실험 4.
Gel Extraction
1. 실험의 목적
- 저번 실험에서 전기영동한 Gel로부터 원하는 DNA를 추출하기 위해 Gel Purification Kit을
이용하여 DNA를 정제한다
2. 사용 시약 및 기구
a. 시약
Bioneer AccuPrep Gel Purification Kit
Absolute ehtanol
Absolute isopropanol
b. 기구
Microcentrifuge tube (1.5ml)
Table-top microcentrifuge 10,000xg (13,000rpm)
Thermal block, 칼
c. 준비
Heating block을 60℃로 예열시킨다.
WB 6μl+ Absolute EtOH 24μl = 30μl
EAlution buffer (EA) 를 60℃로 예열시킨다.
3. 실험방법
① 전기영동한 Gel로부터 원하는 DNA band를 칼로 잘라서 1.5 mL tube에 담는다.
(gel slice의 무게가 ≥200 mg 이 되게 한다. 최대 400mg이 넘지 않게 한다.)
② Gel slice volume의 3배 정도의 Fragment DNA binding buffer (FB)를 gel slice에 첨가한
다. (ex. gel slice 무게 : 200 mg -> FB : 600 ul)
③ 50 ℃ 에서 10분간 incubating 한다. (2 ~ 3분에 한번씩 inverting해서 agarose gel을 완
전 용해, 용해가 안 될시 incubating 시간을 늘린다.)
④ Absolute Isopropanol을 Gel slice volume의 1 : 1 의 비율로 첨가하고 즉시 inverting
후, Spin down 한다.
⑤ Binding column tube를 2 ml tube에 장치하고 준비된 sample을 900ul 넣는다.
⑥ 1분간 14,000 rpm 으로 원심분리한다.
⑦ 하층액은 버려준 뒤, binding column tube에서 나오는 용액이 없을 때까지 반복하여 원
심분리를 한다. (8000 rpm, 1 min)
⑧ 하층액은 버려준 뒤, 500 μl 의 Washing buffer 1 (WB1)를 rim이 젖지 않게 첨가하고
원심분리한다. (14,000 rpm, 1 min)
⑨ 하층액은 버려준 뒤, 500 μl 의 Washing buffer 2 (W2)를 rim이 젖지 않게 첨가하고 원
심분리한다. (14,000 rpm, 1 min)
⑩ ⑨번 과정을 1회 반복한다.
⑪ 하층액을 제거하고 1분간 14,000 rpm 으로 원심분리한다.(drying) 하층액이 나오지 않을
때까지 반복한다.
⑫ Binding column을 새로운 1.5 ml micro-centrifuge tube로 옮기고, 미리 예열시켜 놓은
10 ㎕ 의 Elution buffer (EA)를 가한 뒤 5 min 동안 상온에 방치한다. 이후 14000 rpm으로
1분간 원심분리한다.
⑬ ⑫ 과정을 2회 반복하고 Binding column tube를 제거한다. 각 과정 반복 시 하층액을
버리지 않도록 주의한다. (total 30㎕)
⑭ Nano drop을 사용하여 DNA의 농도를 측정 후 Gel Extraction된 DNA를 -20℃에서 보관
한다.
