Exp.

6 Transient assay in plant tissue

< 실험 원리 >

Transient assay란, 많은 유전자를 짧은 시간 내에 연구하는 것을 가능하게 하는 효율적인 실헙 기

법들을 말한다. 식물의 경우, agrobacterium을 이용한 transient assay를 통해 식물에서 원하는 유
전자를 발현시켜 목표 단백질을 만들도록 할 수 있다. Agrobacterium은 그람음성균으로, 수평적
유전자 전달 방식으로 식물에서 종양 생성을 유도하는 근두암종병의 원인균이다. Agrobacterium
의 Ti (Tumor-inducing) plasmid 내부의 T (transfer)-DNA가 식물 내부로 주입되면, T-DNA는 식물의
염색체에 integration 되어 목표 단백질을 발현시킨다.

식물 면역은 두 층의 선천면역으로 이루어져 있다. 두번째 층의 선천면역, effector-triggered

immunity (ETI) 는 보다 강한 면역 반응을 일으키는데, 이는 결국 국부적으로 식물 세포가 사멸하
는 과민성 반응(Hypersensitive response)으로 이어진다.

본 실험에서는 식물의 두번째 선천면역 ETI를 유도하는 면역 수용체 단백질을 발현시키는

agrobacterium을 담배 식물에 주입하여 과민성 반응을 확인하는 실험을 진행할 것이다.

* 예비레포트에 들어가야 할 내용

1) Agroinfiltration 2) Acetosyringone의 역할 3) Hypersensitive response

< 재료 및 기구 >

 시약

 Infiltration buffer (10 mM MES, 10 mM MgCl2, 0.1 mM acetosyringone)

 식물: Nicotiana benthamiana

 기구

 Centrifuge, 1 mL syringe, spectrophotometer, shaker

< 실험 방법 >

Agro cell preparation

1. 실험 하루 전, 액체 배지에 적절한 항생제를 넣어 agrobacteria cell을 28 ℃에서 배양한

다. .

2. Tube에 overnight culture 한 배지를 담고 13,000 rpm으로 2분간 원심분리한다.

3. Cell pellet만 남기고 broth는 팁으로 완전히 제거한다.

4. Infiltration buffer를 넣어 상온에서 1-2시간 shaking 한다.

5. OD600 값을 측정하여 각각 sample에 적절한 농도를 infiltration buffer로 맞춰준다.

Agroinfiltration

1. 잎에 어떤 샘플을 infiltration할 지 정하고, 헷갈리지 않도록 네이밍한다.

2. 바늘로 주입할 부분에 살짝 상처를 낸다.

3. 1 mL 주사기로 농도를 맞춘 현탁액을 잎에 주입한다. (잎이 찢어지지 않도록 주의)

4. 정확히 주입한 부위를 네임펜으로 기록한다.

5. 물기를 휴지로 톡톡 닦아준다 (식물 잎에 상처나지 않게 주의).

6. 2-3일 후 실험 결과를 관찰한다.

< 실험 결과 >

1. OD600 값 계산 과정과 결과

2. HR이 관찰된 잎과 관찰되지 않은 잎을 적고, 왜 그러한 결과가 나왔는 지에 대한 고찰을

적으세요.