Problemes Resoltos

Sara Andújar Palomino MM, BIOTEC-
UAB
PROBLEMES TEMA 1
INTRODUCCIÓ
Com s’estudia la funció d’un gen en el fenotip en el desenvolupament

d’un bacteri?
S’extreu el gen, es codifica i es veu com afecta al bacteri. A més a més, s’haurà de
mirar el fenotip, com es comporta aquella cèl en unes condicions determinades i mirar
si hi ha diferències entre la q està mutada i la q no ho està.
Suposem q fem una sèrie de mutacions amb un gen q desconeixem:
Tenim una forca de replicació i 2 Pol q hi participen (la Pol I i la III).

qui posa el primer és la primasa
La DNA Pol I és la q treu els primers de RNA (activitat exonucleasa 5’→3’) i omple els
buits amb DNA. Si mutagenitzem aquest gen podem afectar una o altra funció. Si
afectem l’activitat exonucleasa, no podrà treure els primers, i si ens fixem en el fenotip
quedaria RNA-DNA, per tant, hi hauria Us en el DNA i això podria provocar mutacions,
q no es plegués correctament el DNA, etc. La cadena endarrerida quedaria a trossos i
amb gaps, la lligasa no podria lligar els fragments d’Okazaki. Però un dels
cromosomes sí q s’està replicant, el de la cadena líder. Llavors aquella cèl serà viable
gràcies a la replicació d’aquest cromosoma, tot i q tindrà problemes en la divisió i
baixa viabilitat si és defectiva en activitat exo 5’—>3’
acabarà desapareixent.
Si l’activitat afectada és la polimerasa, aleshores la cèl no seria viable, ja q la Pol I

intervé en altres processos cels, com la reparació de DNA i, per això, no podria ser
viable sense aquesta funció.
La DNA Pol III és la q sintetitza la cadena líder, els fragments d’Okazaki (1000-2000
nts) de l’endarrerida i corregeix els seus propis errors. Si mutagenitzem aquesta
polimerasa, de tal forma que no sigui funcional, no serà viable, esdevindrà letal.
Dit això, si toquem un gen dels que hem parlat i la cèl esdevé inviable, l’únic q podem
saber és q aquell gen és vital però no sabem quina funció té.
Les mutacions no tenen pq ser blanc o negre, sinó q pot ser q la prot quedi parcialment
modificada. Es pot introduir una mutació en la DNA Pol III i aquesta no és q no pugui
UAB
dur a terme la seva funció, però no ho fa amb la mateixa eficiència q ho feia
anteriorment. Això es coneix com a MUTANTS DEFECTIUS de gens vitals i els més
interessants i utilitzats són els MUTANTS CONDICIONALS, aquells els quals,
depenent de les condicions del cultiu, aquella prot és activa o inactiva. Aleshores el q
es fa és estudiar les diferències observades en els cultius en les condicions on sí
es poden obtenir mutants defectius en gens vitals? sí, son mutants condicionals.
funciona i on no funciona.
1. Representa gràficament l’evolució al llarg del temps de la concentració de

DNA i de RNA en un cultiu, així com també l’evolució de la mida cel·lular
dels següents microorganismes en les següents condicions:
a) Una soca salvatge d’Escherichia coli.
b) Una soca salvatge de Bacillus subtilis.
soca salvatge: soca que no té mutacions
DNA: la seva concentració augmentarà pq el cromosoma es replica i hi ha

més cèls pq el cultiu va creixent i com + cèls hi hagi, + concentració de DNA
augmentarà de manera lineal al llarg del temps perquè hi haurà replicació del DNA que donarà lloc a més cèl·lules
hi haurà.
RNA: passarà el mateix, augmentarà, ja q si hi ha més cèls vol dir q es
necessita + ribosomes, + RNAm, + RNAr... hi ha més RNA que DNA a la cèl·lula
El motiu pel qual la línia q representa el RNA està més amunt q la del DNA
és pq la concentració de RNA dins d’una cèl és molt + gran q la de DNA.
Mida cel: 1r creixerà progressivament fins a la seva divisió i després
disminuirà fins a la seva mida inicial, és a dir, fins la meitat (són bacils) de
forma immediata. ho anirà fent més d’un cop
c) Una soca d’E. coli mutant sensible a la temperatura a l’inici de la

li afecta la temperatura
replicació cromosòmica creixent a temperatura no restrictiva.

Es comporta igual q la soca salvatge però amb un pendent una mica menor.
UAB
d) Una soca d’E. coli mutant sensible a la temperatura a l’inici de la
replicació cromosòmica quan es fa créixer a temperatura restrictiva.
DNA: Hi haurà un augment de DNA de totes les cèls del cultiu q ja hagin
iniciat la replicació, però quan aquestes finalitzin la replicació, juntament amb
les q ja l’hagin finalitzat quan s’hagi pujat la T a 42ºC, la concentració de DNA
es tornarà constant (plateau), ja que no podran tornar a iniciar una altra
replicació.
RNA: Seguirà creixent mentre vagin creixent les cèls fins a arribar també a
un punt en el qual també s’aturarà, pq el cultiu ja no creixerà +.
Mida cel: La cèl seguirà creixent a 42ºC pq el fet de no poder-se replicar no
vol dir q els altres processos cels no es puguin dur a terme, però no podrà
dividir-se i aleshores arribarà un punt en el qual la cèl tindrà una mida límit i
s’estabilitzarà (plateau).
2. Un mutant dnaAts d'E. coli no pot créixer a 42ºC. En un congrés
internacional, un col·lega ens comenta que ha aconseguit que aquest
mutant pugui créixer a la temperatura restrictiva, simplement introduint en
aquesta soca un plasmidi pBR322 portador del gen dnaA de B. subtilis. És
creïble aquesta afirmació? Si el gen dnaA present en el pBR322 fos de
Helicobacter pylori, es podria opinar el mateix?
Aquest mutant no creixerà ni morirà, simplement es quedarà en una situació
estacionària, ja q com no es podrà replicar pq la DnaA (implicada en l’inici de la
replicació) és termosensible a 42ºC, tampoc es podrà dividir. En el cultiu
observarem q sempre hi ha les mateixes cèls.
UAB
La seq de les caixes-DnaA reconegudes per les DnaA de H.pylori i E.coli NO és

la mateixa.
Si mirem l’oriC de B.subtilis i E.coli sí q és diferent l’un de l’altre, però en els dos
casos tenen caixes d’unió de la DnaA i una regió DUE, on es desestabilitzarà el
DNA. També podem determinar q l’oriC de B.subtilis és + complex, ja q està
dividit en 2 parts pq entremig té el gen de la dnaA.
3. En el socari del laboratori es disposa d’una soca d’E. coli thyA dnaAts.
Aquesta soca és incapaç d’iniciar la replicació quan s’incuba a 42ºC. Tenint
en compte aquestes dades indica quina seria l’evolució del nombre de
cèl·lules viables en les següents condicions:
UAB
S’està referint al genotip d’aquesta soca d’E.coli, pq està escrit en cursiva i la 1a
lletra és en minúscula (si fos fenotip estaria escrit amb lletra normal i en
majúscula la 1a lletra). A més a més, ens indica q en aquests dos gens hi ha
mutacions cromosòmiques, és a dir, canvi de bases.
En aquest cas la mutació en thyA fa q la cèl no pugui sintetitzar timina, per tant,
cal subministrar-li-hi de forma exògena.
En el cas de dnaAts la mutació provoca q la prot sigui termosensible (efecte
fenotípic).
Quan la soca estigui a 30ºC i amb aportació de timina creixerà linealment i es
comportarà com una soca salvatge.
a) Quan s’elimina l’aportació exògena de timina a un cultiu que està
creixent a 30ºC.
b) Quan s’incrementa fins a 42ºC la temperatura d’incubació d’un cultiu

que està creixent a 30ºC.
UAB
La DnaA es tornarà inactiva pq és termosensible i llavors no es podran tornar
a iniciar + cicles de replicació. Però totes aquelles cèls q hagin iniciat
replicacions abans de pujar la T, continuaran replicant i es podran dividir.
Si ja no es poden replicar +, les cèls no es dividiran i seguiran creixent fins a
una mida límit i aleshores, es mantindran en un “plateau”.
c) Després de 20 minuts d’incrementar fins a 42ºC la temperatura
d’incubació d’un cultiu que està creixent a 30ºC s’elimina l’aportació
exògena de timina.
d) Després de 50 minuts d’incrementar fins a 42ºC la temperatura

d’incubació d’un cultiu que està creixent a 30ºC s’elimina l’aportació
exògena de timina.
En aquest cas, totes hauran acabat la fase C (replicació) pq aquesta dura 40

min i hem deixat 50 min fins a treure l’aportació de timina, i aleshores, el cultiu
quedarà en “plateau” fins q torni a aparèixer timina o les cèls comencin a
morir.
4. S’ha calculat que el temps de generació d’un cultiu d’E. coli en un medi ric
és de 20 minuts mentre que quan es fa créixer en un medi mínim les
cèl·lules es divideixen cada 40 minuts. Quin és el nombre de còpies per
cèl·lula dels gens dnaA, rpl, lys, his, xthA, mal, thr, lac, gal i trp en aquestes
dues condicions?
UAB
DADES: L’origen i el final de replicació del cromosoma d’E. coli es troben
respectivament als minuts 83.5 i 32 del seu cromosoma. La localització dels
gens a estudiar és la següent:
 dnaA (minut 82,5)
 rpl (minut 72,5)
 lys (minut 61)
 his (minut 44)
 xthA (minut 38)
 mal (minut 91)
 thr (minut 100)
 lac (minut 8)
 gal (minut 16,5)
 trp (minut 27,5)
Pq es pugui iniciar un altre cicle de replicació cal q hi hagi concentracions

elevades de DnaA-ATP i això ve regulat per la fase d’iniciació i depèn de
les condicions en les q es trobi el cultiu.
UAB
Del C1 tindrem 1 cromosoma per cèl, del C2, 1 també i del C3, ½ de cada cromosoma,
per tant, 2 ½.
Hem de recordar q normalment la replicació de cromosomes bacterians és

bidireccional, per la qual cosa, serà ½ cromosoma a favor i en contra de les
agulles del rellotge des de l’oriC. I per saber exactament on arribarà, ho fem
de la següent forma: sabent q el cromosoma té 100 min, q la meitat són 50
min i q la replicació és bidireccional, per tant, 25 min cap a un costat i 25 cap
a l’altre, haurem de fer 83.5+25 (a favor de les agulles) i 83.5-25 (en contra).
UAB
Del C1 tindrem 1 cromosoma per cèl i del C2, ½ cromosoma.
5. Les cèl·lules d’una soca d’Agrobacterium tumefaciens presenten dos

cromosomes anomenats I i II de 1,5 i 3 Mb, respectivament. Els inicis de
replicació d’aquests dos cromosomes estan coordinats entre si. A més a
més, la replicació dels dos cromosomes finalitza al mateix temps. Què es
pot dir respecte a la direccionalitat de la replicació dels cromosomes I i II
d’A. tumefaciens?
UAB
6. La soca UA1991 d’E. coli presenta una mutació al gen nrd (que codifica la
ribonucleòtid reductasa) que disminueix en un 50% la velocitat de síntesi
de dNTPs. Calcular el nombre de còpies que presentaran els gens ilv, thr,
gal, trp, his i lys en les cèl·lules d’aquest mutant quan creixen amb un
temps de generació de 20 min, 40 min, 60 min i 80 min.
DADES: La posició d’aquests gens al mapa d’E.coli és: thr (minut 100), ilv
(minut 87,5), gal (minut 16,5), his (minut 44), lys (minut 61) i trp (minut 27,5).
Del C1 tindrem 1 cromosoma per cèl i del C2, ½ cromosoma.

UAB
Del C1 tindrem 1 cromosoma per cèl, del C2, ¾ i del C3, ¼ de cada cromosoma,
per tant, 2 ¼ .
Recordem un altre cop q

normalment la replicació de
cromosomes bacterians és
bidireccional, per la qual cosa,
serà a favor i en contra de les
agulles del rellotge des de
l’oriC. I per saber exactament
on arribarà, ho fem de la
següent forma en el cas de ¾ i
¼ , respectivament: sabent q el
cromosoma té 100 min, q la
tercera part són 75 min i q la
replicació és bidireccional, per
tant, 37.5 min cap a un costat i 37.5 cap a l’altre, haurem de fer 83.5+37.5 (a
favor de les agulles) i 83.5-37.5 (en contra); i si un quart són 25 min, seran 12.5
min cap a un costat i 12.5 cap a l’altre, i haurem de fer 83.5+12.5 (a favor de les
agulles) i 83.5-12.5 (en contra).
Els gens q es trobin entre 71 i 96 tindran 4 còpies, els q estiguin entre 46-71 i 96-
21 tindran 2 còpies i els q es trobin entre 21 i 46 en tindran 1.
UAB
Del C1 tindrem 1 cromosoma per cèl, del C2, 1 també, del C3, ¾ de cada
cromosoma, per tant, 2 ¾ , del C4, ½ de cada cromosoma, per tant, 4 ½ i del C5,
¼ de cada cromosoma, per tant, 8 ¼ .
Els gens q es trobin

entre 71 i 96 tindran 16
còpies, els q estiguin
entre 58.5-71 i 96-8.5
en tindran 8, els q es
trobin entre 8.5 i 21, en
tindran 4 i els q estiguin
entre 21 i 46, en tindran
2.
UAB
Del C1 tindrem 1 cromosoma per cèl i del C2, ¼ .

UAB
PROBLEMES ADDICIONALS
7. S’ha aïllat un mutant d’ E. coli sensible a la temperatura en el procés de

replicació del DNA. Respecte a la incorporació de timina tritiada (marcada
radioactivament) el mutant presenta el comportament indicat a la figura
següent:
En quin moment de la replicació del cromosoma creus que està afectat

aquest mutant?
Aquest mutants està afectat en l’inici de la replicació (possiblement és dnaA ts)
pq si estigués afectat en l’elongació, la parada seria més dràstica.
Sara Andújar Palomino MM, BIOTEC-UAB
PROBLEMES TEMA 2-3
INTRODUCCIÓ
L’OPERÓ LACTOSA
L’operó lactosa és el primer q es va descobrir com funcionava la seva regulació, és

l’operó q conté les prot necessàries per la degradació de la lactosa i poder aprofitar
aquest sucre com a font de C i E. I degut a q va ser dels primers, ha estat el més estudiat,
amb el q s’han fet més experiments i s’utilitza en processos industrials, per DNA
recombinant, etc.
Com funciona el catabolisme de la lactosa?
- Per una banda, tenim una prot de memb (Permeasa) q de manera activa
transporta la lactosa dins la cèl (la lactosa no difon lliurement cap al citoplasma).
Un cop dins de la cèl, la β-galactosidasa hidrolitza la lactosa donant lloc a
glucosa i galactosa. Aleshores la glucosa anirà directament a la via de glucòlisi
per l’obtenció de C i E i la galactosa encara haurà de seguir un altre pas però
també serà aprofitable.
- L’al·lolactosa és una petita modificació de la lactosa.
L’operó lactosa té un gen regulador (lacI) q dona lloc a la prot lacI, el repressor del sist,
lacZ q és el gen q codifica per la β-galactosidasa, el gen lacY q és el q codifica per la
permeasa, i el gen lacA q codifica per una acetilasa, però encara no es té clara la seva
importància dins del catabolisme de la lactosa, tot i ser realment fonamental (sinó hauria
estar eliminat fa molt de temps a causa de l’evolució).
A més a més, té una regió promotora, una regió reguladora, un lloc CRP i l’operador, on
s’uneix el repressor lacI.
Com funciona el sistema?
- D’entrada, tenim una expressió constitutiva del repressor, és a dir, la cèl

habitualment expressa aquest repressor. Aquest repressor reconeix la seq de
l’operador, s’hi uneix i impedeix q la RNAP s’uneixi a la regió promotora, per tant,
no hi haurà transcripció de l’operó.
- Si ha lactosa al medi, aquesta s’unirà al repressor pq té aquesta capacitat i això
provoca un canvi conformacional en el repressor (unió al·lostèrica), q farà q
aquest deixi de poder-se unir al DNA i es desenganxarà. Aleshores l’operó queda
lliure i la RNAP ja s’hi podrà unir i hi haurà transcripció (a mRNA).
- Hi haurà expressió dels 3 gens i, per tant, es produirà β-galactosidasa, permeasa
i acetilasa.
- Fixem-nos q lacZ codifica per la β-galactosidasa, la funció de la qual és hidrolitzar
la lactosa. Per tant, degrada la lactosa present en el citoplasma per obtenir font
de C i E, i aleshores està destruint la molèc inductora. El q passarà és q
desapareixerà la lactosa del citoplasma, el nou repressor sintetitzat s’unirà de
nou a l’operador pq no hi ha lactosa i el promotor tornarà a ser inaccessible per
la RNAP, per la qual cosa no hi haurà transcripció ni síntesi de les prot.
- Recordem q això és a nivell basal, q realment sí q hi haurà transcripció, però

amb una taxa molt baixa.
S’han trobat molts mutants de l’operó lactosa:
- lacI-: repressor q té una mutació en la seva estructura q li impedeix unir-se a

l’operador. Per tant, el sist sempre estarà induït o mai reprimit, no hi haurà
regulació.
- lacOC: canvi en la seq de DNA de l’operador q provoca q el repressor no la
reconegui i no s’hi pugui unir. Les conseqüències seran les mateixes q en el cas
anterior, mateix fenotip.
- lacIs: el repressor és insensible a l’inductor, és a dir, q sempre tindrem un estat
basal, ja q el repressor estarà sempre unit a l’operador pq l’inductor no es podrà
unir a ell. Per tant, sempre estarà reprimit l’operó (molt baixa transcripció) i el
fenotip serà Lac- (mai podrà viure en presència només de lactosa).
- lacIq: repressor respon a la presència de lactosa, però la seva unió és tant forta
a l’operador q l’equilibri està fortament desplaçat a la unió a l’operador. En aquest
cas, la inducció del sist serà molt baixa en comparació a si no tingués un
repressor d’alta afinitat.
Normalment tots els bacteris tenen una dotació crom única (haploides), poden tenir +
d’un cromosoma però no tenen repetits els gens. No obstant tenen un altre sist per
poder-se dotar de nous gens, com són els plasmidis. Un plasmidi, p.e., pot portar un
operó lactosa sencer, amb la qual cosa si el gen del cromosoma presenta una mutació,
aquesta pot ser compensada pels gens q porta el plasmidi del mateix operó lactosa.
En el crom tenim un operó perfecte però amb un lacI-, és a dir, amb un repressor NO
funcional i sempre hi haurà expressió dels gens de l’operó.
Ara suposem q aquesta cèl és transformada amb un plasmidi q conté l’operó lactosa
amb el gen lacI sense problemes, i aleshores ara sí q el repressor es sintetitzarà, es
podrà unir a l’operador i l’operó del cromosoma passarà a ser regulable. I de la mateixa
manera, el repressor del plasmidi actuarà també en l’operador del mateix, regulant-lo.
La mutació lacI és recessiva, ja q pot ser complementada en trans.
En aquest cas tenim mutat l’operador (lacOC), es tracta d’un operador constitutiu, en el
qual hi ha hagut un canvi en la seva seq q farà q no sigui reconegut pel repressor (sí q
es pot sintetitzar sense problemes) i aquest no s’hi podrà unir. Sempre hi haurà
expressió de l’operó, fins i tot en absència de lactosa.
Si fem la transformació amb un plasmidi en trans, igualment no hi haurà expressió de

l’operó pq el repressor no es podrà unir a l’operador. Aleshores la mutació lacO C és cis-
dominant, per tant, no podrà ser mai complementada.
1. Un laboratori de recerca disposa de vàries soques d’Escherichia coli que

presenten diferents mutacions en l’operó lactosa. Amb elles es realitza un
experiment en el que es determina la concentració de LacZ (β-
galactosidasa) i de LacY (permeasa) de les diferents soques creixent en
presència o absència d’IPTG (isopropil-β-D-1-tiogalactopiranòsid), un
anàleg no hidrolitzable de la lactosa. Tenint en compte la tipologia de les
mutacions presents a cada soca, omple la següent taula tot indicant si la
concentració de cada proteïna en presència o absència d’IPTG serà nul·la,
baixa o alta.
Mutacions existents a Cultiu sense Cultiu amb
Soca Localització cada gen o regió IPTG IPTG
operó lacI lacO lacZ lacY [LacZ] [LacY] [LacZ] [LacY]
0 Cromosoma wt wt wt wt ↓ ↓ ↑ ↑
1 Cromosoma wt wt lac-1 wt ꭓ ↓ ꭓ ↑
2 Cromosoma wt lac-2 wt wt ↑ ↑ ↑ ↑
3 Cromosoma lac-3 wt wt wt ↑ ↑ ↑ ↑
4 Cromosoma lac-4 wt wt wt ↓ ↓ ↓ ↓
5 Cromosoma wt wt lac-5 wt ꭓ ꭓ ꭓ ꭓ
6 Cromosoma lac-6 wt wt wt ↑ ↑ ↑ ↑
7 Cromosoma wt wt wt lac-7 ↓ ꭓ ↑ ꭓ
8 Cromosoma lac-4 lac-2 lac-5 wt ꭓ ꭓ ꭓ ꭓ
9 Plasmidi F’ lac-3 wt wt lac-7 ↓ ↑ ↑ ↑
Cromosoma wt lac-2 lac-1 wt
10 Plasmidi F’ lac-6 lac-2 lac-1 wt ꭓ ↑ ꭓ ↑
Cromosoma lac-4 wt wt lac-7
11 Plasmidi F’ lac-3 wt lac-1 wt ꭓ ꭓ ꭓ ꭓ
Cromosoma lac-4 wt wt lac-7
12 Plasmidi F’ lac-4 Wt lac-1 wt ↑ ꭓ ↑ ꭓ
Cromosoma wt lac-2 wt lac-7
Mutació Fenotip
lac-1 → LacZ- Mutació que fa no funcional a la proteïna LacZ
En aquest cas no hi haurà síntesi de β-galactosidasa.
lac-2 → LacOC Expressió elevada de l’operó Lac degut a un defecte al punt

d’unió del repressor
El punt vermell hauria d’estar situat sobre de l’operador, ja q la mutació és en la seq de

DNA de l’operador.
En aquest cas el repressor no s’hi podrà unir i el sist estarà sempre induït.
lac-3 → LacId Repressor defectiu
En aquest cas el repressor està mutat i això fa q no es pugui unir a l’operador, per tant,
el sist sempre estarà induït.
lac-4 → LacIs Repressor insensible a l’inductor

En aquest cas tenim un repressor mutat en el qual no s’hi pot unir l’inductor i el sist
sempre estarà reprimit.
lac-5 → LacZ- Mutació polar molt forta al gen lacZ
En aquest cas tenim una mutació polar, el q significa q generalment les seq rut estan
ocultes pels ribosomes, però quan hi ha una mutació sense sentit, com és el cas, els
ribosomes salten, aquestes seq queden al descobert i la prot Rho s’hi pot unir. Això
provoca una terminació prematura de la transcripció. A més a més, ens diuen q la
mutació és molt forta, és a dir, q el codó d’STOP es troba a una distància llunyana del
següent RBS (el del gen lacY) i això voldrà dir q ni lacZ, ni lacY ni lacA s’expressaran.
lac-6 → LacI- Mutació ambre al gen del repressor
En aquest cas tenim una mutació sense sentit en el gen LacI, en la qual s’introdueix un
codó d’STOP, q resulta ser l’ambre (UAG). Per tant, el repressor no serà funcional, no
s’unirà a l’operador i el sist sempre estarà induït.
lac-7 → LacY- Mutació que fa no funcional a la proteïna LacY
En aquest cas no tindrem expressió de la permeasa.

En aquest cas tenim 3 mutacions alhora. Si ens fixem en la de lac-4 i lac-2, la q

predomina és la lac-2, ja q tant és com sigui el repressor (insensible a l’inductor en
aquest cas), q serà incapaç d’unir-se a l’operador pq la seq d’aquest ha patit un canvi.
Ara si ens fixem en lac-5 també, observem q la mutació polar molt forta és la q predomina
sobre les altres dues i, per tant, serà la q determinarà el fenotip de la soca (LacZ-).
En aquest cas tenim un plasmidi transformat en un cromosoma. En el plasmidi tenim

una mutació lac-3 q fa q el repressor no sigui funcional i una mutació lac-7 q fa q no hi
hagi expressió de LacY. En el crom tenim una mutació lac-2 q fa q l’operador sigui
constitutiu i no s’hi pugui unir el repressor i una mutació lac-1 q fa q la prot LacZ no sigui
funcional.
Aleshores en conjunt tenim un repressor inactiu q no es podrà unir mai a l’operador, un

repressor normal q es podrà unir a l’operador q està bé, però no al constitutiu, per tant,
l’expressió de LacZ es veurà sempre inhibida a no ser q hi hagi inductor (IPTG). En

canvi, l’expressió de LacY sempre estarà induïda en presència o absència d’inductor.
En aquest cas en el plasmidi tenim un repressor no funcional i en el crom, un repressor

insensible a l’inductor, q per tant sempre es trobarà unit a l’operador independentment
de si hi ha o no inductor. Si mirem l’operador, en el plasmidi té una mutació lac-2 q fa q
sigui constitutiu i no s’hi pugui unir el repressor, i en el crom és wt.
El repressor insensible a l’inductor es podrà unir a l’operador wt, reprimint l’expressió de

tot l’operó independentment de si hi ha o no IPTG (LacY té una mutació lac-7, per tant,
mai serà funcional la prot).
En el plasmidi no es podrà unir el repressor a l’operador pq és constitutiu, per tant, el

sist sempre estarà induït. Però mai hi haurà expressió del gen LacZ pq la prot serà no
funcional.
En aquest cas, en quant a repressor, tenim la mateixa situació q en la soca anterior,

però la mutació en el plasmidi és lac-3. L’operador és wt tant en plasmidi com en crom i
l’únic q tenim és LacZ- en el plasmidi i LacY- en el crom, q donen lloc a prot no funcionals.
En aquest cas tenim un repressor wt i un operador constitutiu en el crom, i un repressor

insensible a l’inductor i un operador wt en el plasmidi. I en el crom tenim un LacZ wt,
però un LacY-, q dona lloc a una prot no funcional. En canvi, en el plasmidi tenim un
LacZ-, q dona lloc a una prot no funcional.
2. S’està estudiant la concentració de β-galactosidasa de diferents soques

d’E. coli en dos medis de cultiu diferents. El medi A és un medi ric amb
glucosa i el medi B també és un medi ric però que no presenta glucosa com
a font de carboni. Indica quin efecte tindrà sobre la concentració de β-
galactosidasa l’addició de cAMP exogen en cada una de les següents
soques respecte a una soca salvatge quan creixen en els medis esmentats:
a) E. coli lacOC Canvi en la seq de l’operador
b) E. coli lacZ Prot LacZ no funcional
c) E. coli lacI Repressor no funcional
d) E. coli cya Enzim no funcional
e) E. coli crp Enzim no funcional
Tenim un operó lac, operó catabòlic, en el qual tenim un promotor, lloc on s’uneix
la RNAP. Aquest promotor està constituït per un operador, on s’uneix el
repressor inhibint l’expressió dels gens de l’operó. Més amunt del promotor
(upstream) trobem el lloc CAP, on s’uneix la prot CAP/CRP unida a cAMP (quan
[cAMP] són suficientment elevades com pq hi hagi aquesta unió).
En aquest cas tenim un operador constitutiu en el qual NO es podrà unir el

repressor, per tant, el sist sempre estarà induït. Aleshores, tant en el medi A com
en el B hi haurà expressió de tots els gens, en concret, del lacZ. A més a més,
tenim cAMP de forma exògena i això farà augmentar molt l’expressió.
En aquest cas NO tindrem síntesi de LacZ pq la prot no és funcional i tot i tenir

cAMP no hi haurà expressió d’aquesta.
Mateix q a).
El gen cya és el q codifica per l’adenilat ciclasa (ATPcAMP), q en aquest cas

no és funcional. Per tant, la cèl no podrà sintetitzar cAMP, però li afegim de forma
exògena. Tot i això, NO hi haurà síntesi de LacZ pq no tenim inductor en el medi
i, doncs, el sist estarà sempre reprimit.
El gen crp és el q codifica per la prot CRP/CAP, q en aquest cas no és funcional

i aleshores, no es produirà la unió CRP-cAMP. Tot i això, el sist sempre estarà
reprimit pq no hi ha inductor al medi.
3. El reguló Xyl de Bacillus subtilis està format per les unitats transcripcionals
monocistròniques xylA, xylB, xylC i xylD. S’han realitzat estudis de RT-PCR
quantitativa determinant la concentració relativa de cada un dels mRNA en
presència o absència de xilosa i tant en una soca salvatge com en una soca
B. subtilis xylA com en una soca xylB obtenint-se les dades que s’indiquen
a la taula:
Medi cultiu Concentració relativa de cada unitat
Soca utilitzat transcripcional (U.F./cell)
xylA xylB xylC xylD
Medi mínim
B.subtilis wt Amb xilosa 50 3000 2000 2500
Sense xilosa 500 30 40 50
B.subtilis xylA Amb xilosa 500 40 25 35
B.subtilis xylB Amb xilosa 45 3050 1800 2400
Tenint en compte aquests resultats, contesta les preguntes següents:
a) Qui creus que podria ser el regulador transcripcional d’aquest reguló?

Ens hem de fixar en si en algun cas d’aquests l’absència d’una d’aquestes
prot fa q el perfil d’expressió sigui diferent del de wt.
Si mirem el mutant xylB, el seu perfil d’expressió és igual q el de wt, per tant,
xylB no és cap regulador pq la seva absència NO modifica l’expressió dels
gens.
Si mirem el mutant xylA, l’expressió de tots els gens varia: amb o sense xilosa
hi ha una alta expressió de xylA i tant amb xilosa com sense hi ha una baixa
expressió de la resta dels gens. Per tant, el regulador del reguló Xyl és xylA.
b) Quin tipus de control transcripcional (positiu/negatiu;
inducció/repressió) presenta cada gen dels estudiats?
Mirant el 2n cas, quan la xylA no és funcional, els nivells de xylB, C i D són
baixos, mentre q quan aquesta sí és funcional (wt), els nivells pujen, són alts.
Aleshores la regulació serà positiva. Però també hem de fixar-nos en el fet
de si hi ha xilosa o no en el medi de cultiu. Quan hi ha xilosa, els nivells
d’expressió augmenten, per tant, parlarem de la xilosa com a inductor.
Finalment, pels gens xylB, C i D tindrem una regulació POSITIVA PER
INDUCCIÓ.
Si ens fixem en q la prot xylA regula el seu propi gen, quan aquesta no és
funcional, els nivells d’expressió de xylA són alts, mentre q quan aquesta és
funcional (wt), els nivells disminuiran. Aleshores, la regulació serà negativa
pq la seva presència disminueix la transcripció. Ara si observem el fet q hi

hagi o no xilosa al medi, tindrem q quan hi ha xilosa, els nivells d’expressió
disminueixen, per tant, parlarem de la xilosa com a repressor. Finalment, pel
gen xylA tindrem una regulació NEGATIVA PER REPRESSIÓ.
4. L’operó Uab està format per set cistrons diferents (uabABCDEFG).

Coneixent aquest fet contesta les següents qüestions:
a) Quin serà el producte gènic sintetitzat en major quantitat?
UabA, pq els gens q estan + a prop de l’inici de la síntesi de mRNA tindran
una taxa de traducció + elevada q no pas els q es trobin al final. A més a
més, el RBS i l’ATG (Shine-Dalgarno) acostumen a estar molt + disponibles
i a facilitar la unió del ribosoma als q estan a l’extrem 5’ de RNA q no pas als
del 3’.
b) Quin serà el producte gènic sintetitzat en menor quantitat?
UabG, el gen menys traduït.
c) En una soca mutant es detecta una mutació en uabD que dona lloc a un
fenotip UabD-, UabE-, UabF- i UabG-. Què pots dir respecte a aquesta
mutació?
Hi ha una mutació polar molt forta en el gen uabD, és a dir, un codó d’STOP
al principi del gen D.
d) Per altra banda, també s’han aïllat altres soques que presenten
mutacions en uabD però que només manifesten un fenotip UabD-. Dóna
dos hipòtesis diferents que justifiquin aquest fet.
1. Una mutació puntual q inactivi la prot (canvi de base o aa clau).
2. Mutació q provoqui un corriment en el marc de lectura donant lloc a una

prot no funcional, etc.
5. Usant les seqüencies dels operons trp i gal i del gen lacZ d’E. coli s’han
construït les fusions recollides en les figures que es mostren a
continuació:
L’operó trp presenta un control negatiu per repressió mentre que l’operó
gal presenta un control negatiu per inducció anàleg al de l’operó lactosa.
Tenint en compte els esquemes mostrats i les dades de les que es
disposen, contestar les següents preguntes:
a) Quin regulador/s transcripcionals governen l’expressió del gen lacZ
quan es troba sota control de Ptral o Pgarp?
Si es troba sota el control de Ptral, el regulador transcripcional serà GalR, ja
q aquest promotor té l’operador de l’operó gal. En canvi, si es troba sota el
control de Pgarp, el regulador serà TrpR, pq aquest promotor té l’operador
de l’operó trp.
b) Quin tipus de control presenta lacZ en cada cas?
En aquest cas, tindrem un control NEGATIU PER INDUCCIÓ.

En aquest cas, tindrem un control NEGATIU PER REPRESSIÓ.

c) Hi ha alguna alarmona que afecti a l’expressió de lacZ quan es troba
sota control d’aquests promotors sintètics?
6. Per determinar quins són els factors que controlen l’expressió del rRNA,
s’ha construït una soca de Salmonella enterica que és auxòtrofa pel
triptòfan i on el gen lacZ està sota control del promotor de l’operó rrnD (S.
enterica trpA rrnD::lacZ). Aquesta soca es fa créixer en medi ric amb Trp i
glicerol com a font de carboni i s’estudia l’evolució de la síntesi de β-
galactosidasa en diferents situacions:
1. Quan s’elimina el Trp del medi de cultiu
2. Quan s’afegeix glucosa al medi de cultiu
3. Quan s’afegeix cAMP al medi de cultiu
Tenint en compte la proximitat filogenètica amb E. coli, indica com variaria

la concentració de β-galactosidasa en cada condició plantejada.
La soca és auxotròfica pel Trp, per tant, no pot sintetitzar-lo i per la qual cosa li
hem de proporcionar. Aleshores aquesta creixerà i sintetitzarà LacZ, però quan
s’elimini el Trp del medi no podrà sintetitzar Trp, per tant, quan hagi de posar
aquest aa per fer una prot no podrà, no es sintetitzarà LacZ, amb la qual cosa es
quedarà en plateau fins al punt q començarà a disminuir la síntesi de β-gal.
7. S’ha introduït a una soca d’ E. coli ΔtrpR un plasmidi portador d’una fusió
entre la regió promotora i operadora de l’operó Lac i la regió codificant del
gen trpR. A continuació s’ha analitzat l’activitat específica de l’enzim
triptòfan sintetasa (TrpAB) en diferents condicions de cultiu, obtenint-se
els següents valors: 150, 150, 50, 50, 20 i 5 u.e./ml.
Associa aquests valors a cada una de les condicions analitzades.
1) MM + lactosa + Trp
20 u.e.ml pq el sist està molt reprimit, però tot i tenir/necessitar el mateix q la

condició 3, hi ha una diferència notable:
 En aquest cas l’inductor és la lactosa, q a la llarga serà degradada per la

β-gal, ja q aquesta soca igualment té el seu operó lac perfecte q codifica
en el gen LacZ per la β-gal, la qual té la funció de degradar la lactosa.
2) MM + glicerol + Trp
50 u.e./ml pq el sist continua estant lleugerament reprimit. Per això en aquest

cas tenim:
 Trp q se’ns unirà a la TrpR i reprimirà l’expressió de la TrpAB.

 cAMP q s’està sintetitzant dins de la cèl.
Però no tenim:
 Inductor, per tant, tindrem una baixa expressió de TrpR.

3) MM + glicerol + IPTG + Trp
5 u.e./ml pq és el sist + reprimit. Per això necessitem:
 Altes concentracions també de TrpR, la qual està sota el control del
promotor i l’operador Lac.
 Inductor, en aquest cas IPTG, ja q provocarà la desunió del repressor de
l’operador Lac i farà q s’expressi TrpR.
 A més a més, també necessitarà cAMP q farà incrementar la transcripció,
però en aquest cas ja l’està sintetitzant la cèl.
4) MM + glicerol + IPTG – Trp
150 u.e./ml pq el sistema no està reprimit. Per això no tenim:
 Trp q no se’ns unirà aleshores a TrpR i no reprimirà l’expressió de TrpAB.
En aquest cas ens és igual l’inductor pq no tindrem Trp q s’uneixi al repressor.
5) MM + glucosa + cAMP + Trp
50 u.e./ml pq el sist continua estant lleugerament reprimit. Per això en aquest

cas tenim:

 cAMP proporcionat de forma exògena, però q no farà res per l’esmentat
a continuació.
Però no tenim:
 Inductor, per tant, tindrem una baixa expressió de TrpR.

6) MM + glucosa - Trp
150 u.e./ml pq el sistema no està reprimit. Per això no tenim:
 Trp q no se’ns unirà aleshores a TrpR i no reprimirà l’expressió de TrpAB.

 Tampoc inductor q estimuli l’expressió de TrpR, però ens és igual pq no
tenim Trp.
En aquest cas ens és igual la glucosa q inhibirà l’activitat de l’adenilat ciclasa

i no tindrem cAMP.
ΔtrpR vol dir q hi ha una deleció en aquest gen (parcial o total) i, per tant, aquesta
soca és incapaç de produir la prot trpR (regulador de l’operó trp).
El q estem mesurant és l’activitat de la Triptofan sintetasa i l’operó està regulat

per TrpR sempre i quan aquest estigui unit a Trp. Aquest tipus de regulació és
NEGATIVA, pq la unió del factor de transcripció inhibeix l’expressió dels gens, i
a més a més, és PER REPRESSIÓ, ja q pq TrpR s’uneixi a l’operador necessita
Trp (CO-REPRESSOR).
8. Un col·lega de la Universitat de Nottingham ens ha comunicat que disposa

d’un plasmidi que conté un gen de B. subtilis que a l’introduir-lo en una
soca E. coli crp permet que aquesta presenti un creixement equivalent a
una soca d’E. coli wt en medi mínim amb glicerol. És creïble aquesta
informació?
9. L’operó triptofanasa d’E. coli és el responsable de la síntesi d’un conjunt

d’enzims que permeten la obtenció d’àcid pirúvic a partir de triptòfan.
Presenta un control negatiu per inducció on l’inductor es el triptòfan.
Tenint en compte aquestes dades, ordena les següents condicions de
cultiu per tal que l’expressió de l’operó triptofanasa sigui decreixent:
Primer de tot, hem de tenir en compte q la presència de ppGpp no afecta

l’expressió de triptofanasa pq es tracta d’un operó catabòlic i el ppGpp regula els
operons anabòlics. A partir d’aquí, classifiquem les següents condicions de l’1
(màxima expressió) al 4 (mínima).
1) Medi mínim + Trp + Glucosa + cAMP
2) Medi mínim + Trp + Glucosa + ppGpp
3) Medi mínim + Trp + Glucosa
4) Medi mínim - Trp + Glucosa + cAMP
5) Medi mínim - Trp + Glucosa + ppGpp
6) Medi mínim - Trp + Glucosa
7) Medi mínim + Trp + Glicerol + cAMP
8) Medi mínim + Trp + Glicerol + ppGpp
9) Medi mínim + Trp + Glicerol
10) Medi mínim - Trp + Glicerol + cAMP
11) Medi mínim - Trp + Glicerol + ppGpp
12) Medi mínim - Trp + Glicerol
D’entrada pq hi hagi màxima

expressió (1), hi ha d’haver
Trp. També ha de tenir cAMP
pq es pugui incrementar
l’expressió de l’operó catabòlic
quan s’uneixi a CAP.
Glicerol?
El 8 i el 9 no tenen cAMP
exogen, però la cèl el sintetitza.
En aquest cas, l’expressió

continua sent notablement alta
(2) pq hi ha Trp, però a l’afegir
glucosa, inhibim l’AC, per la
qual cosa no hi haurà cAMP q
s’uneixi a la CAP i incrementi
l’expressió de triptofanasa.
En aquest cas, l’expressió és

baixa (3) pq NO hi ha Trp. Tot
i així, hi ha una certa
expressió, ja q en el 4 i el 10 li
afegim cAMP, per tant,
estimularà l’expressió.
En l’11 i el 12 no se li afegeix
cAMP exogen, però la cèl el
sintetitza.
El 5 i el 6 tenen una expressió

mínima (4), gairebé nul·la pq
NO hi ha Trp. A més a més,
se’ls hi afegeix glucosa, amb la
qual cosa, inhibim l’AC, per
tant, no hi haurà cAMP q
s’uneixi a la CAP i incrementi
l’expressió de triptofanasa.
PROBLEMES TEMA 4
1. Indicar a quines de les següents regions gèniques d’Escherichia coli es

poden aïllar mutants sense sentit i/o sensibles a la temperatura:
a) lacO (operador lac)

Correspon a la zona del DNA on s’uneix el repressor de l’operó lac, per tant,
no codifica per cap proteïna. Aleshores en aquest cas, no s’aïllaran mutants
sense sentit, ni tampoc sensibles a la temperatura.
b) lacZ (β-galactosidasa)
S’aïllaran mutants tant sense sentit com sensibles a la temperatura, ja que
en aquest cas afecta a un gen que codifica per una prot.
c) lacP (promotor lac)
Ens trobem amb el mateix cas que l’a), CAP mutant.
d) lacI (repressor lac)
S’aïllaran mutants tant sense sentit com sensibles a la temperatura pq aquest
gen codifica pel repressor de l’operó lac, és a dir, una prot.
e) rrnA (RNA ribosomal)
No s’aïllaran mutants sense sentit pq no es tracta d’un gen codificant per una
prot, sinó per un RNA. Per altra banda, tampoc es poden aïllar mutants
sensibles a la T, ja que un RNA és àcid nucleic i, tot i presentar una estructura
secundària determinada que es pot arribar a desnaturalitzar, (es
desnaturalitza a >60-65ºC) en E.coli no arribaria a passar mai pq la cèl
moriria abans.
f) rrnP (promotor RNA ribosomal)
Ens trobem en el mateix cas que el c), CAP mutant.
g) trpL (atenuador operó trp)
S’aïllaran mutants sense sentit, ja q aquest atenuador és un pèptid i a
l’introduir-se un codó d’stop, quedarà més curt. Per contra, no s’aïllaran
mutants sensibles a la T pq el gen no codifica per una prot q puguem veure
si és funcional o no, simplement codificarà igualment pel pèptid líder i es
podrà dur a terme el control per atenuació.
h) micF (sRNA regulador de l’expressió de l’operó omp)

Ens trobem en el mateix cas que l’e).
i) cya (adenilat ciclasa)
Es podran aïllar mutants sense sentit i sensibles a la T, ja que es tracta d’un
enzim (prot).
j) oriC (origen de replicació del cromosoma)
No s’aïllarà CAP mutant pq és una zona no codificant del DNA.
Justificar la resposta.
2. L’acció d’un determinat mutagen sobre el genoma bacterià pot no ser

uniforme. Digues quines raons poden justificar que un suposat genA sigui
més sensible al 5-bromouracil que un genB.
Segons les hipòtesis trobades, quins resultats esperaries sobre aquests
gens si l’agent usat fos l’etil-metà-sulfonat (EMS) o l’acridina?
 Un agent intercalant és aquell que s’intercala entre les bases del DNA,
provocant microinsercions o microdelecions (una sola base) que faran córrer
el marc de lectura.
3. Un mutant condicional ambre pel bacteriòfag P1 pot infectar soques d’E.

coli que porten el gen sup1 però no les que porten el gen sup2. Com es pot
explicar aquest fet?
4. Es volen obtenir mutants que presentin cada una de les mutacions que
s’indiquen a continuació:
a) Una mutació sense sentit del tipus ambre
Agent alquilant (genera mutacions puntuals) pq provoca una substitució de
bases.
b) Una mutació sense sentit del tipus ocre
Agent alquilant.
c) La deleció d’un parell de bases a la regió central del gen
Agent intercalant (genera corriments en el marc de lectura) pq provoca
delecions o insercions de bases.
d) Una mutació puntual que afecti negativament la conformació d’un
enzim
Agent alquilant.
Indica què és més convenient en cada cas, si usar un agent mutagènic
intercalant o un d’alquilant. Justifica la resposta.
5. La hidroxilamina produeix exclusivament mutacions de tipus GC → AT.

Podrà aquest mutagen induir mutacions sense sentit en una soca salvatge
d’E. coli? I revertir mutacions sense sentit? I suprimir aquest tipus de
mutacions?
 Sí, podrà induir mutacions sense sentit ambre en una soca WT d’E. coli.
 Sí, podrà induir mutacions sense sentit sèpia en una soca WT d’E. coli.
 No es poden revertir les mutacions sense sentit pq les úniques bases que
podríem canviar per acció de la hidroxilamina són les G de l’stop am i se.
Però si ho fem ens acaba donant en els dos casos l’stop oc.
 Sabem que
necessitem una soca
supressora d’aquella
mutació sense sentit,
però ens falta info.
6. Si una població d’una soca Lac+ d’E.coli es mutagenitza amb radiació

ultraviolada i es sembra immediatament en plaques amb X-Gal, apareixen
algunes colònies amb sectors blaus i blancs. Si la sembra en placa té lloc
4 hores després de la irradiació apareixen colònies blanques o blaves, però
no amb sectors. Com es pot explicar aquesta diferència?
Volem veure mitjançant mutacions amb radiació ultraviolada si el gen lacZ que
codifica per la β-galactosidasa es veu afectat o no (quantes cèls passen a ser
Lac- i quantes es mantenen Lac+). Per això s’utilitza X-gal, un substrat de la β-
galactosidasa transparent que al ser hidrolitzat per aquest enzim, dona lloc a un
precipitat de color blau. Aleshores, si la cèl és Lac + donarà lloc a colònies blaves,
en canvi si la seva β-galactosidasa no és funcional (Lac-) donarà lloc a colònies
blanques.
7. Per obtenir mutants d’E. coli del tipus lacIs (capaços d’unir-se a l’operador
lacO però no a l’inductor) seria més útil el bromur d’etidi o el dietil sulfat?
Hem de provocar un canvi de base que faci canviar un aa, per tant utilitzarem el
dietil sulfat.
PROBLEMES TEMA 5
1. Es volen realitzar titulacions dels bacteriòfags P1vir (dsDNA) i R17 (ssRNA)

sobre les soques que s’indiquen a la taula adjunta. En presència del
plasmidi F aquests dos bacteriòfags infecten tant Escherichia coli com
Salmonella enterica. Tenint en compte que la concentració d’ambdós
bacteriòfags és de 109 pfu/ml, indiqueu en cada cas si es detectarà una
disminució o no en el nombre de calbes observades.
Eficiència de
Soca original Soca receptora plaqueig
P1vir (dsDNA) R17 (ssRNA)

E. coli R- M+ (F+) E. coli R+ M+ (F+) NO NO
E. coli R- M+ (F+) E. coli R- M+ (F+) NO NO
E. coli R- M+ (F+) E. coli R- M- (F+) NO NO
E. coli R- M- (F+) E. coli R+ M+ (F+) SÍ NO
E. coli R- M- (F+) E. coli R- M+ (F+) NO NO
E. coli R- M- (F+) E. coli R- M- (F+) NO NO
S. enterica R- M+ (F+) E. coli R+ M+ (F+) SÍ NO
S. enterica R- M+ (F+) E. coli R- M+ (F+) NO NO
S. enterica R- M+ (F+) E. coli R- M- (F+) NO NO
S. enterica R- M- (F+) E. coli R+ M+ (F+) SÍ NO
S. enterica R- M- (F+) E. coli R- M+ (F+) NO NO
S. enterica R- M- (F+) E. coli R- M- (F+) NO NO
Els sistemes de restricció-modificació només afecten al dsDNA.
2. Quin sistema de restricció creus que és més eficient, el d’una espècie

bacteriana en el que l’endonucleasa reconeix una seqüència de 6
nucleòtids (hexàmer) com a motiu d’unió al DNA o el d’una altra que
reconeix un tetràmer? Justifiqueu la resposta.
3. S’ha obtingut un lisat del bacteriòfag Φ32 i un altre del Φ43 ambdós
crescuts sobre E. coli K-12. Aquests dos lisats han estat plaquejats a
continuació sobre la soca E. coli K-12 (P1), obtenint una eficiència de
plaqueig del 100 % per Φ32 i de 10-4 % pel Φ43. Sabent que els dos
bacteriòfags són de dsDNA, que les seves bases no presenten cap tipus
de protecció enfront de la restricció i que no codifiquen cap proteïna que
interfereixi amb el sistema de restricció-modificació del fag P1, com es
poden explicar les diferències d’eficiència de plaqueig observades per
aquests dos bacteriòfags? Justifiqueu la resposta.
El sistema R-M de la soca E.coli K-12 (P1) està actuant sobre el bacteriòfag Φ43,
però no sobre el Φ32. Això es deu a que Φ32 no presenta cap diana reconeguda
pel sistema R-M de P1 i aleshores la REasa no podrà degradar el DNA víric.
PROBLEMES TEMA 6
1. El bacteriòfag P22 infecta Salmonella enterica, és un fag atenuat i pot

integrar-se a la regió pro del cromosoma de la cèl·lula hoste. Pel contrari,
el bacteriòfag P1, que infecta a Escherichia coli, tot i ser moderat resta
normalment en forma extracromosòmica. Ambdós bacteriòfags presenten
redundància terminal i permutació cíclica. Quin tipus de transducció creus
que podran fer aquests bacteriòfags, generalitzada o especialitzada o
ambdues?
Què vol dir permutació cíclica?
Un dels sistemes d’encapsidació del DNA víric a la càpsida consisteix en el

reconeixement d’una seq específica i allà l’enzim o la prot encarregada de
translocar el DNA cap a l’interior i de digerir-lo, la terminasa, reconeix aquesta
seq específica. Aleshores aquest enzim agafa el DNA i l’introdueix a dins de la
càpsida fins que arriba una seq específica i digereix per allà.
Cal recordar que el DNA víric quan és encapsidat es troba en forma de
concatàmers, és a dir, repeticions seguides del cromosoma del bacteriòfag una
darrere l’altra (degut al sistema de replicació per cercle rodant).
Altres bacteriòfags segueixen el sistema d’encapsidació per càpsida plena, que
consisteix en que la terminasa talli el DNA quan ja no n’hi càpiga més a la
càpsida. (Continuació en el 3r punt).
Què vol dir redundància terminal?
Que els extrems tenen les mateixes seq, és a dir, el DNA que s’està introduint
dins de la càpsida té la mateixa seq en els dos extrems. I això és així pq després
pugui recircular.
Aleshores, si les terminases introdueixen tot el DNA dins de la

càpsida, no reconeixen una seq i el digereixen quan la càpsida està
plena, pq presenten redundància terminal?
Suposem que el DNA víric va de la A a la Z i aleshores, dins de la càpsida hauria

d’haver tot el DNA víric, de la A a la Z, però com que dins de la càpsida hi cap
molt més DNA del que mesura el DNA cromosòmic víric i com que la terminasa
no reconeix una seq entre la Z i la A següent en aquest concatàmer, el que fa és
que un cop plena la càpsida, digereix entre la A i la B, no entre la Z i la A. Això
voldrà dir que en els extrems del DNA que ha entrat hi tenim As. Per tant el primer
tall serà A-A, el següent B-B i així successivament. Això és el que s’anomena
permutació cíclica.
El DNA que hi cap dintre de la càpsida és exactament la mida que té

el cromosoma víric?
No, el DNA víric és més petit que la càpsida i llavors pot cabre més material
genètic.
Quines són les condicions pq un bacteriòfag pugui fer transducció

generalitzada?
Que segueixi un cicle lític, que s’encapsidi per càpsida plena, que la terminasa
no reconegui una seq gaire específica per tal de que aquesta també es pugui
trobar en el cromosoma bacterià i que no hi hagi tampoc gaire especificitat
d’hoste, que es tracti d’un virus més general.
Què és la transducció especialitzada o restringida?
Aquella en la qual el fag s’insereix en el cromosoma, després s’escindeix,

s’emporta un tros de DNA de l’hoste i s’encapsida.
2. S’ha infectat la soca la soca UA3456 (Suam) de S. enterica amb el bacteriòfag

P22vir 18am. Amb el lisat obtingut es pretén realitzar una transducció sobre
les soques UA4401 (Thr- Suam) i UA4402 (Thr-) de S. enterica amb la intenció
d’obtenir transductants Thr+. Amb quina de les dues soques creus que
s’obtindrà una freqüència més elevada de transducció?
Nota: El producte del gen 18 del bacteriòfag P22 és la proteïna responsable
de l’inici de la seva replicació. A més aquest bacteriòfag és un mutant
virulent incapaç de realitzar un cicle lisogen.
Què vol dir 18am?
Que aquest gen (codifica per la prot 18) té un stop de tipus ambre, per tant, no
es podrà acabar de sintetitzar la prot i no serà funcional. Com no és funcional,
aleshores el bacteriòfag P22 no es podrà replicar. Només podrà fer-ho quan es
produeixi una transducció amb una soca supressora ambre.
Quin tipus de transducció es produirà entre el llisat i les soques

UA4401 i UA4402?
Una transducció generalitzada, ja que es tracta d’un fag virulent. El virus

transductant hauria de portar els gens necessaris per la síntesi de treonina. I un
cop dins de la cèl, ha d’haver una recombinació homòloga amb el gen afectat de
les soques receptores, pq al final la soca deixi de ser auxòtrofa per la treonina.
3. S’ha obtingut un lisat del bacteriòfag λ a partir d’una soca salvatge d’E.
coli. Amb aquest lisat s’ha portat a terme un experiment de transducció
sobre la soca E. coli UA4555 que és RecA- i Gal-. S’obtindran transductants
Gal+? Què passaria si l’experiment es portés a terme amb el bacteriòfag P1
en lloc del λ?
El fag λ fa transducció especialitzada pq pot seguir un cicle lisogen i el seu DNA
cromosòmic es pot integrar en el cromosoma del bacteri. S’integra entre els gens
gal i bio, és a dir, 2 gens específics (per sintetitzar galactosa i biotina). Aleshores
es podrien obtenir transductants Gal+, però pq això es produeixi, el fag λ s’ha
d’escindir incorrectament del cromosoma bacterià i emportar-se el gen gal.
El bacteriòfag P1 (tot i que pot seguir un cicle lisogen es queda extracromosòmic,

no s’integra en el cromosoma bacterià) fa transducció generalitzada, és a dir,
que s’obtindran partícules víriques que contenen DNA només víric o bacterià.
Per tant, si una partícula transductant del bacteriòfag P1 conté el gen gal, infecta
una altra soca, s’introdueix el DNA i aquest DNA un cop dins de la cèl ha de
recombinar homòlogament depenent de RecA. Però en el cas que ens
presenten, la soca infectada és RecA- i, per tant, no s’obtindran transductants
Gal+.
4. Disposem d’un mutant virulent del bacteriòfag λ que presenta una mutació
en la regió OR1 de l’operador del promotor PR. Amb aquest bacteriòfag
s’infecta una soca lisògena per a λ. Creus que s’obtindran calbes? Què
passaria si el mutant fos virulent a causa d’una mutació al gen cI?
Aquest fag λ seguirà sempre un cicle lític. La mutació que presenta es troba en
el promotor PR, el qual controla l’expressió del gen cro (i O, P i cII). Si tenim
nivells alts de cro, voldrà dir que seguirà un cicle lític (80% o més). I si tenim
nivells elevats de cI, anirà cap a un cicle lisogen.
La regió OR1 es troba al costat del promotor P R i s’hi pot unir tant cro com cI, tot
i que cI té més afinitat per aquesta. Per tant, s’hi unirà primer cI.
L’operador OR presenta 3 regions: OR1, OR2 i OR3, i controla el promotor PR i el

PM (síntesi de cI -> repressió síntesi de cro). OR2 controla els dos promotors i
OR3, el PM.
La prot cI es pot unir a les tres regions de l’operador però primer s’uneix a l’1,
després al 2 i per últim al 3. En canvi, cro s’uneix primer al 3, després al 2 i
finalment a l’1. Quan cI s’uneix a OR1, reprimeix la síntesi de cro. Si hi ha alts
nivells de cI també s’unirà a OR2, fent que la repressió sigui més forta i que
pràcticament l’expressió de cro sigui nul·la. Però quan els nivells són molt alts
també s’uneix a OR3 i aleshores evitarà l’expressió de cI, és a dir,
s’autoreprimirà, pq ja hi ha suficient cI com per reprimir el cicle lític.
Quan aquests nivells baixen, primer es desenganxa del 3 i torna a haver síntesi
de cI.
El que passa en aquest bacteriòfag mutant virulent és que cI no es pot unir a
OR1 i llavors no es pot reprimir el cicle lític i s’indueix la síntesi de cro.
Què són les calbes?
És quan en una placa de Petri, un cultiu en sòlid, no tenim colònies, sinó que tot
està ple de cèls i en les zones on el bacteriòfag hagi infectat les cèls (hi haurà
hagut lisi), en comptes de tenir una placa translúcida, tenim rodonetes que van
engrandint i són més transparents (calbes). Indici que hi ha hagut cicle lític.
5. Mitjançant el bacteriòfag P22 s’han obtingut les següents freqüències de

cotransducció per als marcadors cmlB, pyrD, fabA i aroA de S. Entèrica.
Determinar en quina ordenació es troben aquests gens en el cromosoma

d’aquesta soca.
Què és la transducció?
És un mecanisme de transferència de material genètic horitzontalment. La

transferència es duu a terme mitjançant partícules transductants que porten DNA
bacterià.
Què és la cotransducció?
És la transferència de més d’un gen. Aquesta només es pot dur a terme en la

transducció generalitzada.
6. Disposem d’una soca d’E. coli (Δgal-bio) que conté un plasmidi F’ que li
permet usar la galactosa com a font de carboni i sintetitzar biotina. Es pot
fer servir aquesta soca com a donadora en experiments de transducció
especialitzada amb el bacteriòfag λ?
Aquesta soca té una deleció en el gen gal-bio.
Sí, sempre i quan en el plasmidi la distribució dels gens sigui exactament la

mateixa que té el cromosoma bacterià i s’hagi conservat la regió attB.
La resposta podria ser NO, pq l’únic que sabem és que el plasmidi F’ conté el
gen gal-bio (l’operó gal i el gen per sintetitzar biotina), i pot ser que en el plasmidi
la distribució dels gens sigui separada.
PROBLEMES TEMA 7
1. La replicació d’un plasmidi d’origen hospitalari que codifica resistència a

higromicina B i tetraciclina és sensible a la temperatura. Aquest plasmidi
s’introdueix en E. coli per transformació i després de diverses generacions
es sembren 107 cèl·lules en plaques contenint higromicina que s’incuben a
42°C durant tota una nit. Al matí següent apareixen 15 colònies HygR. Donar
dos mecanismes que puguin explicar la presència d’aquestes colònies.
Dels mecanismes anteriors, hi ha algun que no es produiria en un mutant
RecA-?
Un plasmidi sensible a la T vol dir que a una T restrictiva desapareixerà pq no
pot replicar i aleshores, al llarg de diverses generacions s’acabarà perdent. Això
és degut a que les cèl·lules filles no podran heretar cap còpia, pq el plasmidi no
podrà replicar-se.
Com hem dit, el mecanisme afectat per la T és el de la replicació i, en concret,
afecta a una prot, la Rep (en la replicació per cercle rodant fa un tall en una de
les dues cadenes de DNA del plasmidi, deixa un extrem 3’ OH lliure que s’utilitza
com a primer pq la DNAP III comenci a replicar el plasmidi i aquesta mateixa es
queda unida a l’extrem 5’ per protegir-lo). Aquesta prot també s’encarrega
d’iniciar en un punt en concret la replicació de tipus ϴ. Aquest punt concret
s’anomena oriV.
El gen que codifica per la resistència a higromicina es troba al plasmidi.
Integració del plasmidi en el cromosoma mitjançant recombinació homòloga. Per

això cal que tant el plasmidi com el cromosoma tinguin una seq homòloga i
aquesta podria ser una IS d’un transposó, per exemple.
2. La soca UA5302 d’E.coli Su0 conté el transposó Tn5 (TetR) en el seu

cromosoma. Aquesta soca s’infecta amb el bacteriòfag λ virOam Tn5 (KanR)
i s’obtenen clons KanR amb una eficiència 1.000 vegades inferior a
l’obtinguda quan la cèl·lula infectada és la UA5301 E.coli Su0 amb el Tn10
(TetR). Justifica aquesta diferència.
Una soca supressora 0 vol dir que no és capaç de suprimir cap mutació ocre,
ambre o sèpia.
El bacteriòfag λ pot seguir el cicle lític o lisogen, però aquest és virulent i, per
tant, només seguirà un cicle lític. A més a més, aquest és Oam (la prot O és
necessària per l’inici de la replicació del cromosoma víric, anàloga a la DnaA o
la Rep), és a dir, que té una mutació ambre en el gen que codifica per la prot O
i, per tant, aquesta no serà funcional i no podrà iniciar la replicació del
cromosoma víric, a no ser que infecti una soca Su am. Però en aquest cas, el
bacteriòfag λ infecta una soca Su0 i aleshores no podrà replicar-se i no podrà
seguir un cicle lític. Tot i així s’obtenen clons Kan R.
La resistència a kanamicina ve del cromosoma del fag λ.
Si la soca infectada fos Suam, al final no acabaríem obtenint cap clon Kan R pq la
prot O es sintetitzaria i el fag λ seguiria un cicle lític, amb la qual cosa acabaria
llisant les cèls, provocant la seva mort.
El Tn5 és el que confereix la resistència a Kan als clons obtinguts, ja que salta
del cromosoma víric al bacterià.
Els transposons tenen una baixa freq de transposició i en situacions molt
concretes, ja que a part de ser inespecífics de seq la majoria (excepte el Tn7),
poden afectar a altres gens, ja sigui introduint-se al mig, inactivant-los, o bé
incrementar l’expressió d’aquests. També poden provocar delecions, insercions,
canvis en l’orientació de fragments de DNA, duplicacions, etc. Aquests canvis
seran negatius en la major part dels casos.
Existeixen mecanismes de regulació de la transposició, com el del Tn5, el qual
té el gen per la transposasa però també per l’inhibidor de transposasa (són la
mateixa molèc però la de l’inhibidor és més curta). La transposasa, per dur a
terme la transposició, ha de dimeritzar i per fer-ho cal que les dues transposases
estiguin completes. En canvi, l’inhibidor és més curt i quan dimeritza amb una
transposasa sencera, aquest híbrid (transposasa inactiva) no forma el centre
actiu i no pot dur a terme la transposició. De forma normal hi ha més inhibidor
que no pas transposasa pq no hi hagi una alta freq de transposició. Excepte en
un moment determinat, en el qual els nivells s’inverteixen, tot i que igualment
segueix havent més inhibidor que transposasa, però ara en alguns casos es
podrà dur a terme la transposició i en d’altres no.
3. La soca UA5302 d’E.coli Su0 és portadora dels plasmidis pUA455 (TetR) i

pUA578 (KanR). S’infecta un cultiu d’aquesta soca amb el bacteriòfag λ Oam
Tn3 (AmpR) i després d’una nit d’incubació, s’extreu el DNA plasmídic de
les cèl·lules i es transforma la soca MC1061 d’E. coli amb un sol tipus de
plasmidi. Com a conseqüència de la transformació s’obtenen els següents
clons:
a) TetR KanR AmpR
b) TetS KanR AmpR
c) TetR KanS AmpR
i. Explica l’origen de cadascun d’aquests clons.
ii. Ordena’ls en ordre decreixent segons la freqüència amb la que creus que
s’obtindria cadascun d’aquests fenotips.
Aquest fag λ no podrà seguir
un cicle lític pq no pot replicar
el seu cromosoma víric.
La transformació és un
mecanisme de transferència
genètica entre cèls, però en
el lab es fa de manera
artificial.
La freq d’obtenció dels clons
amb les 3 resistències es molt poc freq pq requereix de més passos per
aconseguir-ho, que no pas en els casos en que només tenen 2 resistències.
4. En un mutant RecA- d’E. coli resistent a les sals d’amoni quaternari, a

l’ampicil·lina i a les sulfamides s’introdueix el plasmidi pUA678 que té
replicació sensible a la temperatura i que codifica resistència a la
kanamicina, però no és portador de cap seqüència d’inserció ni de
transposons. Després de sembrar la soca portadora del plasmidi en
plaques LB amb sulfamida, ampicil·lina i kanamicina i incubar-les a 42°C
durant 1 dia s’obtenen clons capaços de créixer en aquestes condicions
amb una freqüència d’aproximadament 10-3 (1 colònia cada 1000). Quin és
l’origen d’aquests clons?
Ens diuen que el plasmidi no té ni IS ni Tn, però no ens diuen res sobre integrons.
Per tant, podria ser que la soca contingués un integró.
D’integrons trobem 2 tipus i un d’ells són els integrons mòbils. D’aquests n’hi ha
4 tipus i un d’ells (Tipus I) és molt important pq és responsable màxim de la
disseminació de resistència a antibiòtics entre soques hospitalàries.
Una de les característiques d’aquests integrons mòbils de Tipus I és que sempre
presenten 2 resistències que permeten identificar-los: les resistències a amonis
quaternaris i desinfectants sulfamides. I per tant, efectivament la soca conté un
integró mòbil.
Els integrons codifiquen per la integrasa, la qual permet la integració dins de
l’integró de orf (cassettes) que tenen seq reconegudes per la integrasa pq
reconegui allò com un cassette. Un cop integrats, l’integró conté un promotor i
això fa que aquell cassette integrat passi a ser immediatament funcional. En
aquest cas, el més segur és que la soca contingui un integró mòbil de Tipus I
que hagi integrat el gen de resistència a Kan.
Problemes addicionals
5. Un cultiu d’una soca d’Escherichia coli K12 lisògena pel bacteriòfag λ i

portadora d’un plasmidi que codifica resistència a la tetraciclina (Tet R) i al
cloramfenicol (CamR), ha estat irradiada amb llum ultraviolada per induir al
pròfag. Amb les partícules víriques obtingudes s’ha infectat un cultiu d’una
soca d’Escherichia coli Gal- TetS CamS, i s’han obtingut, després de
sembrar a les plaques adequades, colònies Gal+ TetS CamS, Gal+ TetR CamS
i Gal+ TetS CamR. Com es poden explicar aquests resultats? Dels tres tipus
de colònies, quin es trobarà amb més freqüència?
La llum UV indueix mutacions en el DNA i aquestes mutacions (RecA activada)
provoquen autòlisi de la prot cI i això estimula el cicle lític.
Els dos últims tipus de clons no seran tan freq, ja que a banda de saltar el
transposó, també ha de tenir lloc la transducció especialitzada amb escissió
incorrecta.
PROBLEMES TEMA 8-9-10
1. Es vol introduir el plasmidi pUA4010 mitjançant conjugació en una soca de

Pseudomonas putida. Aquest plasmidi és d’ampli espectre i codifica
resistència a kanamicina i tetraciclina. La soca receptora és resistent a
estreptomicina mentre que la soca donadora és salvatge.
La conjugació és la transferència de material genètic horitzontal d’una cèl
donadora a una de receptora a través d’un canal El pili és el receptor, el qual
utilitza la cèl donadora per saber que hi ha una cèl potencialment receptora prop
d’ella. És com una antena que busca cap a l’exterior i en el cas d’haver una cèl
receptora, la identifica pq s’uneix a una prot que es troba en l’embolcall d’aquella
cèl, es crea aquesta unió i el pili comença a despolimeritzar-se per la seva base,
de tal manera que va atraient l’altra cèl que s’aproparà a la donadora. Quan es
trobin prou a prop, aleshores ja s’havia format prèviament en la cèl donadora una
estructura que permet aquesta transferència de DNA d’un lloc a un altre. El que
es crea és un canal de transferència de DNA a partir d’una estructura que la cèl
també fa servir per secretar molèc a l’exterior (Tipus IV → la seva funció bàsica
és la de conjugació).
Per conjugació es pot transferir DNA plasmídic (de plasmidis conjugatius) i part
del DNA cromosòmic. Pq el DNA cromosòmic pugui ser transferit per conjugació,
cal que el plasmidi conjugatiu (o un plasmidi mobilitzable) s’hagi integrat en el
cromosoma.
Per què quan tenim el plasmidi conjugatiu integrat en el cromosoma,

aquest últim es pot començar a transferir a una cèl receptora?
Un plasmidi requereix de la regió oriT pq sigui reconegut per la relaxasa i la

coupling protein, de tal manera que aquest fragment de DNA és agafat i conduït
fins a l’altra cèl. Aleshores si tenim el plasmidi conjugatiu integrat en el
cromosoma, ara el cromosoma també conté la regió oriT. I, per tant, quan
comenci la conjugació, independentment de si hi ha alguna còpia d’aquest
plasmidi en el citoplasma, com que el cromosoma també té un oriT, la relaxasa
també pot identificar aquesta seq com un DNA que s’ha de transferir. Aquesta
farà el nick, és a dir, tallarà una de les dues cadenes i començarà a transferir el
DNA cromosòmic en forma de ssDNA cap a l’altra cèl. S’emportarà el fragment
de plasmidi que hi hagi des de l’oriT fins que comença el cromosoma, i després
continuarà amb el cromosoma sense cap mena de problema. El que passa és
que el temps no és el suficientment llarg com per transferir tot el cromosoma
sencer cap a l’altra cèl.
Aquestes cèls que tenen un plasmidi conjugatiu integrat en el cromosoma i, per

tant, tenen la capacitat també de transferir per conjugació un fragment de
cromosoma, s’anomenen Hfr (Hish frequency of recombination).
a) En quines plaques selectives s’hauria de sembrar la barreja de

conjugació per obtenir clons de P. putida que continguin el plasmidi
pUA4010?
En plaques en medi ric que continguin Kan, Tet i Str, pq si ha incorporat el
plasmidi tindrà les resistències del plasmidi i la de la cèl receptora.
b) Què creus que passaria si les plaques selectives només tinguessin
estreptomicina?
Creixerien totes les cèls receptores, tant les conjugades que hagin rebut el
plasmidi, com les que no. Per tant, no seria un bon mecanisme de selecció.
2. Els plasmidis pUA357 i pUA412 (pertanyen al mateix grup

d’incompatibilitat, són estables a E. coli i presenten el mateix número de
còpies) codifiquen respectivament els gens de KanR i TetR. Cap d’aquestes
dues resistències està associada a un transposó. Ambdós plasmidis
s’introdueixen a la vegada mitjançant conjugació a una soca salvatge d’E.
coli. Dels transconjugants obtinguts, un 49.5% son TetR KanS , un altre
49.5% son TetS KanR i un 1% son TetR KanR.
Que pertanyin al mateix grup d’incompatibilitat vol dir que presenten el mateix
sistema de regulació de la replicació o segregació. El que passarà serà que al
llarg de diverses generacions ,un d’ells acabarà excloent l’altre. Al final acabarem
obtenint en aquest cas, clons resistents només a Tet o bé clons resistents només
a Kan.
Els clons resistents a Kan i sensibles a Tet provenen del plasmidi pUA357 que
ha desplaçat a l’altre plasmidi, pq són incompatibles. En canvi, els clons
resistents a Tet i sensibles a Kan provenen del plasmidi pUA412 que ha
desplaçat l’altre plasmidi. Però també pot haver passat que només s’hagi
transferit un dels plasmidis en cada cas, en comptes dels dos.
a) Com es poden explicar els transconjugants que presenten la doble

resistència?
Que es formi un cointegrat pq en el cas que s’hagin transferit els dos
plasmidis, aquesta és l’únic opció que puguin coexistir els dos alhora i, per
tant, la cèl sigui resistent als dos antibiòtics. Aquest cointegrat es forma pq
els dos plasmidis presenten una regió homòloga que permet la recombinació
entre ells.
Una altra opció seria que un dels dos plasmidis s’integri en el cromosoma o
bé per mitjà de transposons, però l’enunciat ens diu que cap de les
resistències està associada a un transposó.
b) Si volguéssim eliminar la presencia de transconjugants resistents a
ambdós antibiòtics, quina mutació hauria de tenir la soca d’E. coli
receptora?
Hauria de tenir una mutació, el fenotip de la qual fos RecA -, pq així no es
podria donar la recombinació homòloga.
3. Amb els plasmidis:

 pUA793: IncP TetR / 1-2 còpies per cromosoma
 pUA983: IncP KanR Repts / 30-40 còpies per cromosoma
fem la següent conjugació triparental amb les soques:
i. E. coli RecA- Pro- Tyr- RifR

ii. E. coli (pUA793)
iii. E. coli (pUA983)
Per detectar els transconjugants (després de deixar un cert temps de

conjugació, es deixa que creixin durant un temps les cèls), sembrem en
plaques de LB + Tet + Rif i en plaques de LB + Kan + Rif incubant un parell
de cada tipus de plaques a 30°C i 42°C.
El plasmidi pUA983 acabarà desapareixent al llarg de diverses generacions a

una T restrictiva, ja que té la prot Rep termosensible, fet que provoca que aquest
plasmidi no es pugui replicar a T restrictiva.

Per fer la conjugació parental, com a mínim un dels plasmidis ha de ser

conjugatiu i l’altre mobilitzable o conjugatiu.
La cèl receptora final serà la que no conté cap plasmidi d’entrada i per
seleccionar-la al final caldrà plaquejar-la en un medi amb Rif. A més a més, el
medi també haurà de contenir Pro i Tyr, ja que aquesta soca és auxòtrofa per
aquests dos aa.
Els dos plasmidis pertanyen al mateix grup d’incompatibilitat, amb la qual cosa
un acabarà desplaçant l’altre.
a) A quines plaques obtindrem transconjugants per a cada temperatura?

Hem de tenir en compte que en una conjugació triparental la cèl receptora
rebrà els dos plasmidis!!
LB+Tet+Rif (30ºC)
No creixerà res, ja que el plasmidi pUA983 (mig nº de còpies) desplaçarà el
pUA793 (baix nº de còpies), però com no té resistència a Tet acabarà morint
la cèl.
En medi líquid sí que és possible que s’acabi imposant el plasmidi que
presenta resistència a l’antibiòtic present en el medi, tot i ser de baix nº de
còpies, però a l’estar en un medi sòlid això és difícil que passi.
LB+Tet+Rif (42ºC)
Creixerà la soca amb el pUA793, pq pUA983 presenta la Rep termosensible,
el plasmidi no es podrà replicar a 42ºC, amb la qual cosa s’acabarà perdent
i, per tant, no podrà desplaçar el pUA793 que és resistent a Tet.
LB+Kan+Rif (30ºC)
Creixerà la soca amb pUA983, ja que desplaçarà el pUA793 i a més a més,
té resistència a Kan.
LB+Kan+Rif (42ºC)
No creixerà res, pq pUA983 presenta la Rep termosensible, el plasmidi no es
podrà replicar a 42ºC, amb la qual cosa s’acabarà perdent i, per tant, no
podrà desplaçar el pUA793. Però com el pUA793 no presenta resistència a
Kan, doncs la cèl acabarà morint.
b) Variaria el resultat si la soca receptora fos RecA+?
Sí, pq es podria formar un cointegrat entre els dos plasmidis per
recombinació homòloga. Aleshores, obtindríem clons en totes les plaques
resistents a Tet i Kan (+Rif de la pròpia soca). I la T restrictiva no seria un
problema, pq el cointegrat presenta 2 oriV (un de cada plasmidi) i si no es

pot replicar pel del pUA983, ho farà pel de pUA793.
c) Quin és l’origen dels possibles clons TetR que poden aparèixer a 30°C
quan la soca receptora és RecA-?
En els dos casos en que no ens creix res podríem acabar obtenint clons
resistents a Tet o bé a Kan, en cada cas respectivament, a través d’un
transposó que salti, ja que aquest mecanisme és independent de RecA.
4. A les figures 1 i 2 es representen respectivament els mapes del cromosoma

i d’un plasmidi R’ que estan presents en una soca d’E.coli StrS. Després de
fer una conjugació entre aquesta soca i un doble mutant Lys− Ilv− StrR s’han
aïllat recombinats Lys+ Ilv+ StrR. Com es poden justificar els resultats
obtinguts?
Un factor prima (megaplasmidi) és aquell que es forma quan es dona l’escissió
d’un plasmidi conjugatiu que està integrat en un cromosoma i a part de tenir els
gens necessaris per la conjugació i el plasmidi en sí, té part del cromosoma del
que s’ha escindit.
Pq la soca resultant acabi sent Lys+ Ilv+ StrR, s’han hagut de transferir els gens
que codifiquen per aquests aa a la soca receptora i aquests es troben en el
cromosoma, i no pas en el plasmidi R’.
Per tant, observant que tant el cromosoma com el plasmidi tenen una seq
d’inserció idèntica, la IS1, s’ha hagut de donar una recombinació homòloga entre
el cromosoma i el plasmidi en aquests 2 llocs. Aleshores el plasmidi R’ s’integrarà
en el cromosoma, la soca esdevindrà Hfr i com conté un oriT i una regió mob, es
podrà començar a transferir el plasmidi i a continuació, els gens de Lys i Ilv cap
a la cèl receptora.
Important que la regió mob estigui orientada correctament pq els gens que es
transfereixin del cromosoma siguin els de Ilv i Lys!!
PROBLEMES TEMA 11
1. El plasmidi pUA2052 codifica resistència als β-lactams (β-lactamasa) i a les

fluoroquinolones. Es vol estudiar l’evolució del número de còpies d’aquest
plasmidi en una soca d’E. coli que creix en diferents condicions de cultiu.
Quin dels següents mètodes és el més idoni:
a) Analitzar la concentració mínima inhibitòria (CMI) per a l’ampicil·lina.
b) Analitzar la CMI per a la fluoroquinolona.
c) Es pot analitzar indistintament la CMI per a un o altre antibiòtic.
La CMI d’un antibiòtic és la concentració d’antimicrobià mínima necessària pq hi

hagi inhibició del creixement de la cèl o bé provoqui la mort d’aquesta.
Hi haurà una correlació entre el nº de còpies del plasmidi i la CMI.
Hem de de tenir en compte quin és el mecanisme que utilitza aquest antibiòtic

per inhibir el creixement cel i quin és el mecanisme de resistència a l’antibiòtic.
Per començar, el mecanisme d’acció de les β-lactamases és trencar l’anell β-
lactàmic que presenten els β-lactams (penicil·lina o ampicil·lina, p.e). Els β-
lactams impedeixen que es formi la paret cel.
D’altra banda, les fluoroquinolones actuen a nivell de replicació i el que fan és

unir-se a les topoisomerases de tipus II, p.e. a la Topo IV (resol els concatàmers
de cromosomes) i atura la forca de replicació. El mecanisme de resistència a les
fluoroquinolones és la síntesi d’un enzim alternatiu (topoisomerasa) amb
mutacions que la fan resistent a aquest antibiòtic i impedeixen que aquest
s’uneixi al centre actiu de l’enzim (afecta la seva activitat lligasa). Canvien la seva
diana.
Si tenim més β-lactamasa (augmentem el nº de gens de resistència), la soca

serà més resistent a concentracions més altes d’antibiòtic (ampicil·lina), pq a
concentracions més altes d’antibiòtics i també de β-lactamasa, la cèl serà capaç
de resistir amb més intensitat a l’antibiòtic. Si observem que la concentració
d’antibiòtic a la que el cultiu és capaç de resistir augmenta, vol dir que estarem
augmentant el nombre de còpies.
En el cas de la resistència a fluoroquinolones, a la que hi hagi una topoisomerasa

mutada resistent que ja pugui fer la seva funció, serà independent de que hi hagi
una major concentració d’aquestes pq quan tinguem una quantitat suficient
d’aquestes, s’arribarà a un estat plateau. És a dir, si tenim més quantitat de gens
d’aquesta topo, la resistència serà igual, ja que la diana ja està canviada i
l’antibiòtic no l’afecta a partir d’una certa concentració.
Per tant, el mètode més adient serà l’A.
2. Els plasmidis pUA1898 i pUA1899 codifiquen respectivament resistència a

kanamicina (Kan) i trimetoprim (Tpm). La replicació de cadascun d’aquests
plasmidis està coordinada amb la replicació del cromosoma d’E. coli. La
soca UA2000 d’E. coli (pUA1898) és més resistent a la kanamicina quan
creix en medi ric que en medi mínim. De manera contrària, quan aquesta
soca (UA2000) és portadora del plasmidi pUA1899 presenta el mateix nivell
de resistència a trimetoprim tant en medi ric com en medi mínim.
Justifiqueu el comportament diferent d’ambdues soques.
La diferència entre medi ric i medi mínim és que en el ric hi ha més nutrients,
aleshores si les cèls necessiten sintetitzar algun component que s’exhaureix o
del qual necessitem una altra concentració diferent, doncs les cèls tindran més
disponibilitat de recursos.
També depenent de les condicions de creixement de la cèl hi ha més o menys
inicis de replicació, és dir, el temps de duplicació es redueix o s'augmenta
depenent de si està en medi ric o en medi mínim. La conseqüència d’aquest fet
en els plasmidis que són els que contenen la resistència als antibiòtics, és que
augmentarà o disminuirà el nº de còpies de cada plasmidi, donat que la seva
replicació està coordinada amb la del cromosoma. És a dir, que en medi ric
tindrem més còpies del plasmidi que no pas en medi mínim. Però aquest efecte
només l’observem en la soca portadora del plasmidi amb resistència a Kan, el
seu mecanisme de resistència depèn de la dosi gènica.
El mecanisme de resistència a la Kan (aminoglicòsid) és la modificació química
de l’antibiòtic per evitar que aquest porti a terme la seva funció. En concret, pateix
una fosforilació.
En el cas del Tpm (inhibeix la ruta de síntesi de l’àcid fòlic), el mecanisme de
resistència és la síntesi d’un enzim alternatiu que permet la síntesi d’àcid fòlic i,
per tant, també de nucleòtids.
3. S’ha aïllat una soca d’E. coli que presenta una mutació en un únic gen i
com a conseqüència és resistent a tetraciclina, cloramfenicol, salicilat i
Dinitrofenol entre d’altres compostos químics. Quin és el gen afectat?
El mecanisme de resistència que permet proporcionar a les soques un gran nº
de resistències (MDR) és el de bombes de reflux, que la cèl utilitza per bombejar
aquests compostos químics cap a l’ext cel. Les bombes de reflux estan formades
per 3 prot o subunitats que juntes formen un complex capaç de traspassar totes
les membranes i la paret cel. Per tant, estem parlant d’un operó que controla
l’expressió de diferents gens. Però ens demanen un gen únic afectat.
Aleshores, hauríem de pensar en un mecanisme de regulació de diferents
operons que depenguin d’un sol gen. Un reguló controla l’expressió de diferents
gens, però el regulador d’aquest reguló és un factor de transcripció, una prot que
s’uneix al promotor del reguló i quan està unida, l’inhibeix o l’activa.
Per tant, el gen afectat és el del regulador d’aquest reguló o operó (regula
l’expressió de les prot d’una bomba de reflux).
Es tracta d’una resistència fenotípica: resposta directa davant un efector que
provoca un augment en la síntesi de les prot que formen aquesta bomba de
reflux.
Si no ens diguessin que és un gen l’afectat, un altre lloc que podria estar afectat,
que presentés una mutació que causés la mateixa conseqüència (els nivells de
bombes de reflux augmentessin) seria el promotor.
4. Expliqueu la raó per la qual la concentració mínima inhibitòria (CMI) de la

kanamicina és superior en una soca d’E.coli si el Tn5 (KanR) està inserit en
el gen thr (unitat 0 del cromosoma) o en el gen his (unitat 44).
Existeix algun efecte del medi de cultiu en aquest fenomen?
La resistència a kanamicina el que fa és modificar l'antibiòtic, fosforilant la
kanamicina que ja no podrà donar lloc a la seva funció (parar la traducció). El
ribosoma podrà dur a terme la seva funció perquè la kanamicina no se li unirà.
La resistència a Kan és dependent de dosi gènica, llavors a més quantitat de
gens, més concentració d’enzim que fosforila la Kan i, doncs més resistència a
concentracions més altes d’antibiòtic. Per tant, sí que hi haurà algun efecte del
medi. Com més a prop de l'oriC en medis amb un temps de generació baix (medi
ric), més còpies tindrem del 1r Tn5 (thr) que del 2n (his).
Per quin motiu aquesta diferència en la CMI no es produeix quan la
resistència és deguda a insercions en gens cromosòmic com el rpsL (unitat
72) o el gen gyrA (unitat 47,5) quan les resistències són a l’estreptomicina
o a l’àcid nalidíxic respectivament?
Pq els mecanismes de resistència d’aquests antibiòtics no són dosi depenents.
L’estreptomicina s’uneix a la subunitat 30S del ribosoma i impedeix l’inici de la
traducció o la seva terminació prematura. El mecanisme de resistència a aquest
antibiòtic és mitjançant la mutació en un dels gens dels rRNA.
En el cas de l’àcid nalidíxic tenim una mutació en una de les subunitats de la
DNA girasa.
5. Una soca d’E. coli portadora del transposó Tn3 inserit en el gen trp quan
creix en medi mínim amb glucosa i triptòfan és resistent fins a una
concentració de 2 μg/ml d’ampicil·lina. Quan aquesta soca es fa créixer en
les mateixes condicions, però transformada amb un d’aquests dos
plasmidis: pUA2222 o pUA2223; que també contenen el mateix transposó,
el nivell de resistència a l’ampicil·lina és respectivament de 4 i 100 μg/ml.
Quin número de còpies per cromosoma hi ha de cada un d’aquests
plasmidis en les soques corresponents?
6. Com es podria saber si la resistència d’una soca de Salmonella

typhimurium a l’ampicil·lina és deguda a una mutació en la diana de la paret
cel·lular o a la producció d’una β-lactamasa?
Podríem analitzar la CMI de l’ampicil·lina per veure si és dependent o no de dosi
gènica. Aleshores, si ens surt que és dependent de dosi gènica, sabrem que la
resistència és deguda a la producció d’una β-lactamasa, sempre i quan estigui
aquesta resistència en un plasmidi o prop de l’oriC. Això és pq en la mutació de
la diana de la paret cel, per més antibiòtic que hi posem, la CMI no canviarà pq
ja tenim l’enzim necessari per inhibir l’activitat de l’antibiòtic.
També hauríem d’e comprovar que augmentant el nº de còpies, també augmenta
la CMI.
Una altra opció seria una estratègia que s’està utilitzant actualment per millorar
l’eficiència dels antibiòtics β-lactams i inhibir de forma competitiva la resistència
a aquests per β-lactamases, que és afegir unes molèc (NO antibiòtics, àcid
clavulànic, p.e) que presenten una estructura similar a l’anell β-lactàmic dels β-
lactams i, aleshores les β-lactamases també actuen sobre aquestes molèc i es
dona una competició per substrat. Com que la β-lactamasa intenta digerir els dos
substrats, això provoca que l’efecte del β-lactam a unes dosis més baixes, sigui
més ràpid i pal·liatiu en el temps. Si la resistència es veu disminuïda quan
s’afegeix àcid clavulànic al medi, és pq la resistència és deguda a β-lactamases.

Problemes Resoltos

Uploaded by

Document Information

Original Title

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

Problemes Resoltos

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

Sara Andújar Palomino MM, BIOTEC-

Com s’estudia la funció d’un gen en el fenotip en el desenvolupament

Suposem q fem una sèrie de mutacions amb un gen q desconeixem:

Tenim una forca de replicació i 2 Pol q hi participen (la Pol I i la III).

Si l’activitat afectada és la polimerasa, aleshores la cèl no seria viable, ja q la Pol I

1. Representa gràficament l’evolució al llarg del temps de la concentració de

soca salvatge: soca que no té mutacions

DNA: la seva concentració augmentarà pq el cromosoma es replica i hi ha

c) Una soca d’E. coli mutant sensible a la temperatura a l’inici de la

replicació cromosòmica creixent a temperatura no restrictiva.

La seq de les caixes-DnaA reconegudes per les DnaA de H.pylori i E.coli NO és

b) Quan s’incrementa fins a 42ºC la temperatura d’incubació d’un cultiu

d) Després de 50 minuts d’incrementar fins a 42ºC la temperatura

En aquest cas, totes hauran acabat la fase C (replicació) pq aquesta dura 40

Pq es pugui iniciar un altre cicle de replicació cal q hi hagi concentracions

Hem de recordar q normalment la replicació de cromosomes bacterians és

Del C1 tindrem 1 cromosoma per cèl i del C2, ½ cromosoma.

5. Les cèl·lules d’una soca d’Agrobacterium tumefaciens presenten dos

Del C1 tindrem 1 cromosoma per cèl i del C2, ½ cromosoma.

Recordem un altre cop q

Els gens q es trobin

Del C1 tindrem 1 cromosoma per cèl i del C2, ¼ .

7. S’ha aïllat un mutant d’ E. coli sensible a la temperatura en el procés de

En quin moment de la replicació del cromosoma creus que està afectat

PROBLEMES TEMA 2-3

L’operó lactosa és el primer q es va descobrir com funcionava la seva regulació, és

Com funciona el catabolisme de la lactosa?

Com funciona el sistema?

- D’entrada, tenim una expressió constitutiva del repressor, és a dir, la cèl

- Recordem q això és a nivell basal, q realment sí q hi haurà transcripció, però

S’han trobat molts mutants de l’operó lactosa:

- lacI-: repressor q té una mutació en la seva estructura q li impedeix unir-se a

La mutació lacI és recessiva, ja q pot ser complementada en trans.

Si fem la transformació amb un plasmidi en trans, igualment no hi haurà expressió de

1. Un laboratori de recerca disposa de vàries soques d’Escherichia coli que

lac-1 → LacZ- Mutació que fa no funcional a la proteïna LacZ

En aquest cas no hi haurà síntesi de β-galactosidasa.

lac-2 → LacOC Expressió elevada de l’operó Lac degut a un defecte al punt

El punt vermell hauria d’estar situat sobre de l’operador, ja q la mutació és en la seq de

lac-3 → LacId Repressor defectiu

lac-4 → LacIs Repressor insensible a l’inductor

lac-5 → LacZ- Mutació polar molt forta al gen lacZ

lac-6 → LacI- Mutació ambre al gen del repressor

lac-7 → LacY- Mutació que fa no funcional a la proteïna LacY

En aquest cas no tindrem expressió de la permeasa.

En aquest cas tenim 3 mutacions alhora. Si ens fixem en la de lac-4 i lac-2, la q

En aquest cas tenim un plasmidi transformat en un cromosoma. En el plasmidi tenim

Aleshores en conjunt tenim un repressor inactiu q no es podrà unir mai a l’operador, un

l’expressió de LacZ es veurà sempre inhibida a no ser q hi hagi inductor (IPTG). En

En aquest cas en el plasmidi tenim un repressor no funcional i en el crom, un repressor

El repressor insensible a l’inductor es podrà unir a l’operador wt, reprimint l’expressió de

En el plasmidi no es podrà unir el repressor a l’operador pq és constitutiu, per tant, el

En aquest cas, en quant a repressor, tenim la mateixa situació q en la soca anterior,

En aquest cas tenim un repressor wt i un operador constitutiu en el crom, i un repressor

2. S’està estudiant la concentració de β-galactosidasa de diferents soques

En aquest cas tenim un operador constitutiu en el qual NO es podrà unir el

En aquest cas NO tindrem síntesi de LacZ pq la prot no és funcional i tot i tenir

El gen cya és el q codifica per l’adenilat ciclasa (ATPcAMP), q en aquest cas

El gen crp és el q codifica per la prot CRP/CAP, q en aquest cas no és funcional

a) Qui creus que podria ser el regulador transcripcional d’aquest reguló?

pq la seva presència disminueix la transcripció. Ara si observem el fet q hi

4. L’operó Uab està format per set cistrons diferents (uabABCDEFG).

2. Mutació q provoqui un corriment en el marc de lectura donant lloc a una