TEMA 1: TÈCNIQUES IMMUNOLÒGIQUES

1. RESPOSTA IMMUNITÀRIA

El sistema immunitari és el conjunt d’òrgans, cèl·lules, molècules i mecanismes que

protegeixen l’organisme d’agents infecciosos o de cèl·lules pròpies que estan infectades o
alterades.

Està format per:

• Mecanismes inespecífics de protecció, formen la immunitat específica, innata o
natural.
Són els primers en actuar i responen de manera semblant davant qualsevol agent.
• Mecanismes específics de protecció, formen la immunitat específica, adquirida o
adaptativa.
Actuen quan els mecanismes inespecífics de protecció no poden resoldre la
situació.

1.1. MECANISMES INESPECÍFICS DE PROTECCIÓ

Els nadons de 4-5 mesos estan protegits per la resposta immunitària inespecífica i
anticossos de la mare.
A partir dels 8 mesos comencen a sintetitzar anticossos propis.
1.2. MECANISMES ESPECÍFICS DE PROTECCIÓ

Si un agent estrany supera els mecanismes inespecífics de protecció, es posen en marxa

els mecanismes específics de protecció.
Es caracteritza per la síntesi d’anticossos per a respondre contra antígens.
Un antigen és una substància que provoca una resposta immunitària, estimulant la
fabricació d’anticossos.
Es caracteritza per tenir un pes molecular alt i és químicament diferent a l’organisme per
poder detectar-lo.
Tot i així, algunes substàncies pròpies també poden actuar com antígens (malalties
autoimmunes).

Les cèl·lules dendrítiques (CPA) vigilen les possibles vies d’entrada dels patògens.
Les cèl·lules responsables de la immunitat específica són els limfòcits.
Perquè es produeixi la seva activació és necessari que una CPA les presenti a l’antigen.
La CPA expressa a la seva membrana l’antigen unit a la molècula del CMH (Complex
Major d’Histocompatibilitat).
Llavors s’activen i diferencien els limfòcits i es produeix l’activació i proliferació dels
limfòcits.

Els limfòcits T tenen receptors específics (TCR) que identifiquen:

- L’antigen que la cèl·lula presentadora exposa.
- La proteïna del CMH a la qual està fixat l’antigen.

Sense l’acció de la CPA els limfòcits no poden reconèixer l’antigen.

Els antígens dissulars seran presentats als limfòcits T a nivell de ganglis limfàtics.
Els ganglis limfàtics estan distribuïts per tot el cos i funcionen com a filtres per veure si hi
ha algun patogen.
Els antígens emòtics es presenten a nivell de la melsa.
Els antígens de pell o mucoses es presenten en el teixit limfoide associat amb mucoses.

Segons l’origen de l’antigen s’activen:

• Limfòcits Th, reconeixen antígens units a molècules del CMH de classe II.
Els CMH de classe II són les cèl·lules presentadores d’antigen.
Aquests limfòcits activen als limfòcits B, els quals sintetitzen cèl·lules
plasmàtiques.
• Limfòcits Tc, reconeixen antígens units a molècules del CMH de classe I.
El CMH de classe I el porten totes les cèl·lules nucleades.
Aquests limfòcits destrueixen les cèl·lules infectades, però part d’elles
romandran com cèl·lules de memòria.

Els limfòcits B activats tenen receptors específics que reconeixen directament l’antigen,
sense necessitar una cèl·lula presentadora.
A més, també inicien la producció d’anticossos o d’immunoglobulines.
Els anticossos s’uneixen als antígens.
Els anticossos estan formats per 2 cadenes lleugeres i 2 cadenes pesades que estan
enllaçades entre elles.
La zona d’unió de l’antigen s’anomena epítop, és la zona d’unió de l’antigen amb l’anticòs.
La zona d’unió de l’anticòs s’anomena paràtop, és la part de l’anticòs que s’uneix a
l’antigen.
Les immunoglobulines són molècules produïdes per les cèl·lules plasmàtiques, i poden
ser de 5 classes diferents en funció de la seva cadena: IgA, IgG, IgM, IgD, IgE.
Els anticossos es dirigeixen contra antígens de membrana i contra toxines secretades, i
actuen per diferents mecanismes després de la unió antigen-anticòs:

• Neutralització, es col·loquen a sobre del patogen o la toxina, mediada pels isòtops

IgG, IgM i IgA (sobretot apareix en mucoses i secrecions).
La unió Ag-Ac provoca la neutralització de l’agent.

• Opsonització i fagocitosi, l’anticòs detecta l’antigen i marca al patogen, llavors les

cèl·lules fagocítiques, mediades per IgG i C3b (substància involucrada en el
sistema complement), detecten el patogen marcat i l’eliminen.
Els macròfags tenen abundants receptors del fragment Fc dels anticossos i per
factors del complement.

• Activació del complement per via clàssica, es produeix la lisi dels patògens.

• Citotoxicitat cel·lular depenent de l’antigen, s’activen les cèl·lules NK mitjançant

els anticossos.
Els anticossos reconeixen als antígens que es troben a la membrana de la cèl·lula
infectada i s’uneixen a ells i serveixen de pont entre la cèl·lula alterada o infectada i
les cèl·lules NK.
Les cèl·lules NK secreten enzims que activen l’apoptosi (mort cel·lular programada)
de la cèl·lula infectada.

2. DINÀMICA DE LA RESPOSTA HUMORAL

Conèixer la resposta humoral és bàsic per realitzar un seguiment serològic de la malaltia

infecciosa.
L’estudi dels components del sistema immunitari que s’han activat ajuda a aconseguir un
diagnòstic.

Immunitat cel·lular: tot el referent als limfòcits Th i Tc.

Immunitat humoral: tot el referent a la síntesi d’anticossos.
2.1. RESPOSTA D’ANTICOSSOS

Els anticossos proporcionen una resposta específica davant un tipus concret d’antigen.
Si es detecta un anticòs determinat en sang, es pot deduir que hi ha hagut contacte amb
l’antigen corresponent.
Segons l’isòtop d’Ig detectat i la seva quantitat, podem obtenir informació sobre la
infecció.

A més, es formen limfòcits B de memòria capaços de respondre ràpidament si es presenta

novament el mateix antigen.
Gràcies a això es poden detectar infeccions antigues.

Amb el diagnòstic serològic s’estudia anticossos sèrics que donen informació sobre
antígens presents o que han estat presents, i també sobre l’evolució de la infecció.

La resposta d’anticossos es divideix en diverses fases:

1) Fase de latència, és el període entre l’entrada de l’antigen i la detecció d’anticossos
específics en sèrum.
2) Fase exponencial, es produeix un augment exponencial d’anticossos.
3) Fase de meseta, es manté el nivell d’anticossos mentre es manté l’estimulació
antigènica.
4) Fase de disminució, els anticossos van neutralitzant l’antigen i els immunocomplexes
Ag-Ac es van retirant de la circulació.

2.2. RESPOSTA PRIMÀRIA I SECUNDÀRIA

En l’estudi d’anticossos en sèrum es distingeix entre:

• Resposta primària, es deu a l’activació de limfòcits B verges, quan no hi ha hagut

contacte previ amb l’antigen.

• Resposta secundària, es deu a l’estimulació de clons de limfòcits B de memòria.

Aquests fabriquen IgG amb més rapidesa i afinitat per
l’antigen, a causa de la maduració de l’afinitat que es
produeix durant la resposta primària.
Si es compara la dinàmica d’anticossos davant un antigen en la resposta primària
respecte la secundària es detecten algunes diferències:

• Dinàmica en sèrum, a la resposta secundària la fase de latència és curta i es

prolonga la fase de meseta i de disminució.

• Nivell d’anticossos, en la fase de meseta de la resposta secundària és 10

vegades major que en la resposta primària.

• Isòtops d’anticossos, a la resposta primària principalment són IgM i a la

secundària IgG.

• Afinitats dels anticossos, és major a la resposta secundària perquè ja s’ha

produït la maduració de l’afinitat.
3. DIAGNÒSTIC I SEGUIMENT DE MALALTIES INFECCIOSES

El diagnòstic de les malalties infeccioses es divideix en 2 fases:

• Diagnòstic de sospita, no proporciona un diagnòstic definitiu de la malaltia.
Es basa en:
◦ Dades clíniques (febre, vòmits...).
◦ Antecedents epidemiològics (aliments consumits, viatges...).

• Diagnòstic de confirmació, detecta l’agent etiològic o l’efecte sobre el sistema

immunitari.
Es basa en:
◦ Diagnòstic etiològic, trobada del patogen o del seu ADN en un fluid o mostra
biològica.
◦ Diagnòstic immunològic, determinació d’antígens o anticossos en mostres
biològiques per a l’estudi de la resposta cel·lular.

3.1. DIAGNÒSTIC SEROLÒGIC DE MALALTIES INFECCIOSES

El diagnòstic serològic és el diagnòstic de certesa que s’estableix mitjançant la detecció

d’antígens o anticossos al sèrum del pacient a través de tècniques d’immunodiagnòstic.

3.1.1. Detecció d’anticossos

Es poden aplicar diferents tècniques d’immunodiagnòstic, dissenyades a partir de diverses

característiques de les Ig.
La detecció d’IgM indica que la infecció està en fase aguda.
La detecció d’IgG indica que la infecció està en una fase avançada.
El paràtop de l’anticòs és hipervariable, perquè s’uneix de forma específica a l’antigen.

3.1.2. Anticossos heteròfils

Els antígens heteròfils són antígens de diferent procedència, però molt semblants
estructuralment.
Per això poden produir reaccions creuades, és a dir, resultats erronis en proves
d’immunodiagnòstic.
Com per exemple els carbohidrats del grup A amb els polisacàrids capsulars
pneumocòccics.
Els anticossos que es formen en resposta a aquests antígens s’anomenen anticossos
heteròfils.
Els anticossos heteròfils generalment són IgM i aglutinen eritròcits de carner.
D’altra banda, s’han trobat anticossos heteròfils en el sèrum de pacients sans i d’afectats
de malalties com la mononucleosi infecciosa.
La mononucleosi infecciosa és una malaltia causada pel virus d’Epstein-Barr (EBV).
L’EBV infecta limfòcits B i produeix un trastorn mieloproliferatiu agut autolimitat i benigne.
La persona infectada produeix anticossos i anticossos heteròfils contra l’EBV.

Els anticossos heteròfils es produeixen gràcies a una expansió policlonal de limfòcits B, i

es detecten per aglutinació d’eritròcits de cavall.
El nombre d’anticossos heteròfils augmenta a la 1 a setmana, arriba al punt màxim a les 2
setmanes i es manté alt durant unes 6 setmanes.

3.2. SEGUIMENT DE MALALTIES INFECCIOSES

El seguiment serològic permet:

- Diagnosticar o ajudar en el diagnòstic.
- Conèixer la fase, l’evolució, el pronòstic... de la malaltia.
- Informar sobre el risc de patir una infecció congènita.

En el cas de les infeccions congènites si es detecten IgG en la sang del nadó, aquests
són de la mare i han passat a través de la placenta.
En canvi si es detecten IgM, aquestes han estat creades per sistema immunitari del nadó.

3.2.1. Seguiment serològic de la toxoplasmosis

En el cas de la toxoplasmosi hi ha 2 situacions en què cal realitzar un diagnòstic:

• Embaràs, hi ha risc de transmissió fetal i la toxoplasmosi congènita té greus
conseqüències.
• Immunodepressió, augmenta la patogènia del paràsit, com per exemple en VIH
pot causar encefalitis toxoplàsmica, la qual causa la mort.

Quan es pateix toxoplasmosi les IgM són les primeres a aparèixer a les 2 setmanes.
Les IgG comencen la seva producció el primer mes, i tal com aquestes augmenten les
IgM van disminuint, excepte en casos crònics.
Les IgG augmenten fins als 3 mesos i després disminueixen però no desapareixen.
Les IgA comencen quasi com les IgM, però tarden més en desaparèixer (3-4 mesos).
Les IgE surten a l’inici de la infecció però durant molt poc temps.

En persones embarassades l’anàlisi es repeteix a les 2-3 setmanes, una quantitat alta
d’IgG significa una infecció recent i una quantitat baixa significa una infecció antiga.
Si quan es fa la prova dona positiu en IgG es miren els IgM.
Si surt negatiu en IgM, significa infecció crònica.
Si surt positiu en IgM, es realitza la prova d’avidesa.
3.3. ESTUDIS SEROEPIDEMIOLÒGICS

La seroepidemiologia és la part de l’epidemiologia que realitza estudis epidemiològics per

a conèixer la seroprevalença mitjançant proves serològiques.
La seroprevalença és el nivell d’anticossos en la població davant determinats agents
infecciosos.

Els valors dels estudis depenen de l’adequada selecció de la població i l’ús d’una tècnica
d’immunodiagnòstic sensible i específica.
La sensibilitat és la probabilitat que havent hi ha hagut contacte amb l’agent infecciós, la
prova doni positiu.
Especificitat és la probabilitat que no havent hi ha hagut contacte amb l’agent infecciós, la
prova doni negatiu.

La seroprevalença és fonamental en els programes de les autoritats sanitàries per

controlar malalties pròpies i malalties importades (cada vegada són més nombroses).
Aporten informació sobre:
• Grups de risc.
• Grups responsables.
• Mecanismes de transmissió.
• Emergència i reemergència.

Depenen de:
• Selecció de la població adequada.
• Tècnica d’immunodiagnòstic adequada, la qual ha de ser sensible, específica i
econòmicament rendible.

4. TÈCNIQUES IMMUNOLÒGIQUES

Les tècniques immunològiques o immunoassajos es basen en la detecció dels

immunocomplexes que es formen gràcies a la propietat dels anticossos d’unir-se
específicament a l’antigen que va desencadenar la seva producció.
Es basen en la producció In vitro de les reaccions antigen-anticòs.
Per exemple, per detectar si en un sèrum hi ha un determinat anticòs es pot afegir
l’antigen corresponent i veure si es formen o no immunocomplexes.

4.1. OBTENCIÓ D'ANTÍGENS

Els antígens es poden obtenir mitjançant:

- Fraccionament o solubilització a partir del patogen.
- A partir del medi de cultiu del patogen (en aquest cas els antígens s’anomenen antígens
secretats o antígens d’excreció-secreció).
- Tecnologia d’ADN recombinant, s’estudia la seqüència del genoma de l’antigen i es fica
dins d’una altra cèl·lula, la qual produirà l’antigen seleccionat).
- Expressió en bacteris infectats amb vectors vírics apropiats, s’injecta ADN o ARN del
bacteri a un altre bacteri mitjançant un virus).
4.2. OBTENCIÓ D’ANTICOSSOS

Els anticossos s’utilitzen com a reactiu de laboratori per fer proves immunològiques.
Es poden preparar anticossos policlonals i monoclonals.

4.2.1. Anticossos policlonals

Com un sol antigen te diferents epítops s’activen diversos clons de limfòcits B, els quals
procedeixen d’una mateixa cèl·lula mare.
Aquestes limfòcits B sintetitzen cèl·lules plasmàtiques, i aquestes produeixen diferents
anticossos.
Cada anticòs és específic per a l’epítop concret d’un antigen.
Aquesta diversitat d’anticossos s’anomena anticossos policlonals.
4.2.2. Anticossos monoclonals

La producció d’anticossos monoclonals no va ser possible fins l’any 1975, quan Köhler i
Milstein van desenvolupar la fabricació d’hibridomes.
Els anticossos monoclonals és la producció d’anticossos a partit d’un únic clon de limfòcits
B.

Producció d’un sèrum monoclonal:

El primer pas per a la producció d’hibridomes és la immunització d’un ratolí amb l’antigen
d’interès.
D’aquest antigen s’extrauen limfòcits B activats que produiran cèl·lules plasmàtiques que
es mesclaran amb cèl·lules del mieloma.
S’han d’eliminar de la fusió aquelles cèl·lules que no s’hagin fusionat i seleccionar les
cèl·lules híbrides que secreten anticossos específics davant l’antigen utilitzat.
Les cèl·lules seleccionades es cultiven per produir l’anticòs monoclonal en elevades
concentracions
Aquestes es sotmetran a múltiples fases de clonació per assegurar l’especificitat de
l’anticòs i l’estabilitat de l’híbrid.
Els hibridomes poden créixer in vitro per a la seva recollida en altes concentracions en el
líquid ascític.
Un cop seleccionats els anticossos monoclonals, es du a terme la seva caracterització, és
a dir, s’avalua la concentració i el títol.
4.3. FONAMENTS DE LES TÈCNIQUES IMMUNOLÒGIQUES

Consisteix en identificar i quantificar immunocomplexes mitjançant diverses tècniques:

• Tècniques indirectes o secundàries, són els canvis en el medi.
Les principals tècniques d’aquest grup són:
◦ Reaccions d’aglutinació, es forma una xarxa antigen-anticòs.
◦ Reaccions de precipitació, es formen complexes grans que precipiten.
◦ Reaccions del sistema complement, els eritròcits actuen com a sistema
revelador.
• Tècniques directes o primàries, són els marcadors, és a dir, enzims i
fluorescència.
Les principals tècniques d’aquest grup són:
◦ Immunofluorescència.
◦ Immunoenzimàtiques.
◦ Radioimmunoanàlisi.
◦ Test immunocromatogràfic.
◦ Western blot.
En totes aquestes tècniques els anticossos es marquen amb enzims, fluorocroms o
amb substàncies radioactives.

TEMA 2: TÈCNIQUES BASADES EN REACCIONS ANTIGEN-ANTICÒS

SECUNDÀRIES

1. TÈCNIQUES SECUNDÀRIES

Les tècniques secundàries mesuren els anticossos de manera indirecta.

La unió antigen-anticòs pot produir reaccions visibles i no visibles.
Les reaccions visibles són:
• Aglutinació, els anticossos s’uneixen a diversos antígens i viceversa i es forma
una xarxa que provoca una aglutinació.
• Precipitació, algunes unions d’antigen-anticòs són massa grans per a poder-se
mantenir i precipiten.

Les reaccions no visibles són:

• Fixació del complement, es produeix la lisis de les hematies.

2. TÈCNIQUES D’AGLUTINACIÓ

Les tècniques d’aglutinació es basen en la capacitat que tenen els antígens per a unir-se
als seus anticossos complementaris, i d’aquesta manera formar immunocomplexes
visibles a simple vista.

L’aglutinació es produeix quan les concentracions d’antígens i anticossos són equivalents.

Si es produeix un desequilibri en les concentracions, es produeix un fenomen de zona i el
resultat és un fals negatiu.

Depenent de si l’antigen és particulat o es necessita insolubilitzar-lo mitjançant la fixació

sobre una partícula o cèl·lula, existeixen 2 tipus d’aglutinació:
• Aglutinació directa, es produeix quan l’antigen és particulat.
• Aglutinació indirecta, es produeix quan l'antigen s’ha d’insolubilitzar.
2.1. TÈCNIQUES D’AGLUTINACIÓ DIRECTA

Les tècniques d’aglutinació directa són simples i sensibles.

Consisteixen en detectar la reacció d’aglutinació que provoca la formació d’alguns
immunocomplexes.
Aquests immunocomplexes es formen a partir de:
- Suspensió d’antígens formes.
- Sèrum d’anticossos davant dels epítops.

Els resultats d’aquestes tècniques són visibles a simple vista.

Per comprovar que el resultat és positiu:
Si la prova es realitza sobre un suport pla, es formen grúmols.
Si la prova es realitza sobre una placa de microtitulació, es forma un vel.
Les tècniques d’aglutinació directa més habituals són: la prova ràpida d’aglutinació en
placa i la hemaglutinació directa.

2.1.1. Prova ràpida d’aglutinació en placa

Utilitza la suspensió de bacteris Brucella tenyides amb rosa de Bengala com a antigen per
al diagnòstic de la brucel·losi.
Permet detectar la presència en sèrum d’anticossos davant la Brucella.
S’utilitza com a prova de descart perquè de vegades s’obtenen falsos positius.

(Pàg 27. Exemple pràctic 1: Tècnica d’aglutinació directa per detetctar la presencia en
sèrum d’anticossos davant la Brucella)

2.1.2. Hemaglutinació directa

Hi ha 4 fenotips ABO: →

Hi ha 2 tipus d’antígens Rh:

• Rh+, eritròcits amb Rho.
• Rh-, eritròcits sense Rho.

Per a la determinació del grup sanguini:

1) S’obtenen 3 gotes de sang i es col·loquen separades
sobre una placa de vidre.
2) A una se li afegeix antisèrum A, a l’altra antisèrum B i a
l’última antisèrum Rh.
3) La gota en què es produeixi aglutinació indicarà que és
d’aquell tipus.
2.2. TÈCNIQUES D’AGLUTINACIÓ INDIRECTA

En les tècniques d’aglutinació indirectes s’utilitzen antígens solubles.

Aquests antígens s’han d’insolubilitzar mitjançant la fixació a un suport que pot ser:
• Sòlid inert (boles de làtex, partícules de bentonita, carbó actiu o gelatina).
• Cèl·lules (eritròcits).

D’aquesta manera es formen artificialment antígens particulats.

Les tècniques d’aglutinació indirecta més habituals són: l’aglutinació de làtex en placa,
l’hemaglutinació indirecta, la inhibició de l’hemaglutinació i les proves de Coombs.

2.2.1. Aglutinació de làtex en placa

És una tècnica senzilla.

Normalment és qualitativa, però es pot convertir en semiqualitativa amb dilucions d’un
sèrum.
El làtex són esferes de poliestirè suspeses en un tampó i a les quals es poden unir
antígens o anticossos solubles.

Aquesta tècnica es sol utilitzar per a la determinació d’anticossos ASO.

L’estreptolisina O és un enzim produït per estreptococs beta hemolítics A, C i G
La determinació d’anticossos ASO al sèrum s’aplica al diagnòstic de febre reumàtica,
glomerulonefritis aguda i infeccions estreptocòcciques.
Si el resultat d’aquesta prova és positiu l’aglutinació es mostra com una granulació fina.
Si el resultat és negatiu l’aglutinació es mostra amb un aspecte lletós.

(Pàg. 29 Exemple pràctic 2: Tècnica d’aglutinació de làtex per detectar la presència en

sèrum d’anticossos ASO)

2.2.2. Hemaglutinació indirecta (HAI)

Com a suport dels antígens s’utilitzen hematies tractades.

La tècnica es realitza sobre una placa de microtitulació amb dilucions de sèrums.
En el cas de resultat positiu apareix un vel rosat al pouet.
En el cas de resultat negatiu apareix un anell o botó roig, ja que si no existeixen
anticossos, les hematies s’aglutinen i acaben sedimentant al fons del pouet.
Aquesta tècnica necessita un control negatiu per a comprovar que no hi hagi
hemaglutinacions al sèrum problema.

(Pàg. 30 Exemple pràctic 3: Tècnica d’hemaglutinació indirecta per realitzar una

determinació quantitativa d’anticossos davant la Toxoplasmosi gondii)
2.2.3. Inhibició de l’hemaglutinació (IHA)

Aquesta tècnica és una variant de l’hemaglutinació indirecta.

L’hemaglutinació es deu a la capacitat que tenen alguns virus i bacteris en poder-se unir a
receptors de membrana d’eritròcits de mamífers i aus.
Això també es pot aprofitar per detectar anticossos específics contra gèrmens.
En absència d’anticossos específics, els antígens del patogen provocarien l’aglutinació
dels eritròcits.
Aquesta tècnica s’utilitza en malalties com la Rubeola.

2.2.4. Proves de Coombs

Aquesta tècnica és una variant de l’hemaglutinació indirecta.

Utilitza el reactiu Coombs, un antisèrum animal, contra globulines humanes.
Quan s’incuba amb glòbuls rojos rentats del pacient, el reactiu provoca la seva
aglutinació.
Hi ha dos variants de la prova de Coombs:
• Prova de Coombs directa, permet la detecció d’anticossos units a eritròcits.
• Prova de Coombs indirecta, permet la detecció d’anticossos lliure en ell sèrum.

(Pàg. 32 Exemple pràctic 4 i 5: Tècnica d’hemaglutinació, prova de Coombs directa i

indirecta.)
3. TÈCNIQUES DE PRECIPITACIÓ

Les tècniques de precipitació es basen en la reacció de precipitació que es produeix quan

un antigen soluble s’uneix a un anticòs específic, creant així immunocomplexes que
precipiten al medi.
Els dos components són solubles i només precipiten quan formen immunocomplexes.

Amb aquestes tècniques també s’ha de treballar amb concentracions iguals d’antígens i
anticossos, per evitar fenòmens de zona que produeixen falsos negatius.
Tant l’excés d’anticossos (prozona) com l’excés d’antígens (postzona) provoquen una
disminució de la concentració d’immunocomplexes.

3.1. TÈCNIQUES DE PRECIPITACIÓ EN MITJÀ LÍQUID

Es basen en mesurar la terbolesa que produeix la precipitació d’immunocomplexes en un

medi líquid.
Es poden utilitzar per determinar anticossos, factors del complement, proteïnes de fase
aguda i proteïnes sèriques.
Aquestes tècniques gairebé no s’utilitzen perquè han estat substituïdes per les tècniques
de precipitació en gel.

La mesura de la terbolesa es pot realitzar mitjançant 2 tècniques:

• Turbidimetria, (llum transmesa).
• Nefelometria, (llum dispersada).
Ambdós consisteixen en la projecció d’una llum incident.

3.1.1. Immunoturbidimetria

S’utilitza per a mostres que contenen grans concentracions de partícules dispersants.

Utilitza la relació entre la concentració d’analit i la transmitància mesurada amb un
espectrofotòmetre.

La tècnica s’aplica a la determinació quantitativa d’IgA, IgG i IgM en sèrum humà, per això
s’utilitzen antisèrums amb anti-IgA, anti-IgG i anti-IgM.
La terbolesa produïda pels immunocomplexes es pot mesurar per fotometria a 365 nm.
La quantitat d’immunocomplexes que es formen és proporcional a la concentració d’Ig
present.

3.1.2. Immunonefelometria

És una tècnica senzilla, reproduïble i ràpida.

S’utilitza per a mostres que contenen petites concentracions de partícules dispersants.
Sempre que es disposi dels anticossos necessaris es pot utilitzar en la determinació d’Ig,
components del complement...
Es mesura la dispersió de la llum (raig làser) en un angle aproximat de 70º.
Es necessita la utilització d’un blanc de mostra per poder descartar que la terbolesa s’hagi
produït per agregats insolubles no immunològics.
3.2. TÈCNIQUES DE PRECIPITACIÓ EN GEL

Per a aquesta tècnica s’utilitza un suport semisòlid.

Aquest suport és un gel d’agar o agarosa, el qual té una preparació molt senzilla:
1) Es dissol en calent (+50ºC) l’agarosa al 1% en tampó fosfat PBS o en una solució
salina.
2) El gel que es forma es diposita en calent sobre el suport en el que es realitzarà la
reacció.
3) Es deixa refredar.
4) Un cop solidificat s’excaven els pouets necessaris per poder dur a terme la reacció.

Els components de la reacció es dipositen als pouets del gel.

Es difonen a través del gel i en les zones on hi ha una equivalència d’antígens i
anticossos.
D’aquesta manera es formen immunocomplexos i apareixen línies, arcs i bandes de
precipitació que es veuen a simple vista.

La velocitat de difusió d’un antigen o anticòs depèn de:

• Concentració.
• Temperatura, si la temperatura augmenta s’afavoreix la difusió.
• Mida de les molècules, la velocitat de difusió és inversament proporcional al pes
molecular.
• Viscositat del medi, una alta viscositat disminueix la velocitat de difusió.

El nombre de bandes de precipitació que es formin és igual al número de complexes

antigen-anticòs formats.
Existeixen diferents modalitats de precipitació:

També es poden distingir segons si són tècniques qualitatives o quantitatives.

TÈCNIQUES DE DIFUSIÓ ESPONTÀNEA

3.2.1. Doble difusió o reacció de Ouchterlony

Es tracta d’una tècnica qualitativa que informa sobre la concentració relativa.

Es posa una solució d’agarosa calenta sobre un portaobjectes, s’estén i es deixa refredar.
S’excaven dos pouets i es posa la solució antigènica en un i el sèrum en el qual busquem
anticossos a l’altre.
Es forma un gradient de concentracions.
Entre l’espai dels dos pouets hi ha una zona en què els reactius es troben en una zona
d’equivalència, i allí és on es forma un precipitat.
Aquest precipitat es mostrarà com una banda visible a simple vista i es formarà més prop
del pouet que contingui el component menys concentrat i/o de major pes molecular.
Gràcies a la tècnica es pot determinar l’existència o no de determinants comuns entre
antígens, estudiant les bandes de precipitació.
Les bandes de precipitació poden ser:
• Identitat total, la reacció correspon a antígens que comparteixen tots els
determinants antigènics. (les bandes es fusionen)
• No identitat, no es comparteix cap determinant, són antígens diferents.
• Identitat parcial, hi ha alguns determinants comuns i altres diferents. Els antígens
diferents fan que la banda se’n vagi cap al pouet amb menys determinants reactius.

(Pàg. 37 Exemple pràctic 6: Precipitació en agar, doble difusió)

3.2.2. Immunodifusió radial o tècnica de Mancini

Es basa en la difusió d’un dels components (antigen o anticòs) de la reacció per un gel
que porta l’altre component.
La difusió ocorre en totes direccions a partir del pouet, i es forma un gradient de
concentració.
La formació de complexos forma un anell de precipitació, el diàmetre del qual és
proporcional a la concentració del component que es difon pel gel.
Aquesta tècnica permet aconseguir una determinació quantitativa d’un antigen.

Existeixen kits comercials que inclouen:

- Plaques d’agar amb anticossos.
- Control d’una concentració coneguda.
- Taula de concentració d’antígens mostra.
La seva funció és determinar una substància.
S’utilitza per quantificar fraccions plasmàtiques de proteïnes (Ig, factors de coagulació o
components del complement).

(Pàg. 38 Exemple pràctic 7: Precipitació en agar, immunodifusió radial)

3.2.3. Immunoelectroforesis

És una tècnica qualitativa.

Combina la separació de proteïnes per electroforesis i
immunodifusió.
Els components de la mescla es separen primer aplicant
corrent elèctrica i després per difusió en el gel.
Aquesta separació permet obtenir arcs o bandes de
precipitació davant una determinada fracció antigènica.
Les seves principals aplicacions són:
• Separació de proteïnes que estan en desús.
• Identificació de fraccions proteiques.
• Troballa d’anticossos específics.
• Determinació de la puresa d’un antigen.
3.2.4. Immunofixació

És una variació de la immunoelectroforesi i s’utilitza en el laboratori per determinar el

mieloma múltiple.
El mieloma múltiple és una proliferació anormal de cèl·lules plasmàtiques malignes i
paraproteïna (un tipus d’immunoglobulina).

Per realitzar-la es diposita el sèrum problema en 5 carrils i es fa una electroforesi.

A cada carril es posa un antisèrum: IgG, IgA, IgM i cadenes lleugeres kappa i lambda.
Quan l'anticòs reconeix l’antigen es forma un precipitat que queda atrapat al gel.
El gel es neteja per eliminar les proteïnes no precipitades i es tenyeix per identificar les
proteïnes que han format immunocomplexes.

Aquesta tècnica s’aplica per a l’avaluació de proteïnes del mieloma.

En la majoria de pacients que pateixen aquesta malaltia tenen una producció excessiva
de cadenes lleugeres de kappa i lambda.
Aquestes tenen un pes molecular suficientment gran com per poder ser excretades per
orina.
Llavores aquestes cadenes s’anomenen proteïnes de Bence Jones.

TÈCNIQUES DE DIFUSIÓ FORÇADA EN CAMP ELÈCTRIC

3.2.5. Contraimmunoelectroforesi (CIEF)

Aquesta tècnica consisteix en una doble difusió forçada per un camp elèctric.
És una tècnica qualitativa d’alta sensibilitat.

Els components disposats als pouets de normal migren en sentit contrari.

Per això es tria el pH de forma que els anticossos tinguin una càrrega positiva i els
antígens una càrrega negativa.
Així, en aplicar electricitat es mouen l’un cap a l’altre fins trobar-se en la zona
d’equivalència, on es formen immunocomplexes, i per tant, línies de precipitació.

3.2.6. Electroimmunodifusió (EID)

Aquesta tècnica també es coneix com electroforesi en coet o «rocket».

És una tècnica quantitativa ràpida i sensible.
És una immunodifusió radial forçada per un corrent elèctrica.

Els antígens són sotmesos a electroforesi en un gel que porta incorporat l’anticòs.
El pH del gel es tria isoelèctric, per això els anticossos no migren i només ho fan els
antígens.
Com a resultat es formen uns precipitats en forma de coet que tenen una altura
proporcional a la concentració d'antígens.
Els valors desconeguts es determinen per interpolació en una corba patró.
4. TÈCNIQUES DE FIXACIÓ DEL COMPLEMENT

Proporcionen una mesura indirecta d’anticossos que no donen reaccions visibles.

Es basen en què la formació d’immunocomplexes activa el sistema complement i produeix
complexes que lesionen les membranes d’eritròcits i altres cèl·lules.

4.1. SISTEMA COMPLEMENT

El sistema complement està format per un conjunt de proteïnes plasmàtiques que davant
certs estímuls, s’activen en forma de cascada.

Entre les seves accions biològiques destaquen:

• Introducció del procés inflamatori: crida i activació de fagòcits i desgranulació de
mastòcits.
• Opsonització i fagocitosi.
• Lisi de membranes cel·lulars.
• Eliminació d’immunocomplexes circulants.

El sistema complement es pot activar per diverses vies:

- Via alternativa.
- Via de les lectines.
- Via clàssica.

4.2. TÈCNIQUES DEL SISTEMA COMPLEMENT

4.2.1. Tècnica en una etapa
Serveix per quantificar la quantitat de complement
El que fem és col·locar un volum conegut de glòbuls rojos i li afegim un volum conegut
d’hemolisines (anticossos específics dels glòbuls rojos) i ho barregem, ho incubem i el que
obtenim és que les hemolisines s’acoblen sobre els glòbuls rojos.
Després, afegim un determinat volum d’un sèrum problema, les molècules de complement
que hi ha dins del sèrum s’acoblen sobre el glòbul roig+hemolisina.
El complement mitjançant via clàssica hemolitza el glòbul roig+hemolisina.
Segons el grau d’hemòlisi el tub d’assaig tindrà un color un altre, com més hemòlisi més
roig fort, com menys hemòlisi tindrà un color rosat.
4.2.2. Tècnica en dues etapes
Serveix per a mesurar la concentració d’un antigen o d’un anticòs en un sèrum problema.
Es col·loca una quantitat de l’antigen per al qual volem determinar la presència
d’anticossos.
Li afegim el sèrum problema i després una quantitat coneguda de complement.
Els anticossos del sèrum problema s’uneixen als antígens, i el complement als anticossos
+ antígens.
Després, afegim una quantitat d’eritròcits de carner hemolitzats mitjançant hemolisina.
En col·locar-los es produirà el trencament de glòbuls rojos.
Per tant, com més anticossos de la malaltia hi hagi menys grau d'hemòlisis per part dels
glòbuls rojos es produirà.