Acceptar o rebutjar les nostres hipòtesis

INSTRUCCIONS:

Heu donat voltes al vostre problema experimental, heu pensat en

possibles causes d’aquests errors (hipòtesis) i heu espiat els altres grups
per saber quines hipòtesis de treball tenien.

És l’hora de saber quina/nes de les vostres hipòtesis són certes i quines

no ho són!

Aquí teniu nou hipòtesis i els experiments que s’han dut a terme per tal
de comprovar si són certes o falses. La vostra tasca consistirà en aceptar
o rebutjar aquestes hipòtesis, tot jusitificant el perquè tenint en compte
els resultats que us donem.

PISTA! Almenys UNA de les hipótesis és CERTA!

 Hipòtesi: El plàsmid pQE-30-AT és erroni
Patró de restricció de pQE-30-AT Seqüenciació del plàsmid pQE-30-AT
(mètode Sanger)
or
a rcad
M 4
1 2 3
Mw

Stock seguretat
(control)
3500 bp -

Auditoria
1200 bp -

1: plàsmid de l’stock de seguretat (no digerit)

2: plàsmid de l’stock de seguretat digerit EcoRI/KpnI
3: plàsmid auditoria (no digerit)
4: plàsmid auditoria digerit EcoRI/KpnI

Accepteu o rebutgeu la hipòtesi? Per què?

Rebutgem aquesta hipotesi ja que el patró de restricció i la seqüenciació
del plàsmid son correctes i per tant no hi han incoherències.
Hipòtesi: El cultiu de E. coli estava contaminat amb
bacteriòfags lítics
Assaig per determinar presència/absència
de fags lítics al cultiu “auditoria”

Control Negatiu Control Positiu Cultiu auditoria

(sense fags) (amb bacteriòfags)

Accepteu o rebutgeu la hipòtesi? Per què?

Rebutgem aquesta hipotesi per que el control de l’auditoria i el nostre son
correctes, ja que tenen el mateix resultat.
Hipòtesi: El medi de cultiu no estava ben elaborat, i
això va provocar una cinètica de creixement anòmala
Cinètiques de creixement E. coli

0,7 0,7

0,6 0,6

0,5 0,5
OD 600nm

0,4 0,4

0,3 0,3

0,2 0,2

0,1 0,1

Temps (h) Temps (h)

Cultiu de referència Cultiu “auditoria”

Accepteu o rebutgeu la hipòtesi? Per què?

Rebutgem aquesta hipotesi ja que el cultiu de referencia que utilitzem i el
de l’auditoria han donat els mateixos resultats.
Hipòtesi: L’espectrofotòmetre i/o les pipetes no estaven
ben cal·librades ni tenien un bon manteniment
Revisió i calibració de
l’espectrofotòmetre i les pipetes

Accepteu o rebutgeu la hipòtesi? Per què?

Rebutjem aquesta hipotesi ja que tenim una acreditació de que els aparells
estàn calibrats
Hipòtesi: El procés d’inducció de l’expressió d’AT amb
IPTG no es va dur a terme correctament
Control del procés d’inducció amb IPTG

kDa Accepteu o rebutgeu la hipòtesi? Per què?

Rebutgem aquesta hipótesi perque el cultiu
induit es igual al marcador.

- AT

1 2 3

1: marcador de pes molecular

2: Cultiu no induït
3: Cultiu induït (IPTG)
Hipòtesi: La proteïna recombinant AT es degrada durant
el procés de purificació
Determinació de la integritat de la AT recombinant
(no degradació durant la purificació)

w
M
or
d
ca
ar
m
60
50

30

Accepteu o rebutgeu la hipòtesi? Per què?

Rebutgem aquesta hipótesi perque la integritat de la proteïna es l’ideal en el
procés de purificació
Hipòtesi: La quantificació de la proteïna recombinant AT
no va funcionar correctament.
Quantificació de la proteïna recombinant AT

Biuret Bradford Nanodrop

~ ~
5.6 mg/ml 5.5 mg/ml 5.4 mg/ml

Accepteu o rebutgeu la hipòtesi? Per què?

Rebutgem aquesta hipótesi ja que les quantitats que aporten son poc
diferents entre els aparells com perque alteri els resultats de la ATIII.
Hipòtesi: El funcionament del coagulòmetre no és
correcte
Mesura del APTT amb el coagulòmetre

28 ± 14.2 segons

Control patològic
(REF 1709106)

27 ± 13.2 segons

Control normal
(REF 1709104)

Accepteu o rebutgeu la hipòtesi? Per què?

Acceptem aquesta hipótesi, la màquina està donant uns valors diferents i la
variació d’error es molt gran i aixó provoca que els resultats es solapin.
INSTRUCCIONS:

És hora de recuperar les vostres hipòtesis i les que vàreu copiar dels
vostres companys i companyes.

Feu una llista de totes aquelles hipòtesis que NO han sortit en les
diapositives anteriors.
- Contaminació de la mostra amb ADNases fent que no hi hagi ADN
recombinant impedint la producció d’antitrombina III.
- El gen utilitzat s’ha degradat per un mal transport, és a dir, es
produeix menys antitrombina III.

A continuació, aneu analitzant cada hipòtesi seguint la plantilla que us

donem.
Hipòtesi: Un error humà contamina la mostra amb
ADNases fent que no hi hagi ADN recombinant impedint
la producció d’antitrombina III.

Les ADNases són enzims que trenquen la cadena d'ADN, es troben en

qualsevol mitjà de manera que si no es realitza un procediment correcte pot
contaminar la mostra afectant l'ADN recombinant.
Caldria repetir la prova posant es quantitats estipulades en el protocol i
tornar a fer-ho amb les quantitats correctes.
Caldria posar les quantitats estipulades en el protocol i tornar a fer-ho amb
les quantitats correctes.
En cas que la hipòtesi fos incorrecta els resultats esperats serien iguals als
originals, sense cap canvi.
Hipòtesi: El gen utilitzat s’ha degradat per un mal
transport, és a dir, es produeix menys antitrombina III.
La mostra està en mal estat per culpa del transport o per un mal tracte en
arribar al laboratori. La temperatura o un altre factor han fet malbé la mostra
que volem comprovar, per tant, els resultats donen erronis.
Caldria comprovar els recipients de les mostres i fer un seguiment de les
mostres per veure on està el problema, a més de repetir amb altres mostres i
veure si passa el mateix. Repetir el procediment experimental corroborant
quines condicions són òptimes a l'hora de realitzar l'experiment.

En cas que la hipòtesi fos incorrecta la producció d'antitrombina III seria

normal, és a dir, no hi hauria una disminució dels valors d'antitrombina III.
Hipòtesi: Els enzims de restricció que utilitzem tallen el
gen d’interès, fent que es faci una antitrombina III
defectuosa i menys eficient.
Els enzims de restricció són uns enzims que detecten uns gens “diana” a
l'inici i final del gen recombinant, si aquestes dianes estan dintre del gen,
aquest enzim de restricció tallen malament el gen.

Utilitzar altres enzims de restricció que sapiguem que no tallen el gen

d'interès.
En el cas que la hipòtesi fos incorrecte, l'enzim de restricció seria el
correcte, per tant, l'antitrombina lll es generaria correctament i seria més
eficient.
Hipòtesi:Les variacions de temperatura, pH i medi
utilitzat poden fer que afecti al creixement de la soca
produint menys proteïna antitrombina III

Depenent les variacions de temperatura, ph o medi d’ambient on

s’emmagatzema les mostres no sigui l’adequat per conservar-la, un altre
factor és que la placa fa servir un medi nutritiu que no afavoreixen el
creixement de la soca que utilitzem.
Canviar el medi de cultiu i comparar l’eficiència de la nova placa i la placa
que dona error, controlar el seu nivell de pH i temperatura.
En cas que la hipòtesi fos incorrecte veuríem que l’efectivitat no canviaria
amb l’ús d’un medi diferent
Hipòtesi: A l'hora de la transcripció hi ha un canvi de
nucleòtid formant codo nou que transcriu una proteïna
diferent que no te la mateixa activitat que l’antitrombina
III
La transcripció és el procés final del clonatge del gen, és un procés delicat
que amb el mínim canvi (mig, temperatura, pH) pot no transcriure
correctament el gen, codificant una proteïna completament diferent i
defectuosa.
Seqüenciar l’ARN missatger per saber si el gen no s’ha transcrit de manera
correcta i que no transcriu una base o un codó afectant l’estructura de la
proteïna generada.
En cas que la hipòtesi fos incorrecte L’ARNmissatger traduiria el gen
transcrit sencer