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조항

콜라겐 특이적 샤페론에 대해 siRNA를 전달하기 위해 비

타민 A 결합 리포솜을 사용한 간경변증의 해결

Yasushi Sato1,2, Kazuyuki Murase1,2, Junji Kato1,2, Masayoshi Kobune1, Tsutomu Sato1, Yutaka Kawano1,
Rishu Takimoto1, Kouichi Takada1, Koji Miyanishi1, Takuya Matsunaga1, Tetsuji Takayama1 & Yoshiro Niitsu1

현재 간경변증에 대해 승인된 항섬유화 요법은 없습니다. 우리는 인간 열충격 단백질 47의 쥐 상동체인 gp46에 대한 작은 간섭 RNA(siRNA)를 간 성상 세포에 전달
하기 위해 비타민 A 결합 리포솜을 사용했습니다.
우리의 접근 방식은 비타민 A의 흡수 및 저장뿐만 아니라 섬유화에서 이들 세포의 주요 역할을 이용합니다. siRNA 함유 비타민 A 결합 리포솜을 사용한 5가지 처
리는 간 섬유증을 거의 완전히 해결했고 그렇지 않으면 치명적인 디메틸니트로사민에 의해 유도된 쥐의 생존 기간을 연장했습니다. 용량 및 기간 의존 방식으로 간경
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변.
구조는 오프 타겟 효과와 관련이 없거나 선천적 면역 모집과 관련이 없습니다. 수용체 특정 siRNA 전달은 콜라겐 분비를 억제하고 CCl4 또는 담관 결찰에 의해 유도된 섬유증
을 치료하는 데 유사하게 효과적이었습니다. 간 섬유증의 급성 및 만성 모델을 모두 사용하는 접근법의 효능은 인간 간경변증을 역전시킬 수 있는 치료 가능성을 시사합니다.

모든 형태의 만성 간 손상의 궁극적인 병리학적 특징인 간경화 또는 섬유증은 전 세계적
으로 많은 이환율과 사망률의 원인이 됩니다. 간 섬유화를 담당하는 주요 세포 유형은
순환에서 비타민 A를 흡수하고 저장하는 상주 perisinusoidal 세포인 간 성상(HS)
세포입니다. 활성산소 중간체 또는 사이토카인에 의해 자극을 받으면 HS 세포가 활성
화되고 증식성, 섬유화성 및 수축성 근섬유아세포1로 변형되어 프로콜라겐을 합성하고
분비합니다. 프로콜라겐은 말단 도메인이 프로콜라겐 펩타이드에 의해 절단된 후 불용
성 콜라겐으로 축적되어 섬유증을 유발합니다. 콜라겐 특이적 샤페론인 열 충격 단백
질 47(HSP47)은 소포체에서 프로콜라겐의 적절한 삼중 나선 형성을 보장하여 콜라
겐 분비를 촉진하고 프로콜라겐 합성의 변환 조절에도 관여합니다2,3.
레티놀 결합 단백질(RBP)에 대한 수용체를 통해 비타민 A 섭취에 대한 놀라운 능력을
가진 HS 세포에 우선적으로 있습니다.
디메틸니트로사민(DMN), CCl4 또는 담관 결찰에 의한 유도를 포함하는 세 가지
간경변증 동물 모델을 사용하여 우리의 조직학적 분석은 HSP47의 상동체인 래트
gp46을 인코딩하는 mRNA에 대한 siRNA를 운반하는 비타민 A 결합 리포솜의 정맥
(iv) 주사를 보여줍니다 . , (VA‑lip‑siRNAgp46)은 간 섬유증을 빠르게 해결합니다.
HS 세포와 유사한 세포가 만성 췌장염10 및 후두 섬유증11 과 관련된 섬유증을 유발
하는 데 필수적인 역할을 하기 때문에 우리의 접근 방식은 간 이외의 기관에서 섬유증
상태를 치료하는 데 가치를 찾을 수 있습니다.

콜라겐 합성이 억제될 때 동물4 및 인간5 의 간 섬유증이 퇴행할 수 있다는 실증은
섬유증이 역전될 수 있으며, 아마도 매트릭스 메탈로프로테이나제의 활동에 의해 가장
가능성이 높다는 것을 시사합니다.
콜라겐 합성을 억제하거나 매트릭스 메탈로프로테이나제를 활성화하기 위한 다양한
치료법이 동물 모델에서 조사되었습니다6,7. 그러나 특정 분자 및/또는 세포를 특이적
으로 표적화할 수 없기 때문에 주로 부작용이 있기 때문에 아직 임상적으로 적용되지
않았습니다.
다양한 범위의 콜라겐 유형3,8,9 과 HSP47의 특정 연관성 은 siRNA를 사용하여
HS 세포 매개 콜라겐 분비를 표적화하기 위한 탁월한 후보가 됩니다. 이러한 전략의 특
이성을 강화하기 위해 우리는 비타민 A 결합 리포솜에 siRNA를 캡슐화하는 것이 이를
표적으로 삼아야 한다고 추론했습니다.
결과
siRNAgp46은 gp46 발현과 콜라겐 분비를 억제합니다 우리는 먼저 정상 쥐 신장
(NRK) 세포에서 풍부한 gp46 전사체(그림 1a 및 보충 그림 1 온라인)에 대한 3개의
siRNA(유형 A, B, C)의 효과를 설명했습니다. 이전에 콜라겐 생산12을 연구하는 데
사용되었습니다. 세 가지 siRNA 모두 gp46 mRNA(보충 그림 1b)와 gp46 단백질(그
림 1a)의 축적을 억제했지만 A형 siRNA(siRNAgp46A)를 사용하여 관찰된 가장 큰
효능으로 후속 실험을 위해 선택했습니다. 다양한 투여량의 siRNAgp46A로 NRK 세
포를 형질도입한 결과 50 nM에서 거의 완전한 억제와 함께 gp46 발현의 명백한 투여
량 의존적 억제가 나타났습니다(그림 1b). 그런 다음 siRNAgp46A가 콜라겐 분비를
억제할 수 있는지 여부를 테스트하기 위해 프롤린 통합 분석을 사용했습니다. NRK 세
포 배양액에서 새로 합성된 콜라겐의 농도

1삿포로의과대학교 의과대학 내과4부, 삿포로, 060‑8543, 일본. 2이 저자들은 이 작업에 동등하게 기여했습니다.
서신은 YN(niitsu@sapmed.ac.jp)으로 보내주십시오.

1월 27일 접수; 3월 6일 접수; 2008년 3월 30일 온라인 게시 doi:10.1038/nbt1396

Nature BIOTECHNOLOGY 26권 4호 2008년 4월 431

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조항

siRNAgp46A로 형질도입된 세포는 부모 세포 및 무작위로 선택된 결합 및 분광광도법13. 처리되지 않은 NRK 또는 siRNArandom으로 처리된 NRK
siRNA(siRNArandom)로 형질감염된 세포에 비해 유의하게 감소했습니다(P<0.01) 세포보다 siRNAgp46A 처리된 NRK 세포에서 훨씬 적은 콜라겐이 분비되었습니다
(그림 1c). 배양된 NRK 세포의 콜라겐 분비량을 Sirius red 염료로 측정 (P < 0.01).
(그림 1d).

ㅏ cd e [ 3H]프롤린 혼입

gp46 조직 배양 플레이트에 콜라 쥐 pHS 세포

NS 겐 침착 RBP(µg/ml)
β‑액틴 NS 80 80
120 *
MFI = 10.65 치료 없음 +RBP MFI = 13.05
* 치료 없음 0
100 * 100 * 0.7µg/ml
미처리 siRNA 랜덤 siRNA A siRNA B siRNA C
0 80 0 80
어
제
% 어
제
%

80 80
Lip‑siRNA‑FAM 66.42
비 Lip‑siRNA‑FAM 0.7 93.76
+RBP 0.7µg/ml
60 60
gp46
0 80 0 80
40 40 Lip‑siRNA‑FAM
β‑액틴 0 88.91 +RBP 0.7µg/ml 63.94
20 20 +RBPAb
1nM 5nM 50nM 0 80 0 80

미처리 리포좀 0 0 87.08 VA‑lip‑siRNA‑FAM

0.07 108.68
+RBP 0.7µg/ml
siRNAgp46 siRNA 랜덤 50nM 0 80 0 80
처리되지 않은 siRNAgp46 siRNArandom 처리되지 않은 siRNAgp46 siRNArandom VA‑lip‑siRNA‑FAM
0.14 106.98 74.86
+RBP 0.7µg/ml
+RBPAb
VA‑립‑siRNA‑FAM 0 80 0
145.09 80 VA‑lip‑siRNA‑FAM
0.28 105.47
+RBP 0.7µg/ml +대
에프
일차 쥐 피부 섬유아세포 조군 Ab
0 80 0 100 101 102 103 104
RBP(µg/ml)
173.88
80 80 0.7
치료 없음
치료 없음 0 MFI = 5.90 MFI = 6.49 0 80
+RBP 0.7µg/ml
164.29
0 80 0 80 1.4
Lip‑siRNA‑FAM 0
Lip‑siRNA‑FAM 0.7 33.50 36.26
+RBP 0.7µg/ml 100 101 102 103 104

0 80 0 80
Lip‑siRNA‑FAM LI90
0 34.21 +RBP 0.7µg/ml 38.63 g 80
시간

+RBPAb 5.24
치료 없음
0 80 0 80 VA‑lipsiRNAgp46‑FAM Lip‑siRNAgp46‑FAM
10% FBS
VA‑lip‑siRNA‑FAM 0
0.07 32.95 37.22
+RBP 0.7µg/ml 100 101 102 103 104
0 80 0 80 80
VA‑lip‑siRNA‑FAM 37.67
0.14 32.57 35.59 Lip‑siRNA‑FAM
+RBP 0.7µg/ml
10% FBS
30
분

+RBPAb
VA‑립‑siRNA‑FAM 0 80 0 80
VA‑lip‑siRNA‑FAM 0 100 101 102 103 104
0.28 30.44 31.01
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+RBP 0.7µg/ml +대
조군 Ab
0 80 80
0 100 101 102 103 104 72.5
VA‑립‑siRNA‑FAM
0.7 31.55 10% FBS

0 80 0 100 101 102 103 104

1.4 31.79
조직 배양 플레이트에 콜라
나
0 겐 침착
100 101 102 103 104
NS
*
100 *
HS 세포에 의한 VA‑lip siRNAgp46‑FAM의 gp46 발현 및 콜라겐 합성 및 어
제
%
간
시
2

RBP 수용체 의존성 흡수에 대한 siRNAgp46의 억제 효과. (a) Lipotrust 80

를 사용하여 3가지 유형의 siRNAgp46(A, B, C) 또는 siRNArandom으로 60

형질감염된 NRK 세포에서 gp46 또는 b‑액틴(정규화 대조군)의 발현을 분석
40
하기 위해 웨스턴 블롯 분석을 사용하였다. (b) siRNAgp46A에 의한
gp46 발현의 용량 의존적 억제. (c) siRNAgp46 또는 siRNArandom으로 처 20

리된 NRK 세포에서의 콜라겐 합성은 형질감염 2일 후 [ 3H]프롤린 혼입을 평가함 0

으로써 검정되었다 . (d) NRK 세포로부터의 콜라겐 침착은 염료‑결합 방법
에 의해 형질감염 1일 후에 분석되었다. 데이터는 5번의 형질감염으로부터 계산된
평균 ± sd 및 처리되지 않은 대조군의 백분율로 표현되었습니다. *P o 0.01 처리되지 않은 VA‑lip‑siRNAgp46 VA‑lip siRNA무작위

대 siRNAgp46. NS, 중요하지 않음. (e,f) siRNAgp46‑FAM(lip‑

siRNAgp46‑FAM) 또는 VA‑lip‑siRNAgp46‑FAM을 운반하는 비타민 A가 없는 리포솜으로 처리된 쥐 pHS 세포(e) 및 일차 쥐 피부 섬유아세포(f)의 대표적인 FACS 패턴 다양
한 농도(0.07–1.4 mg/ml)의 RBP 및 항‑RBP 항체가 있거나 없는 0.7 mg/ml RBP에서 lip‑siRNAgp46‑FAM 또는 VA‑lip‑siRNAgp46‑FAM으로 처리된 세포의 존재. 무관
한 마우스 단클론 항체는 음성 대조군으로 사용되었습니다. (g) 10% FBS의 존재 하에서 lip‑siRNAgp46‑FAM 또는 VA‑lip‑siRNAgp46‑FAM으로 처리된 LI90 세포의 대표
적인 FACS 패턴. 평균 형광 강도(MFI)가 표시됩니다. 각각의 (e‑g)에서 5개의 독립적인 실험이 수행되었으며 결과는 본질적으로 동일했습니다. (h) FAM‑표지된 siRNA의 세포내
분포의 대표적인 형광 이미지. 래트 pHS 세포를 VA‑lip‑siRNAgp46‑FAM 또는 lip‑siRNAgp46‑FAM으로 처리하였다. 30분에 배지를 새로운 배지로 교체하였다. 표시
된 시간에 세포를 고정하고 형광 현미경으로 분석하여 siRNA‑FAM(녹색)의 상대적인 세포내 분포를 결정했습니다. 원래 배율(200, 상단 패널)로 촬영한 사진과 상자로
둘러싸인 영역에 해당하는 확대 이미지가 하단 패널에 표시됩니다. 축척 막대, 100mm. 5개 중 하나의 대표 이미지가 표시됩니다. (i) VA‑lip‑siRNAgp46 또는 VA‑lip siRNA
무작위 및 조직 배양 플레이트 상의 콜라겐 침착으로 처리된 래트 pHS 세포를 염료‑결합 방법에 의해 형질감염 1일 후에 검정하였다. 데이터는 평균 ± sd로 표현되었고, 5번의 형
질감염으로부터 계산되었으며 처리되지 않은 대조군의 백분율로 표시되었습니다. *P o 0.01 대 VA‑lip‑siRNAgp46. NS, 중요하지 않음.

432 26권 4호 2008년 4월 자연 생명공학

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리포좀에 대한 비타민 A의 최적 비율 siRNAgp46
을 HS 세포로 전달하기 위한 최적의 비타민 A/리포좀 비율을 결정하기 위해 우리는
carboxyfluorescein(FAM)(lip‑siRNAgp46‑FAM)에 결합된 siRNAgp46을 운반
하는 리포좀을 비타민 A와 함께 인큐베이션했습니다. 1:2에서 16:1까지. 한외여과로
자유 비타민 A를 제거한 후, FACS(형광 관련 세포 분류)를 사용하여 쥐의 일차 조혈
모세포(pHS 세포)의 비타민 A 결합 lip‑siRNAgp46‑FAM(VA‑lip siRNAgp46‑
FAM)에 의한 형질도입 효율을 조사했습니다. 가장 높은 평균 형광 강도(MFI) 수준
은 인큐베이션 용액에서 2:1의 몰비타민 A/리포좀 비율에서 관찰되었습니다(보충 그
림 2 온라인). 우리는 모든 후속 실험에서 리포솜의 양이온성 지질 몰당 0.65몰 비타
민 A에 해당하는 이 인큐베이션 몰비에서 복합체를 사용했습니다.
VA‑lip‑siRNAgp46에 대한 RBP의 결합 확인 겔 여과를 사용하
여 RBP와 함께 배양된 VA‑lip‑siRNAgp46과 비타민 A가 없는 lip‑siRNAgp46을
분리했습니다. VA‑lip‑siRNAgp46 제제의 RBP는 공극 부피에서 리포솜으로 용출되
었습니다. 대조적으로, lip‑siRNAgp46 제제의 RBP는 리포좀을 포함하지 않는 분획
에서 공극 부피 후에 용출되었습니다(보충 그림 3 온라인). 이것은 VA‑lip‑siRNAgp46
에 대한 RBP의 결합을 확인합니다.
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비타민 A 결합 리포좀의 크기 비타민 A 결합 리포
좀, lip‑siRNAgp46, VA‑lip‑siRNAgp46 및 RBP 결합 VA‑lip‑siRNAgp46 제제의
평균 크기를 변형되지 않은 리포좀과 비교하기 위해 동적 광산란을 사용했습니다. 가
장 큰 것부터 가장 작은 것까지 입자 크기는 다음과 같습니다: 리포솜, 비타민 A 결합
리포솜, lip‑siRNAgp46, VA‑lip‑siRNAgp46 및 RBP 결합 VA‑lip‑siRNAgp46(보
충 표 1 온라인).
pHS 세포에 의한 VA‑lip‑siRNAgp46‑FAM의 수용체 매개 흡수 다양한 농도(0.07
mg/ml–1.4 mg/ml)의 RBP 및 세포의 FACS 패턴을 조사했습니다. 비특이적 리포
펙션 속도가 증가하고 더 긴 형질도입 시간을 갖는 수용체 매개 형질도입의 속도와
더 유사해지기 때문에(데이터는 표시되지 않음), 형질도입 시간은 VA‑lip‑siRNAgp46
의 수용체 매개 형질도입 효능과 lip‑siRNAgp46의 비특이적 형질도입 효능. VA‑lip‑
siRNAgp46‑FAM으로 처리된 쥐 pHS 세포는 RBP 농도가 0.07 mg/ml에서 0.7
mg/ml로 증가함에 따라 증가하는 형광 강도를 보였고 강도는 40.7 mg/ml RBP
농도에서 정체되었습니다(그림 1e). RBP 수용체에 의한 비타민 A 결합 리포솜/RBP
복합체의 특이적 흡수를 추가로 확인하기 위해 RBP(0.7 mg/ ml). 이들 세포의 MFI
는 항‑RBP 항체에 의해 lip‑siRNAgp46‑FAM에 가까운 수준으로 억제되었습니다(그
림 1e).
lip‑siRNAgp46‑FAM에 비해 VA‑lip‑siRNAgp46‑FAM의 우선적 섭취는 정상 쥐의
일차 피부 섬유아세포를 사용하여 관찰되지 않았습니다(그림 1f). 우리는 LI90 세포
(활성화된 인간 HS 세포주)14를 사용하여 pHS 세포와 관련된 실험과 유사한 실험을
수행했으며 본질적으로 동일한 결과를 발견했습니다(그림 1g).
쥐 pHS 세포에서 VA‑lip‑siRNAgp46‑FAM의 세포내 수송
RBP 수용체에 의한 흡수 후 siRNAgp46‑FAM의 세포 내 위치를 밝히기 위해 VA‑lip‑
siRNAgp46‑FAM 처리된 쥐 pHS 세포와 lip‑siRNAgp46‑FAM 처리된 쥐 pHS 세
포를 모니터링했습니다.
Nature BIOTECHNOLOGY 26권 4호 2008년 4월
조항
형광 현미경을 사용하여 (그림 1h). VA‑lip siRNAgp46‑FAM을 처리한 세포에서 형
광은 30분에 세포질에서 희미한 과립형 패턴으로 나타났고, 2시간에 핵주위 영역에서
더 조밀한 과립형 패턴으로 나타났다. 대조적으로, lip‑siRNAgp46‑FAM으로 처리된
세포의 세포질에서는 30분 후에 녹색 형광이 관찰되지 않았다. 더욱이, 2시간에서의
핵주위 형광은 매우 희미하였다.
VA‑lip‑siRNAgp46은 pHS 세포의 콜라겐 분비를 억제합니다 처리되지 않은 세
포와 VA‑lip siRNA 무작위 처리된 세포보다 현저히 낮습니다(P < 0.01)(그림 1i).
간경변 쥐 간에서 HS 세포에 대한 VA‑lip‑siRNAgp46‑FAM의 전달 생체 내에서 HS
세포에 의한 비타민 A 결합 리포솜의 수용체‑매개 흡수는 이전에 DMN으로 처리된 쥐
에서 확인되었습니다(4주에 걸쳐 12회 복강내 정맥 주사; 보충 그림 . 4 온라인) 그
런 다음 VA‑lip‑siRNAgp46‑FAM을 주입했습니다(3회 주입, 각각 0.75 mg/kg
siRNA 및 격일 제공). siR NAgp46‑FAM의 조직 분포는 최종 주입 24시간 후 형광
방출에 의해 검사되었습니다. siRNAgp46‑FAM(녹색)의 형광은 주로 α‑평활근 액틴
(a‑SMA, 적색, 활성화된 HS 세포의 지표)에 대해 양성으로 염색된 영역에서 병합된 노
란색 색상을 갖는 영역을 생성하는 영역에서 확인되었습니다. 각 표본에서 무작위로 선
택된 10개의 고배율(630) 필드의 노란색 영역은 a‑SMA에 대해 염색된 영역의 61.2
± 9.8%를 차지했습니다(그림 2a, 이미지 i, v). 대조적으로, a‑SMA‑양성 영역(그림
2a, 이미지 iii)의 노란색 영역은 lip‑siRNAgp46‑FAM을 주입한 쥐에서 무시할 수 있
었습니다(5.6 ± 2.3%).
생체 내에서 HS 세포에 대한 siRNAgp46의 특이적인 전달을 확인하기 위해, 우리
는 VA‑lip‑siRNAgp46‑Cy5를 주입한 DMN 처리된 쥐의 간에서 분리한 간세포, HS
세포 및 Kupffer 세포에서 시아닌 5(Cy5) 형광 강도의 FACS 분석을 수행했습니
다. . 우리는 CD 163‑양성 세포(Kupffer 세포) 또는 알부민 양성 세포(간세포)보다
α‑SMA‑양성 세포(HS 세포)에서 siRNAgp46‑Cy5의 훨씬 더 큰 축적을 관찰했습니
다. HS 세포에서 siRNAgp46‑Cy5의 축적은 lip‑siRNAgp46‑Cy5를 주입한 쥐에
서는 분명하지 않았습니다(그림 2b).
VA‑lip‑siRNAgp46‑FAM을 주사한 쥐의 폐에서 자가형광을 보인 내피세포(폐포
상피)를 제외한 극소수의 세포가 형광발광에 대해 양성이었으며 이들 세포의 형광(녹
색)은 적색과 병합되었습니다. ‑ 대식세포(CD68)의 염색은 대식세포에 의한
siRNAgp46‑FAM의 비특이적 흡수를 나타냅니다. 유사하게, 같은 쥐의 비장에 있는
형광 세포는 빨간색으로 염색된 대식세포와 합쳐져 노란색 신호를 생성했습니다. lip‑
siRNAgp46‑FAM을 주사한 쥐의 폐와 비장을 분석한 결과 VA‑lip siRNAgp46‑FAM
을 사용한 결과와 유사한 결과가 나타났으며(그림 2c), 이는 대식세포에 의한
siRNAgp46‑FAM의 비특이적 흡수가 두 기관에서도 발생했음을 나타냅니다. 광수용
체 기능을 위해 비타민 A가 필요한 망막은 처리된 쥐에서 거의 염색되지 않았습니다
(그림 2c).
VA‑lip‑siRNAgp46의 약력학 및 조직 분포를 더 자세히 밝히기 위해 [3H]비타민
A와 함께 siRNAgp46을 운반하는 방사성 표지된 리포솜을 꼬리 정맥을 통해 정상적
인 쥐와 DMN에 의한 급성 간경변 유도 개시 24일 후 쥐에 주입했습니다. (24일 쥐;
그림 2d). [3H]VA‑lip‑siRNAgp46 의 순환 반감기는 DMN 처리된 쥐와 정상 쥐에서
각각 19분과 61분이었는데, 간경변에서 [3H]비타민 A(그림 2d, 삽입) 의 경우 13분이
었습니다. 쥐. 방사능은 주사 24시간 후 간경변 간에서 거의 독점적으로 발견되었습니
다(그림 2d). 동량의 방사성 표지된 비타민 A 결합 리포좀
433
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조항

ㅏ VA‑립‑siRNAgp46‑FAM Lip‑siRNAgp46‑FAM 비 VA‑립‑siRNAgp46‑Cy5 입술‑siRNAgp46‑Cy5 104

104
DAPI siRNA‑FAM DAPI siRNA‑FAM 0.55% 32.96% 0.21% 1.34%

103 103

102 102

101 32.98% 101

64.11%

100 100
siRNA‑
Cy5

100 101 102 103 104 100 101 α 102 103 104
α SMA‑Cy3 병합 α SMA‑Cy3 병합 SMA‑FITC

104 104
나

ii ⅲ 12.00% 1.65% 3.62% 2.95%

103 103
iv
102 102

101 19.08% 101 28.60%

나 ii ⅲ iv
100 100
100 101 102 103 104 100 101 102 103 104
CD163‑FITC 104

V
104
0% 0.21% 0% 0.15%
103 103

102 99.79% 102 99.85%

V
101 101

100 100
100 101 102 103 104 100 101 102 103 104
장백의‑FITC

리포좀 Lip‑siRNAgp46‑FAM 망막
씨
리포좀 Lip‑siRNAgp46‑FAM VA‑립‑siRNAgp46‑FAM

병합

VA‑립‑siRNAgp46‑FAM

CD68 병합

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디
100
삼
35 × 106 90 [ H]VA‑lip‑siRNAgp46(정상 래트) 3 [
는
있
아
남
에
액
혈%
80 H]VA‑lip‑siRNAgp46(간경변 쥐) 3 [
30 × 106 70
리포좀 Lip‑siRNAgp46‑FAM H]VA(간경변 쥐)
60
50
25 × 106
40
30
cpm/
직
(조
능
사
방 )

20 × 106 20
10
비장
0
15 × 106
0 4 8 12 16 20 24
시간(시간)
VA‑립‑siRNAgp46‑FAM 10 × 106
간경변 쥐
CD68 병합
일반 쥐
5 × 106

간 폐 신장 비장 마음
눈 뇌
장
그림 2 간경변 쥐의 HS 세포에 대한 VA‑lip‑siRNAgp46의 특정 전달. ( a ) DMN 처리 된 간경변 쥐의 간 표본에서 DAPI (청색) 및 siRNAgp46‑FAM (녹색)으로 대조 염색
된 Cy3‑ 접합 항 ‑α‑SMA 항체 (적색), 핵에 의해 시각화 된 α‑SMA의 대표적인 형광 이미지 (일 24 쥐) 격일로 VA‑lip‑siRNAgp46‑FAM 또는 lip‑siRNAgp46‑FAM을 주사
(총 3회 주사). 간 표본은 마지막 주입 후 24시간에 수확되었습니다. 원래 배율(200)로 촬영한 사진과 상자로 둘러싸인 영역에 해당하는 확대 이미지는 i, ii 및 iii, iv에 표시됩니다.
이미지 v: 세포질에서 형광 염색을 보여주는 i의 고배율 이미지. 축척 막대, 100mm. (b) VA‑lip‑siRNAgp46‑Cy5 또는 lip‑siRNAgp46‑Cy5의 3회 주사 후 24시간에 수확된
래트 HS 세포, 쿠퍼 세포 및 간세포 풍부 분획을 항 α‑SMA‑FITC, 항‑랫트 CD168‑FITC 및 항‑알부민‑FITC(alb‑FITC) 각각, 유세포 분석기로 분석하였다. (c) 폐, 비장 및 망
막에서 Alexa 568‑표지된 항‑CD68 항체(적색) 및 siRNAgp46‑FAM(녹색)을 사용한 대식세포의 대표적인 면역형광 염색. VA‑lip‑siRNAgp46‑FAM, lip‑siRNAgp46‑FAM 또
는 리포솜의 정맥주사 24시간 후 이들 기관의 조직학적 절편을 수집했습니다. 이 섹션의 형광 이미지는 공초점 레이저 현미경을 사용하여 얻었습니다. 축척 막대, 100mm. (a–c) 5
개의 독립적인 실험에서 유사한 결과가 얻어졌습니다. (d) 래트에서 [3H]VA‑lip‑siRNAgp46의 대표적인 조직 생체분포 및 약동학 . DMN 처리 간경변 쥐(쥐 24일) 또는 정상 쥐
(그룹당 n=3) 에 꼬리 정맥을 통해 200mCi [3H]VA‑lip‑siRNAgp46을 단일 정맥 주사했습니다 . 조직 생체 분포는 24시간 후에 분석되었습니다. 데이터는 평균 ± sd(n =
3)를 나타냅니다. 삽입된 그림은 감염 후 지정된 시간에 혈액에 남아 있는 주입된 용량의 백분율을 보여줍니다. 각 점은 평균 ± sd(n = 3)를 나타냅니다.

2개의 독립적인 실험에서 유사한 결과가 얻어졌다.

434 26권 4호 2008년 4월 자연 생명공학

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조항

ㅏ VA‑립‑siRNAgp46 디 0 1w 2w 3w 4w 5w 6w 7w 8w 9w 10w 11w 0 1w 2w 3w 4w 5w 6w 7w 8w 9w 10w 11w

SD 쥐 SD 쥐
치료 후 일
DMN DMN
012345
0.1 mg/kg × 2/주, iv 1.0 0.75 mg/kg ×2 /주,iv 1.0
률
존
생 률
존
생

gp46
0.8 0.8 **
β‑액틴 0.6 0.6
0.4 0.4
비 입술‑siRNAgp46
0.2 * 0.2
치료 후 일
0 0
012345 0 10 20 30 40 50 60 70 80 0 10 20 30 40 50 60 70 80
낮 낮
gp46

조직학적 분석
β‑액틴
0 1w 2w 3w 4w 5w 6w 7w 8w 9w 10w 11w 0 1w 2w 3w 4w 5w 6w 7w 8w 9w 10w 11w
SD 쥐 SD 쥐
DMN DMN
씨 주사 후 일
0.5 mg/kg ×2 /주,iv 1.0 0.75 mg/kg ×3 /주,iv 1.0
0 2345 7 률
존
생 률
존
생 **
gp46
0.8 0.8
**
β‑액틴 0.6 0.6
0.4 0.4
1.2
0.2 0.2
GAPDH
gp46/

1.0
0.8 0 0
0 10 20 30 40 50 60 70 80 0 10 20 30 40 50 60 70 80
0.6 낮 낮
0.4 VA‑립‑siRNAgp46 VA
0.2 입술‑siRNAgp46 siRNA
VA‑립‑siRNA무작위 PBS
0 VA 리포좀

0일 2일차3일차4일차5일차7일차

그림 3 간경변 쥐 생존에 대한 iv 주사된 VA‑lip‑siRNAgp46의 효과. ( a, b ) HS 세포에서 gp46 발현에 대한 siRNAgp46의 억제 효과 기간.
래트 pHS 세포를 VA‑lip‑siRNAgp46(a) 또는 lip‑siRNAgp46(b)으로 처리하였다. 30분에 배지를 새로운 배지로 교체하였다. 지시된 시간에 gp46 및 b‑액틴(표준화 대조군)의 발현을 웨스턴
블롯팅으로 분석하였다. 3개의 독립적인 실험에서 유사한 결과가 얻어졌다. ( c ) VA‑lip‑siRNAgp46 (siRNA 0.75 mg / kg, 24 일에 1 회 주사, n = 3)으로 처리 한 DMN‑ 간경변 쥐에서 gp46 발현의 시간
경과. 표시된 시간에 gp46의 발현을 분석하기 위해 western blot 분석(상단)과 정량적 실시간 PCR(하단)을 사용하였다. 간 gp46 mRNA 수준은 GAPDH mRNA에 비해 정량화되었습니다. 데이터는
3마리 쥐를 대표하는 분석에서 얻은 평균 ± sd입니다. (d) VA‑lip‑siRNAgp46을 0.1, 0.5 또는 0.75 mg/kg의 siRNA 용량으로 주 2회(n = 6/그룹) 또는 0.75 mg/kg을 3회 정맥 주사한 DMN 처리된 쥐
의 생존 주(그룹당 n=12). 대조군에서는 DMN 처리된 쥐에게 lip‑siRNAgp46, VA‑lip‑siRNArandom, 비타민 A 결합 리포솜, 비타민 A, PBS(각 그룹에 대해 n = 6, 0.1, 0.5 또는 0.75 mg/kg을 1회 2회
주사했습니다. 주 3회 0.75 mg/kg의 각 그룹에 대해 n = 12) 또는 siRNAgp46(0.75 mg/kg siRNA의 그룹에 대해 n = 12, 주 3회). 수명표 분석은 Kaplan‑Meyer 플롯으로 표시됩니다. (*P o 0.05; **P
o 0.0001 대조군 쥐와 비교).
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siRNAgp46을 같은 나이의 비간경변성 쥐에게 주사하면 모든 장기에서 방사능 축적
이 상당히 감소했습니다. 이것은 VA‑lip‑siRNAgp46을 특이적으로 흡수한 HS 세포
가 간경변증 간에서와 같이 정상 간에서 같은 정도로 증식하지 않았음을 나타냅니다.
VA‑lip‑siRNAgp46에 의한 gp46 억제 기간 24일에 DMN 쥐에
VA‑lip‑siRNAgp46을 정맥 주사했습니다(그림 3c). 랫트 pHS 세포와 DMN 랫트
의 간 모두 적어도 3일 동안 gp46 발현이 억제된 반면(도 3a, c), pHS 세포를 립
siRNAgp46으로 처리하면 gp46 발현이 억제되지 않았다(도 3b).
VA‑lip‑siRNAgp46으로 iv 치료에 의한 DMN 쥐의 생존 우리는 일반적으로 치
명적인 DMN 치료에 노출된 쥐의 생존에 대한 siRNAgp46의 효과를 조사했습니다
(그림 3d). 이 일련의 실험에서 치료는 DMN의 12회 투여에 의해 간경화(24일) 유
도 후 시작되었습니다(보충 그림 4). 매주 2회 PBS, 비타민 A, 비타민 A 결합 리포
솜, VA‑lip siRNArandom 또는 lip‑siRNAgp46으로 처리된 대조군은 모두 DMN
처리 후 52일 이내에 사망했습니다.
표시되지 않음). 대조적으로, 매주 2회 VA‑lip‑siRNAgp46으로 처리된 쥐는 생존 시
간의 용량 의존적(0.1, 0.5, 0.75 mg/kg) 연장과 0.75 mg에서 훨씬 더 높은 생존
율(83.3%; 5/6 쥐)을 보였습니다. /킬로그램. 0.75mg/kg 용량을 주당 3회 투여했
을 때 생존율은 100%(12/12)였습니다(그림 3d). 이는 gp46 발현이 72시간 동안
억제되었지만 siRNAgp46 처리 후 4일 이내에 회복되었다는 관찰과 일치하는 결과
입니다. (그림 3a,c).
DMN 처리된 쥐에서 siRNAgp46에 의한 간 섬유증의 해결 VA‑lip siRNAgp46(0.75
mg/kg)을 5회 투여한 DMN 처리된 쥐(33일)의 간 섬유증을 Azan‑Mallory(그림
4a) 및 콜라겐 I을 사용하여 검사했습니다. 염색(그림 4b). 콜라겐 염색을 위한 전산
화된 이미지 분석 스코어링에 의해 검출된 섬유화 영역은 대조군 표본보다 VA‑lip‑
siRNAgp46‑처리된 래트로부터의 표본에서 상당히 더 작았다(P < 0.001)(도 4c);
이러한 결과는 프로콜라겐 I형 및 TIMP‑1 mRNA에 대한 정량적 RT‑PCR 데이터와
일치하며, 이는 VA‑lip‑siRNAgp46 처리에 의해 mRNA 발현이 실질적으로 억제됨
을 보여주었다(도 4d). 마찬가지로, VA‑lip‑siRNAgp46 처리된 쥐의 히드록시프롤
린 수치는 대조군 쥐보다 현저히 낮았습니다(P<0.001)(그림 4e). VA‑lip‑
siRNAgp46 처리된 쥐에서도 병리학적 병기, 즉 섬유증 및 구조적 변화가 명확하게
억제되었습니다(그림 4f).

DMN 처리된 쥐는 복수, 위장 출혈 및 타르 배설물이 발생했기 때문에 간부전으 간 gp46 발현에 대한 siRNAgp46의 효과는 주입된 쥐의 간 표본에서 gp46에
로 사망한 것으로 보입니다(데이터 대한 염색에 의해 조사되었습니다.

Nature BIOTECHNOLOGY 26권 4호 2008년 4월 435

Machine Translated by Google
조항

VA‑lip‑siRNAgp46 및 VA‑lip‑siRNArandom으로 5회(33일). 다른 날), PBS, 비타민 A 단독, 비타민 A 결합 리포좀, VA lip‑siRNArandom 또
양성으로 염색된 영역(빨간색)은 전자에서 상당히 작았습니다(그림 4g). 웨스턴 블 는 lip‑siRNAgp46; (그룹당 n = 3). HS 세포와 겹치는 영역의 TUNEL 양성 세포
롯 분석 결과는 이 면역조직학적 관찰과 일치했습니다. gp46 밴드의 강도는 대조군 (a‑SMA 양성)는 VA‑lip‑siRNAgp46 대 VA lip‑siRNArandom으로 처리한 쥐에
보다 VA‑lip‑siRNAgp46 처리된 쥐에서 더 약했습니다(그림 4h). 서 분명히 증가했습니다(보충 그림 5a 온라인). a‑SMA 양성 영역의 TUNEL 양성
세포(보충 그림 5b)는 대조군에 비해 VA‑lip‑siRNAgp46 처리된 쥐에서 유의하게
증가했습니다(P < 0.01).
간경변의 가역성은 각각 44일과 46일에 DMN 및 VA‑lip siRNAgp46 처리를 중
단한 47일 및 70일 쥐의 간 표본에서 조사되었습니다. 정상적인 간 구조의 거의 완
전한 복원이 47일 및 70일 랫트의 표본에서 관찰되었으며(그림 4i), 이는 간 조직 HS 세포 배양 실험에서 siRNAgp46에 의해 형질 감염된 쥐 pHS 세포의 세포
의 재생 능력을 나타냅니다. 사멸 핵에서 TUNEL 염색은 대조군 HS 세포보다 3 일 후에 더 컸습니다 (보충 그림
5c).
siRNAgp46으로 형질 감염된 HS 세포의 모든 핵의 약 절반 (48 ± 12 %)이 세포
사멸을 나타 냈습니다. 대조군 (P <0.01)에 비해 상당한 증가입니다 (보충 그림
siRNAgp46에 의한 래트 HS 세포에서의 세포사멸 유도 이러한 관 5d). 이러한 결과는 siRNAgp46이 HS 세포로부터 콜라겐의 분비를 억제할 뿐만 아
찰은 siRNAgp46 처리가 HS 세포의 세포사멸사를 유도할 수 있다는 추측을 하게 니라 세포사멸을 통해 섬유화 조직에서 HS 세포를 제거하여 조직에서 추가 콜라겐
하였다. Apoptosis는 VA‑lip‑siRNAgp46(0.75 mg/kg을 매일 5회 주사한 축적을 차단함을 시사합니다.
DMN 처리된 쥐의 간 표본 33일에 TUNEL 염색으로 결정되었습니다.

PBS _ 버지니아
VA‑리포솜 씨 (%) 디 이자형

25 * * 일반 쥐
* * PBS 주입 DMN 래트(29일)
1,500 **
*
*
겐
라
콜
I

20 *
VA‑lip‑siRNAgp46 처리된 DMN 쥐(3회 주입, *
29일) 1,250
15
VA‑lip‑siRNAgp46 처리된 DMN 쥐(5회 주입,
백
의
적
면
진
룩
얼율
분

1,000
33일) 린
롤
프
시
록
드
이
하 mg/
간)
(g

10 750
10
VA‑lip‑siRNA 랜덤 입술‑siRNAgp46 VA‑립‑siRNAgp46 9
5 500
8
**
PBS GAPDH
mRNA
율
비 /
7 250 *
0
6
0 PBS
5
VA VA ‑ 리포솜
4
Lip‑siRNAgp46 VA‑lip‑siRNAgp46 정상 쥐
3
VA‑립‑siRNA무작위
VA‑lip‑siRNAgp46 정상 쥐
2
VA VA ‑ 리포좀 VA‑lip‑siRNA무작위 Lip‑siRNAgp46

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b PBS 버지니아
VA‑리포솜
10

6 * * * 프로콜라겐 I TIMP‑1
수
점
기
병
적
학
직
조 **
에프
5
4 VA‑립‑siRNA gp46
g VA‑립 siRNA무작위
삼

2
1
VA‑lip‑siRNA 랜덤 입술‑siRNAgp46 VA‑립‑siRNAgp46
0
PBS 버지니아

입술‑siRNAgp46
VA‑립‑siRNAgp46
VA ‑ 리포솜 VA‑lip‑siRNA무작위

시간 나
gp46 47일차 70일
그림 4 간경변 쥐의 간 조직학에 대한 VA‑lip‑siRNAgp46의 iv 주사 효과. (a,b) VA‑lip‑siRNA
gp46(0.75 mg/kg의 siRNA 용량, 3회 주사)을 5회 주사한 간경변 쥐에서 얻은 Azan‑Mallory(a) β‑액틴
PBS
버지니아

및 콜라겐 I 염색 간 절편(b)의 대표적인 현미경 사진 일주일) 및 대조군 쥐(그룹당 n = 12). 화살촉은 콜

라겐 피브릴을 나타냅니다. 축척 막대, 100mm. (c) 콜라겐 I 염색 양성 영역은 디지털 이미지에서
간 전체 영역에 대한 염색 영역의 비율로 평가됩니다. 데이터는 각 12마리 쥐 그룹에서 무작위로 선택된
VA ‑ 리포솜 Lip‑siRNAgp46 VA‑lip‑siRNA무작위 VA‑lip‑siRNAgp46

6개 필드에서 얻었으며 평균 ± sd *P o 0.001을 나타냅니다. **P o 0.01 대 VA‑lip‑siRNAgp46.

(d) 정상 래트(n=3), PBS 3회 주사로 처리된 DMN 처리된 간경변 래트(n=3), VA‑ lip‑
siRNAgp46(n=3) 및 VA‑lip‑siRNAgp46(n=3)을 5회 주사한 DMN‑간경변 쥐를 실시간 PCR
로 정량화했습니다. 발현은 하우스키핑 유전자인 GAPDH mRNA에 대한 비율로 정규화하였다. 데이터는 3마리의 다른 래트를 대표하는 한 분석의 평균 ± sd입니다. (e) 간의 하이드록시프롤린 함
량. 그룹당 12마리의 평균 ± sd. *P<0.001 대 VA‑lip‑siRNAgp46. (f) 조직학적 병기를 위한 반정량적 스코어링 분석. 간 조직은 a에 기술된 바와 같이 처리된 래트로부터 얻었다. 값은 평균 ±
SD(그룹당 n = 12)입니다. *P<0.001 대 VA‑lip‑siRNAgp46. ( g ) VA‑lip‑siRNArandom (n = 3) 또는 VA‑lip‑siRNAgp46 (n = 3)을 격일로 3 회 주사 한 쥐 (24 일 쥐)의 간경변 간에서 gp46에 대한 대
표적인 면역 형광 염색 패턴 24 시간 마지막 주입 후. 공초점 레이저 현미경을 사용하여 Alexa 568 표지 항gp46 항체(빨간색)로 염색된 gp46과 DAPI(파란색)로 대조 염색된 핵의 면역형광 이미지를 얻었습
니다. 축척 막대, 100mm. 간 균질액에서 gp46의 웨스턴 블롯 분석(h)은 본질적으로 조직학적 분석과 동일한 결과를 나타냈고; 즉, VA‑lip‑siRNAgp46 처리에 의한 gp46 밴드의 억제입니다. 3마리 쥐
로 구성된 각 그룹의 결과는 본질적으로 비슷했습니다. (i) 47일째 및 70일째 래트의 대표적인 Azan‑Mallory‑염색 간 절편.

6마리 쥐로 구성된 각 그룹의 결과는 본질적으로 비슷했습니다. 축척 막대, 200mm.

436 26권 4호 2008년 4월 자연 생명공학

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조항

0 1w 2w 3w 4w 5w 6w 7w 8w 9w 10w 11w
PBS
비 VA‑립‑siRNAgp46 씨
ㅏ 잔
아

SD 쥐 (%)
40
* *
CCI4 × 2/주 30
25
VA‑lip‑siRNAgp46(0.75 백
의
역
영
된
색
염
I로
겐
라
콜 율
분

20 NS
mg/kg) × 2/주
15
조직학적/생화학적 분석
10
디 이자형 PBS VA‑립‑siRNAgp46 5
* * 겐
라
콜
I
0
1,500
(µg/
간)
g

린
롤
프
시
록
드
이
하 1,250
1,000
750
NS 일반 쥐
PBS VA‑lip‑siRNA무작위 VA‑lip‑siRNAgp46

500
250
0
에프 세럼 히알루로네이트 혈청 빌리루빈 mg/
µg/ dl
*
일반 쥐 l 1,200 *
PBS VA‑lip‑siRNA무작위 VA‑lip‑siRNAgp46

1,000 1.0

800

600
그림 5 CCl4 처리된 간경변 쥐 에 대한 VA‑lip‑siRNAgp46의 iv 주사 효과 . ( a ) CCl4 유발 간경변증이있는 쥐의 VA‑lip siRNAgp46 치 0.5
료 일정 . 간 및 혈액 샘플은 VA‑lip‑siRNAgp46, VA‑lip‑siRNArandom(siRNA 용량 0.75mg/kg, 주 2회) 또는 PBS 단독(그룹당 n=6)의 400

6회 주사로 처리된 CCl4 쥐로부터 채취되었습니다 . ( b ) Azan‑Mallory 및 콜라겐 I 염색 간 섹션의 대표적인 현미경 사진. 축척 막대, 200 *
100mm. (c) 전산화된 이미지 분석에 의해 평가된 콜라겐 I 염색 양성 영역. 데이터는 각 그룹의 6마리 쥐(VA‑lip‑siRNAgp46, VA‑lip‑
0 0
siRNA무작위, PBS 처리 및 정상 쥐)의 간 표본의 무작위로 선택된 6개의 저전력 필드에서 얻었으며 평균 ± sd(d) 하이드록시프롤린
함량을 나타냅니다. 간. 그룹당 6마리의 평균 ± sd.
일반 쥐 일반 쥐
PBS VA‑lip‑siRNA무작위 VA‑lip‑siRNAgp46 PBS VA‑lip‑siRNA무작위 VA‑lip‑siRNAgp46

*P<0.05 대 VA‑lip‑siRNAgp46 처리된‑CCl4 쥐. NS, 중요하지 않음. (e) 공초점 레이저 현미경을 사용하여 Alexa 568‑
표지된 항‑gp46 항체(빨간색)로 염색된 gp46 및 DAPI(파란색)로 대조염색된 핵의 대표적인 면역형광 이미지를 얻었다. 축척 막대, 100mm. 3마리 쥐로 구성된 각 그룹의 결과는 본질적으로 비슷했습니
다. (f) 쥐의 혈청에서 총 빌리루빈 및 히알루로네이트 수준. 값은 각 그룹에 대한 평균 ± sd입니다(그룹당 n = 6). *P<0.05 대 VA‑lip‑siRNAgp46 처리‑CCl4 쥐.

siRNAgp46 처리가 간 기능에 미치는 영향 VA‑lip‑ siRNAgp46 처리된 간경변 쥐의 간에서의 콜라게나아제 활성 간경변 간에서의 콜
siRNAgp46(0.75 mg/kg, 격일로 5회)은 대조군 간경변 쥐에 비해 VA‑lip‑ 라게나아제 활성을 평가하기 위해, 우리는 DMN 쥐의 간 균질액에서 콜라게나아제
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siRNAgp46 처리 간경변 쥐에서 혈청 빌리루빈 및 히알루로네이트의 상승을 유의 활성을 측정했습니다. PBS 또는 VA‑lip‑siRNAgp46을 3회(29일) 주입한 DMN 처
하게 약화시켰습니다. 33일째, DMN 노출 동안(P < 0.01). 70일째에 DMN 쥐의 빌 리된 쥐의 콜라게나제 활성은 정상 간에서와 같이 높았고 VA‑lip‑siRNAgp46으로
리루빈, 히알루로네이트, 알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALT) 및 알부민 수치는 VA‑ 5회 처리(33일) 후에도 높은 상태를 유지했습니다(보충 표 3 및 보충 방법).
lip siRNAgp46 처리로 거의 또는 완전히 정상화되었습니다(보충 그림 6 온라인).

CCl4 유발 간경변 에 대한 VA‑lip‑siRNAgp46의 효과 쥐에게 CCl4

DMN 간경변증에 대한 siRNAgp46B 및 siRNAgp46C의 효과 siRNAgp46A 를 연속적으로 복강 내 투여하면 (8주에 걸쳐 16회) 치명적이지 않은 간경변이 발생
로 처리하여 얻은 시험관내 및 생체내 결과가 비표적 효과로 인한 가능성을 제거하기 합니다4. 우리는 siRNAgp46 및 VA‑lip‑siRNAgp46을 3주 동안 매주 2회 투여하
위해, 간경변증에 대한 gp46, siRNAgp46B 및 C의 두 가지 다른 siRNA의 효과 여 항섬유화 가능성을 추가로 평가하기 위해 화학적으로 유발된 간경변의 이 추가
를 테스트했습니다. DMN 처리된 쥐에서. 연장된 생존, 감소된 조직학적 섬유증 및 모델을 사용했습니다(그림 5a). siRNAgp46의 효과는 섬유화 부위의 수축(그림
하이드록시 프롤린 축적의 억제는 siRNA(보충 그림 7 온라인)에 대한 노출과 명확 5b,c), 히드록시프롤린 수준의 억제(그림 5d) 및 gp46 발현(그림 5e)과 관련하여
하게 연관되어 있으며, 이는 siRNAgp46A의 효과가 오프타겟팅과 관련이 없음을 DMN 처리된 쥐에서와 본질적으로 동일했습니다. VA‑lip‑siRNAgp46으로 처리한
나타냅니다. CCl4로 처리한 간경변 쥐 에서도 빌리루빈과 히알루로네이트 수치가 개선되었습니
다 (그림 5f).

VA‑lip‑siRNAgp46은 면역 반응을 유발하지 않습니다 간, 비장 및

폐에서 인터페론‑a(IFN‑a) mRNA 발현은 VA‑lip‑siRNAgp46 처리 후 정상으로 VA‑lip‑siRNAgp46이 담관 결찰 유발 간경변증에 미치는 영향 담관 역류를 동반한
유지되었습니다(보충 표 2 온라인). 리포펙타민‑2000과 복합체를 형성한 만성 지속 자극에 의해 유발된 간경변증에도 우리의 방식이 효과적인지 확인하기 위
siRNAbgal728이 포유류15에서 면역 반응을 유도하는 것으로 보고됨에 따라 (보 해 담관 결찰술을 시행한 쥐에게 VA‑lip‑siRNAgp46을 투여했습니다16( BDL ;
충 방법 온라인), 우리는 또한 리포펙타민‑2000과 복합체를 형성한 VA‑lip‑ 그림 6a). VA‑lip‑siRNAgp46(0.75 mg /kg, 격일). 이러한 효과는 BDL 자극에도
siRNAgp46 또는 siRNAbgal728로 처리한 쥐에서 TNF‑α 및 IL‑12의 혈청 농도 불구하고 동일한 약제를 일주일에 두 번 연속 주사하여 67일까지 유지되었습니다(그
를 테스트했습니다. TNF‑a 및 IL‑12의 혈청 농도는 VA‑lip‑siRNAgp46 처리 후 림 6f‑i).
정상으로 유지되었으며, 이는 리포펙타민‑2000과 복합체화된 siRNAbgal728로 처
리된 래트에서 유의하게 상승된 값과 대조적이었습니다(P<0.05)(보충 표 2).

Nature BIOTECHNOLOGY 26권 4호 2008년 4월 437

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조항

67일
ㅏ 씨 디 에프

0 1주 2주 3w 4w 5w 6w 7w 8w 9w 10주 11주 (%)

**
* VA‑lip‑siRNA 랜덤 VA‑립‑siRNAgp46
40
30
1,500 *
SD 쥐 (µg/
간)
g
1,250 잔
아

25 린
롤
프
시
록
드
이
하

1,000 NS
겐
라
콜역
영
된
색
염
해
대
I에율
분
백
의
20 NS 750
15 500
BDL
10 250
5 0
VA‑립‑siRNAgp46(0.75mg/kg) 0
PBS

일반 쥐
VA‑lip‑siRNAgp46 정상 쥐 PBS VA‑lip‑siRNA무작위 VA‑lip‑siRNAgp46
조직학적/생화학적 분석 VA‑립‑siRNA무작위 겐
라
콜
I

비 45일차

VA‑lip‑siRNA 랜덤 VA‑립‑siRNAgp46 e
세럼 히알루로네이트 혈청 빌리루빈
잔
아 µg/l mg/dl
3,500 14
**
3,000 12

2,500 10 g (%)
40 **
시간
**
1,500
2,000 * * 8
30 (µg/
간)
g
1,250
1,500 NS 6 25 린
롤
프
시
록
드
이
하

1,000 NS
20 750
1,000 4 겐
라
콜역
영
된
색
염
해
대
I에율
분
백
의

15 500
500 2 * 10 * 250
0 0 5 0
겐
라
콜
I PBS PBS 0
PBS

VA‑lip‑siRNAgp46 정상 쥐 VA‑lip‑siRNAgp46 정상 쥐 일반 쥐
VA‑립‑siRNA무작위 VA‑립‑siRNA무작위 VA‑lip‑siRNAgp46 정상 쥐 PBS VA‑lip‑siRNA무작위 VA‑lip‑siRNAgp46

VA‑립‑siRNA무작위

나 세럼 히알루로네이트 혈청 빌리루빈
µg/ mg/dl
l 3,500 * * 14 **

3,000 12

2,500 10
그림 6 BDL 유발 간경변 쥐에 대한 VA‑lip‑siRNAgp46의 iv 주사 효과. ( a ) BDL 유발 간경변증이있는 쥐의 VA‑lip‑siRNAgp46 치 2,000 8
료 일정. BDL 36일째에 쥐를 VA‑lip‑siRNAgp46, VA‑lip‑siRNArandom 또는 PBS(그룹당 n=10)로 처리했습니다. 주사는 1,500 6

0.75 mg/kg siRNA의 1일 용량으로 격일로 5회 투여한 후 일주일에 2회 6회 투여하였다. ( b – i ) 45 일 ( b – e ) 및 67 일 ( f – i ) (그 1,000 4

500 * 2 *
룹당 n = 10)에 BDL 쥐에서 간 및 혈액 샘플을 채취했습니다. 45일(b) 및 67일(f)에 Azan‑Mallory 및 콜라겐 I로 염색된 간 절편
0 0
의 대표적인 현미경 사진. 축척 막대, 100mm. BDL 쥐의 45일(c) 또는 67일(g)에서 얻은 간에서 콜라겐 I 염색 양성 영역의 백분율. 데이 PBS PBS
터는 각 그룹의 10마리 쥐(VA‑lip‑siRNAgp46, VA‑lip‑siRNA무작위, PBS 처리 및 정상 쥐)의 간 표본의 무작위로 선택된 6개의 저전력 필
드에서 얻었으며 얻은 간에서 평균 ± sd Hydroxyproline 함량을 나타냅니다. BDL 쥐의 45일(d) 또는 67일(h)을 형성합니다. 데이터 일반 쥐 VA‑lip‑siRNAgp46 정상 쥐
VA‑립‑siRNA무작위 VA‑립‑siRNAgp46 VA‑립‑siRNA무작위
는 각 그룹의 10마리 래트에서 얻었고 45일(e) 또는 67일(i)에서 얻은 래트 혈청의 평균 ± sd 총 빌리루빈 및 히알루오네이트 수준을 나타
냅니다. 값은 각 그룹의 평균 ± sd입니다(그룹당 n = 10).

*P<0.05 대 VA‑lip‑siRNAgp46‑처리된‑BDL 쥐.
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PBS‑ 또는 VA‑lip‑siRNA무작위 처리 그룹에서 섬유증과 동반된 현저한 담관 증 IFN‑a 유도와 같은 면역 반응을 피하기 위해 전사 인자 IRF3의 활성화를 손상시키는 것으
식에 의해 입증된 바와 같이 지속되었습니다. 로 나타난 2‑뉴클레오티드 3¢ 오버행이 있는 siRNA를 사용했습니다(참조 19). 또한, 우
리의 siRNA에는 IFN 유도에 역할을 하는 것으로 알려진 T7‑transcript(제조업체 정보)
논의 의 5¢ 삼인산이 포함되어 있지 않습니다20. 사실, VA‑lip siRNAgp46으로 처리된 쥐의
간 섬유증을 치료하기 위한 대부분의 접근법의 부적절한 표적 특이성으로 인해 임상적 사 순환계에서 간에서 IFN‑α mRNA 또는 TNF‑α 및 IL‑12의 상승은 없었습니다. 그러나 위
용에 대한 적합성이 제한되었습니다17. 특이성을 보장하기 위한 우리의 두 갈래 전략은 첫 에서 설명한 siRNA의 변형이 모든 면역 반응의 유발을 막지 못할 수 있으므로 본 연구에
째, siRNA로 콜라겐 특정 샤페론 분자(gp46)를 표적으로 삼고, 둘째, 비타민 A 결합 리 서 낮은 면역 활성화가 siRNA의 변형 외에도 RBP 수용체 매개 siRNA 흡수와 관련이
포솜을 사용하여 특히 콜라겐 생성 간 세포에 siRNA를 전달하는 것입니다. 이를 통해 있을 가능성이 있습니다. 구조.
DMN 또는 CCl4 치료 또는 담관 결찰 에 의한 간경변 유도와 관련된 쥐 모델에서 간 콜라
겐 침착을 해결할 수 있었습니다 . DMN 처리된 쥐의 생존은 용량 및 기간 의존 방식으로
연장되었으며, 이는 siRNAgp46 처리의 생물학적으로 특정한 효과를 나타냅니다.

특이성이 중요하지만 siRNA를 치료제로 사용하는 또 다른 중요한 요소는 표적 분자

의 억제 효능입니다. 길이가 25‑30 뉴클레오티드인 합성 RNA 듀플렉스는 기존의 21‑
mer siRNA21보다 최대 100배 더 강력하기 때문에 2‑뉴클레오타이드 3¢ 오버행이 있
TLR(Toll‑like receptor)3 또는 TLR 7/8(참조 15)과의 상호작용에 의해 구동되는 는 27‑뉴클레오타이드 RNA 듀플렉스를 사용했습니다.
인터페론(IFN‑a)의 유도와 같은 비표적 효과18 및 면역 반응은 종종 사용과 관련된 두 가
지 문제입니다 . siRNA 실험을 잘못 해석할 수 있는 siRNA의
siRNA 치료의 효능에 영향을 미치는 또 다른 요인은 주로 세포 분열로
우리는 동일한 표적(gp46) mRNA에 대해 3개의 독립적인 siRNA를 사용했고 생 인한 희석에 의해 지배되는 유전자 침묵의 지속 기간입니다. 빠르게 분열하
체 내에서 유사한 유전자 침묵 효능 및 항섬유화 효과를 발견했으며(그림 1a 및 보 는 종양 세포에서 siRNA에 의해 억제된 단백질 수준이 치료 전 수준으로 회
충 그림 7), 이는 gp46의 하향 조절로 관찰된 표현형이 실제로 gp46 녹다운과 관련 복되는 데는 1주 미만이 소요되는 반면 느리게 분열하는 섬유아세포나 분열
이 있음을 시사합니다. siRNA 서열의 방관자 효과가 아닙니다. 하지 않는 간세포에서는 43주가 걸립니다22. 우리는 gp46의 수준을 확인
했습니다.

438 26권 4호 2008년 4월 자연 생명공학

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siRNA로 처리된 HS 세포에서 in vitro 및 in vivo에서 최소 72시간 동안 억제
된 상태를 유지했으며 생체 내 효능을 입증하기 위해 siRNA 주입 간격으로
48‑72시간을 사용했습니다.
우리 연구에서 사용된 생체 내 siRNA 용량(단일 주사당 0.75mg/kg)은 이전에
생체 내 치료 효과가 있는 것으로 나타난 용량보다 적었습니다23‑25. 이것은
siRNAgp46을 HS 세포에 우선적으로 전달하기 위해 비타민 A 결합 리포좀을 사용
하는 것과 관련이 있을 수 있습니다.
HS 세포에서 혈장 RBP/레티놀 복합체에서 세포 RBP로의 레티놀 전달이 수용체 구
동인지 또는 수동 확산26에 의해 진행되는지에 대해 오랫동안 논의되어 왔습니다. 가
장 최근의 연구 결과는 HS 세포 에 의한 레티놀의 수용체 유도 흡수와 일치 하지만
세포막의 소수성 부분으로의 직접적인 위치 지정과 수용체 매개 흡수가 완전히 배제
되지는 않았습니다 .
수용체 기반 이론과 일관되게 혈장 RBP에 결합한 후 HS 세포에 의한 비타민 A 결
합 리포솜의 특이적인 섭취는 RBP 농도 의존성, RBP 항체의 효과(그림 1e,f) 및 세
포 내 국소화 (그림 1h). 특히, 비타민 A 결합 리포솜을 정맥 주사한 쥐의 간경변 간
에서 siRNA‑FAM 형광은 주로 HS 세포(a‑SMA 염색으로 식별)가 있는 영역에서 관
찰되었지만 실질 영역에서는 관찰되지 않았습니다. FAM‑florescence와 HS 세포
가 병합된 영역이 비타민 A가 없는 리포좀으로 처리된 쥐보다 현저하게 더 크다는 발
견과 함께, 이는 비타민 A 결합 리포좀이 HS 세포에 특이적으로 흡수된다는 개념과
도 양립할 수 있습니다. RBP 수용체에 의해
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간 섬유증이 퇴행하고 생존 시간이 siRNAgp46을 운반하는 비타민 A 결합 리포솜
으로 처리된 동물에서만 유의하게 연장되었다는 관찰은 비타민 A 수용체 이론
(Breslow‑Gehan Wilcoxon test, P o 0.0001)을 추가로 뒷받침합니다.
부수적으로, 우리의 결과는 또한 활성화 과정에서 비타민 A 침착이 없는 활성화
된 HS 세포가 비타민 A32 를 저장하는 휴지 HS 세포만큼 효과적으로 비타민 A를
흡수한다는 것을 확인합니다. 활성화된 HS 세포주(LI90)와 in vitro 배양으로 활성
화된 1차 쥐 간 HS 세포는 모두 비타민 A가 없는 리포좀 대신에 비타민 A가 결합된
리포좀과 함께 배양했을 때 현저하게 향상된 FAM 형광을 나타냈습니다(그림 1e,g).
VA‑lip‑siRNAgp46‑FAM 분포는 망막에서 무시할 수 있었는데, 아마도 눈이
강력한 혈액 망막 장벽을 가진 고립된 시스템이기 때문일 것입니다. 그것은 비장과
간에서 약간 분명했는데, 세망내피계(대식세포)에 대한 비타민 A 수용체 독립적인 방
식으로 VA‑lip‑siRNAgp46의 흡수를 보여주었지만, 이들 세포는 주로 콜라겐 생성
세포가 아니므로 영향을 받지 않아야 합니다. siRNAgp46의 비특이적 흡수에 의해.
방사성 표지된 비타민 A 결합 리포솜의 장기 분포를 조사한 결과 간경변증 간에
서만 현저한 방사능 흡수가 관찰되었습니다. 다른 장기의 방사능은 DMN 처리된 쥐
와 정상 쥐 모두에서 본질적으로 동일했으며, 이는 비타민 A 결합 리포솜의 전달이
실제로 RBP 수용체를 소유한 HS 세포에 특이적이고 다른 조직으로의 전달이 비특
이적인 방식으로 발생했음을 나타냅니다. , 아마도 대식세포에 의한 비특이적 삼켜짐
을 통해.
또한 siRNA 전달을 위한 우리의 비타민 A 결합 리포좀 시스템이 기존의 리포좀
을 사용하는 이전에 보고된 방법과 비교하여 상당히 효율적인 것으로 나타났습니
다. 우리의 비타민 A 결합 리포솜은 0.75mg/kg 리포솜의 용량에서 생물학적 효과
를 생성한 반면, 이전 보고서23,24,35,36 에서는 B8‑160mg/kg의 용량이 필요했
습니다. 또한, 대부분의 다른 연구37에서는 총 혈액량에 대한 용액의 비율을 약 1:10
으로 사용했습니다(즉, 마우스의 혈액량은 200ml/2ml, 마우스의 혈액량은
2,000ml/20ml).
Nature BIOTECHNOLOGY 26권 4호 2008년 4월
조항
쥐) 단일 볼루스 주입을 위해 siRNA를 포함하는 리포솜을 용해합니다. 그러나 우리
는 200g 쥐(1:100 혈액량)에 대해 주사당 200ml만 사용했습니다. 이것은 우리 연
구에서 유체 역학적 압력이 siRNA의 생체 내 전달에 기여하지 않았지만 이전 연구에
서는 siRNA가 적어도 어느 정도 유체 역학적 압력에 의해 강제로 변환되었을 수 있
음을 시사합니다. 이것은 FAM에 대한 배경 형광이 약하고 간 이외의 조직에 대한 방
사성 비타민 A 결합 리포좀의 비특이적 분포가 낮은 이유를 설명할 수 있습니다.
간 섬유증의 다양한 동물 모델이 연구되었습니다4,6,16,38,39.
우리는 DMN 모델이 진행성 및 치명적인 섬유증을 유발하기 때문에 주로 DMN 모델
에 초점을 맞추기로 결정했으며, 이를 통해 섬유증의 장기간 생존 해상도를 입증할
수 있었습니다. 이러한 결과 는 DMN 모델보다 경미한 비살상 CCl4 모델과 담즙 역
류를 지속적으로 자극하여 만성 간경변증을 유발하는 담관 결찰 모델을 모두 사용
하여 이러한 결과를 확인하였다 . 세 가지 모델 모두에서 결과의 일관성은 다양한 유
형의 간경변에 대한 접근 방식의 적용 가능성을 나타냅니다.
이 모델에서, 섬유증의 퇴행은 siRNAgp46의 5회 주사 후 발생했지만, 동물은 여
전히 DMN, CCl4 또는 BDL 자극에 노출되었습니다 . 치료 효과의 기본 메커니즘은
siRNAgp46(그림 1c,d,i)에 의한 콜라겐 분비의 억제와 콜라게나제 활성에 의한 미
리 축적된 콜라겐의 부수적인 분해로 추측되며, 이는 섬유화가 거의 완전히 사라질
때까지 정상 간에서와 같이 높게 유지됩니다. VA‑lip‑siRNAgp46(보충 표 3)을 사
용한 5가지 처리로 해결되었습니다. 이 발견은 매트릭스 메탈로프로테이나제가 일단
세포에서 분비되면 타입 1 콜라겐에 결합하여 지속적인 세포외 매트릭스 관련 풀을
형성한다는 개념과 일치합니다40,41. 또한 고정 부위 (콜라겐)의 손실로 인한 HS 세
포 세포 사멸은 치료 효과의 이차적 메커니즘으로 간주됩니다 (보충 그림 5).
부수적으로, siRNAgp46 자체에 의해 야기되어서는 안 되는 siRNAgp46‑처리된 간
에서의 프로콜라겐 I mRNA의 명백한 억제(도 4d)는 또한 콜라겐 생성 HS 세포의
아폽토시스에 기인할 수 있다.
세 가지 간경변 모델 모두에서 혈청 빌리루빈 및 히알루로네이트 수치의 개선은
문맥 영역에서 섬유증의 해결을 추가로 입증합니다. 그러나 혈청 알부민과 ALT 수준
은 DMN 처리된 쥐에서 VA‑lip‑siRNAgp46 처리에 의해 크게 개선되지 않았습니
다. 이는 70일째에 DMN 처리된 래트가 정상적인 간 구조의 회복(그림 4i)과 혈청
외에 혈청 알부민 및 ALT 수준의 거의 완전한 정상화를 보였기 때문에 진행 중인
DMN 처리의 독성 효과로 인한 것일 수 있습니다.
빌리루빈 및 히알루로네이트(보충 그림 6). 따라서 우리의 방식은 실제로 간경변증
을 조직학적 및 기능적으로 역전시킵니다. 이것은 간경변증 치료를 위한 임상 번역에
대한 약속을 강조합니다.
방법 세포주 .
RIKEN 세포 은행(RIKEN Institute)으로부터 정상 래트 신장 섬유아세포(NRK) 세포 및
LI90 세포(인간 HS 세포주)를 입수하였다. 세포를 10%(wt/vol) FBS, 1mM 피루브산나트
륨 및 4mM L‑글루타민이 보충된 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM; Life
Technologies, Inc.)에서 37℃, 5% CO2에서 유지 시켰다 .
siRNA의 준비. 인간 HSP47의 래트 동족체인 gp46(GenBank 수탁 번호 M69246)에 대
한 siRNA의 세 가지 제형을 홋카이도 시스템 사이언스에서 구입했습니다. siRNA의 센스 및
안티센스 가닥은 다음과 같습니다. 5¢‑P. GUUGUCUACC AUCUUAUGGUGGAACAU‑3¢
(안티센스); gp46(시퀀스 B), 시작
439
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조항
NT 1626, 5¢‑P에서. CCACAAGUUUUAUAUCCAAUCUAGCAG‑3¢(센스), 5¢‑
GCUAGAUUGGAAUAUAAAACUUGUGGAU‑3¢(안티센스); gp46(시퀀스 C), nt 1909에
서 시작, 5¢‑CUAGAGCCAUUACAUUACAUUGACAAG‑3¢(센스); 5¢‑
UGUCAAUGUAAUGUAAUGGCUCUAGAU‑3¢(안티센스). siR NA‑랜덤, 5¢‑
CGAUUCGCUAGACCGGCUUCAUUGCAG‑3¢(센스) 및 5¢‑
GCAAUGAAGCCGGUCUAGCGAAUCGAU‑3¢(안티센스).
일부 실험의 경우, 센스 가닥의 5¢ 말단에 결합된 6¢‑카르복시플루오레세인(6‑FAM) 또는
시아닌 5(Cy‑5)가 있는 gp46 siRNA(서열 A)를 사용했습니다. 이러한 모든 서열은 BLAST 검
색에 의해 알려진 래트 mRNA와 서열 상동성을 공유하지 않는 것으로 나타났습니다. 인터페
론 반응 실험을 위해 Dharmacon, Inc.에서 구입한 인터페론 생성 유도 모티프를 포함하는 b‑
갈락토시다아제를 표적으로 하는 siRNA(siRNAbgal728)를 사용하였다15.
siRNA의 형질감염. 제조사의 프로토콜에 따라 Lipotrust(Hokkaido System Science)를
사용하여 siRNA를 NRK 세포에 도입하였다.
웨스턴 블롯 분석. 세포 또는 간 표본의 단백질 추출물을 4/20 SDS‑폴리아크릴아미드 겔로 분
해하고, 니트로셀룰로스 막으로 옮기고, HSP47(gp46)(Stressgen) 또는 b‑액틴(Cell
Signaling)에 대한 항체로 조사한 다음, 퍼옥시다제 결합 항체를 다음과 같이 조사했습니다.
2차 항체(Oncogene Research Product). 마지막으로 ECL(Amer sham Life Science)
로 시각화했습니다.
콜라겐 합성 분석. NRK 세포의 콜라겐 합성은 프롤린 혼입 분석으로 평가되었습니다42. 간략
하게, 10% FBS를 함유하는 배양 배지로 6‑웰 플레이트에 1×105개의 NRK 세포를 시딩하였
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다. 24시간 후, 세포를 Lipotrust를 사용하여 50 nM의 siRNAgp46으로 형질감염시키고 24
시간 동안 배양하였다.
그 후, 배지를 [2,3‑3 H]‑lL 프롤린(5 mCi/ml, NEN)을 포함하는 OPTI‑MEM으로 변경하였
다. 24시간 후, 배양 상등액의 200ml 분취량 2개를 각 웰에서 제거했습니다.
새로 합성된 총 [3H]프롤린 표지 단백질 생산을 정량화하기 위해 상청액 샘플을 사용했습
니다 . 비콜라겐 단백질과 콜라게나아제 분해 단백질의 양은 콜라게나아제(Clostridium
histolyticum, Sigma)를 사용하여 두 번째 분취액에서 측정하였다. 방사능은 섬광 계수로
측정되었습니다. 각 배양 상등액에 존재하는 콜라겐의 양은 전체 단백질을 측정하기 위해 사용
된 분취량에서 얻은 cpm에서 비콜라겐 단백질을 측정하기 위해 사용된 분당 계수(cpm)를 빼
서 결정했습니다. 데이터는 대조군 배양에 비해 생성된 콜라겐의 백분율로 표시됩니다.
siRNAgp46을 운반하는 VA 결합 리포솜의 준비. 양이온성 지질로서 O,O¢‑ditetradecanoyl‑
N‑(a‑trimethylammonio acetyl) diethanolamine chloride(DC‑6‑14)(보충 그림
2a)를 함유하는 양이온성 리포좀(Lipotrust)43, 콜레스테롤 및 디올레오일포스파티딜에탄올
아민을 몰비 로 4:3:3(체외 및 생체 내 유전자 전달을 위한 혈청 함유 조건에서 높은 형질감염
효율을 나타냄43,44)은 홋카이도 시스템 사이언스에서 구입했습니다. 리포솜은 이전에 기술
된 동결 건조된 빈 리포솜 방법을 사용하여 제조되었으며 사용 전에 와류 상태에서 동결 건조
된 지질 혼합물에 이중 증류수(DDW)를 첨가하여 1mM(DC‑16‑4)의 농도로 제조되었습니다.
VA 결합 리포좀을 제조하기 위해, DMSO에 용해된 200 nmol의 비타민 A(레티놀, 시그마)를
25℃에서 1.5 ml 튜브에서 볼텍싱하여 리포좀 현탁액(DC‑16‑4로서 100 nmol)과 혼합하였
다. siRNAgp46(VA‑lip‑siRNAgp46)을 운반하는 VA 결합 리포좀을 제조하기 위해,
siRNAgp46(DDW에서 580pmol/ml) 용액을 25℃에서 교반하면서 레티놀 결합 리포좀 용
액에 첨가하였다. siRNA 대 DC‑16‑4의 비율은 1:11.5(mol/mol)이고 siRNA 대 리포좀 비
율(wt/wt)은 1:1이었습니다. 리포좀에 의해 흡수되지 않은 자유 비타민 A 또는 siRNA는 마이
크로파티션 시스템(VIVASPIN 2 농축기 30,000 MWCO PES, VIVASCIENCE)을 사용하여
리포좀 제제로부터 분리되었습니다. 리포좀 현탁액을 필터에 첨가하고 1,500g에서 5분 동안
25℃에서 3회 원심분리하였다. 분획을 수집하고 필터에 갇힌 물질을 PBS로 재구성하여 시험
관 내 또는 생체 내 사용을 위해 원하는 용량을 달성했습니다.
래트 HS 세포 및 피부 섬유아세포의 분리. 쥐 HS 세포는 pronase‑collagenase로 분해한
다음 Nycodenz 기울기에서 원심분리하여 분리했습니다. 그런 다음 세포를 DMEM에서 배양
했습니다.
440
10% FBS, 100 U/ml 페니실린 및 100 mg/ml 스트렙토마이신을 포함합니다. 2일 후, 세포
찌꺼기 및 부착되지 않은 세포를 세척하여 제거하고 이후 매 2 또는 3일마다 배지를 교체하였
다. 순도는 현미경, 내인성 비타민 A 자가형광 및 데스민에 대한 단클론 항체를 사용한 면역세
포화학 검사(1:25, Dako)로 평가했습니다. 세포 생존력은 트리판 블루 배제에 의해 검사되었
습니다. 세포 순도와 생존율 모두 95%를 초과했습니다. 분리 후 10일 동안 배양된 세포를 활
성화된 HS 세포로 간주하였다33. 이전에 설명한 방법에 따라 쥐 피부 섬유아세포를 얻었다.
콜라겐 생산의 정량화. 래트 pHS 세포 또는 NRK 세포를 10% FBS를 포함하는 DMEM에서
웰당 1×105의 밀도로 6‑웰 조직 배양 플레이트에 플레이팅하였다 . 24시간 배양(0일) 후,
NRK 세포를 Lipotrust를 사용하여 50nM의 siRNA로 형질감염시키고, 래트 pHS 세포를
VA‑lip‑siRNAgp46(50nM의 siRNA) 또는 VA‑lip‑siRNArandom(50nM의 siRNA)으로
처리하였다. . 1일째에 세포를 세척하고 웰에 침착된 콜라겐을 이전에 설명한 바와 같이 Sirius
red 염료(Biocolor)로 염색했습니다. 결합되지 않은 염료를 세척하여 제거하고 결합된 복합체
를 0.5% 수산화나트륨에 용해시켰다. 콜라겐은 540nm에서 분광광도법으로 정량화되었고
결과는 처리되지 않은 대조군의 백분율로 표시되었습니다.
VA‑lip‑siRNAgp46‑FAM의 FACS 분석. 쥐 pHS 세포 또는 1차 피부 105 세포)를 다양한 농
siRNAgp46‑ 도의 RBP(0.07–1.4 mg/ml, 105 세포 SCIPAC)의 존재 하에 VA‑lip‑
FAM(50 nM의 섬유아세포(1 siRNA))로 처리 하고 차단 분석을 위해, VA lip‑siRNAgp46을
전에 1마리를 마우스 항‑RBP 항체(10 mg/ml, BD Pharmingen) 또는 음성 첨가하기
대조군 마우스 IgG1(10 mg/ml, Dako)로 30분 동안 처리하였다. ‑FAM.LI90 세포를 10%
FBS 존재 하에서 VA‑lip‑siRNAgp46‑FAM으로 처리하고 30분 동안 배양했습니다. 벡튼 디
킨슨).
VA‑lip‑siRNAgp46‑FAM의 세포내 분포 분석. 쥐 pHS 세포 104개 세포/챔버. 1VA‑lip‑
는 lip‑siRNAgp46‑FAM을 Lab‑Tek 챔버 커버 유리에 플레이팅 siRNAgp46‑FAM 또
하거나 최종 siRNA 농도 50nM로 세포에 첨가했습니다. 세포를 10% FBS가 포함된 DMEM
에서 30분 동안 배양한 후 배지를 새로운 배지로 교체하였다. 처리 30분 및 2시간 후, 세포를
PBS로 3회 세척하고 25℃에서 15분 동안 4% 파라포름알데히드로 고정시켰다. 고정 후 세포
를 PBS로 3회 세척하고 Prolong Gold Antifade Reagent with DAPI(Molecular
Probes)에 1분 동안 노출시켜 핵을 염색하였다. FAM‑표지된 siRNAgp46의 세포하 국소화
를 형광 현미경(Keyence, BZ‑8000)을 사용하여 평가하였다.
동물 치료. 4 내지 5주령의 수컷 Sprague‑Dawley 쥐(Charles River)를 사용하였다. 모든
동물 절차는 삿포로 의과 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았습니다. 쥐를 펜토
바르비탈 나트륨(체중 40mg/kg, 복강내)으로 마취하고 하대정맥을 통해 방혈했습니다.
DMN 간경변의 유도. 쥐에게 식염수에 용해된 1% DMN(체중 1ml/kg)을 주당 3일 연속으로
24일째까지 복강 내 투여하여 간경변증을 유도했으며, 일부 실험에서는 간경변증을 유지하기
위해 3주 더 투여했습니다38(보충 그림 4) . .
쥐 간 및 기타 기관에서 VA‑lip‑siRNAgp46‑FAM의 생체 내 국소화.
DMN 처리된 간경변 래트(24일)에 1 ml/g 체중의 VA‑lip‑siRNAgp46‑FAM 또는 lip‑
siRNAgp46‑FAM을 정맥 주사하였다. 주사는 격일로 3회 제공된 0.75 mg/kg siRNA의 일
일 용량으로 상압 하에 투여되었다. 마지막 주사 후 24시간에 식염수 관류로 쥐를 죽이고 간
및 기타 장기(폐, 비장 및 망막)를 적출했습니다. 조직 표본을 즉시 OCT 배지에 포매하고 극저
온 절편화했습니다. 절편을 슬라이드에 장착하고, PBS로 세척한 4% 파라포름알데히드에 고
정하고, PBS 중 0.2% Triton X‑100으로 투과시키고, PBS 중 1% BSA로 차단했습니다.
면역형광 연구를 위해 슬라이드에 장착된 간 절편을 단클론 항‑α‑SMA‑CY3 결합 항체
(1:400, Sigma)로 처리했습니다. 다른 조직 절편은 항‑CD68 항체(1:100,
26권 4호 2008년 4월 자연 생명공학
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DAKO) Alexa Fluor 568 마우스 IgG1 라벨링 키트(Molecular Probes)로 25°C에서 2시
간 동안 미리 라벨링했습니다. 모든 슬라이드를 PBS로 세척하고 DAPI가 포함된 Prolong
Gold Antifade Reagent에 1분 동안 노출시켜 핵을 염색했습니다.
Zeiss Axioskop 2 형광 현미경(Carl Zeiss MicroImaging)이 장착된 Radiance 2100
Rainbow(Bio‑Rad)를 사용하여 공초점 레이저 스캐닝 현미경으로 조직의 다색 형광 염색을
분석했습니다. 간 섹션의 형광 신호를 비디오 디지털화하고 임계값 설정(Photoshop 4.0;
Adobe)으로 총 염색 영역을 자동으로 설명하는 소프트웨어 프로그램으로 분석했습니다. 그런
다음 이 영역을 NIH Image 1.62 소프트웨어로 정량화하고 각 섹션에서 병합된 노란색 영역
과 전체 a‑SMA 염색 영역의 비율로부터 변환 효율을 계산했습니다. 영역은 각 간에서 표본당
10개의 무작위로 선택된 고배율 필드(630)에서 평가되었습니다.
간에서 다양한 세포 유형으로 VA‑lip‑siRNAgp46‑Cy5 전달. DMN 처리된 간경변 쥐(24일)
에 VA‑lip siRNAgp46‑Cy5 또는 lip‑siRNAgp46‑Cy5를 정맥 주사했습니다. 주사는 0.75
mg/kg siRNA의 1일 용량으로 1 ml/g 체중의 부피로 상압 하에 격일로 3회 투여하였다. 마
지막 주입 24시간 후, HS 세포, Kupffer 세포 및 쥐 간의 간세포가 풍부한 분획을 pronase‑
collagenase 방법으로 얻었고 항‑α‑ SMA FITC(Sigma), 항‑쥐 CD168‑FITC( Serotec)
및 항‑쥐 알부민‑FITC(Cedarlane Laboratories) 각각. 세포내 알부민과 α‑SMA를 검출하
기 위해 세포를 Perm Buffer I(BD Biosciences)로 전처리했습니다. 그런 다음 세포를 유동
세포 계측법으로 분석했습니다.
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방사성 표지된 VA‑lip siRNAgp46의 조직 분포 및 약동학. 방사성 표지된 VA‑lip‑
siRNAgp46 은 siRNAgp46을 운반하는 VA‑커플링된 리포좀의 제조를 위해 전술한 바와 같
이 리포좀에 [3H]레티놀([11,12‑3H (N)]: 44.4Ci/mmol, Perkin Elmer) 을 혼입하여 제조
하였다 . [3H]VA‑lip‑siRNAgp46(200mCi)을 DMN 처리된 간경변 쥐(24일) 또는 정상 쥐에
서 정상 압력 하에 꼬리 정맥을 통해 투여하고 혈액을 꼬리 정맥 닉을 통해 24시간 동안 수집했
습니다. 24시간 후, 쥐를 마취 상태에서 죽이고, 조직을 채취하고, 50mg 샘플을 유리 신틸레이
션 바이알에 옮기고 Solvable(Perkin Elmer)로 가용화했습니다. 가용화된 조직은 Hionic‑
Fluor(Perkin Elmer)로 액체 섬광 계수를 통해 방사능에 대해 분석되었습니다.
정량적 RT‑PCR. 제조업체의 프로토콜에 따라 RNeasy 미니 키트(Qiagen)를 사용하여 총
RNA를 분리했습니다. 총 RNA(1mg)는 cDNA 사이클 키트(Invitrogen)를 사용하여 총 부
피 20ml의 역전사에 사용되었습니다. 프로브와 혼합된 모든 TaqMan 프라이머는 Applied
Biosystems에서 구입했습니다. 실험을 위한 프라이머는 다음과 같다: gp46 포워드 5¢‑
TTTAAGCCGCACTGGGATGAGAAGT‑3¢, 리버스 5¢‑TGGGGACACCT TAGCATC‑3¢;
프로콜라겐, 유형 I, 알파 1(COL1A1), 포워드 5¢‑TAAGGGT GACAGAGGTGATGCTGGT‑3¢, CCl4 처리 76일째에 모든 쥐를 죽이고 간 및 혈청 샘플을 준비했습니다. 면역조직화학 평가,
리버스 5¢‑TGGGGACACCTTAGCATC‑3¢; 메탈로프로테이나제 1 포워드 5¢‑
ACTCGGACCTGGTTA TAAGGGCTAA‑3¢, 리버스 5¢‑TGGGGACACCTTAGCATC‑3¢
의 tis sue 억제제; IFN‑a 순방향 5¢‑AGAGCAGAAGTGTGGAGAGCCCTGT‑3¢, 역방향
5¢‑ACAGGGTCTCTC CACACTTCTGCTCT‑3¢; GAPDH, 정방향 5¢‑
AACCCATCACCATCTTCCAG GAGCG‑3¢, 역방향 5¢‑CATCGAAGGTGGAAGAGTGG‑3¢.
GAPDH는 RNA 무결성에 대한 대조군으로 사용되었습니다. TaqMan 반응은 ABI Prism
7700 서열 검출 시스템(Applied Biosystems)을 사용하여 수행되었습니다. 결과는 동일한
RNA(각각의 cDNA) 샘플 및 PCR 실행으로부터의 하우스키핑 유전자(GAPDH)의 카피 수에
대한 생성물 유전자의 카피 수의 비율로 표현되었습니다.
생체 내 siRNAgp46 처리. 간경변증에 대한 siRNAgp46 처리의 효과를 평가하기 위해 두 세
트의 실험을 수행했습니다. 첫 번째 실험 세트에서는 24개 그룹의 쥐를 사용하여 생존에 대한
용량 및 기간 의존 효과를 결정했습니다. DMN 투여 24일째부터 심각한 간경변증이 확인되었
을 때(보충 그림 4), 쥐의 4개 치료 그룹에 VA‑lip‑siRNAgp46을 siRNA 용량 0.1, 0.5 또는
0.75 mg/kg으로 일주일에 두 번 정맥 주사했습니다. 각 그룹에 대해 n=6), 또는 0.75 mg/
kg을 주 3회(각 그룹에 대해 n=12).
20개의 대조군은 동일 용량을 사용하여 lip‑siRNAgp46, VA‑lip‑siRNA 랜덤, 비타민 A
결합 리포솜, 비타민 A 또는 PBS 주사를 받았습니다.
Nature BIOTECHNOLOGY 26권 4호 2008년 4월
조항
해당 4개의 치료 그룹으로 일정을 잡습니다. 또한, siRNAgp46(0.75 mg/kg 주 3회) 주사도
수행했습니다(n=12).
두 번째 실험 세트에서는 6개 그룹의 쥐(각 그룹당 n=12)를 조직학적 및 간 기능 평가에 사
용했습니다. 각 그룹은 일주일에 세 번 PBS, 비타민 A 단독, 비타민 A 결합 리포좀, lip
siRNAgp46, VA‑lip‑siRNArandom 또는 VA‑lip‑siRNAgp46(0.75 mg/kg siRNA)으
로 처리되었습니다. 모든 주사는 1 ml/g 체중의 부피로 정상 압력 하에서 꼬리 정맥을 통해 제
공되었습니다. 쥐의 간을 10% 파라포름알데히드로 고정하고, 파라핀 포매 절편을 Azan‑
Mallory 염색 또는 항콜라겐 I 항체(1:100, Abcam)로 EnVision 시스템(Dako)을 사용하
여 제조업체의 지침에 따라 염색했습니다. , DakoLiquid DAB(diaminobenzidine) 기판‑
Chromagen 시스템 키트가 이어집니다.
콜라겐 I‑양성 영역을 정확하게 정량화하기 위해 각 쥐의 간 섹션당 6개의 무작위로 선택된
저배율 필드(100)의 슬라이드를 현미경으로 관찰했습니다(Axioplan 2; Carl Zeiss, Inc.). 디
지털 사진은 디지털 TV 카메라 시스템(AxioCam High Resolution color, Carl Zeiss,
Inc.)을 사용하여 비디오 보관 시스템을 통해 캡처되었습니다. 자동화된 소프트웨어 분석 프로
그램(KS400, Carl Zeiss, Inc.)을 사용하여 디지털 현미경 사진에서 염색된 영역의 백분율을
결정했습니다.
면역형광 연구를 위해 슬라이드에 장착된 간 절편을 Alexa Fluor 568 마우스 IgG2b 라벨
링 키트(Molecular Probes)를 사용하여 사전 라벨링된 항‑gp46 항체(1:250, Stressgen)
로 처리했습니다. 쥐를 죽였을 때 혈액 샘플을 채취하여 표준 절차에 따라 혈청 빌리루빈, 히알
루로네이트, 알부민 및 ALT를 평가했습니다. 조직학적 병기 평가를 위해, 각 그룹의 12마리 랫
트로부터 간 준비물을 사용하여 맹검 방식으로 독립적인 간 전문의(일본 간학회의 간장 전문의)
가 이전에 설명한 대로48 반 정량적 점수(점수 0~6)를 수행했습니다 .
하이드록시프롤린 함량 분석. 하이드록시프롤린 함량은 이전에 보고된 바와 같이 Jamall 방
법에 의해 결정되었습니다49. 간략하게, 간 조직(300mg)을 6N HCl에서 균질화하고 110℃
에서 18시간 동안 가수분해하였다. 25 마이크로리터 분량을 60 °C에서 건조했습니다. 침전물
을 1.2 ml의 50% 이소프로판올에 용해시키고 아세테이트 시트레이트 완충액 pH 6.0에서
0.56% 클로라민 T 용액(Sigma) 200 ml와 함께 배양하였다. 25℃에서 10분 동안 인큐베이
션한 후, 1ml의 Ehrlich's 시약을 첨가하고 혼합물을 50℃에서 90분 동안 인큐베이션하였
다. 냉각 후 560 nm에서 흡광도를 측정하였다.
CCl4로 유발된 쥐 간 섬유증 의 VA‑lip‑siRNAgp46 치료 . 간경변증은 성인 수컷 Sprague‑
Dawley(200g) 쥐를 CCl4 ( 올리브 오일의 CCl4, 주 2회 복강내 주사로 체중 kg당 1:1(vol/
vol))로 8주간 처리하여 생성되었습니다4 . CCl4 처리 58일째에 랫트를 VA‑lip‑siRNAgp46,
VA‑lip‑siRNA 무작위(0.75 mg/kg siRNA, 주 2회) 또는 PBS 단독 주 2회 처리하였다.
간 기능 평가 및 히드록시프롤린 함량 분석은 기본적으로 이전 섹션에서 설명한 대로 수행되었
습니다.
BDL 유발 쥐 간 섬유증의 VA‑lip‑siRNAgp46 치료. 담즙성 간 섬유증은 이전에 설명한 바와
같이 수컷 Sprague‑Dawley(200g) 쥐의 총담관 결찰에 의해 유발되었습니다. 간단히 말해
서, 총담관을 확인하고 3‑0 실크 합자로 이중 결찰했습니다. BDL 투여 5주 후, 래트를 3개의
처리군 중 하나로 배정하였다: (i) VA‑lip‑siRNAgp46, (ii) VA‑lip‑siRNArandom 또는 (iii)
PBS 단독. 주사는 0.75 mg/kg siRNA의 1일 용량으로 1 ml/g 체중의 부피로 상압 하에 격
일로 5회, 이어서 1주에 2회 6회 투여하였다. BDL 45일과 67일에 쥐(그룹당 n=10)를 죽이고
간 및 혈청 샘플을 이전 섹션에서 설명한 대로 면역조직화학적 평가, 간 기능 평가 및 히드록시프
롤린 함량 분석을 위해 준비했습니다.
통계. 결과는 각 샘플에 대한 평균(± sd)으로 표시됩니다. 대조군과 다른 집단 간의 다중 비교
는 Dunnnet's test로 수행하였다. Kaplan‑Meier 방법에 따라 생존 곡선을 구성하고
Breslow‑Gehan‑Wilcoxon 분석으로 테스트했습니다.
441
Machine Translated by Google
조항

참고: 추가 정보는 Nature Biotechnology 웹사이트에서 확인할 수 있습니다. 22. Bartlett, DW & Davis, ME 살아있는 세포 및 살아있는 동물 생물 발광 영상에서 siRNA 매개 유전자 침묵의 동역
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었습니다.
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저자 기여 YS, K. Murase 및 JK는 25. Song, E. et al. Fas를 표적으로 하는 RNA 간섭은 전격성 간염으로부터 마우스를 보호합니다.
연구를 설계하고 실험을 수행하고 논문을 작성했습니다. MK, TS, YK, RT, KT, K. Miyanishi, Nat. 중간 9, 347–351(2003).
TM 및 TT가 실험을 수행하였다. YN은 연구를 설계하고 논문을 작성했으며 전체 프로젝트를 26. 꽃, DR 수퍼패밀리 너머: 리포칼린 수용체. 바이오킴. Biophys. Acta 1482, 327–336(2000).

감독했습니다. 모든 저자는 결과에 대해 논의하고 원고에 대해 논평했습니다.

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