TECH NOTE

① Protein Extraction : Cell 또는 조직에서 Protein을 추출해내는 과정

② Protein assay : 분리해 낸 Protein의 농도를 측정
③ SDS-PAGE : SDS로 (-)charge를 띄게 한 후 (+)charge를 연결해 Protein분자량 별로 분리
④ Transfer : gel 내부의 단백질은 항원이 결합할 수 없기 때문에 항원이 결합할 수 있는
Membrane으로 size 별로 분리된 단백질을 그대로 이동시키는 과정
⑤ Blocking : 단백질의 Transfer 되지 않은 부분이 다른 단백질로 오염되거나 antibody가
붙을 수 없도록 Skim milk 나 BSA 등으로 Block 해주는 과정
⑥ 항원-항체 반응 : 원하는 단백질에 결합하는 antibody(1st) 와 1st에 결합하고, HRP가
부착된 2nd를 반응시킴
⑦ Detection : 2nd 의 HRP가 ECL의 luminol을 산화시켜 방출되는 빛을 Detection

• Southern blot : DNA detection

• Northern blot : RNA detection
• Western blot : Protein detection
- 단백질을 크기 별로 분리하는 기술
- 항원-항체 반응을 이용하여 전체 단백질에서 특정 단백질 만을 Detection
- Sample(Total protein)을 SDS-PAGE를 이용해 분리
- 분리된 단백질을 Membrane에 옮겨 항원-항체 반응을 시켜 발광 유도하여 검출
① Protein size별 분리 (SDS)
② 항원-항체 반응
③ Detection (HRP-Luminol,ECL)

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① Protein Extraction [일반적인 Protease&Phosphatase Inhibitor]
• Protein 분리방법 Choice Inhibitor Target
- 세포에서 세포소기관, 단백질, DNA, RNA 등 생물학 분자를 분리하는 다양한 방법이 있다.
Sodium Fluoride Ser/Thr and Acidic Phosphatases
- Homogenization : 조직, 식물의 세포벽
- Sonication : 조직 Sodium Orthovanadate Tyr and Alkaline Phosphatases
- Freeze/Thaw : 식물 benzamide Serine protease
- Reagent (Detergent) :동물세포(가장 많이 이용되는 방법) Phenylmethanesulfonyl fluoride(PMSF) Serine protease
• Reagent(Detergent)를 이용한 lysis buffer Choice 4-(2-aminoethyl)-benzenesulfonyl fluoride(AEBSF) Serine protease
Antipain Cysteine protease
Detergent Effect
Chymostatin Chemotrypsin
membrane을 쉽게 분산시켜 버리긴 하지만 모든 protein을
Anionic Detergent
파괴하는 성질 (예 : SDS, Cholic acid-NA) Leupeptin Serine protease, Cysteine protease
Peptatin A Asparagin산protease (산성protease)
일정 농도에서 protein은 그냥 놔두고 lipid membrane만 파괴
Non-Ionic Detergent
(예 : Triton X-100, NP-40, Tween-20) Phosphoramidon 금속protease
Protinin Kallikrein, trypsin, chemotrypsin
가용화 능력이 강하고 단백질 변성이 적음. pH7이하가 되면
Amphionic Detergent
용해도가 낮아짐 (예 : CHAPS, CHAPSO) Ethylenediaminetetraacetic acid(EDTA) 금속protease

② Protein assay (단백질 정량)

• 원하는 Protein이 위치하는 곳에 따른 Lysis buffer Choice • 단백질을 정량하는 과정
• 각 Sample 내에 포함된 단백질의 양, 농도를 구하는 과정
Protein Location 추천하는 buffer  SDS-PAGE에 Loading 되는 protein의 양이 동일해야 특정 단백질 양의 상대적인 값을 비교할 수 있기 때문
Whole Cell RIPA buffer (89901)
Membrane MEM-PER (89826)
Nuclear & Cytoplasmic NE-PER (78833)
Mitochondria Mitochondria isolation kit (89801)

• Protease & Phosphatase Inhibitor

- Lysis buffer 에 첨가하여 사용. Lysis가 시작되면 Proteolysis, dephosphorylation,
denaturation 과정이 일어나는데 이들 Inhibitor 를 처리함으로써 늦출 수 있음
(4’C에서 Lysis를 진행하는 것도 이를 늦추기 위함)
- 확인하고자 하는 단백질 중 Phospho-가 있다면 phosphatase를 첨가하는 것이 좋다.

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 • BCA Protein assay (추천) • gel percentage 선택 : 보고자 하는 protein size 에 따라 gel percentage 선택
- Lowry법 보다 빠르고 정확
- comassie(bradford)법 보다 variation 이 적음
- detergent(SDS, Triton X-100)와 호환 가.(bradford는 BME, DTT와 호환)
- 측정범위 : 20~2000ug/ml
- 실험시간 30분

③ SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)

• 원리
- SDS : SDS는 native proteins을 individual polypeptides로 denature 하는데 가장 자주 사용되는
agent로 SDS를넣고 100℃에서 단백질을 끓이면 SDS가 polypeptide backbon을 감싸게
된다. 이 과정에서 polypeptide chain 고유의 charge는 잃어버리고 SDS에 의해 (-) 전하
를 띄게 된다.
- Acrylamide : Separating gel 경우 Acrylamide gel의 농도를 이용하여 단백질의 이동속도 조절
Acrylamide의 농도가 높아지면 gel 내부의 그물구조가 더욱 촘촘해 지므로
단백질들의 이동속도 차이를 더욱 높일 수 있다.
- Stacking gel : 로딩 샘플들이 농축되어 Running gel에 들어가기 전 같은 출발선에 위치하게 함
- Separating gel (Running gel) : 단백이 크기(와 charge) 별로 전개/분리되는 부분

• SDS gel 만들기

[SDS-PAGE gel 조성표]

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[Gel 농도별 조성표]

• Sample boiling (Denaturation)

- 정량이 끝난 후 SDSbuffer를 넣고 90℃에서 5분간 끓인다. (Heat block 이용)
- 3차 구조에서 1차 구조로 바꿔주기 위함. SDS를 negative charge을 띄게 하기 위함

④ Transfer
• SDS-PAGE를 통해 분리한 단백질을 membrane으로 옮기는 과정

단백질이 SDS로 인해 (-)전하를 띄는 성질을 이용한 것으로 Gel(-) / Membrane(+)로 하여

단백질에 전기장을 걸어 주어 Membrane 쪽으로 이동하게 한다
• Membrane으로 옮겨진 단백질은 항체를 이용하여 검출이 용이
Gel 내부에 있는 단백질은 항체와 결합할 수 없기 때문에 Membrane 위로 단백질들을 옮겨서
항체가 결합할 수 있도록 하기 위해 Transfer를 한다.

[Transfer 방식]

Tank Semi-dry

* Methanol: SDS-protein complex의 PVDF에 대한 binding capacity를 증가시키는 역할

** Transfer 조건은 샘플에 따라 다를 수 있다.(Wet의 경우, 250mA – 300mA로 1시간 Transfer 한다

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[Membrane 종류]

⑥ 항원-항체 반응

• 항체

- 항원과 결합하는 단백질

- 혈액과 체액에 녹아있는 Immunoglobulin (Ig)을 지칭
- Fab (antibody binding fragment) : 항원과 결합할 수 있는 조각
- Fc (crystallizable fragment) : 항원과 결합하지 못하는 조각

[Monoclonal Ab & Polyclonal Ab]

• Transfer 확인
- Transfer 가 끝난 후 Protein 위치와 기포 없이 Transfer가 잘 되었는지 확인
- Standard size marker의 위치를 표시. 필요없는 size의 membrane제거
- Membrane을 Ponceau S 용액 또는 Reversible Protein Stain Kit (Thermo #24580, #24585)에
15~60초(밴드가 보일 때까지 염색) 가량 염색시킨 후 band를 확인

[Primary Ab selection guide]

⑤ Blocking

• 단백질이 붙지 않는 filter의 여백에 5% skim milk* (or 5% BSA)의 단백질이 붙어서 antibody의
non-specific binding을 피하기 위함 (*Tip : 5% skim milk 제조 시 TBST/PBST에 녹이면 잘 녹는다)
• Ponceau S 용액을 DW나 PBS 로 washing
- Species Reactivity : 이 antibody가 인식할 수 있는 antigen site가 있는 종(Species)
• Blocking Buffer(5% skim milk in TBST)를 membrane이 잠기도록 넣고 (10x7의 경우 10ml이면 충
- Application : 본사에서 test 된 이 antobody를 이용할 수 있는 실험
분) shaking  1hr RT
- Host : Antibody가 생산된 동물
- Antibody Type : monoclonal 인지 polyclonal 인지를 나타냄

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 • SecondaryAntibody ⑧ Stripping
- Primary로 사용한 antibody의 Host에 따라 2nd 를 선택한다.
- 다양한 Conjugation Antibody • Membrane에 있는 Antibody를 제거하는 과정
 내가 보고자 하는 결과물을 형광, 발색, 침전물 등 현상을 이용하여 편리하고, 빠르게 보기 위해 선택 • Development 까지 끝난 membrane에 새로운 단백질이 있는지 확인하고 싶을 때,
Primary antibody 처리 전 과정을 생략하기 위해 사용하는 reagent
Conjugation Antibody Application
HRP, AP, Biotin Western Blot, ELISA, IHC/ICC
Dylight 488, Dylight 694 IF

• 반응과정
- Antibody는 Blocking buffer에 희석해서 사용

⑦ Detection
• Chemiluminescent Western Blotting Ⅲ. Protocol
- Horseradish peroxidase(HRP) or Alkaline phosphatase (AP) 이용

① Cell Extraction

- RIPA buffer
- Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X)
- Lysis buffer
 RIPA buffer에Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X)를 사용 전 1X로 섞어서 사용

1. Carefully remove (decant) culture medium from adherent cells.

[Horseradish Peroxidase (HRP) 원리]
2. Wash cells twice with cold PBS.
3. Add cold RIPA Buffer to the cells. Use 1mL of buffer per 75cm2 flask containing 5 × 106 cells
4. Keep on ice for 5 minutes, swirling the plate occasionally for uniform spreading.
5. Gather the lysate to one side using a cell scraper, collect the lysate and transfer to a tube.
6. Centrifuge samples at ~14,000 × g for 15 minutes to pellet the cell debris.
 Note: To increase yields, sonicate the pellet for 30 seconds with 50% pulse.
7. Transfer supernatant to a new tube for further analysis

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② Protein assay (단백질 정량)

- BCA assay
- BSA standard를 농도별로 dilution 시켜놓고, BCA A와B solution을 비율대로 mix 한다.
- 원리 : protein이 Cu 이온 (Cu 2+, Cu 1+)을 reduction 할 수 있는 성질을 이용한 방법
protein에 의해 reduction된 Cu 이온은 BCA용액과 반응하여 보라색의 화합물을 생성하며,
이 화합물은 562nm에서 읽을 수 있게 됨.

1) BSA standards 준비하기

3-B)Microplate Procedure (Sample to WR ratio = 1:8)
Datasheet의 table 1을 참고 (Data sheet 2page의 table 1, microplate (위), tube (아래))
> http://www.piercenet.com/instructions/2161296.pdf 1. 준비한 standard와 농도를 구하고자 하는 sample 25 μl를 각각 microplate well로 옮김
2. 각 well 마다, WR 200 μl를 첨가하고 plate를 shake에서 30 sec 간 잘 섞어줌
3. Plate를 덮고, 37 °C, 30 min 동안 incubation
2) BCA Working Reagent (WR)의 준비 4. RT에서 plate를 식힘
1. 필요한 WR의 total 양을 구하기 위해 다음 공식대로 하면 된다. 5. 562 nm에서 흡광도를 측정 * 이 방법은 540~590 nm 사이의 파장에서 흡광도를 측정해도 무방
(standards수+sample수) x (실험 반복횟수) x (sample당 WR의 양a) = 필요한 WR의 total 양
*a) sample당 필요한 양은 Test-tube 방법에서는 2ml, microplate 방법에서는 200μl 이다
2. Kit에 들어있는 BCA Reagent A 50 parts와 BCA Reagent B 1 parts를 mixing 하여 준비 4) 농도계산
*WR는 RT에서 밀폐된 용기에 보관할 시, 수일간 stable. (* WR만!)

0 25 125 250 500 750 1000 1500 2000

0.08 0.0858 0.1282 0.1746 0.2692 0.3576 0.4457 0.6003 0.7673
3-A) Test-tube Procedure (Sample to WR ratio = 1:20) Standard
curve 0.078 0.0839 0.1253 0.1691 0.2664 0.3379 0.4179 0.5778 0.7497
0.0775 0.0819 0.1182 0.1626 0.2548 0.3401 0.4155 0.5711 0.7288
평균 0.0785 0.0838667 0.1239 0.1687667 0.2634667 0.3452 0.4263667 0.5830667 0.7486

0.8
* y = 0.0003x + 0.0845 * Protein값은 X값을 구하면 됨. (단위μg/mL)
0.7
* R² = 0.999
0.6 * R2 값=1에 가까울수록 정확도가 높다는 것.
0.5 * x0.8을 한 것은 protein에 5xSDS buffer를 넣을 경우
0.4 dilution 된 protein 농도를 계산한 것.
0.3 * 100μg Loading 시 따야 하는 sample volumn
0.2
1. 준비한 standard 100 μl와 농도를 구하고자 하는 sample 100 μl를 각각 test-tube로 옮김 0.1
2. 각 tube 마다, WR 2 ml 첨가 후 Mix 0
3. Tube를 덮고, 37 °C, 30 min 동안 incubation (Standard Protocol) 0 500 1000 1500 2000 2500
* Standard Protocol : 37℃ for 30 minutes (working range = 20-2000μg/mL) Sample sample1 sample2 sample3 sample4 sample5 sample6 sample7 sample8 sample9
* RT Protocol : RT for 2 hours (working range = 20-2000μg/mL)
0.206 0.3169 0.1598 0.2193 0.1996 0.1682 0.3906 0.2612 0.4121
* Enhanced Protocol : 60°C for 30 minutes (working range = 5-250μg/mL)
* Tube를 heating 하기 위해 water bath를 사용하는 것이 좋다 O.D값 0.1886 0.2904 0.1562 0.1984 0.1947 0.1587 0.3816 0.2531 0.4028
Air incubator는 고르지 않은 열 전달로 color development 상에서 잘못된 값이 나올 수 있음 0.1993 0.299 0.1511 0.2024 0.1898 0.1636 0.3764 0.2605 0.3907
4. RT에서 tube를 식힘 평균 0.19796667 0.3021 0.1557 0.2067 0.1947 0.1635 0.3828667 0.2582667 0.4018667

5. spectrophotometer를 562 nm로 setting 하고, cuvette을 물로 채운 뒤 zero 설정 Protein 값 378.2 725.3 237.3 407.3 367.3 263.3 994.6 579.2 1057.9

6. 10 min 이내에 모든 sample의 흡광도 측정 * x0.8 302.6 580.3 189.9 325.9 293.9 210.7 795.6 463.4 846.3

* color의 변화에 따라 흡광도의 값이 달리 측정되니 꼭 유의 * 50 μg 0.165 0.086 0.263 0.153 0.170 0.237 0.063 0.108 0.059

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③SDS-PAGE ④Transfer
- Pre-made gel 혹은 Manual gel 사용 (SDS-PAGE gel 조성표 참조) - Hoefer Semi-dry Transfer 사용 (TE70X, TE70XP, TE77X, TE77XP)

1. 사용할 glass plate를 methanol로 잘 닦아서 caster에 고정 1. Transfer Unit 준비: 증류수로 Transfer unit을 미리 세척
2. 틈새로 gel 이 새지 않도록 미리 D.W를 넣어 casting unit이 잘 고정되었는지 확인 2. Gel 준비: transfer 할 gel의 well 또는 stacking gel 부분을 잘라냄
3. 보고자 하는 protein size에 따라 gel% 선택 3. Membrane 준비: gel size를 재고, Blot paper와 membran을 gel size에 맞게 자름
4. conical tube에 Resolving gel(Running gel)에 필요한 solution 넣어 제조 * nitrocellulose 또는 nylon membranes 는 증류수로 미리 적셔 놓는다.
* APS와 TEMED를 가장 마지막에 넣어야 한다. * PVDF 또는 hydrophobic membranes 은 methanol로 미리 적셔 놓는다.
* mix 한 후에 gel 판에 옮겨 넣는다. (stacking gel을 만들어야 하기 때문에 1-2 cm를 남긴다.) * 그런 다음, 모든 membran은 2-5분 동안 transfer buffe에 담가둔다.
5. isopropanol을 1~2ml 넣어준다. 4. Blotting paper 준비
* 섞이지 않도록 조심스럽게 벽을 타고 넣어줌 * Gel 하나당 6개의 blotting paper 준비
6. gel 이 굳을 때까지 기다린다. (약 30분) * 60분 동안 transfer 한다면 버퍼의 고갈이나 건조를 방지하기 위해서 충분한 buffer가 필요
7. gel 이 굳었으면 isopropanol을 따라 버리고 DW로 2-3회 wash 5. 아래와 같이 stack 준비
8. 물기 제거 뒤, 5% stacking gel을 조성대로 넣고 mix 하여 running gel 위에 넣어줌 * blotting paper 위에 미리 적셔놓은 membrane을 놓고, membrane 위에 gel을 올려 놓는다.
* Stacking gel은 running gel에 비해 빨리 굳기 때문에 빨리 진행해야함 * 주의: 단백질은 membrane에 닿자마자 진행되기 때문에 첫 번째 시도에 잘 준비해야 함.
9. gel 이 굳기 전 준비한 comb 넣어줌 * 그 후, 버퍼로 saturate된 blotting paper 3개를 gel 위에 붓는다.
* 기포가 생기지 않도록 주의하면서 천천히 넣어줘야 함
10. stacking gel 이 굳으면 comb를 빼고, tank에 장착
* 전기영동장치:Hoefer SE260 / power supply:PS300B
11. Marker, sample loading 후 +/-를 잘 맞춰서 Unit과 power supply를 연결한다
* 20-40mA로 50-90 분 Running

6. Transfer 뚜껑을 닫고, power supply와 연결한다(TE70XP, TE77XP는 power supply 내장)
* Transfer lead의 색이 빨간색이면 빨간색 power supply에, 검은색은 검은색으로 연결.
* 빨간색은 (+)electrode, 검은색은 (-)electrode.

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 ⑥ 항원-항체 반응
- Band가 확인되는 정도에 따라 antibody 농도나 washing횟수를 조절한다.
7. Power supply 전류 setting
* 최대 전류는 gel 표면의 0.8 mA/cm2를 초과하지 말아야 한다. 1. Primary로 사용할 antibody를 5% skim milk에 dilution 한다.
* 만약 Transfer할 gel이 여러 개라면 transfer 시간을 더 길게 하면 됨. * volume은 membrane이 살짝 잠길 정도면 됨
2. 4℃, overnight, rocking
8. Power supply 시간setting 3. Washing : 10분씩 3회
* 대부분의 Transfer는 한 시간 내에 완료된다. * 담겨진 TBST 버리고 새 TBST로 갈아준다
* 사이즈가 큰 단백질/negative gel Transfer/두꺼운 gel  Transfer 시간을 늘려주면 됨
4. secondary antibody를 5% skim milk에 dilution
5. 상온, 1시간, rocking
6. Washing : 10분씩 3회

⑦ Detection

- ECL solution : #34080 (SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate)

- Imaging장비 : Analytik Jena #97-0685-05 (ChemStudio)

⑤ Blocking
- Membrane 염색 : PonceauS (#NB5225) or Reversible Protein Stain Kit (#24580, #24585) 사용
- Skim milk 사용 1. ECL solution을 membrane size에 맞춰 필요한 만큼 1:1로 mix
* 0.1mL Working Solution per cm2 of membrane
2. Washing이 끝난 membrane에 1)의 ECL solution 을 pipette 으로 조심스럽게 묻혀 줌
1. Transfer unit에서 membrane을 분리하고, Ponceau S solution에 넣고 흔든 후 뺀다.
* 10초-1분 사이 염색됨. 염색되는 정도를 보고 membrane 뺀다, protein만 염색됨 3. 반응이 끝난 solutio을 OHP film을 기울여 휴지에 흡수 시켜 제거
2. 염색된 band가 가장 잘 보일 때까지 washing, Transfer, marker로 단백질의 위치를 확인 4. Membrane 위에 다시 OHP film을 겹치고 bubble 이 생기지 않도록 휴지로 살살 밀어줌
3. Blocking: 5% Skim milk (in TBST) 에서 1시간 상온에서 Rocking 5. ChemStudio를 이용해 노출 정도를 조절하여 band를 detection
* 자세한 소프트웨어 사용법은 기기구매 시 포함되는 manual 참조

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 분류 브랜드 품번 품명 설명
Hoefer SE250-10A-1.0 MIGHTY SMALL II Mini Vertical Electrophoresis unit (Complete)
Running 전기영동 장치
Hoefer SE260-10A-1.0 MIGHTY SMALL II Deluxe Mini Vertical Electrophoresis unit (Complete) *Best
Running / Transfer Hoefer SE300-10A-1.0 MINIVE COMPLETE 전기영동/Transfer 모두 가능
Hoefer TE22 TE 22 SMALL TRANFER UNIT *Best
Wet tank 방식 Transfer 기기
기기
Transfer Hoefer TE70X TE 70X Semi-Dry Transfer Unit Semi-Dry 방식 Transfer 기기
Hoefer TE70XP TE70XP Semi-Dry Transfer Unit w/Power Supply Semi-Dry 방식 Transfer 기기 (Power supply 내장)
Power supply Hoefer PS300B Power Supply Power supply
ChemiDoc Analytik Jena US 97-0685-02 UVP ChemStudio Imaging system
Thermo 78501 M-PER MAMMALIAN PROTEIN EXTRACTION REAGENT Mammalian cell 전용 Lysis buffer
Thermo 23225 PIERCE BCA PROTEIN ASSAY KIT*Best 단백질 정량 kit
Sample Prep
SERVA 3922801 BCA Protein Assay Macro Kit 단백질 정량 kit
Thermo 39000 LANE MARKER REDUCING SAMPLE BUFFER Sample loading buffer
Thermo 17919 TEMED
VWR(Amresco) 0761-100ML TEMED
Gel을 직접 만들어 사용할 경우
VWR(Amresco) 0486-100G AMMONIUM PERSULFATE (APS)
Gel Running
Thermo(USB Chemicals) J75832 20% SODIUM DODECYL SULFATE, LIQUID
Thermo 28398 BUPH TRIS-HEPES-SDS RUNNING BUFFER Running Buffer
Thermo 24590 GELCODE BLUE STAIN REAGENT Protein Gel 염색 시약
Thermo 88018 NITROCELLULOSE MEMBRANE, .45 MICRON, 30 CM X 3.5 M, ROLL NC membrane
시약 / Kit
Transfer Thermo 35040 PIERCE WESTERN BLOT TRANSFER BUFFER, 10X, METHANOL FREE Transfer Buffer
NOVUS NB5225 Ponceau S Staining Solution Transfer membrane 염색 시약
Thermo 28372 PBS
Thermo 28376 TBS
VWR(Amresco) 0777-1L TWEEN® 20
Blotting
Thermo 31430 PIERCE GOAT ANTI-MOUSE IGG, (H&L), PEROXIDASE CONJUGATED*Best
Secondary Antibody
Thermo 31460 PIERCE GOAT ANTI-RABBIT IGG , (H&L), PEROXIDASE CONJUGATED*Best
Thermo 88600 WESTERN BLOTTING FILTER PAPER, 8 CM X 10.5cm Blotting Paper
*Best
Thermo 34580 SUPERSIGNAL WEST PICO PLUS ECL solution
Develop
Thermo 34091 CL-XPOSURE FILM X-ray Film
기타 Thermo NBID 46430 RESTORE PLUS WESTERN BLOT STRIPPING BUFFER Stripping Buffer

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