các thí nghiệm khác. Các
Tuy nhiên, kế hoạch thí nghiệm không bao gồm các thí nghiệm về độ ổn định. Do đó, sự ổn định phải được
được đánh giá trong một nghiên cứu bổ sung tuân theo các yêu cầu nêu trong phần 2.5, Phụ lục I của Quy định
Thực hiện của Ủy ban (EU) 2021/808.
17

Bảng 13: Các thử nghiệm cần thiết cho một lần chạy phương pháp tiếp cận mẫu để xác nhận hoàn toàn theo cách tiếp cận xác nhận thay thế.
Các mẫu bắt buộc tối thiểu cho một lần chạy (một loạt xác thực) # Mẫu Đặc tính hiệu suất
5 phân số từ 1 lô, được tăng cường trước khi chiết xuất ở 5 cấp độ khác nhau # 5 đường cong hiệu chuẩn ma trận
5 giải pháp tiêu chuẩn # (5) đường chuẩn hiệu chuẩn
5 phân số từ 1 lô, được tăng cường trước khi chiết xuất ở 5 cấp độ khác nhau # 5 khả năng tái tạo trong phòng thí nghiệm, độ lặp lại, độ chân thực, CCα, (CCβ ‡ ), độ phục
hồi tuyệt đối *, độ chắc chắn
1 mẫu trắng ma trận ** 1 tính đặc hiệu / tính chọn lọc
1 mẫu trắng nền được tăng cường (các) chất chuẩn nội 1 tính đặc hiệu / tính chọn lọc
1 mẫu trắng nền được tăng cường (các) chất phân tích và (các) chất chuẩn nội ở mức liên quan 1 hiệu ứng ma trận tương đối ***
Tổng cộng
13 (18)
#
bao gồm một mức trống, nếu có
‡ Chỉ phù hợp với các phương pháp sàng lọc định lượng (bán phần).
* Chỉ cần thiết khi không sử dụng chất chuẩn nội hoặc không sử dụng đường chuẩn tăng cường chất nền.
** Chỉ cần thiết nếu không có cấp độ trống nào được bao gồm trong các cấp độ củng cố (dòng ở trên)
***
Các thí nghiệm bổ sung có thể là cần thiết để đáp ứng các yêu cầu của Quy định thực hiện của Ủy ban 2021/808 dự đoán việc điều tra hiệu ứng ma trận trên 20 mẫu trắng
mẫu.
18

4.2.5. Tính toán tham số
Thông tin chi tiết về việc tính toán các thông số có thể được tìm thấy trong:
Jülicher, B., Gowik, P. và Uhlig, S. (1998) Đánh giá các phương pháp phát hiện trong phân tích dấu vết bằng các phương tiện
của một khái niệm xác thực nội bộ dựa trên thống kê. Chuyên viên phân tích, 123, 173.
Gowik, P., Jülicher, B. và Uhlig, S. (1998) Phương pháp đa dư lượng để chống viêm không steroid
thuốc trong huyết tương sử dụng phát hiện mảng sắc ký lỏng-quang đi-ốt hiệu suất cao. Phương pháp
mô tả và xác nhận nội bộ toàn diện. J. Chromatogr., 716, 221.
Jülicher, B., Gowik, P. và Uhlig, S. (1999) Một phương pháp tiếp cận dựa trên xác thực nội bộ từ trên xuống cho
khảo sát độ không đảm bảo đo bằng thực nghiệm giai thừa phân số. Chuyên viên phân tích, 124, 537.
4.2.6. Giải thích kết quả
Đánh giá đồ họa
Màn hình đồ họa của kết quả thu được cho các mức nồng độ trong mỗi lần chạy có thể hữu ích
trong việc xác định trực quan các lần chạy với hiệu suất khác nhau đáng kể. Hơn nữa, nó được khuyến khích
tạo sơ đồ cho tất cả các yếu tố khác nhau và sử dụng các màu khác nhau cho các lần chạy với hệ số khác nhau
mức độ (Hình 1). Điều này có thể giúp nhận thấy xu hướng trong kết quả do các yếu tố riêng lẻ gây ra. Nữa
biểu đồ thuận tiện để có được ấn tượng đầu tiên về kết quả xác thực là hiển thị tất cả các thử nghiệm
kết quả cùng với đường chuẩn trung bình và khoảng thời gian dự đoán. Biểu đồ như vậy cho phép
xác định trực tiếp các ngoại lệ. Một ví dụ về đánh giá đồ họa bao gồm các phép đo, chạy
các chức năng hiệu chuẩn và các chức năng hiệu chuẩn tổng thể cũng như khoảng thời gian dự đoán được đưa ra trong Hình
2. Đối với ví dụ này, tất cả các mức hiệu chuẩn đã được bao gồm trong tính toán, không có việc loại bỏ
những ngoại lệ.
19

Hình 1: Biểu đồ hộp hiển thị kết quả đo metronidazole (MNZ) thu được trong các lần chạy sử dụng mẫu huyết tương (xanh lam) và mẫu
huyết thanh (đỏ) so với mức nồng độ tăng cường (tính bằng µg / kg). Kết quả
giữa huyết tương và huyết thanh không có sự khác biệt đáng kể.
1.400
1.200
1.000
0,800
0,600
0,400
0,200
0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1 1,1 1,2
Nồng độ
Chạy 04 Lượt chạy 08 Lượt chạy 01 Lượt chạy 07 Lượt chạy 02 Lượt chạy 06 Lượt chạy 03 Lượt chạy 05
Hình 2: Đường cong hiệu chuẩn thu được cho các lần chạy thử nghiệm khác nhau đối với metronidazole (MNZ) được tăng cường trong huyết
tương và huyết thanh trong một nghiên cứu xác nhận giai thừa được đưa ra là µg / kg. Khoảng dự đoán của các đường cong được cho bằng màu
xanh lam đậm.
20

Phiên bản 1.1, ngày 25 tháng 11 năm
2021 Tài liệu hướng dẫn EURL về xác
Khả năng phục hồi, độ lặp lại và khả năng tái tạo nội bộ
Các tiêu chí chấp nhận cho các dữ liệu này phải được đánh giá riêng biệt cho mọi chất phân tích. Cho một
tổng quan về các tiêu chí để áp dụng, tham khảo các bài viết tương ứng trong Quy chế thực hiện của Ủy ban
(Liên minh Châu Âu) 2021/808. Dữ liệu hiệu suất của phương pháp làm ví dụ để xác định metronidazol (MNZ) trong
huyết tương và huyết thanh được đưa ra trong Bảng 14. Tất cả các yêu cầu liên quan đến các thông số hiệu suất là
hoàn thành.
Bảng 14: Dữ liệu hiệu suất của phương pháp làm ví dụ thu được để xác nhận MNZ trong huyết tương và huyết thanh.
Phân tích Khoảng thời gian Số lượng Độ phục hồi CCα [%] ở Rel sR [%]
hiệu chuẩn giá trị CCα tại CCα
Bộ Y Tế 0,050 - 1.200 48 0,072 107,0 10,7
Chức năng công suất và giới hạn quyết định CCα
Các gói phần mềm thống kê có thể đưa ra phép tính cái gọi là hàm công suất được tạo ra bằng cách vẽ biểu đồ xác
suất lỗi 1-β so với nồng độ. Độ dốc của hàm công suất phụ thuộc
về sự phân tán được xác định, các giới hạn được đặt ra trong Quy định Thực hiện của Ủy ban
(EU) 2021/808 và loại phương pháp (sàng lọc / xác nhận) cho mỗi chất phân tích đã chọn. Giả sử bình thường
phân phối, CCα nằm ở khoảng 50% xác suất lỗi β. Độ dốc của hàm lũy thừa càng lớn thì phương pháp này càng tốt.
21

1,00
0,90
0,80
0,70
0,60
0,50
0,40
0,30
0,20
0,10
0,00
0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1 1,1
Nồng độ
Hình 3: Chức năng công suất để xác định metronidazole (MNZ) trong huyết tương và huyết thanh. Nồng độ được tính bằng
µg / kg.
Hiệu ứng yếu tố và sự không chắc chắn
Đối với mọi yếu tố, độ lệch tỷ lệ và độ lệch không đổi giữa các mức yếu tố có thể là
được tính toán từ mô hình thống kê cơ bản. Từ những dữ liệu này, đóng góp của từng ảnh hưởng
hệ số của tổng độ không đảm bảo có thể được ước tính. Độ lệch tỷ lệ (tức là độ dốc của đường cong)
biểu thị độ lệch trung bình của độ dốc của đường chuẩn tương ứng so với giá trị trung bình tổng thể.
Độ lệch không đổi (tức là vị trí của đường cong) biểu thị độ lệch trung bình của mức.
Ví dụ về độ lệch được đưa ra trong các tài liệu tham khảo được trích dẫn trong 4.2.5. Một ví dụ thực tế cũng
được trình bày trong Bảng 15. Ở đây, đối với cấp nhân tố “toán tử không quen thuộc” của nhân tố “toán tử” tỷ lệ
độ lệch là -2,56%, có nghĩa là độ dốc trung bình cho mức yếu tố này thấp hơn 2,56% so với tổng thể
độ dốc và sự khác biệt đối với cấp nhân tố “toán tử quen thuộc” là 5,12%.
22

Bảng 15: Hiệu ứng yếu tố đối với MNZ của chất phân tích được tính toán cho phương pháp xác định nitroimidazol trong huyết
tương và huyết thanh.
Hệ số Mức độ Độ lệch tỷ lệ Độ lệch

liên tục
ma trận huyết tương (+); huyết thanh 0,13 0,28
loài (-) gà tây (+); lợn(-) 1.13 0,98
nhà điều hành không quen (+); Quen biết(-) -2,56 -1,18
số lượng ma trận 2g (+); 1g (-) 0,98 0,13
lưu trữ chiết xuất phân tích trực tiếp (+); 2-3 ngày lưu trữ (-) -0,23 -0.01
lọc có (+); không(-) -2,25 -2,04
âm lượng 200 uL khối lượng cuối cùng (+); Khối lượng cuối cùng 120 uL (-) 2,33 2,24
Những hiệu ứng giai thừa này góp phần đáng kể vào độ không đảm bảo đo toàn bộ. Tuy nhiên, nếu các giá trị của
nồng độ tới hạn tính toán (CC) được chấp nhận, không cần thiết phải thực hiện phương pháp riêng biệt
xác nhận cho các yếu tố riêng biệt (e. g. ma trận). Thường có thể chấp nhận hiệu ứng giai thừa lên đến 10%.
Nếu việc đánh giá dữ liệu dẫn đến kết luận rằng các mức yếu tố khác nhau đáng kể,
nó cần được xem xét lại liệu điều này bắt nguồn từ một sai lệch có hệ thống hay ngẫu nhiên. Để chống lại
sai lệch hệ thống, các thông số kỹ thuật bổ sung có thể được thêm vào trong phần mô tả phương pháp (ví dụ: một hệ số
có thể được cố định ở một mức). Tuy nhiên, độ lệch ngẫu nhiên phải được chấp nhận. Nếu độ lệch trên 20% đến
30% được tính toán, có thể cần phải loại trừ yếu tố khỏi xác thực hoặc tìm đối số
ủng hộ một sự bao gồm. Ngoài ra, luôn có thể xác nhận các mức yếu tố một cách riêng biệt. Trong này
trường hợp các thí nghiệm bổ sung được yêu cầu.
Trong Hình 4, tổng quan về các độ không đảm bảo đóng góp vào tổng độ không đảm bảo của việc xác định
metronidazole (MNZ) trong huyết tương và huyết thanh được đưa ra. Ngoại trừ độ không đảm bảo đo của dung dịch tiêu chuẩn tương đối
được cố định ở mức 3 % 23, tất cả các độ không đảm bảo được ước tính từ dữ liệu chạy thử nghiệm. Nói chung,
Độ không đảm bảo đo độ lặp lại có ảnh hưởng lớn nhất đến độ không đảm bảo đo tổng trong khi độ không đảm
bảo đo của hiệu chỉnh phục hồi, dung dịch tiêu chuẩn và độ không đảm bảo đo chạy có ảnh hưởng nhỏ. Ở mức CCα,
độ không đảm bảo đo ma trận và độ không đảm bảo đo độ lặp lại có tác động lớn nhất. Tổng độ không đảm bảo là
được tính toán bằng cách kết hợp tất cả các đóng góp của độ không đảm bảo đo bằng cách sử dụng luật lan truyền của
những điều không chắc chắn:
( ) = √ ( )2 + () 2
+ ( )2 + ( )2 + ( )2
23 Được xác định từ đánh giá độ không đảm bảo đo từ dưới lên để chuẩn bị các dung dịch pha loãng theo thực hành của EURL
Berlin.
23

13,0
Đường sắt. thảm
12,0 đường sắt. Đường
sắt chạy. lặp lại

Rails. un Rails.
11,0
gian hàng đường
sắt. toàn bộ
10,0
9,0
8,0
7,0
6,0
5,0
4,0
3,0
2,0
1,0
0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1 1,1
Nồng độ
Rel. ma trận không chắc chắn

Rel. chạy không chắc chắn
Rel. độ không đảm bảo lặp lại
Rel. sự không chắc chắn của hiệu chỉnh phục hồi
Rel. giải pháp tiêu chuẩn không chắc chắn
Rel. hoàn toàn không chắc chắn
Hình 4: Những đóng góp vào tổng độ không đảm bảo khi xác định metronidazole (MNZ) trong huyết tương và huyết thanh.
Tổng độ không đảm bảo đo
Theo Quy định Thực hiện của Ủy ban (EU) 2021/808, khả năng tái tạo trong phòng thí nghiệm
và độ đúng cần được xem xét đối với tổng độ không đảm bảo đo. Mặc dù các cách tiếp cận
để bao gồm cả hai khía cạnh đã được đề xuất24, không có khái niệm được chấp nhận chung. Từ
các nghiên cứu xác nhận phương pháp thường được thực hiện trên vật liệu nền trắng được gia cố, tính đúng của phương pháp
góp phần vào độ không đảm bảo đo tổng theo thiết kế. Khả năng tái tạo trong phòng thí nghiệm có thể
do đó, được coi là một ước lượng tốt về tổng độ không đảm bảo đo nếu tất cả các yếu tố liên quan là
được tính đến trong quá trình nghiên cứu xác nhận.
4.2.7. Dịch vụ EURL

0,8 0,9 1 1,1
sự Việc sử dụng phần mềm thương mại có sẵn cho phương pháp xác nhận thay thế có thể không phù hợp với mọi phòng thí nghiệm,
đặc biệt nếu phương pháp xác nhận thông thường cho đến nay được sử dụng riêng.
Do đó, EURL Berlin cung cấp cho NRLs một công cụ để lập kế hoạch cho các nghiên cứu xác nhận giai thừa.
24
Magnusson và Elisson (2008), Hậu môn. Bioanal. Chèm. 390, 201-213.
24

Các phòng thí nghiệm có thể chọn các yếu tố và mức độ yếu tố cho nghiên cứu xác nhận của họ với sự tham vấn của
EURL, nếu được yêu cầu, và thiết lập kế hoạch thử nghiệm của họ bằng cách sử dụng một mẫu. Sau khi hoàn thành
thử nghiệm, NRLs có thể gửi kết quả phân tích của họ cho EURL Berlin khi cần thiết
tính toán sẽ được thực hiện bằng phần mềm thống kê. Cuối cùng, NRLs sẽ được cung cấp một chi tiết
báo cáo thẩm định cho từng chất phân tích có trong phương pháp. Việc sử dụng dịch vụ này là tự nguyện và được cung cấp
miễn phí.
5. Tập thể dục có mục đích
Bất kể phương pháp xác nhận nào đã được sử dụng, cần phải đánh giá kết quả của
nghiên cứu xác nhận tính phù hợp của phương pháp cho mục đích và giải quyết tất cả các khía cạnh liên quan trong quá trình xác nhận
báo cáo. Các tiêu chí chấp nhận để đánh giá liệu một phương pháp có thể được xem xét một cách đầy đủ hay không
có giá trị đối với một chất nhất định được cho trong Bảng 16.
Nếu bất kỳ tiêu chí nào trong số này không được đáp ứng đối với một chất thì phương pháp đó không phù hợp với mục đích đã định. Các
hậu quả sẽ là
- để xác định khả năng áp dụng của phương pháp cho phù hợp (ví dụ: chỉ áp dụng cho định lượng
xác định 3 trong số 4 chất dự định ban đầu)
- để xác định phương pháp cho một mục đích khác (ví dụ: chỉ sàng lọc định tính) nếu dữ liệu được yêu cầu
có sẵn
- để tiếp tục phát triển phương thức, sau đó là một nỗ lực khác để xác thực phương thức.
Trong trường hợp dữ liệu xác nhận ngụ ý rằng một phương pháp phân tích không đáp ứng tất cả các yêu cầu đối với
phương pháp xác nhận định lượng được nêu trong Quy định thực hiện của Ủy ban (EU) 2021/808, phương pháp này
vẫn có thể được áp dụng như một phương pháp xác nhận định tính (đối với chất A).
Bảng 16: Đặc điểm hoạt động và tiêu chí chấp nhận tương ứng.
Đặc tính hiệu suất Tiêu chí chấp nhận
Nhận biết Có đủ số lượng điểm nhận dạng cho kỹ thuật đo được áp dụng, các yêu cầu về tách sắc ký,
phát hiện khối phổ hoặc các yêu cầu khác; xem 1.2.3, 1.2.4 và 1.2.5., Phụ lục của Quy định
thực hiện của Ủy ban (EU) 2021/808,
CCα Tiêu chí định tính
-các chất được ủy quyền: cao hơn nhưng gần bằng MRL / ML như
có thể đạt được về mặt phân tích
-các chất bị cấm / trái phép với RPA: thấp hơn hoặc bằng
RPA
-các chất bị cấm / trái phép mà không có RPA: thấp bằng phân tích
có thể đạt được
CCβ ‡ Tiêu chí định tính
-các chất được ủy quyền: thấp hơn hoặc bằng các chất bị cấm / trái
phép MRL / ML với RPA: thấp hơn hoặc bằng
RPA
-các chất bị cấm / trái phép mà không có RPA: thấp bằng phân tích
có thể đạt được
25

Phiên bản 1.1, ngày 25 tháng 11 Phòng thí nghiệm tham chiếu
năm 2021 Tài liệu hướng dẫn EURL được hỗ trợ bởi
Sự thật Nồng độ phụ thuộc, xem 1.2.2.1, Phụ lục của Quy định thực hiện của Ủy ban (EU) 2021/808
Độ chính xác Nồng độ phụ thuộc, xem 1.2.2.2, Phụ lục của Quy định thực hiện của Ủy ban (EU) 2021/808
Hiệu ứng ma trận tương đối Xem 2.10, Phụ lục của Quy định Thực hiện của Ủy ban (EU) 2021/808
Phục hồi tuyệt đối Không có tiêu chí cố định. Các kết quả cho tham số phải được đánh giá bằng kiến thức chuyên môn.
Nhà khoa học chịu trách nhiệm phải xác định các khía cạnh quan trọng có thể yêu cầu cải tiến phương
pháp.
Tính đặc hiệu / tính chọn lọc Không có tiêu chí cố định. Các kết quả cho tham số phải được đánh giá bằng kiến thức chuyên môn.
pháp.
Sự ổn định Xem 2.5, Phụ lục của Quy định Thực hiện của Ủy ban (EU) 2021/808, các thử nghiệm về độ ổn định
không được bao gồm trong các kế hoạch xác nhận mẫu được đưa ra trong hướng dẫn này
Độ chắc chắn Không có tiêu chí cố định. Các kết quả cho tham số phải được đánh giá bằng kiến thức chuyên môn.
pháp.
‡ Chỉ phù hợp với các phương pháp sàng lọc định lượng (bán phần).
26

Phụ lục
Phụ lục này cung cấp một cái nhìn tổng quan về những khác biệt chính giữa Quy chế Thực hiện của Ủy ban
(EU) 2021/808 (phiên bản ngày 22 tháng 3 năm 2021) và Quyết định của Ủy ban (EU) 2002/657 về các vấn đề đặc biệt
để xác nhận (tái) các phương pháp phân tích. Do số lượng thay đổi và phạm vi cũng như độ phức tạp
của các chủ đề được quy định trong các văn bản pháp luật, phụ lục này không thể cung cấp một danh sách đầy đủ các sửa đổi. Vì
chi tiết, luôn luôn tham khảo các văn bản pháp luật. Bản tóm tắt những thay đổi có liên quan nhất được đưa ra trong Bảng
17, sự khác biệt được thảo luận cụ thể hơn trong các đoạn sau.
Bảng 17: Tổng quan về những thay đổi trong các yêu cầu đối với đặc tính hiệu suất của phương pháp từ CD 2002/657 đến CIR 2021/808.
Đặc tính hiệu suất Những thay đổi từ CD 2002/657 thành CIR 2021/808
Nhận biết Thay đổi khái niệm cho các điểm nhận dạng
Sắc ký Các yêu cầu chung về xác nhận vẫn như cũ, các yêu cầu về nhận dạng đã được điều chỉnh
Đường cong hiệu chuẩn Không có thay đổi trong các yêu cầu
Mức / phạm vi nồng độ Các cấp độ / phạm vi cần được xác thực đã được sửa đổi
Độ chính xác Các hệ số biến thiên có thể chấp nhận được đã được sửa đổi
Sự thật Khoảng chấp nhận được đối với phần khối lượng chất phân tích> 1 µg / kg đã được sửa đổi
Độ không đảm bảo đo Không được đề cập rõ ràng trong CD 2002/657
Hiệu ứng ma trận tương đối Không được đề cập rõ ràng trong CD 2002/657
Phục hồi tuyệt đối Trước đây được gọi là "phục hồi"
Tính đặc hiệu / tính chọn lọc Không có thay đổi trong các yêu cầu
Độ chắc chắn Không có thay đổi về yêu cầu, nhưng thông tin được cung cấp chi tiết hơn trong
CD 2002/657
CCα Phương pháp tính toán bổ sung
CCβ Thay đổi khái niệm về CCβ
Sự ổn định Không thay đổi yêu cầu
Tiêu chí nhận dạng

Trong CIR 2021/808, một khái niệm mới cho các điểm nhận dạng được giới thiệu, khái niệm này cũng quy cho một điểm
kỹ thuật tách được áp dụng (Bảng 18).
27

Phiên bản 1.1, ngày 25 tháng 11 năm 2021 Phòng thí nghiệm tham
Tài liệu hướng dẫn EURL về xác thực chiếu được hỗ trợ bởi
phương pháp xác nhận
Bảng 18: Điểm nhận dạng theo CD 2002/657 và CIR 2021/808.
Kĩ thuật Điểm nhận dạng 2002/657 Điểm nhận dạng 2021/808
Tách (GC, LC, SFC, CE) 1,0
Ion LR-MS 1,0 1,0
Ion tiền thân 1,0 1,0 (gián tiếp, lựa chọn ở phạm vi khối
lượng <± 0,5 Da)
Ion sản phẩm LR-MSn 1,5 1,5
Ion HR-MS 2.0 1,5
Ion sản phẩm HR-MSn 2,5 2,5
Sắc ký Các yêu

cầu chung cần được tôn trọng để xác nhận vẫn được giữ nguyên. Tuy nhiên,
các yêu cầu cụ thể để xác định chất phân tích (ví dụ thời gian lưu tương đối tối đa cho phép,
độ lệch tỷ lệ ion tối đa cho phép) đã được điều chỉnh và cần được đánh giá cho các phương pháp
trước đây đã được xác nhận theo CD 2002/657 (xem bên dưới). Hơn nữa, theo CIR 2021/808 HPLC-DAD
và các phương pháp HPLC-FLD chỉ có thể được sử dụng làm phương pháp xác nhận cho các chất được phép và
không được coi là thích hợp để sử dụng như các phương pháp xác nhận trái phép hoặc bị cấm
vật liệu xây dựng.
Thời gian lưu
Cả CD 2002/657 và CIR 2021/808 đều yêu cầu thời gian lưu giữ tối thiểu cho GC và LC là hai
nhân với khối lượng rỗng. Hơn nữa, theo CIR 2021/808, độ lệch của chất phân tích
thời gian lưu trong dịch chiết ± 0,1 phút so với thời gian lưu của chất phân tích trong hiệu chuẩn
giải pháp được cho phép. Đối với sắc ký nhanh với thời gian lưu của chất phân tích <2,0 phút, độ lệch
<5% là chấp nhận được. Các tiêu chí này trước đây chưa được đưa vào CD 2002/657.
Về thời gian lưu tương đối (thương số của thời gian lưu của chất phân tích và chất nội
tiêu chuẩn), độ lệch cho phép đối với GC được đưa ra là ± 5% trong CD 2002/657 và CIR 2021/808. Các
sai lệch chấp nhận được của thời gian lưu tương đối đã được điều chỉnh cho LC từ ± 2,5%
(CD 2002/657) đến ± 1,0% (CIR 2021/808).
Cường độ ion tương đối
Quyết định của Ủy ban 2002/657 liệt kê dung sai tối đa được phép đối với cường độ ion tương đối trong
mẫu so với hiệu chuẩn cho các kỹ thuật khối phổ khác nhau. Trong hoa hồng
Thực hiện Quy định 2021/808, điều này đã được thay thế bằng một yêu cầu chung rằng sự khác biệt
ở cường độ tương đối không được vượt quá ± 40%.
Mức / phạm vi nồng độ

Các mức nồng độ cần được điều tra trong một nghiên cứu xác nhận đã được sửa đổi cho
CIR 2021/808 (Bảng 19). Điều này một phần là do khái niệm giới hạn hiệu suất yêu cầu tối thiểu (MRPL) không còn được áp dụng
nữa. Ngoài ra, một giới hạn pháp lý mới, điểm tham chiếu cho hành động
28

(RPA), và một yêu cầu kỹ thuật tối thiểu mới, yêu cầu hiệu suất phương pháp tối thiểu
(MMPR), đã được thành lập trong thời gian chờ đợi. Đối với các hợp chất trái phép không có RPA
đã được thiết lập khái niệm về mức hiệu chuẩn thấp nhất (LCL) đã được đưa ra. Trong trường hợp
xác nhận được thực hiện bằng cách sử dụng phương pháp giai thừa, các mức nồng độ cho trong Bảng 19 phải là
được bao phủ bởi dải nồng độ đã được xác nhận.
Bảng 19: Các mức nồng độ được xác nhận đối với các đặc tính hiệu suất khác nhau theo CD 2002/657 và CIR 2021/808.
Giới hạn pháp lý CD 2002/657 CIR 2021/808
MRL / ML 0,5, 1,0, 1,5 MRL / ML 0,1 (0,5) 25 , 1,0, 1,5 MRL / ML
MRPL 1.0, 1.5, 2.0 MRPL Khái niệm MRPL đã bị thu hồi
RPA26 0,5 (1,0) 27, 1,0, 1,5 RPA
MMPR28 Khái niệm lần đầu tiên được giới thiệu trong Các phương pháp phân tích cần được xác nhận dưới MMPR,
CIR 2021/808 mức độ bổ sung có thể tương tự như đối với các hợp chất
RPA
Hợp chất trái phép 1.0, 2.0, 3.0 LCL
Độ chính xác
Khả năng tái lập

Nói chung, độ tái lập đối với việc phân tích lặp lại chất chuẩn hoặc chất tăng cường, không nên
vượt quá độ lệch chuẩn HORWITZ tương ứng với phần khối lượng chất phân tích. Vì phương trình có thể cho giá trị rất
cao đối với nồng độ thấp, độ tái lập chấp nhận được đã được điều chỉnh dựa trên
trên chức năng HORWITZ cho cả CD 2002/657 và CIR 2021/808, nhưng vẫn phụ thuộc vào chất phân tích
phần khối lượng. Phạm vi của các phần khối lượng, cũng như độ tái lập có thể chấp nhận được đã được sửa đổi
cho CIR 2021/808 (Bảng 20) nhưng phần lớn các phương pháp đã được xác thực theo CD 2002/657
nên hoàn thành các tiêu chí mới.
25 Trong trường hợp không thể đạt được 0,1 MRL / ML một cách hợp lý, mức này có thể được thay thế bằng nồng độ
hợp lý thấp nhất có thể đạt được giữa 0,1 và 0,5 MRL / ML.
26 Các mức nồng độ cho các chất RPA được hiểu là các mức nồng độ mẫu.
Các phương pháp phân tích để xác nhận các chất mà RPA đã được thiết lập phải được xác nhận ở nồng độ thấp nhất có
thể đạt được một cách hợp lý.
27 Trong trường hợp không thể đạt được 0,5 RPA một cách hợp lý, mức này có thể được thay thế bằng nồng độ hợp lý thấp
nhất có thể đạt được giữa 0,5 và 1,0 RPA.
28
Các chất phân tích mà MMPR đã được thiết lập có thể được xác nhận tương tự với các hợp chất trái phép
như đã cho trong bảng.
29

Bảng 20: Hệ số biến thiên cho phép trên mỗi phần khối lượng chất phân tích phù hợp với CD 2002/657 và CIR 2021/808.
CD 2002/657 CIR 2021/808
Phần khối lượng Độ tái lập CV (%) Phần khối lượng CV tái lập (%)
1 µg / kg Chậm nhất có thể <10 µg / kg 30 (hướng dẫn), càng thấp

càng tốt
10 µg / kg Chậm nhất có thể 10-120 µg / kg 25 (hướng dẫn), càng thấp

càng tốt
100 µg / kg 23 > 120 µg / kg đến 1000 µg / kg 22
1000 µg / kg 16 > 1000 µg / kg 16
Độ lặp lại
Về độ lặp lại, không có yêu cầu nghiêm ngặt nào được đưa ra trong CD 2002/657. Nó chỉ được lưu ý rằng
độ lặp lại thường phải lớn bằng một phần ba đến hai phần ba giá trị cho
độ tái lập (Bảng 20). Trong CIR 2021/808, có quy định rằng độ lặp lại không được lớn hơn 2/3 hệ số biến thiên được
đề xuất cho độ tái lập. Do đó, phần lớn các phương pháp
trước đây đã được xác nhận theo CD 2002/657 nên đáp ứng các yêu cầu mới về độ lặp lại.
Vì độ lặp lại không cần thiết để xác định các nồng độ tới hạn nên ý nghĩa của nó là
một tham số phương thức hiện đang được thảo luận.
Khả năng tái tạo trong phòng thí nghiệm

Theo CD 2002/657, khả năng tái tạo trong phòng thí nghiệm đối với các chất mà hợp pháp
giới hạn đã được thiết lập không được vượt quá các giá trị đã cho đối với độ tái lập ở mức 0,5 lần giá trị pháp lý
giới hạn. Đối với các phương pháp đã được xác nhận phù hợp với CIR 2021/808, độ tái lập trong phòng thí nghiệm phải
không vượt quá các giá trị cho trong Bảng 20.
Sự thật
Các yêu cầu tối thiểu về tính đúng của các phương pháp định lượng đã được điều chỉnh trong
CIR 2021/808 (Bảng 21). Bất kỳ phương pháp nào đã được xác thực trước đó phù hợp với các yêu cầu của
CD 2002/657 đáp ứng các yêu cầu cập nhật. Lý tưởng nhất nên đánh giá độ đúng bằng cách phân tích lặp lại chất chuẩn
đã được chứng nhận. Nếu không có sẵn CRM phù hợp, các tài liệu khác, e. g. từ liên
Các nghiên cứu trong phòng thí nghiệm hoặc tăng cường vật liệu trắng có thể được sử dụng cho các nghiên cứu phục hồi. Đối với sau này, 18
phân số được củng cố ở ba mức nồng độ (6x3). Lưu ý rằng các mức nồng độ yêu cầu đã thay đổi (Bảng 19).
Bảng 21: Yêu cầu tối thiểu về tính đúng của các phương pháp định lượng theo CD 2002/657 và CIR 2021/808.
Phần khối lượng Dải CD 2002/657 Phạm vi CIR 2021/808
≤ 1 µg / kg -50% đến +20% -50% đến +20%
> 1 µg / kg đến 10 µg / kg -30% đến +10% -30% đến +20%
≥ 10 µg / kg -20% đến +10% -20% đến +20%
30

Độ không đảm bảo đo

Việc ước lượng độ không đảm bảo đo không phải là yêu cầu của CD 202/657. Cân nhắc
dựa trên việc suy ra độ không đảm bảo đo tổng liên quan của phương pháp phân tích được đưa ra trong
phần 4.1.1 và 4.2.6 của tài liệu này.
Hiệu ứng ma trận
Theo CIR 2021/808, bắt buộc phải đánh giá hiệu ứng ma trận tương đối của bất kỳ định lượng nào
phương pháp xác nhận hoặc sàng lọc nếu nó chưa được xác định là một phần của nghiên cứu xác nhận hoặc
các thí nghiệm sơ bộ. Vì đây không phải là yêu cầu trực tiếp của CD 2002/657 nên hiệu ứng ma trận tương đối
phải được đánh giá để xác nhận lại. Nếu có thể thu thập đủ dữ liệu về hiệu ứng ma trận tương đối từ các phân tích trước
đó được thực hiện bằng phương pháp được đề cập (ví dụ: dữ liệu từ các mẫu kiểm soát chất lượng),
chúng có thể được đề cập đến. Một nghiên cứu thử nghiệm mới là cần thiết khi bản thân phương pháp đã thay đổi,
Tuy nhiên.
Phục hồi tuyệt đối

Theo CD 2002/657, chỉ yêu cầu đánh giá độ thu hồi của phương pháp phân tích,
khôi phục không được yêu cầu rõ ràng. Với CIR 2021/808, sự phục hồi tuyệt đối sẽ được xác định cho
tất cả các phương pháp xác nhận hoặc sàng lọc định lượng không sử dụng hiệu chuẩn tăng cường chất nền hoặc
tiêu chuẩn nội bộ. Nếu không có sẵn các nghiên cứu như vậy, thì các thử nghiệm này cần được đưa vào
nghiên cứu xác nhận lại.
Độ chắc chắn
Nói chung, các yêu cầu vẫn giống hệt nhau. Tuy nhiên, chúng đã được cung cấp chi tiết hơn trong
CD 2002/657. Một cuộc điều tra về độ chắc chắn được bao gồm trong cách tiếp cận xác nhận thay thế và một
ví dụ về cách tiếp cận xác nhận thông thường được đưa ra trong tài liệu hướng dẫn về xác nhận
phương pháp xác nhận. Ngoài ra, các mẫu để bố trí các nghiên cứu về độ chắc chắn có sẵn từ
EURL theo yêu cầu.
Nồng độ tới hạn
Giới hạn quyết định CCα đối với các chất trái phép và bị cấm
Phương pháp 1 và 2 để tính CCα được đưa ra trong CIR 2021/808 giống với các phương pháp được đưa ra trong
CD 2002/657. Phương pháp tính toán 3 mới được thêm vào cung cấp cách tiếp cận dựa trên thống kê cho
tính toán giới hạn quyết định. Lưu ý rằng việc áp dụng phương pháp 2 chỉ phù hợp để phân tích
các phương pháp được xác thực trước khi CIR 2021/808 có hiệu lực và chỉ có thể được tham chiếu cho đến khi
Ngày 1 tháng 1 năm 2026. Đối với tất cả các phương pháp phân tích được xác thực sau khi CIR 2021/808 có hiệu lực,
phương pháp 2 có thể không được áp dụng.
Giới hạn quyết định CCα đối với các chất được phép
Phương pháp 1 để tính CCα được đưa ra trong CIR 2021/808 giống với phương pháp 1 được đưa ra trong CD 2002/657.
Phương pháp 2 đã được thay thế bằng cách tiếp cận dựa trên thống kê để tính toán giới hạn quyết định.
31

Khả năng phát hiện CCβ

Về khả năng phát hiện, khái niệm đã được sửa đổi. Với CIR 2021/808 mới, nó không
còn cần thiết để xác định CCβ cho các phương pháp xác nhận vì kể từ bây giờ tham số này chỉ là
được sử dụng để đánh giá hiệu quả của các phương pháp sàng lọc. Các phương pháp tính toán về nguyên tắc giống hệt nhau
đối với những thứ được đặt ra trong CIR 2021/808 để tính CCα nhưng tất nhiên là tham chiếu
nồng độ khác nhau (ví dụ: nồng độ mục tiêu sàng lọc STC). Tính toán phù hợp nhất
phương pháp phụ thuộc vào loại phương pháp phân tích và là i. một. phụ thuộc vào chế độ phát hiện (e. g.
phương pháp hóa miễn dịch, phương pháp khối phổ) và định lượng (ví dụ: định tính
phương pháp, phương pháp định lượng (bán) có hoặc không có hiệu chuẩn). CCβ hợp lệ theo
yêu cầu của CIR 2021/808 có thể đối với các phương pháp bán định lượng thường cũng được tính toán
hồi cứu đối với các phương pháp hiện có, ví dụ bằng cách đặt mức bổ sung phù hợp làm STC. Vì
thêm chi tiết về việc xác nhận các phương pháp sàng lọc, hãy tham khảo CIR 2021/808 và Hướng dẫn EURL
tài liệu về xác nhận phương pháp sàng lọc29 .
29 Đang chuẩn bị
32

Guidance Validation Confirmatory v1!1!211125 Tieng Viet

Uploaded by

Document Information

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

Guidance Validation Confirmatory v1!1!211125 Tieng Viet

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

Machine Translated by Google

Liên minh Châu Âu

về xác thực phương pháp xác nhận

Tài liệu Hướng dẫn EURL về

Xác nhận Phương thức Xác nhận

1. Phạm vi................................................. ...................................................... ............................................ 2

2. Định nghĩa ................................................... ...................................................... ....................................... 2

2.1. Số lượng mẫu ... ...................................................... ............. 2

2.2. Lô hàng................................................. ...................................................... ................................. 2

2.3. Biệt đội ... ...................................................... ............................... 2

2.4. Thiết kế thử nghiệm ................................................ ...................................................... .......... 2

2.5. Kế hoạch thực nghiệm: ................................................... ...................................................... .............. 2

2.6. Hệ số................................................. ...................................................... ................................ 2

2.7. Yếu tố tiếng ồn ... ...................................................... ........................ 3

2.8. Yếu tố thiết kế ... ...................................................... ...................... 3

2.9. Mức độ yếu tố ... ...................................................... ........................ 3

2.10. Hiệu ứng giai thừa ... ...................................................... ............... 3

2.11. Chạy thử nghiệm ... ...................................................... ............ 3

2.12. Chức năng nguồn ... ...................................................... ............... 3

3. Nhận xét chung ............................................. ...................................................... .............................. 3

4. Thực tiễn triển khai .............................................. ...................................................... ................. 5

4.1. Phương pháp xác nhận thông thường .............................................. ........................................ 5

4.1.1. Thử nghiệm xác nhận và tính toán .............................................. ............................. 7

4.2. Phương pháp xác nhận thay thế ...................................................... .......................................... 11

4.2.2. Thiết kế các thí nghiệm............................................... ...................................................... .... 13

4.2.3. Thử nghiệm xác nhận .................................................................. ...................................................... 15

4.2.5. Tính toán tham số ... ...................................................... .. 19

4.2.6. Giải thích kết quả ............................................... ...................................................... . 19

4.2.7. Dịch vụ EURL ... ...................................................... ............... 24

5. Tập thể dục có mục đích ............................................. ...................................................... ......................... 25

Phụ lục................................................. ...................................................... ...................................................... 27

Liên minh Châu Âu

về xác thực phương pháp xác nhận

2.1. Số lượng mẫu

mẫu cơ từ 7 loài bò khác nhau.

2.4. Thiết kế thử nghiệm

2.5. Kế hoạch thử nghiệm

Liên minh Châu Âu

2.7. Yếu tố tiếng ồn

2.8. Yếu tố thiết kế

2.9. Mức độ yếu tố

thiết kế thử nghiệm.

2.10. Hiệu ứng giai thừa

2.11. Chạy thử nghiệm

2.12. Chức năng nguồn

và CCβ có thể được xác định bằng đồ thị.

3. Nhận xét chung

1 Phạm vi cụ thể được quy định trong CIR 2021/808.

Liên minh Châu Âu

phép, thì việc xác nhận có thể

đến mức có thể đạt được một cách hợp lý6 .

2 Quy định của Ủy ban (EU) 37/2010

Liên minh Châu Âu

các phòng thí nghiệm đủ điều kiện.

được tiếp tục áp dụng thường xuyên phương pháp này.

4. Thực tế triển khai

4.1. Phương pháp xác nhận thông thường

Liên minh Châu Âu

cách tiếp cận xác nhận mẫu (Bảng 1).

ma trận bất thường.

Phần còn lại Cấp độ 1 Cấp độ 2 Cấp 3

Không được ủy quyền14 1,0 LCL 2.0 LCL 3.0 LCL

Được ủy quyền 0,115 MRL / ML 1,0 MRL / ML 1,5 MRL / ML

Liên minh Châu Âu