등록특허 10-0344572

(19) 대한민국특허청(KR)
(12) 등록특허공보(B1)
7
(51) 。Int. Cl. (45) 공고일자 2002년08월19일
C12N 15/29 (11) 등록번호 10-0344572
(24) 등록일자 2002년07월05일

(21) 출원번호 10-2000-0010241 (65) 공개번호 특2001-0085138

(22) 출원일자 2000년02월29일 (43) 공개일자 2001년09월07일

(73) 특허권자 대한민국

(72) 발명자 박수철

경기도수원시팔달구매탄동한국아파트101동301호
정미정
경기도수원시권선구금곡동강남아파트107동606호
변명옥
서울특별시서초구서초4동삼풍아파트2동306호
류진창
경기도수원시권선구구운동강남아파트3동608호

(74) 대리인 최종락

전영일

심사관 : 최규환

(54) 식물의 고온 저항성 유전자 및 그의 염기 서열

요약

본 발명은 환경 피해 방지에 이용될 수 있는 새로운 고온 저항성 유전자 및 그 염기 서열에 관한 것으로서, 상세하게는

온도 상승시 생물체 내에서 생성되는 열 충격 단백질 (heat shock protein, HSP)과 관련된 hsp 104 유전자 및 그의
염기 서열 그리고 열 충격 단백질 HSP 104 단백질 및 그의 아미노산 서열로 구성되며, 상기 고온 저항성 유전자는 담
자균으로부터 분리되고 온도 변화에 민감하게 발현이 조절되므로 작물 재배시 가장 중요한 환경 스트레스 중 하나인 고
온 피해를 막을 수 있는 고온 저항성 형질전환 식물체의 개발 등에 유용하게 사용될 수 있다.

대표도
도1

명세서

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도면의 간단한 설명

도 1 은 여름 느타리 버섯 (Pleurotus sajor-caju)에서 분리한 고온 저항성 유전자 hsp 104 의 염기 서열 및 이로부

터 유추한 열 충격 단백질 HSP 104 의 아미노산 서열을 나타낸 것이고,

도 2 는 여름 느타리 버섯 균사에 다양한 조건을 처리하고 이를 배양함으로써 고온 저항성 유전자 hsp 104 의 발현 (
mRNA)이 조절되는 양상을 RT-PCR 서던 블럿으로 나타낸 것이다.

Con : 25℃ 에서 4시간 처리한 경우;

Salt : 25℃ 에서 2 M 염화나트륨을 처리한 경우;

Cold : 4℃ 에서 4시간 처리한 경우;

Heat : 40℃ 에서 4시간 처리한 경우;

Dry : 25℃ 에서 진공 상태로 4시간 처리한 경우;

발명의 상세한 설명

발명의 목적

발명이 속하는 기술 및 그 분야의 종래기술

본 발명은 환경 피해 방지에 이용될 수 있는 새로운 고온 저항성 유전자 및 그 염기 서열에 관한 것으로서, 상세하게는

담자균에서 분리한 열 충격 단백질 (heat shock protein, HSP)과 관련된 고온 저항성 유전자 hsp 104 및 그의 염기
서열 그리고 열 충격 단백질 HSP 104 및 그의 아미노산 서열에 관한 것으로서, 상기 고온 저항성 유전자는 고온 피해
에 저항성이 있는 형질전환 식물체의 개발에 유용하게 사용될 수 있다.

생물체는 외부 환경 스트레스 (염도, 온도, 습도 등)에 대응하는 세포 내 적응 기작을 가지고 있다. 특히 생물체의 생육
시 정상 이상의 고온 상태로 환경이 변화하는 경우 생체 내 단백질의 변형이 유발되어 다양한 형태의 고온 피해를 입게
되므로, 모든 생물체는 고온 피해를 자체적으로 방어하기 위하여 열 충격 단백질 (heat shock protein, HSP)이라는
일련의 고온 저항성 단백질을 생성한다.

이러한 열 충격 단백질 (HSP)은 생물체의 외부 온도가 올라가면 자동적으로 생성되고 고온으로 인하여 변형된 주요
단백질을 둘러싸서 단백질의 형태를 보존시키는 작용을 하며, 온도가 다시 정상 상태가 되면 열 충격 단백질이 떨어져
나와 보존되어 있던 변형 단백질이 원래의 형태로 복귀된다. 이러한 과정을 통하여 열 충격 단백질이 생물체가 고온에
서 생존할 수 있도록 그 역할을 수행한다.

생물체는 열 충격 단백질을 생성하는 일련의 고온 저항성 유전자 hsp 를 여러 종류 보유하고 있는데, 이들 유전자 중에
서 hsp 104 유전자는 고온 피해의 방지에 가장 중요한 것으로 보고되어 있다 (Ref. 1. Proc Natl Acad Sci USA '96
May 28;93(11):5301-6, 2. Plant Cell '94 Dec;6(12):1899-909, 3. Plant cell '94 Dec;6(12):1889-97).

다양한 환경 스트레스 중에서 고온 피해는 작물의 생육에 있어 가장 중요한 피해 중 하나이므로 고온 저항성 유전자를
확보하여 이를 고온 저항성 형질전환 식물체의 개발에 이용하는 것은 매우 중요하다.

이에 본 발명자들은 환경 피해 방지에 이용될 수 있는 고온 저항성 유전자를 얻기 위하여, 고온에서 재배되는 유일한 식

용 버섯인 여름 느타리 버섯의 균사로부터 열 충격 단백질 관련 hsp 유전자를 분리하고 그 염기 서열을 결정하여 이 유
전자가 담자균에서 처음 발견된 hsp 104 유전자이고 고온 처리시 유전자 발현이 현저하게 증가되는 것을 확인함으로
써 본 발명을 완성하였다.

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발명이 이루고자 하는 기술적 과제

본 발명은 새로운 환경 스트레스 관련 유전자 및 그의 염기 서열 그리고 이를 환경 저항성 식물체의 형질전환에 사용하

는 용도를 제공함에 그 목적이 있다.

발명의 구성 및 작용

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 열 충격 단백질 (heat shock protein)과 관련된 고온 저항성 유전자를 제공
한다.

구체적으로, 본 발명은 열 충격 단백질 HSP 104 와 관련된 고온 저항성 hsp 104 유전자를 담자균으로부터 분리한다.
담자균으로는 여름 느타리 버섯 (Pleurotus sajor-caju) 등을 사용한다.

본 발명의 고온 저항성 유전자 hsp 104 는 서열번호 1의 염기 서열을 포함한다.

또한, 본 발명은 상기 hsp 104 유전자를 포함하는 플라스미드 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 플라스미드 벡터를 대장균에 형질전화시켜 얻은 형질전환체를 제공한다.

또한, 본 발명은 담자균의 열 충격 단백질 HSP 104의 아미노산 서열을 제공한다. 본 발명의 열 충격 단백질 HSP 104
는 서열번호 2 의 아미노산 서열을 포함한다.

또한, 본 발명은 상기 유전자를 환경 피해를 막을 수 있는 고온 저항성 식물체의 형질전환에 사용하는 용도를 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 환경 피해의 방지에 이용될 수 있는 환경 스트레스 관련 유전자 중에서 생물체가 고온에서 생존하는데 필수
적인 열 충격 단백질 (heat shock protein, HSP)과 관련된 고온 저항성 유전자를 제공한다.

특히 본 발명은 상기 열 충격 단백질을 생성하는 고온 저항성 유전자 hsp 중에서 고온 피해를 방지하는데 중요한 것으
로 보고되어 있는 hsp 104 유전자를 분리한다.

본 발명은 고온 저항성 형질전환 식물체의 개발에 유용한 유전자를 얻기 위하여, 담자균으로부터 상기 고온 저항성 유
전자를 분리한다. 담자균으로는 여름에 재배되는 유일한 식용 버섯인 여름 느타리 버섯 (Pleurotus sajor-caju) 등을
사용한다.

구체적으로, 여름 느타리 버섯 균주로는 ASI 2070 균주 등을 사용하고 이로부터 통상의 과정으로 유전자를 분리하여
느타리 버섯의 cDNA 유전자 은행을 제작한 다음 중합효소 연쇄반응 (PCR)을 수행하여 상기 hsp 104 유전자를 분리
한다. 이 때 프라이머로는 이미 보고된 열 충격 단백질의 hsp 104 유전자 (효모, 콩, 옥수수 등)의 염기 서열을 참고하
여 합성된 것을 사용한다. 상기 과정으로 얻은 PCR 산물인 hsp 104 유전자는 플라스미드 벡터에 클로닝하여 염기서열
을 확인하였다.

본 발명은 통상의 과정으로 상기 고온 저항성 유전자 hsp 104 의 염기 서열 및 열 충격 단백질 HSP 104 의 아미노산
서열을 확인하여 기존에 보고된 서열과 비교한다.

본 발명의 고온 저항성 유전자 hsp 104 는 서열번호 1의 염기 서열을 포함하고, 열 충격 단백질 HSP 104 는 서열번호
2 의 아미노산 서열을 포함한다. 이 서열들은 유전자 은행(GenBank)에 1999년 10월 7일에 기탁하였다(ACCESSIO
N NO. AF188207).

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실제로 상기 고온 저항성 유전자는 하나의 오픈 리딩 프레임 (open reading frame)을 포함하는 완전한 유전자 (com
plete cDNA)이며 전체 2892 bp 로 구성되어 있고 870개의 아미노산 (amino acids)을 코드 (coding)할 수 있다 (도
1 참조). 또한, 상기 hsp 104 유전자는 효모에서 분리된 hsp 104 유전자와는 각각 49.1%(nucleotide)와 45.7%(am
ino acid), 옥수수의 동종 유전자와는 각각 53.4%(nucleotide)와 43.5%(amino acid), 콩의 동종 유전자와는 각각
53.2%(nucleotide)와 38.2%(amino acid)의 상동성을 나타낸다.

상기 hsp 104 유전자는 담자균류에서는 처음으로 분리된 것으로 그 염기 서열의 특이 부위를 가지는 담자균으로부터
분리된 모든 고온 저항성 유전자 hsp 104 는 본 발명의 범주에 포함될 수 있다.

또한, 상기 hsp 104 유전자의 기능을 확인하기 위하여 고온에서 그 발현되는 양상을 RT-PCR 서던 블럿으로 조사한
결과, 고온의 스트레스 상태에서 hsp 104 유전자 발현이 현저히 증가됨을 확인하였다 (도 2 참조).

본 발명의 hsp 104 유전자는 식물체 유래의 고온 저항성 유전자로서 온도 변화에 민감하게 발현이 조절되므로 환경 피
해를 방지할 수 있는 형질전환 식물체의 개발에 유용하게 이용될 수 있다.

이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다.

단 하기의 실시예는 본 발명의 예시일 뿐이며, 실시예에 의하여 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1 여름 느타리 버섯 균주의 배양 및 유전자 (DNA 및 RNA) 분리

여름 느타리 버섯으로 Pleurotus sajor-caju ASI 2070 균주를 선별하고 MCM 배지 (dextrose, 20g; peptone, 2g
; yeast extract, 2g; K 2 HPO4 , 1.0g; KH 2 PO4 , 0.46g; MgSO 4 7H2 O, 0.5g; DW 1L)를 사용하여 상기 균주를 15일
간 25℃에서 액체 배양하였다. 이로부터 얻은 균사체를 미라 천 (mira cloth)에 거르고 3회 수세하여 -70℃에 보관하
고 하기 유전자 (RNA 및 DNA)의 분리에 사용하였다.

(1) DNA 분리

여름 느타리 버섯의 균사는 액체 질소를 이용하여 마쇄한 다음 이에 추출 완충용액 (extraction buffer; 1 ml/100 m
g)을 첨가하여 60℃에서 40분간 처리하였다. 40분이 경과한 후 12,000 rpm 으로 20분간 원심 분리하여 상등액을 얻
고 동량의 페놀 (phenol)을 첨가하여 다시 원심 분리하였다. 다시 상등액을 취하여 RNase (50 mg/ml)를 첨가하고,
37℃에서 40분간 처리한 다음 동량의 페놀-아이소아밀 알코올 (phenol-isoamyl alcohol; 24 : 1)을 첨가하여 원심
분리하였다. 다시 상등액을 취하여 1/10 양의 소듐 아세테이트 (sodium acetate)와 2배의 100% 에탄올을 첨가하여
-70℃에 1시간 침전시킨 후 원심 분리하여 침전물을 70% 에탄올로 세척하고 멸균 증류수에 녹여 사용하였다.

(2) RNA 분리

여름 느타리 버섯의 상기 마쇄된 균사에 마쇄 완충용액 (grinding buffer; 1 ml/100 mg)과 동량의 페놀을 첨가하고
잘 섞은 다음 12,000 rpm 으로 10분간 원심분리하였다. 이로부터 상등액을 얻어 다시 동량의 페놀을 첨가하여 섞고
원심 분리 하여 상등액을 취한 다음 동량의 페놀-아이소아밀 알코올 (phenol-isoamyl alcohol; 24 : 1)을 첨가하여
섞고 다시 원심 분리하였다. 상등액에 1/3 양의 8 M 리튬 크로라이드 (LiCl)를 첨가하여 4℃에서 12시간 침전시키고
12,000 rpm 으로 30분간 원심 분리하여 상등액은 버리고, 침전물은 100 mM 트리스 / 10 mM EDTA 에 녹여 다시
1/3 량의 8 M 리튬 크로라이드를 첨가하고 4℃에서 12시간 침전시킨 다음 원심 분리하였다. 이로부터 얻은 침전물은
100 mM 트리스 / 10 mM EDTA 에 녹이고, 여기에 1/10 양의 3 M 소듐 아세테이트 (NaOAC)와 2.5배의 에탄올을
첨가하여 -20℃에 1시간 침전시킨 후 원심 분리하였다. 침전물은 70% 에탄올로 세척하고 DEPC 가 처리된 멸균 증류

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수에 녹여 사용하였다.

< 실시예 2 느타리 버섯의 cDNA 유전자 은행의 제작 및 파아지 DNA 분리

본 발명은 느타리버섯의 cDNA 유전자 은행을 제작하기 위하여, 람다 ZAP Ⅱ cDNA 합성 키트 (Lambda ZAP Ⅱ cD
NA synthesis kit)와 기가팩 Ⅱ 골드 패키징 추출물 (Gigapack Ⅱ gold packaging extract; Stratagene사)을 제조
회사가 제시한 방법에 따라 사용하였다.

먼저, 균사를 고온에 처리하고 전체 RNA 를 분리한 다음 폴리 A 퀵 컬럼 (poly A quick column; Stratagene사)을
통과시켜 poly A + RNA 를 분리하고, poly A + RNA 를 주형 (template)로 하여 RNase H 역전사효소 (reverse tra
nscriptase)를 사용하므로 첫번째 가닥 (first strand) cDNA 를 합성하였다. 다음 RNase H 를 사용하여 RNA 를 제
거하고 DNA 중합효소 Ⅰ (DNA polymerase I)을 사용하여 두 번째 가닥 (second strand) cDNA 를 합성하였다. 이
합성된 cDNA 에 다시 Eco RI 어댑터 (adaptor)를 라이게이션 (ligation)시키고 제한효소 Xho I 을 처리하여 제한효
소 Eco RI 및 Xho I 부위 (site)를 만들고, 제한효소 Eco RI 및 Xho I이 처리된 Uni-zap XR 벡터에 라이게이션시켰
다. 다음 라이게이션한 용액을 생체외 패키징 키트 (in vitro packaging kit; Stratagene사)를 사용하여 패키징한 후
대장균에 감염시켜 파아지 타이터 (Phage titer)를 측정하였다. 이는 다시 증폭 (amplify)시켜 보존 스톡 (stock)으
로 만든 다음 사용하였는데, 이 때 플라크(plaque)의 수는 약 15만개로 측정되었다.

< 실시예 3 고온 저항성hsp104유전자의 분리

본 발명은 고온 저항성 hsp 104 유전자를 분리하기 위하여, 상기에서 제작된 cDNA 유전자 은행을 사용하여 중합효소
연쇄반응 (PCR)을 수행하였다. 구체적으로, 효모, 콩, 옥수수 등에서 이미 보고된 열 충격 단백질의 hsp 104 유전자
염기 서열을 참고로 하여 hsp 104 유전자에 특이한 센스 프라이머 (sense primer)를 합성하고, 이 합성된 프라이머와
상기 실시예에서 제작된 여름 느타리 버섯 cDNA 유전자 은행으로부터 분리된 DNA 를 주형으로 하여 PCR 을 실시하
였다.

이 때 3' 방향은 cDNA 유전자 은행이 갖고 있는 T7 프라이머 부위 (primer site)를 사용하였는데, 합성된 hsp 104
유전자 특이 센스 프라이머를 센스로 하고, T7 프라이머를 안티센스 프라이머 (antisense primer)로 사용하여 증폭시
켰다. 또한, 5' 방향은 상기 과정으로 분리한 hsp 104 유전자의 3' 방향 단편의 염기 서열을 해독하여 얻은 동 염기 서
열의 일부로 만들어진 hsp 104 특이 안티센스 프라이머와 cDNA 유전자 은행이 갖고 있는 T3 프라이머 부위를 이용한
T3 프라이머를 각각 센스와 안티센스 프라이머로 사용하여 증폭시켰다.

상기 PCR 과정을 수행하여 얻은 산물을 pBluescript SK + (Ⅱ) 벡터에 클로닝하고 그 염기 서열을 분석한 결과, 2개의
PCR 산물이 제한효소 Xba I 부위를 공통으로 갖고 있으면서 이를 중심으로 겹치게 증폭되어 있었으므로 이 Xba I 부
위를 이용하여 2개의 단편을 연결시켜 pYES2 벡터에 클로닝하였다.

이와 같이 클로닝된 인서트 DNA 의 염기 서열과 아미노산 서열을 분석한 결과, 이 DNA 는 870개의 아미노산 (amin
o acids)을 코드 (coding)할 수 있는 오픈 리딩 프레임 (open reading frame)이 포함된 완전한 유전자 (complete
cDNA)인 것으로 확인되었다 (도 1 참조). 구체적으로, 상기 hsp 104 유전자는 효모에서 분리된 hsp 104 유전자와는
각각 49.1%(nucleotide) 와 45.7%(amino acid), 옥수수의 동종 유전자와는 각각 53.4%(nucleotide) 와 43.5%(
amino acid), 콩의 동종 유전자와는 각각 53.2%(nucleotide) 와 38.2%(amino acid)의 상동성을 나타내었다.

< 실시예 4 고온 저항성 유전자hsp104 의 발현 검정

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본 발명은 상기 hsp 104 유전자가 고온에서 발현되는 양상을 관찰하기 위하여, MCM 배지에서 배양된 느타리 버섯 균
사를 살균된 증류수로 3회 세척하여 필터 (filter)에 거른 다음 25℃에서 2 M 염화나트륨 용액에 담가두었다가 수거
(염 처리)하고, 다시 4℃ 에서 두었다가 수거 (저온 처리)하여 40℃의 항온기에 두었다가 수거 (고온 처리)하고, 25℃
에서 10분간 진공 건조하여 무균 상자에 두었다가 수거(건조 처리)하였다. 이 때 처리 시간은 4시간으로 하고, 처리된
균사로부터 각각 RNA 를 분리하여 이들 RNA 로부터 cDNA 를 합성한 다음 이 cDNA 를 주형 (template)으로 하여
hsp 104 특이 프라이머를 센스 그리고 올리고 dT 프라이머 (oligo dT primer)를 안티센스 프라이머로 하여 PCR 을
수행하였다.

PCR 조건은 95℃에서 5분간 1회 반응, 95℃에서 1분, 55℃에서 1분, 72℃에서 2분으로 총 35회 (cycle) 반복 실시
하였다. 증폭된 PCR 산물은 아가로스 젤 (agarose gel)에 전기영동하여 서던 블럿 (Southern blot)을 실시하였는데,
이 때 프로브 (probe)로는 상기 실시예에서 분리한 hsp 104 유전자 단편을 사용하였다. RT-PCR 서던 블럿으로 분석
한 결과, 상기 hsp 104 유전자는 고온의 스트레스 상태에서 mRNA 발현량이 아무 것도 처리하지 않은 균사에 비해 현
저히 증가되었음을 확인할수 있었다 (도 2 참조).

발명의 효과

상기에서 살펴 본 바와 같이, 본 발명의 고온 저항성 유전자는 담자균인 여름 느타리 버섯 (Pleurotus sajor-caju)으

로부터 분리된 것으로 온도 변화에 민감하게 발현이 조절되므로 작물 재배시 가장 중요한 환경 스트레스 중 하나인 고
온 피해를 막을 수 있는 고온 저항성 형질전환 식물체의 개발 등에 유용하게 사용될 수 있다.

(57) 청구의 범위

청구항 1.

여름 느타리 버섯(Pleurotus sajor-caju)로부터 분리하고 고온 저항성을 나타내는 서열번호 1의 염기서열을 갖는 유

전자.

청구항 2.

삭제

청구항 3.

삭제

청구항 4.

삭제

청구항 5.

상기 제1항의 유전자에 의해 암호화 되는 서열번호2의 아미노산서열을 갖는 단백질.

청구항 6.

삭제

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청구항 7.

삭제

청구항 8.

상기 제1항의 유전자를 포함하여 고온 저항성을 부여하는 형질전환용 발현벡터.

도면
도면 1

도면 2

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<110> The commissioner of rural development administration;ROK(rural development

administrat
ion) <120> High temperature resistant gene and its nucleotide sequence <130>
p2000-2
5 <160> 2 <170> KOPATIN 1.5 <210> 1 <211> 2892 <212> DNA
<213> Pleurotus sajor-caju <400> 1 gaattcggca cgagccccat catgtctgtt gataatttcg
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actcgagcg tcttgctgaa cgaaagatta caatcgacat cgacgacgtg 2520 gcgaagagct acctcagctc
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gt acggcgcccg tccactgaat 2580 cgggccattc aaagcgaact cttgaacccc ttgtcgatca tgatcttgtc
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40 cgcttcgacg gacctcataa tcgtctgaat atcatcccga atcacgaagc caccgaaacg 2700 caagggatgg
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ly Leu Gly Asp 1 5 10 15 Ala Ser
Ser Arg Ser Gln Ser Leu Phe H
is Ser Ala Ile Ser Lys Ala 20 25 30
Gly Gly Asp Pro Ala Val Va
l Lys Arg Gly Tyr Arg Arg Ala Val Val 35 40
45 Arg Leu Pro T
hr Gln Asp Pro Pro Pro Glu Glu Val Tyr Phe Ser Gly 50 55
60 P
ro Ala Leu Lys Val Leu Arg Glu Gly Gln Ser Leu Gln Lys Thr Met 65 70
75
80 His Asp Ser Tyr Ile Ala Gln Asp His Leu Leu Leu Ala Ala Leu Lys 85
90
95 Asp Ala Thr Ile Gln Ala Val Ile Lys Glu Ala Gly Leu Thr Glu Ala 100
105
110 Thr Leu Lys Thr Ala Ile Glu Gln Ala Arg Gly Asn Arg Arg Ile Glu 115
120
125 Ser Lys Thr Ala Glu Gln Gly Phe Asp Ala Leu Gln Lys Tyr Ala Val 130
135
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150
155 160 Arg Asp Asn Glu Ile Arg Pro Val Ile Arg Ile Leu Cys Arg Arg Thr
165

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170 175 Lys Asn Asn Pro Val Leu Ile Gly Glu Pro Gly Val Gly Lys Thr
Ser 180
185 190 Ile Ala Glu Gly Leu Ala Gln Arg Ile Val Lys Arg Asp Val
Pro Ala 195
200 205 Ser Leu Ile Ser Arg Leu Tyr Ser Leu Asp Met Gly Ala
Leu Met Ala 210
215 220 Gly Ala Lys Tyr Lys Gly Glu Tyr Glu Glu Arg Ile
Lys Ala Val Leu 225
230 235 240 Asn Glu Val Glu Lys Ala Ser Glu Asp Gly Gly
Pro Gly Val Ile Leu
245 250 255 Phe Val Asp Glu Leu His Leu Ile Met Ala
Gly Arg Gly Ala Glu Gl
y 260 265 270 Gly Gly Met Asp Ala
Ala Asn Leu Phe Lys Pro Leu
Leu Ala Arg Gly 275 280 285 Lys Leu
Arg Cys Ile Gly His Asp Le
u Arg Ile Ser Lys Tyr Ile Glu 290 295 300
Thr Asp Ala Ala Leu G
lu Arg Arg Phe Ala Gln Val Leu Val Asn Glu 305 310 315
320 Pro Se
r Val Leu Glu Thr Ile Ser Ile Leu Arg Gly Ile Arg Glu Lys 325
330 3
35 Tyr Glu Val His His Gly Val Arg Ile Leu Asp Gly Ala Leu Ile Gln 340
345
350 Ala Ala Thr Leu Ala His Arg Tyr Leu Thr Ser Arg Gly Leu Pro Asp 355
360
365 Ala Ala Ile Asp Leu Val Asp Glu Ala Cys Ala Ser Val Arg Val Asn 370
375
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390
395 400 Glu Leu Glu Ile Glu Ile His Ala Leu Glu Ala Pro Arg Ala Arg Glu
405
410 415 Gly Cys Cys Lys Arg Ser Val Ser Lys Leu Pro Lys Lys Ala Ile
Ser 420
425 430 Asp Val Asp Glu Glu Leu Gln Pro Arg Gln Ala Ala Phe Gln
Ala Glu 435
440 445 Lys Met Arg Gly Asp Glu Leu Asn Val Leu Arg Arg Lys
Met Asp Glu 45
0 455 460 Leu Lys Ala Lys Ile Glu Glu
Ala Glu Arg Arg Arg Thr Leu
Pro Pro 465 470 475 480 Ala Ser Asp Leu
Lys Phe Tyr Ala Val Pro G
lu Val Gln Ala Arg Ile 485 490 495
Glu Gln Leu Glu Ala Lys Lys A
la Ala Arg Ala Ser Thr Gly Ser Ala 500 505
510 Ala Asp Val Val
Thr Pro Glu Ala Ile Ala Asp Ile Val Gly Arg Trp 515 520
525 Thr
Asn Ile Pro Val Ser Arg Leu Met Ser Ser Glu Lys Glu Lys Leu 530 535
540

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Leu Arg Met Glu Arg Ile Leu Thr Glu Asn Val Val Gly Gln Pro Glu 545 550
555
560 Ala Val Lys Arg Val Ala Asn Pro Ile Arg Leu Ser Arg Ser Gly Pro 565
570
575 Ala Asn Ala Gln Arg Pro Ile Ala Ser Phe Leu Phe Ala Gly Pro Ser 580
585
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600
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615
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630
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645
650 655 Thr Glu Tyr Val Arg Arg Lys Pro Tyr Ser Ile Ile Leu Ile Asp
Glu 660
665 670 Ile Glu Lys Ala Cys Arg Glu Phe Val Thr Leu Phe Leu Gln
Val Leu 675
680 685 Asp Asp Gly Arg Leu Thr Asp Gly Gln Gly Arg Val Val
Asp Phe Arg 690
695 700 Asn Ser Val Ile Ile Met Thr Ser Asn Leu Gly Ala
Ala Tyr Leu Asn 705
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Arg Thr Leu Val Met
725 730 735 Gly Ala Ile Gln Gly His Phe Pro Pro Glu
Phe Val Asn Arg Ile Asp
740 745 750 Glu Ile Val Ile Phe Arg Ala Leu Ser
Gln Lys Asn Val Leu Lys
Ile 755 760 765 Val Asp Ile Arg Leu
Lys Glu Val Leu Glu Arg Leu
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Ile Asp Ile Asp Asp Val Ala
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yr Gly Ala Arg Pro Leu Asn Arg Ala Ile Gln 805 810
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Leu Leu Asn Pro Leu Ser Ile Met Ile Leu Ser Glu Gln Val 820
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