TECH NOTE 목차

SeouLin Bioscience

Sep. 2022
Ⅰ. Introduction
1. Life Science Workflow
2. Cell Culture 정의 및 목적

: 세포를 살아있는 조직에서 분리한 후 특정 환경조건 (pH, C.H.N.O.P. Nutrients, Trace

Metal Elements 등)에서 증식시키는 과정. Adherent 또는 Suspension Cell 형태로 성장
Gene Transfection

shRNA&siRNA
miRNA
Virus
Plasmid DNA

Cell Biology Genomics Proteomics

Sample preparation Sample Preparation Sample Preparation

Cell Culture&Maintenance Bacteria Cell Culture Cell Lysis
Cell Isolation Plasmid Purification Dialysis&Concentration
Cell Treatment Genomic DNA Purification Seperation
Differentiation Protein Assay

Characterization Characterization Characterization

Cell Culture&Maintenance Cloning ELISA
Cell Isolation RT-PCR&qPCR IP
Cell Treatment Northern Blot Western Blot
Differentiation Genotyping Mass
Transfection Micro Array ChIP

Tech Note - Cell Culture 2 Sep. 2022

 3. Cell의 종류 2) Suspension Cell
1) Primary Cell - 단일세포 또는 작은 응집체가 Media에서 부유하며 자라는 세포
- 인간이나 동물 조직에서 바로 분리해낸 세포 Ex) CHO Cell
- 계속 자라지 못하고 제한된 수의 분열을 한 후 성장 정지
- 세포가 일정부분 성장하면 Subculture를 통해 Cell이 성장할 수 있는 환경을 제공해
야함
- 조직의 거의 모든 특성을 유지하고 있음

2) Cell Strain
- Primary Cell을 특정한 조건으로 Positive Selection하여 얻은 특정 성질을 가진 세포
- Primary Cell 보다 오랜 기간 Subculture 가능

5. Cell의 형태
3) Cell line
- Cell을 tumorization / immortalization 시켜 지속적으로 culture 가능한 상태의 세포 1) Fibroblastic Cell

- Subculture를 통해 무한정 증식 가능 : 양극성 또는 다극성이며, 길쭉한 모양을 가지며 Substrate에 부착되어 성장

4. Cell의 유형

1) Adherent Cell
- 일반적인 동물세포의 유형으로, 바닥에 붙어서 자라는 세포
Ex) HeLa Cell

Tech Note - Cell Culture 3 Sep. 2022

 2) Epithelial-like Cell 1. Primary Cell Culture
: 더 규칙적인 다각형 모양이며 별개의 패치로 Substrate에 부착되어 성장
〮 정의

: 조직으로부터 단일 세포를 분리/배양하는 과정을 통칭

〮 특징

1) 배양 상태가 생체 내 환경과 유사한 생물학적 특징을 지님

2) Cell line과 다르게 체외 환경에 적응하는 노화과정을 거침
3) 지속적인 성장이 아닌 제한된 passage를 가짐

3) Lymphoblast-like Cell
: 구형을 띠는 세포로 일반적으로 표면에 부착되지 않고 Supernant에서 성장

출처: Molecular Virology of Human Pathogenic Viruses

Ⅱ. 실험방법 및 원리
(1) protocol

〮 Mouse Embryonic Fibroblasts (MEF) 분리 실험

① Media Warming
② 임신한 지 13~14일째 되는 Mice 준비
③ Embryo 적출 후 Cold PBS에 옮김

Tech Note - Cell Culture 4 Sep. 2022

 ④ 머리를 자르고 내장을 제거한 후, 새로운 plate에 넣음
* Contact Inhibition
⑤ Suction 후, Cold PBS로 3회 Washing (마지막은 깨끗하게 Washing)
: Cell growth가 지속되어 Cell 사이의 간격이 너무 조밀할 경우, Cell 성질에 변화를 주고
⑥ Cold Trypsin/EDTA Solution을 Embryo가 잠길만큼 넣고 4°C Rocker에서
성장이 방해를 받는 현상
Overnight
⑦ 1000ul Tip으로 Pipetting하여 Embryo 파쇄
⑧ Cell Strainer를 Conical tube 위에 올려놓고 plate에 있는 Cell을 올려놓음
⑨ Media를 추가하여 ⑥, ⑦ Step 반복
⑩ 1000 rpm, 3 min Centrifuge
⑪ Media Suction 후 Cell 양 확인
⑫ 37°C CO2 Incubator에서 Overnight
⑬ 다음날 Media change 후 Stock 제조 * Passage Number
: Cell culture하면서 Subculture 한 횟수로, 한 번 Subculture를 할 때마다 Passage
2. Subculture (Passage) Number 하나씩 증가

〮 정의 - Primary cell의 경우, Passage가 너무 많이 지나면 Cell 성질을 잃어버릴 수 있기 때

: Cell의 성장에 필요한 영양소 및 성장인자 등을 Media로부터 공급받아, 2~3일에 한 문에 새로운 Stock을 사용

번씩 Media를 바꿔주고(Cell doubling time에 따라 다름) 적당한 시간 간격으로 Cell을

여러 Dish에 나누어 키우는 것 * Media 조성
: 각 Cell에 맞는 Basal Media (DMEM, RPMI 1640 등) + FBS 10% + P/S 1%
∙ FBS (Fetal Bovine Serum): 세포 성장에 꼭 필요한 인자들(Albumin, Growth Factor,
Cytokine, Protein)이 다양하게 포함되어 있어 세포 성장을 도움
∙ P/S (Penicillin-Streptomycin): 세포 배양 시 오염을 예방하기 위해 사용
- Penicillin: 세균 세포벽 전환을 직접적으로 저해하고 세포벽을 변형시키는 효소 분
비를 유도하는 간접 억제 작용을 하여 Gram Positive 균 제거
- Streptomycin: 세균 리소좀 30S에 결합해 단백질 합성을 억제하고 감수성 높은 세
균의 사멸을 유도하여 Gram Negative 균 제거

Tech Note - Cell Culture 5 Sep. 2022

 ∙ Trypsin/EDTA Solution: Plate에 부착되어 있는 세포를 떼어낼 때 사용 3. Cryopreservation
- Trypsin: 단백질 분해효소로, Collagen 등의 섬유성 단백질 및 당단백질 분해
〮 정의
- EDTA: Ca2+과 Mg2+과 같은 이가양이온과 결합하여 세포와 Plate의 부착 방해
: Subculture를 반복하면서 Cell이 본래의 성질을 잃어버리는 것을 방지하고 장기간 보관
∙ PBS: 완충용액으로, pH변화를 조절하고 이온의 세기를 맞춰주며 세포 손상을 막음
하기 위해 passage가 낮은 건강한 상태의 Cell을 저장(동결)하는 과정

(1) Protocol - Cryovial에 담아 액체질소에 보관

- 최대한 낮은 Passage Number의 Cell 사용
① Media, PBS, FBS Warming
* Freezing Process 중 급격한 동결에 의한 Ice 형성, 삼투압 스트레스, Membrane
② Cell Culture Media Suction
damage 등을 최소화하기 위해 DMSO나 Glycerol 등 Cryo-protectant를 반드시 첨가
③ Plate 벽면에 PBS를 흘려주고 부드럽게 흔들어가며 Washing
- 적정 비율의 FBS와 DMSO를 혼합한 Freezing Media 나 Cryopreservation solution
④ PBS Suction
사용
⑤ Trypsin/EDTA Solution을 Plate 벽면에 흘려주고 상온 혹은 37°C에서 2~3 min
- DMSO (Dimethyl Sulfoxide): Cell이 어는 과정에서 Ice 형성을 줄여 세포 사멸 방지
Incubation (Cell마다 시간 상이)
- FBS: Cell starvation 방지와 잔류하는 Trypsin으로 인한 Cell damage 막는 Trypsin
⑥ 세포가 90%이상 Plate에서 분리되면 Trypsin/EDTA Solution 중화를 위해
inactivation 역할
Media 분주
⑦ 세포를 15ml Conical Tube에 옮긴 후 약 3~5 min Centrifuge
(1) Cryopreservation 시 생길 수 있는 세포 손상 원인
(Cell마다 원심분리 속도와 시간 상이)
① 저온 노출
⑧ 상층액 제거 후 Media로 Pellet 풀기
: Cell이 낮은 온도에 노출됨으로써 세포 내 기관과 기능 장애 → 냉각속도에 의해 영향을
⑨ 총 세포 수와 생존율 고려하여 적정량의 Cell Seeding 후 Incubation
받음 (냉각속도가 빠를수록 손상이 커짐)

* Automated Cell counter FACSCOPE B 에 대한 상세한 설명은 링크 참고 부탁드립니다. 이 때, 세포막 구조 변화로 인해 반투과성의 변화가 발생할 수 있고 세포질의 수축 또는
세포골격 요소의 응집 등 형태학적/기능적 손상 초래

Tech Note - Cell Culture 6 Sep. 2022

 ② Ice 형성으로 인한 물리적 영향 (2) Protocol
: 세포 동결 시, 온도가 계속 내려가면서 세포외액의 ice가 자라면 세포막의 물리
① Media, PBS, FBS Warming
적 손상 초래
② PBS로 Cell Wash 후 Trypsin/EDTA Solution으로 세포를 Plate에서 분리
⇒ 동결 속도를 천천히 내리면(-1° C/min) 세포내액이 세포 밖으로 충분히 유출되
③ 5 min, 1000 rpm, 4°C Centrifuge
면서 세포 내 얼음결정 형성 시간이 지연되고 얼음 결정이 형성되더라도 얼음결
④ 상층액 제거 후 Pellet은 Mixed media로 풀어준 후 마지막에 DMSO 첨가
정보다 크기가 작은 결정을 이루기 때문에 세포 내 기관에 큰 영향을 미치지 않음
⑤ Vial마다 Cell을 담고 -80°C에서 Coolcell® Container 에 넣은 뒤 천천히 동결시킨
후, 4시간 후 LN2 Tank로 옮겨 보관

4. Cell Thawing

〮 정의
: 동결보존되어 있는 Cell을 녹여 생명활동을 다시 시작하게 하는 과정
- Cell damage를 줄이기 위해 빨리 녹여야함
- 보통 water bath에 넣어서 녹임 (contamination 조심)
- 녹은 세포에 Culture media를 충분히 넣고 Centrifuge하여 DMSO를 완전히 제거한
cell 사용

(1) Protocol

① Media Warming
② LN2 tank에서 Vial을 꺼낸 후 37°C water bath에서 흔들어주며 Cell을 녹임
③ 세포외액/내액의 조성 변화
* Water bath 또는 Cell thawing device 사용
: 세포 동결 시, Ice 결정 내의 용매가 밖으로 빠져나와 잔존 액체에 축적 → 세포막
③ 거의 다 녹았을 때 Clean bench에 넣고 Media가 들어있는 Tube에 Cell을 넣고
내외의 삼투압 차이 발생 → 세포질 내외가 고장액으로 변하게 되어 삼투압 스트레
Pipetting
스가 세포 손상 초래 → 세포 내 부피가 줄면서 세포막이 쪼그라드는데 이 경우 세
④ Cell seeding
포막 손상 발생 또는 세포외액의 점도나 pH 변화도 세포에 나쁜 영향 초래
⑤ DMSO 제거를 위해 12 hr 후 Media change
* 출처: 한국생물공학회지 제21권 제2호

Tech Note - Cell Culture 7 Sep. 2022

 5. Cell Line 제조 Ⅲ. Trouble Shooting Guide

① Media 색의 비정상적인 변화

원인 해결방안

Incubator 내의 CO2 농도 조정
잘못된 Carbon Dioxide
(CO2) 농도 Sodium Bicarbonate 가 2.0~3.7 g/L일 경우에 5~10%의
CO2 사용

Flask의 Cap이 꽉 조여있는지 확인 후 Cap을 1/4바퀴

원활하지 않은 산소 공급
느슨하게 풀기

불충분한
최종 농도가 10~25mM이 되도록 HEPES buffer 추가
Bicarbonate Buffering
(1) Virus-mediated Methods
CO2 환경에서는 Earle’s Salts-based media 사용하고
〮 Retroviruses Media의 잘못된 Salt
대기 조건에서는 Hanks’ Salts-based media 사용
- Murine leukemia virus (MuLV)
- Human immunodeficiency virus (HIV) 해결 방안 없음
Bacteria, Yeast, Fungi
Cell과 Media를 버리고 재배양 권장
- Human T-cell lymphotropic virus (HTLV) 오염
(Antibiotics 첨가 필수, 후드와 Incubator 청소)
〮 DNA viruses
- Adenovirus
- Adeno-associated virus (AAV) ② Media에 침전물
- Herpes simplex virus (HSV) 원인 해결방안

해결 방안 없음
(2) Protocol Bacteria, Yeast, Fungi
Cell과 Media를 버리고 재배양 권장
오염
(Antibiotics 첨가 필수, 후드와 Incubator 청소)
① Cloning Gene into a Shuttle Vector
② Generating Recombinant Adenovirus Plasmids using AdEasier Cells - Serum을 filtering 한 후 사용
Frozen Serum
③ Generating Recombinant Adenoviruses in HEK-293 Packaging Cells - 올바른 방법으로 해동

④ Stepwise Amplication and Purification of High-titer Recombinant

Adenoviruses

Tech Note - Cell Culture 8 Sep. 2022

 ③ Plate에 cell이 부착되지 않은 경우

원인 해결방안

과도한 양의 Trypsin 처리 Trypsin 처리 시간 줄이거나 양 줄이기

Mycoplasma Infection Test

Mycoplasma 오염
후드와 Incubator 청소

Media에 부착 요소가 Serum-free의 경우 부착 요소가 조성에 포함되어

없을 경우 있는지 확인

Cell Type (Adherent Cell, Difficult Adherent Cell,

Cell에 맞지 않은 Plate 사용 Suspension Cell) 마다 사용가능한 Plate의 종류가
다르기 때문에 확인 후 알맞은 Plate 사용

④ Cell 성장 감소

원인 해결방안

- Glucose, Amino Acids와 다른 Components

다른 Media와 비교
부적절한 Media와 - Cell Growth 실험에서 Serum의 이전 Lot과
Serum 사용 새 Lot 비교
- 초기 접종 Cell 수 증가
- 새로운 Media 사용

세포가 제대로 얼거나 - 세포 장기 보관 시 질소탱크(-196°C)에서 보관

해동되지 않았을 경우 - 세포 해동 시, 최대한 빠르게 Step 진행

Media Change 시 Serial로 나눠서 새로운 Media와

갑작스런 Serum Change
섞어 사용

Plate 면적 대비 세포 간의 상호작용이 원활하게 일어날 수 있도록

적은 양의 Cell Cell 양 조절

Tech Note - Cell Culture 9 Sep. 2022

Ⅳ. 필요한 기기 및 시약

분류 브랜드 품번 품명

1378-TIF / 1383-TIF / 1376-TIF Direct Heat CO2 Incubator / Water Jacketed CO2 Incubator

THERMO FORMA 1344-TIF Biological Safety Cabinet

기기 909-TIF / 904-TIF / 990-TIF Deep Freezer (용량별 상이)

WAKEN AST-601 ThawSTAR CFT2 Automated Thawing System

AZENTA BCS-405 CoolCell® LX

SH30919 Characterized US-sourced Fetal Bovine Serum

SH30042 Trypsin/EDTA

HYCLONE SV30010 Penicillin-Streptomycin

SH30243 / SH30255 / SH30026 DMEM / RPMI 1640 / F-12

시약 / Kit SH30028 DPBS

DR1022-500-00 DMSO
바이오세상
ER2025-100-00 70% EtOH

WAKO 302-14681 Bambanker (Research Grade)

AKRON AK8899 CryoSolutions™ 100%, DMSO Solution (GMP Grade)

SARSTEDT
소모품 - Cell Culture Dish, Plate, Micro Tube, Tip, Cell Strainer
/AXYGEN

Tech Note - Cell Culture 10 Sep. 2022