생체의학공학 - 03 - Stem cell engineering

HUMAN MEDICAL BIOENGINEERING (Fall 2022)
PART I: Stem Cell Engineering
Dr. KYOBUM KIM
DONGGUK UNIVERSITY
DEPARTMENT OF CHEMICAL & BIOCHEMICAL ENGINEERING
Contents
• Cell culture technique
• Stem cell differentiation
• Experimental techniques to evaluate cellular characteristics

동물세포에 대한 이해
(1) 동물세포 (animal cell): 동물의 몸을 구성하는 가장 작은 생체 단위

(2) 세포 < 조직 < 기관 < 기관계 < 신체
(3) 조직 = 세포 + 세포외기질
(4) 동물세포의 대량 배양 및 증식을 통해 인간에게 필요한 각종 단백질을 얻어내는
“바이오의약” 산업이 발전 중
(5) 체외(in vitro)에서 인공적으로 체내 (in vivo)와 유사한 조건을 제공하여 세포를
대량 증식
동물세포에 대한 이해: 세포내 소기관
(1) 각 동물세포 내부에는 각종 세포내 소기관이 존재함
(2) 각 세포내 소기관은 각기 다른 역할을 하며 세포의 생장, 분화, 및 단백질 발현을 담당
(3) 핵 (nucleus)에 존재하는 유전정보로부터 특정 단백질의 발현이 가능함

동물세포에 대한 이해: 핵
(1) 핵 (nucleus): DNA를 포함한

유전정보가 담긴 가장 중요한
세포내소기관
(2) Central dogma:

DNA  RNA  Protein
(3) Protein:
- 세포의 성장, 활동을 포함한 신체
조직의 반응에 중요한 요소
- Growth factor, cytokine, antibody
등 세포의 신호전달, 생장, 분화 등을
제어하는 생체분자
동물세포에 대한 이해: 단백질의 발현 과정
동물세포에 대한 이해: 세포막
(1) 동물세포는 세포막으로 둘러쌓여 있음 (Cellular membrane)

(2) 세포막은 지질이중층 (Lipid bilayer)
(3) 유동성 (Fluidity)
(4) 각종 당단백질, 단백질 복합체 등이 박혀있는 구조 (Heterogeneous)
동물세포에 대한 이해: 세포외기질
• 세포외 기질 (ExtraCellular Matrix: ECM)
• 조직 (tissue) = 세포 (cell) + 세포외기질 (ECM)
• 세포들 사이의 공간을 채우며 조직의 구조적 지지를 담당하는 구조체
• 세포가 분비하는 단백질 섬유 및 다당류 물질로 구성되는 그물망 구조
• 조직의 기능 및 특성에 따라 모양 및 구성성분이 달라짐
부착세포 (Anchorage Dependent Cell)
• 대부분의 고형 조직 유래의 세포는 단층으로 부착하여 증식

• 대부분 적당한 전하를 띄도록 처리된 플라스틱 용기에 부착하여 증식
• 세포의 부착은 세포외 기질 (ECM)에 대한 세포 표면 리셉터 (receptor)에 의해
매개
부착세포
• 부착 세포는 바닥의 표면에 부착하기 전에 세포로부터 ECM 단백질이 합성 및 분

비되어야 하며 그렇지 않을 경우에는 표면이 ECM 단백질로 처리된 배양 용기가
제공되어야 함
• 그외에 세포와 혈청 유래 proteoglycan, 그리고 기타 단백질들이 세포 표면과
배양 용기의 표면에 관여하여 세포 부착을 촉진시킴
부착세포의 예시 (현미경 사진)
Fibroblastic Epithelial
Endothelial Neuronal
동물세포 배양
(1) 동물세포 배양 (animal/human cell culture)

• 특정 동물의 생체세포나 조직을 분리하여 생체 밖의 환경에서 어느 일정기간
생육시키는 기술
• 체외(in vitro)에서 인공적으로 체내 (in vivo)와 유사한 조건을 제공하여
세포를 대량 증식시키는 방법
(2) 배양 목적
• 효소, 호르몬, 백신, 항암제 등 의료용 단백질 (바이오의약품)을 생산
• 의료용 단백질은 유전자 재조합된 미생물을 이용하여 생산할 수도 있다.
• 그러나 동물세포를 이용하는 것이 제품 (최종 생성물)의 품질면에서 바람직
• 이들 생산에 필요한 최적화된 배양조건 및 세포내 신호 (signal) 기작을 연구
• 동물세포는 부착 (attachment) 상태나 부유(suspension) 상태로 배양
동물세포 배양: 고려해야 할 점
• 대부분의 동물세포는 표면에 부착하여 생장

• 동물세포는 미생물보다 크고 복잡한 세포로서 생장속도가 미생물에 비하여
매우 느리기 때문에 생산성이 상대적으로 낮음
• 미생물에 비해 환경적응력이 떨어지기 때문에 많은 조건을 충족시켜주어야
만 배양 가능: 배양 조건 및 배양배지 최적화 필요!
배양배지 (cell culture media)

: 동물세포의 생장에 필요한 각종
성분을 함유하고 있는 액체 물질
• 일반적인 동물세포 배양의 기본조건 (중요!)

• 배양배지: 세포 생장에 필요한 영양 성분
• 온도: 37°C
• 기체: 5% 이산화탄소 (CO2) + 산소 (O2) 혼합기체 필요
• pH: 7.4 ~ 7.7
• 적절한 수분 조건 (습도)
• 증식에 필요한 충분한 공간
• 배양에 필요한 배지의 조성은 항상 최적화 필요
• 혈청(serum)과 같은 값비싼 성분이 필요

• 혈청에는 호르몬, 성장인자, 다수의 미지의 성분 등이 포함되어 있으며
이 물질들은 동물세포배양에 반드시 필요
• 동물세포는 섬세한 지질이중층 막 (cellualr membrane)으로 둘러 쌓여 있어

전단력 (shear force)에 약하므로 산소 공급을 목적으로 한 심한 교반을 피
해야 함
• 동물세포는 일정한 세포수가 유지되어야 세포간 communiation이 잘 이루

어지고 정상적인 증식을 하게 됨
동물세포 생장곡선
• Lag phase: 세포의 생장이 시작되기 전 휴지단계

• Log phase: 지수적으로 세포의 숫자가 증가하는 성장단계
• Stationary phase: 세포의 숫자가 더이상 증가하지 않고 유지되는 단계
• Death phase: 영양분의 감소 및 생장조건 변화로 인한 세포 사멸 단계
부착세포 배양
• 부착세포를 계속해서 배양하게 되면 스스로 죽어나가게 되어 무한정 계속 배양할
수 없음
• Passage (계대 배양, subculture): 배양접시의 바닥을 꽉채운 세포를 떼어내어

더 넓은 배양공간으로 옮기는 작업
• 연속적인 세포 배양을 위해 주기적으로 다시 세포를 준비하여야 한다.
• 새로 증식한 세포들도 계속하여 배양접시에 부착하여 증식하게 되어 결국에는
배양접시 바닥에 세포들이 다닥다닥 붙어있는 세포의 단층 (monolayer)로 자
라게 된다.
• 세포들은 더 이상 부착할 곳이 없는 상태가 되면 증식을 멈추게 된다.
• 이러한 세포들을 계속하여 증식하게 하려면 세포의 일부를 배양접시에서 떼어
내어 새로운 배양접시에 넣고 배양하여야 한다.
부착세포 배양
• Passage (계대 배양, subculture): 배양접시의 바닥을 꽉채운 세포를 떼어내어
더 넓은 배양공간으로 옮기는 작업
부착세포 배양: 계대배양법
• Passage (계대 배양) 순서
• 현미경으로 세포의 증식 정도 확인: 세포층이 덮고 있는 바닥면적이 배양접시의
70% 정도 되면 계대배양 진행
• 오래된 배양배지 제거 (주로 suction 이용)
• 세포층 wash (PBS buffer 이용)
• PBS buffer 제거
• Trypsin 처리 + 37°C 5분: 부착에 필요한 세포표면 단백질을 제거하는 효소로,
이러한 표면단백질이 분해되면 세포가 바닥에 더이상 붙어있지 못함
• Trypsin 중성화: 사용한 trypsin의 2배 부피의 배양액 추가
• 원심분리 (centrifuge) 용기로 옮겨 cell pellet 형성: 세포들만 바닥에 가라앉음
• 상층액 (trypsin 및 추가된 배양배지) 제거
• 새로운 배양배지 추가
• 원하는 세포 농도로 새로운 배양접시에 배분
부착세포 배양: 계대배양법
• Passage (계대 배양) 순서
부착세포 배양: 계대배양시 고려해야 할 점
• 계대 배양 (Passage)시 에는 부착에 관여하는 세포막 단백질의 분해가 필요함:
단백질 분해효소 (trypsin, pronase 등)의 처리 강도와 방법, 사용 여부는 세포에
따라 다르므로 세포에 따라 적절한 방법 필요
• 일반적으로 부착 세포를 계대 배양할 경우에 배지를 제거하고 단층세포를 탈착하

기 위해서 trypsin을 처리하며, 일부 부착 정도가 약한 세포는 shaking함으로써
탈착 가능
• 세포의 탈착 후 세포를 모아서 적합한 배양 배지에 희석하여 배양함
• 그러나 예외적으로 일부 단층 세포들은 trypsin 처리로 충분히 탈착되지 않는다.

이러한 세포에는 pronase, dispase, collagenase와 같은 강력한 단백질 분해효소
를 처리해야 함
부착세포 배양: 계대배양시 고려해야 할 점
• 계대 배양 (Passage)시 에는 부착에 관여하는 세포막 단백질의 분해를 위해
단백질 분해효소 (trypsin, pronase 등)와 함께 EDTA와 같은 칼슘이온 제거제
(Ca2+ chelating reagent)의 도움이 필요하기도 함
• 세포벽의 구조를 유지하는데 칼슘 이온이 필수적

• EDTA는 칼슘이온에 결합하여 세포벽이 군데군데 무너지게 함
• 이렇게 무너진 자리로 trypsin과 같은 단백질 분해효소가 잘 침투함
• 따라서 일반적으로 Trypsin-EDTA 혼합액이 주로 사용됨

부착세포 배양용기의 예
• 유리제와 플라스틱제가 있다
• 부유세포의 경우에는 유리제와 플라스틱제의 어느 쪽에도 문제가 없으나,

접착세포의 경우 유리제에 collagen, poly-D-lysine, fibronectin 등의 접착인자를
coating하는 전처리 과정이 필요
• 플라스틱제 배양기는 일반적으로 일회용으로서 세척, 멸균 등의 작업이 필요없다.
• 플라스틱제 배양기는 dish, flask, microwell plate, roller bottle 등의 여러가지

크기와 형상이 있으며 각각의 특징을 아래 표에 나타내었다.
부착세포 배양용기의 예
부착세포 배양기: Roller Bottle
• 부착세포의 scale-up
• 병 속에 있는 배양배지를 회전시킴
• 일반적인 부착세포 배양 조건에 필요한 배양배지

보다 적은 부피의 배양배지 소모
부착세포 배양 심화
• (예) 에리스로포이에틴 (Erythropoietin): 암젠에서 생산된 Epogen (빈혈치료제)
• 연 매출 10억달러 이상의 블록버스터 약품으로 최초의 동물세포 유래 재조합
단백질
• Roller bottle 이용
• 전체 용량의 10-30% 배지를 충전
• CHO세포가 바닥에 부착할수 있도록 천천히 회전
• 세포는 늘 배지에 젖어 있어야 하고,
• 산소는 용기내 공간 부분에서 공급
• Bottle의 수가 규모를 결정하므로 scale-up에 용이함
• Liter 당 50 -200 mg 범위내 생산 가능
• 연간 kg 단위 생산 가능
• Batch 리액터에 비해 단위 부피당 세포 농도가 낮아 리터당 gram 단위 생산은
어려움
• 부착세포는 또한 마이크로 캐리어 (micro carrier)라고 하는 고분자 구형물체에 부
착시켜 Batch 리액터를 이용하여 현탁 배양 가능
• 마이크로 캐리어를 이용한 CHO 세포배양은 난포자극 호르몬/바이러스 백신 생산

에 널리 이용되고 있음
• 마이크로 캐리어를 이용한 인플루엔자 바이러스 생산 공정의 예시
부착세포 대량배양의 예
• Cell Factory (Thermo Fisher)

현탁 배양 (Suspension cell culture) = 부유 배양
• 배양배지에 세포가 떠있는 상태 (suspension)로 배양
• 필요에 따라서 부착 세포이더라도 기계적으로 부유 상태를 유지하며 증식시킬 수

있다.
• 배양배지의 교반을 위한 Agitation (회전에 의한 배양액의 유동성) 필요
• 부유 세포 배양시 탈착 과정 (trypsin처리 등)을 필요로 하지 않음
• 세포를 유지하기 위해서는 주로 배양 세포를 희석시킴으로서, 또는 계대 배양없이

단순히 배지의 양을 증가시킴으로써 지속적으로 배양할 수 있다.
• 단백질 대량생산에 주로 이용됨

현탁 배양기: Spinner flask
• 자기회전력을 이용한 혼합장치를 포함
• 대량생산 직전의 scale-up process에 주로

이용됨
현탁 배양기: 바이오리액터
• 대량생산에 필요
현탁 배양기: 바이오리액터
• Batch (회분식): 일정량의 배양배지 이용
• Fed-batch (유가식): 농축된 배지를 추가적으로 공급
• Continuous (연속식): 새 배지를 연속적으로 리액터에 공급하고 오래된 배지를 연
속적으로 제거
현탁 배양기: (1) Batch 리액터 (회분식)
• Agitator와 heating/cooling 내부장치가

포함된 탱크형태
• 일반적으로 1 – 15,000 리터 규모
• 고체/액체 물질은 위 뚜껑에 연결된 관을
통해 공급
• 배양과정에서 생성되는 가스는 위 뚜껑에
연결된 관을 통해 배출
• 배양 후 액체는 바닥으로 배출
현탁 배양기: (2) Fed-Batch 리액터 (유가식)
• Batch와 Continuous 리액터의 중간 형태

• 농축된 배지를 추가적으로 연속적으로 혹은 주기적으로 공급
• 이를 위한 배지의 적절한 공급속도 (Feed rate) 가 필요함
현탁 배양기: (3) Continuous 바이오리액터 (연속식)
• 신선한 배양배지가 지속적으로 관을 통해 공급 (Fresh media feed)

• 사용된 배양배지 (남은 영양분, 세포부산물 등 포함)는 같은 속도로 배출 (Exit liquid
flow)
• 반응기 내부 배양배지의 부피는 일정하게 유지됨
세포 동결 (Cell freezing)
• 세포 배양시 장기간에 걸쳐 계대 배양을 계속하게 되면 본래의 세포 집단과는 전혀 다
른 세포 집단으로 변할 수 있음
• 이러한 유전적 변이를 최소화하고, 세포 노화와 형질전환을 방지하는 등 세포주를 안

정하게 보존하고, 오염에 의한 소실을 방지하기 위해서 세포의 동결 보존은 반드시 필
요
• 낮은 온도에서 세포를 얼린 후 장기간 보관

• Cryoprotectant: 동결 보존시 세포에 내동성을 부여하기 위해서 dimethyl sulfoxide
(DMSO) 또는 glycerol을 첨가
• Freezing medium: 70% 배양배지, 20% 혈청, ~10% DMSO
• 포함된 DMSO는 세포에 독성을 나타낼 수 있으므로 동결 조작은 신속히 진행
• 고밀도 (5x106-1x107 cells/ml)로 cryogenic vial에 저장한다.
• 동결시 감온 속도는 세포에 따라 다르며 보통 -1°C/min 속도로 동결한다. 이를 위해

Programmed cooler를 이용하거나 또는 솜을 채운 ice box에 저장할 세포가 포함된
vial을 넣고 -70 ~ -90°C의 deep-freezer에 정치한 후,
• 나중에 액체 질소로 옮김으로써 동결 보존을 완료함.

액체질소탱크
• 세포의 장기 보존 용도로 액체 질소 이용 (-196°C)
• 액체질소가 동결앰플(ampule) 내에 침투할 경우 바이러스 등의 오염의 원인이 되고,
해동시에는 앰플내의 액체질소가 기화하여 폭발할 위험이 있다.
• 이러한 이유로 액체질소 용액 내에 보존을 할 경우 silicone rubber에 packing이 붙어
있는 플라스틱제의 cryogeni vial 를 사용하든가, 유리앰플에 봉합하여 사용하는 것이
바람직
• 거의 반영구적으로 보존이 가능 (이론적)
• 액체질소는 기화하여 감소하기 때문에 정기적으로 보충
Freezer cane
동결된 세포의 배양
• 액체 질소에 저장 상태인 동결 세포 vial은 액체 질소에서 꺼내는 즉시 37 - 40°C

정도의 수조에서 신속히 해동하고, 미리 준비한 배양 배지에 세포 현탁액을 넣는다.
• DMSO나 glycerol을 제거하기 위해, 2 - 3 분간 원심분리하여 상층액을 버리고

새로운 배지에 세포를 현탁한 후 배양 용기에서 배양한다.
• 이때 보통의 계대 배양때보다 높은 세포 접종 밀도로 배양을 시작

동물세포 배양에 필요한 기기
(1) CO2 incubator
(1) Clean Bench
(2) 초순수 물 제조장치
(3) 배양용기
(4) 액체질소탱크
(5) 현미경
동물세포 배양에 필요한 기기: CO2 incubator
• 동물 세포 배양 기간 동안 배양 배지 안의 pH는 일정
수준으로 유지
• 일반적인 액상 배지의 한 성분인 Sodium bicarbonate

(NaHCO3)와 CO2 기체와의 평형에 의해 배양배지의
pH가 조절
• 따라서 동물 세포 배양에는 CO2 incubator가 필수적
• 대부분은 water jacket 형으로서 문의 개폐에 따르는 온도변화가 작고 복귀속도도

빠름
• Incubator 내부 가장 아래에는 배지의 습기 증발을 막기 위해서 가습용기가 있어야

하며 늘 멸균수를 채워 넣어 내부 습도를 100%로 유지
https://www.thermofisher.com/kr/ko/home/references/gibco-cell-culture-basics/cell-culture-environment.html
• CO2 incubator는 고온다습하여 오염가능성이 크므로, 무균 상태를 유지하도록 주

의해야하며 자주 청소할 필요가 있음
• Incubator의 내부는 1% SDS로 닦고 건조시킨 후 70% ethanol로 다시 한번
닦아낸다. 또한 가습용기의 물은 멸균수를 사용하고 방부제로 methyl p-
hydroxybenzoic acid를 적당한 양으로 첨가하면 좋다.
- Provide a sterilized area for handling cells
- Regulated air flow & HEPA filter

동물세포 배양에 필요한 기기: Clean bench
• 무균조작을 위한 작업대
• HEPA filter 및 송풍기를 사용하여 무균공기를 항상 내부로 보냄
• 내부에는 형광등과 자외선 살균등이 설치되어 있어야 하며, 사용하지 않을 때에는 항
상 살균등을 켜놓아야 한다.
• 사용한 후에는 작업대를 70% ethanol로 닦아야 한다.
• Clean bench 내에는 세포배양에 필요한 여러장비, 즉, autopipettor, aspirator (배

양액을 원심분리한 후 배양상층액을 흡취하는데 사용한다), forceps, micropipetter,
burner, pipette 등을 둔다.
동물세포 배양에 필요한 기기: 현미경
• 세포배양시 항상 세포의 모양과 세포수 관찰
• 광원이 위에 있고, 대물렌즈가 아래에 있는 도립 (inverted) 현미경을 갖추는 것이
좋고
• 배율은 40 - 200배 정도라면 적당
• 일반적 접안렌즈 비율 (x10)
• 일반적 대물렌드 구성 ( x4, x10, x20, x40)
세포 계수 (Cell Counting)
(1) Hemocytometer
• 현미경으로 관찰하며 소량의 세포 현탁액 내 세포의 숫자를 셀 수 있게
도와주는 유리 슬라이드 형태의 기구
- 총 세포수 / 4
- x 104/mL
- x 총 세포 현탁액의 부피 (mL)
- x Dilution factor (DF)
x 2 if original cell suspension 1 + dilution buffer 1 (total 2 volume)

x 4 if original cell suspension 1 + dilution buffer 3 (total 4 volume)
x 7/3 (=2.33) if original cell suspension 3 + dilution buffer 4 (total 7 volume)
 As an example: If the total cell count is 145 & DF of the cell suspension is 3
(= original cell suspension 1 + dilution buffer 2), the total suspension volume
is 6 mL, the cell density (or the cell concentration) is:
145/4 (# of cells per corner) x 104/mL x DF 3 x tot 6 mL = ( ) cells in 6 mL

세포 계수 (Cell Counting)
(2) Automated cell counter
• 자동 세포 계수기
Reagents: Cell culture media
(1) Cell culture media 성분
• Amino acid
• Vitamin
• Ions
• Carbohydrate
• Phenol Red
• Others
Welgene Technical Information: Cell Tissue Culture

(1) Amino acid
• Essential amino acid에는 세포에 의해서 합성되지 않는 아미노산과 cystein과 tyrosin이 포함
• Nonessential amino acid는 세포에 의해 합성된다. 그러나 이들 아미노산을 합성하지 못하거나 합성
속도보다 소모 속도가 더 빠른 일부 세포들을 위해서 배지에 첨가해주기도 한다.
• 모든 아미노산 농도가 최대 세포 농도와 증식 속도에 영향을 준다
• 이 중 가장 중요한 L-glutamine은 단백질 합성 및 D-glucose, pyruvate와 함께 주요한 에너지원으로
사용

(2) Vitamin
• 가장 많이 이용되는 종류는 vitamin B-group (folic acid, biotin, pantothenate 등)
• 일부 배지에는 ascorbic acid (vitamin C)와 a-tocopherol (vitamin E)이 포함
• 일반 배지에 첨가되어지는 혈청은 주요한 비타민 원으로 작용한다. 따라서 혈청의 농도가 낮아지거나
제거되어지면 비타민 첨가량을 증가시키거나 새로운 비타민 종류를 첨가해야 한다.
• 비타민은 대사과정의 보조 인자로 작용하기 때문에 저농도의 비타민은 대사과정을 제한하여 세포 생
존과 증식 속도에 영향을 미친다.
(3) Ions
• 이온은 배지의 삼투압을 결정
• 배지에 사용되는 이온은 Na+, K+, Mg2+, Ca2+, Cl-, SO42-, PO43-, HCO3- 등
• Ca2+와 Mg2+는 부착과 cell aggregation의 보조 인자로 작용하기 때문에 부유 세포 배양에서는 감량
되어 있다.

(4) Carbohydrate
• 대부분의 배지에서는 D-glucose가 L-glutamine과 함께 에너지원으로 작용
• D-glucose는 glycolysis를 통해서 pyruvate로 전환되고 pyruvate는 Krebs 회로를 통해서 에너지를
생산
• 일부 세포주에서는 이 Krebs 회로가 불완전하여 다른 대체 에너지원을 요구하는데, 이때 제일 많이
사용되는 것이 L-glutamine이다.
• D-glucose는 D-galactose, D-fructose, D-mannose와 같은 다른 탄수화물로 대체될 수 있는데, 대
체된 탄수화물의 사용은 배지내 젖산 (lactic acid)의 축적을 방지하여 배지의 산성화를 막음

(5) Phenol Red

• pH 지시제: 산성 pH = 황색, 중성 pH = 적색, 염기성 pH = 보라색
• phenol red는 스테로이드 호르몬 (steroid hormone)과 유사하여 이와 유사한 반응 (steroid-like
response)을 유발할 수 있다.
• 세포 배양시, 특히 mammary tissue 배양시 이러한 스테로이드 호르몬 유사 반응을 방지하기 위해
phenol red가 제거된 배지를 사용하기도 한다.

배양 배지에 적용되는 완충작용
• 세포 대사의 결과 발생되는 대부분의 대사 산물은 산성

• 모든 세포 배양 배지에는 이러한 대사 산물로 인해 발생되는 pH의 변화를 줄이기 위해서 완충 작용을
하는 물질이 최소 1가지 이상 포함
• 이상적인 완충 작용 : (1) 특정 배지에 주어진 pH를 지속적으로 유지, (2) 배지 성분과 화학적 반응을
하지 않아야 하고, (3) 배양시 일어나는 화학적, 생화학적 반응을 방해하지 않아야 한다.
• 1차 완충작용을 하는 것은 sodium bicarbonate (NaHCO3) 와 HEPES이다.

• 2차 완충작용하는 것은 무기 염류에 포함되어 있는 phosphate salts
• 배지 첨가제인 혈청 (FBS) 또한 완충 역할을 한다.

• sodium bicarbonate / carbon dioxide (NaHCO3 / CO2)는 아래와 같은 반응을 함으로써 세포내
pH를 유지함
• NaHCO3 + H2O → Na+ + HCO3- + H2O → Na+ + H2CO3 + OH- → Na+ + OH- + H2O + CO2
→ increased alkalinity
• NaHCO3 역할: (1) pH 유지, (2) 삼투압 유지, (3) 에너지원 제공
• 그러나, NaHCO3 를 사용할 경우

(1) NaHCO3는 37℃에서 pKa 6.3 가짐으로 pH 7.0 - 7.5 범위에서 최적 완충 작용을 하는 것은 아님
(2) 5 - 10% CO2 / 95-90% air의 특수한 환경을 필요로 한다는 단점이 있다.

• 단점 보완
• (1) Hanks' balanced salt는 NaHCO3 의 농도를 낮추어 후자의 경우를 보완
• (2) NaHCO3 를 대신하여 Tris를 사용. 그러나 Tris는 amine을 가지고 있어 화학 반응성이 높고, 세포
증식의 저해제로 작용할 수 있고, 생체막을 통과할 수 있고, 생체막을 통과할 수 있고, 온도에 따라 pH
가 변화되는 단점이 있다.
• (3) pH 6.15 (MES)에서 pH 9.55 (CHES)의 범위를 망라하는 zwitterionic buffer 계열을 도입하였는
데 이에 HEPES가 포함되어 있다.
• HEPES buffer는 37℃에서 pKa 7.31을 가지고 있어 세포 배양 배지에 최적하며 세포막을 통과하지
않는다. HEPES를 배양배지에 포함시킬 경우에는 삼투압을 맞추어주기 위해서 NaCl 농도를 낮추어
준다.

Reagents: Serum
(1) 혈청의 역할
• 혈청(serum)
 기본 배양 배지에 주요한 첨가제
 광범위한 고분자 단백질, 저분자 영양분, 호르몬, 미네랄, 지방 등을 운반하는 수송 단백질을 제공
 단백질 분해효소 (protease)의 활성을 억제하고, pH 조절용 완충제 역할을 하는 등의 장점
 가격이 고가 (>600,000원 / 500 mL)

 혈청 내에 포함되어 있는 단백질 및 펩티드 때문에 세포배양 후 얻어지는 제품의 분리정제 공정이 매우
복잡해진다.
 혈청을 멸균하기 위하여 가열법을 사용하지 못하고 여과 (filtration)해야 하기 때문에 마이코플라즈마
(mycoplasma) 또는 바이러스 등에 의한 오염의 가능성을 증가
 혈청을 함유한 배지는 거품이 잘 생긴다.
 그러나 혈청 사용의 가장 큰 문제점은 배치 (batch) 마다 혈청의 조성이 달라지기 때문에 혈청을 사용
한 실험은 재현성을 얻기 어렵다는 점이다.
 동일한 세포를 같은 성분의 배지에서 배양한다 하더라도 그 배양의 결과가 항상 다르게 나타난다.

Reagents: Serum
(1) 혈청의 역할
 이러한 문제점을 극복하기 위해 무혈청 배지 (serum-free media)가 개발

 무혈청 배지 내에는 포도당, 글루타민, 다른 아미노산, 염들 이외에도 혈청 대체 물질로서 인슐린, 트렌
스페린 (transferrin), 셀레늄 (selenium)을 포함하기도 한다.
 무혈청 배지는 그 구성 물질의 조성을 분명히 알 수 있어 배지 조성이 표준화되며 실험의 재현성을 높
힌다.
 또한 멸균이 용이하고, 생성물의 정제가 쉽고, 가격이 비교적 저렴한 장점이 있다.
 무혈청 배지의 문제점으로는 특정 호르몬이나 성장인자를 첨가해야 하는 경우 비용이 비싼 점, 상업화
가 불가능하므로 용도에 따라 맞춤 생산이 되어야 하는 점, 세포의 생장속도가 혈청이 함유된 배지보다
느린 점, 세포 계통마다 서로 다른 무혈청 배지 조성을 요구하는 점과 무혈청 배지에 적응되지 않는 세
포 계통이 있다는 점이다.
 대표적인 무혈청 배지에는 Eagle's MEM (Minimal essential medium), DME (Dulbecco's modified
Eagle's medium), Ham's F 12, SF 12, RPMI 1640 등이 있다

Reagents: Serum
(2) 혈청의 종류
• Fetal Bovine Serum (FBS) vs Bovine calf serum (BCS)

 조직 및 세포 배양에서 가장 많이 사용되고 있는 혈청
 BCS는 대개 16 개월된 송아지에서 혈청을 채취 + FBS에 비해 단백질의 양이 2배에 달하고 항체 또한
약 100배 정도 많이 함유되어 있다.
 일반적으로 FBS를 더 많이 사용
• Newborn calf serum (NCS)

 생후 10일 이하의 송아지에서 채취
 FBS와 유사하나, 다만 protein 함량이 약간 높음
 때로 바이러스 감염의 위험성을 제공하기도 하는데 이러한 위험성을 완전히 제거하기 위해
서 gamma 선 조사 처리된 gamma-irradiated serum을 사용하기도 한다.

Reagents: Serum
(3) 혈청의 성분
• 단백질(protein)
 단백질은 혈청의 대부분을 차지하는 성분으로 혈청 내 조성 및 기능들이 완전히 밝혀진 것은 아니
다.
 albumin, globulin, 세포 부착 촉진시키는 fibronectin과 fetuin, trypsin을 억제하는
α2-macroglobulin, 그리고 철과 결합하는 transferrin 등이 있다.

Reagents: Serum
• Polypeptide
 혈액 채취 직후 원심 분리로 세포를 제거한 혈청보다 자연적으로 응고된 혈청으로 세포를 배양하
면 세포가 더 잘 증식된다.
 이것은 혈소판에서 유리되는 polypeptide 때문인데, 이에 속하는 platelet-derived
growth factor (PDGF)이다.
 PDGF는 세포 증식을 촉진하는 능력을 가지고 있어 섬유아세포와 신경교의 증식을 촉진한다.
 transforming growth factor (TGF)와 같은 혈소판 유리 polypeptide는 상피세포의 증식을 억제
하고 세포분화를 촉진한다.
 fibroblast growth factor (FGF),epidermal growth factor (EGF), endothelial growth factor,
insulin-like growth factor (IGF-1, IGF-2) 등이 혈청 내 소량으로 존재

Reagents: Serum
• 호르몬 (hormone)
 혈청내에 존재하는 호르몬들은 세포의 증식에 많은 영향을 줄 수 있으며
 동일한 호르몬이더라도 세포의 종류에 따라서 서로 다른 효과를 나타낼수 있다.
 Insulin은 glucose와 아미노산의 세포내로의 섭취를 촉진하여 세포 증식 촉진 효과를 나타낼 수
있고,
 IGF-1 수용체의 활성도에 의해서 그 효과를 나타낼 수도 있다.
 태아 혈청에 존재하는 hydrocortosone은 FBS에서 그 양이 일정치 않은데, 세포의 유착과 증식
을 촉진하는 역할을 한다.
 그러나, hydrocortisone은 어떤 조건에서는 오히려 세포 증식을 억제하고 세포 분화를 유발하기
도 한다.

Reagents: Serum
• 각종 영양소와 대사물질(nutrient and metabolite) : 아미노산, 당, 케토산, 지질, ethanolamine,

phosphoethanolamine, 기타 영양소와 중간 대사물질이 혈청 내에 존재
• 각종 무기물질(inorganic component)
 소량의 미네랄 성분과 철분, 구리, 아연 등은 혈청 단백질에 결합된 상태로 혈청 내에 존재
 selenium은 GSH synthetase의 보조인자로서 free radicals를 해독하는데 도움
• 억제 인자(inhibitor)
 혈청 내에는 또한 세포 증식을 촉진하는 인자들이 많지만 억제하는 물질들도 존재
 세포 증식을 억제하는 인자에는 γ-globulin, TGF-β, 보체(complement) 등이 포함된다.

Freshney.(1992) Animal Cell Culture.
Freshney (1992) Animal Cell Culture
Reagents: Serum Free Media
• 대부분의 세포주들의 경우에는 배지에 혈청을 첨가해 주어야 하지만,

• 1950년대에 합성 배지로 자연 배지를 부분적으로 대체할 수 있다고 보고된 이후로 혈청 공급 없
이 세포 배양을 하려는 시도
• 현재는 다양한 무혈청 배지가 개발되어 상용화
• Ex) Ham's medium, NCTC 109, 135, Waymouth's MB752/1, MB705/1, Brich & Pirt media,
Higuchi media, MCDB media 등
• 혈청의 첨가 없이 세포의 성장을 유지할 수 있으며 대부분 이들 배지에 insulin, EGF (epidermal
cell growth factor), albumin, transferrin, polyamine, fatty acid 등을 첨가하여 사용
• 그러나, 무혈청 배지의 주요한 목적은 세포가 생산하는 생리활성물질의 분리정제 과정을 최소화
하기 위한 경우가 많으므로 불필요한 인자들의 첨가는 피하는 것이 좋다.
• 최근에는 철을 수송하는 단백질인 transferrine 대신에 iron citrate, iron chelating reagent를
첨가하여 단백질 성분을 전혀 함유하지 않은 protein-free media도 개발되었다.

Reagents: Antibiotics (항생제)
• 동물 세포 배양시 bacteria, fungi, mycoplasma, yeasts 등에 의한 오염은 빈번한 사건이다.

• 우선 이들에 오염되지 않도록 무균조작 및 무균 상태 유지에 주의를 기울이는 것이 가장 중요
• 차선책으로 antibiotics와 antimycotics를 사용

• 세포주에 영향을 줄 수 있으므로 신중히 사용하여야 하며 사용하기 전에 세포 독성을 나타내는
dose를 확인하는 것이 좋다.

Cells in Tissue Engineering & Regenerative Medicine
 Cell types
• Tissue specific differentiated cells
• Skin (fibroblasts), cartilage (chondrocytes), bone (osteoblasts)
 Stem cells
• Self-renewal
• Potential to differentiate along more than one lineage
• difficult to direct differentiation and achieve sufficient cell numbers
 Issues in the choice of cells

• Sources and function
• Culture conditions for in vitro expansion
• Balance between ethical. safety, and efficacy issues
• Development of large scale cell culture systems
• Cell storage techniques
• Sterilization of cells
• Maintenance of cell function
• Direct cell function
Phenotype vs Genotype
표현형 (유전자와 환경의 영향에 의해 형성된 생물의 형질)
유전형
Stem Cell
 Stem cell Properties
– the capacity to regenerate or repair tissues that have been destroyed or damaged
by injury or disease such as cartilage, spinal cord
- Stem cells are specially important in tissues that do not have the ability to
regenerate
- Self renewal: the ability to go through numerous cycles of cell division while
maintaining the undifferentiated state
- Potency : the capacity to differentiate into specialized cell types
- Clonality: ability of a single cell to form many similar cells
- Differentiation: process by which a less specialized cell becomes a more
specialized one
Somatic Cells Stem Cells
Two identical daughters Self-renewal Differentiate

Stem Cell Phenotype
Types of Stem Cell: By Origin
 Embryonic stem cells (ESC)
 Adult (postnatal) stem cells
 Cell reprogramming (Induced Pluripotent Stem (iPS) Cells)

Stem Cell Phenotype: By Potential
Stem Cell Phenotype: By Potential
Morphogenesis
 Morphogenesis (발생 형태 형성)

• Evolution and development of form
• Spherical and geometrically symmetric (fertilized egg) – form shape (during
development)
• Highly coordinated process
• Structure controls function
• Cellular basis (mostly understood), molecular basis (still under investigation)
Embryonic Stem Cell (ESC)
 ESC
• isolated from the inner cell mass of blastocysts (hollow balls) of preimplantation-
stage embryos
• potential for unlimited expansion and pluripotency
• a potential source for regenerative medicine and tissue replacement after injury
or disease
• require specific signals to differentiate to the desired cell type
• if simply injected directly, they will differentiate into many different types of cells,
• resulting in a tumor derived from this abnormal pluripotent cell development (a
teratoma).
• Limitations: the directed differentiation of ES cells and avoidance of transplant
rejection
(접합자) (배반포)
Human Embryogenesis
 Zygote (접합자): the fertilized egg
Human Embryogenesis
cleavage
8-cell stage
Blastocyst
Blastocyst inner mass cells
Human Embryogenesis
Milestones in Embryonic Development
 Morula (상실배): solid ball of cells formed from cleavage
 12-16 cells/day 3
 60 cells/day 4
 Blastocyst (Day 5 - 6, 배반포): 70 to 100 cells

 On day 4-5 – reorganization of spherical mass
 Form fluid-filled structure
 Inner cell mass (embryoblast) – embryo
 Trophoblasts – placenta
 Days 7 - 14: Embryo implants in the uterus (착상)
 Division of inner cell mass (Day 8 - 9)

 Epiblasts and hypoblast – form bilaminar disc
 Migration of epiblast – initiation of formation of three germ layers
 Day 16: Three distinct layers begin to form

Milestones in Embryonic Development
 Gastrulation
 Large-scale morphogenic processes
 3D formation of a tubular structure (Ex: mouth to anus, finger)
 Symmetrical – asymmetrical
 Need cell interactions
 Days 14 - 21: Beginning of future nervous system
 Days 21 - 24: Beginning of future head, neck, mouth, and nose
 Weeks 3 - 8 (Days 21 – 56): Beginning of organ formation
 Week 8 (Days 56): Embryo is called a fetus
Three germ layer
Endoderm
Ectoderm Mesoderm
Ectoderm Mesoderm Endoderm

Nervous system Skeleton Digestive tract
Epidermis of skin Muscles Respiratory system
Circulatory system Liver, pancreas

Bladder
In vitro Fertilization (Conception in a Dish)
 ESC
• isolated from the inner cell
mass of blastocysts (hollow
balls) of preimplantation-
stage embryos
• potential for unlimited
expansion and pluripotency
 Characteristics
• Highest level of pluripotency
• Ability to differentiate to all somatic cell types (except fetus, placenta) under appropriate
culture environments
• Unlimited self-renewal
• with controlled undifferentiated stages
 Limitation and potential solutions

• Teratoma Formation - Pre-differentiate cells in culture then insert
• Animal pathogens- Feeder-free culture conditions (Matrigel)
• Immune Response - Somatic cell nuclear transfer, Universalize DNA
• Ethics - ?
Teratoma (기형종)
: an encapsulated tumor with tissue or organ
components resembling normal derivative of
more than one germ layer.
Postnatal (Adult) Stem Cell
 Regulate the homeostasis of the majority of our tissues
 Generate new progenitors and mature, functional cells to replace old cells
 Exist in various tissues
• bone marrow, neural tissue, skin, retina, dental epithelium
 Promising tool for regenerative therapy
 Problems: difficult to harvest stem cells & insufficient number of cells
Hematopoetic Stem Cell (HSC)
 Isolated from bone marrow and umbilical cord

 Have been primary targets for tissue engineering and cellular therapy owing to
their capacity for differentiation and self - renewal
 Generate hepatocytes, cardiomyocytes, a host of epithelial tissues
 Characteristics
• Exist in small number
• Unlimited expansion of hematopoietic components over life
• Definition: ability to regenerate all components of bone marrow upon
transplantation following myeloablation
• Unsymmetrical process-self-renewal/multi-lineage differentiation
 Important applications of HSCs

• Controls immune system
 Plasticity : from HSC to hepatocytes
 Major source in liver tissue engineering or immune cells
Postnatal (Adult) Stem Cell
Bone marrow (골수)
 Home of at least two different types of stem cells

• HSC (hematopoietic stem cell) → hematopoietic system
• SSC (skeletal stem cell) → skeletal system
 Contribute differentiated cell types

outside of their physiological
progeny
 Need to substantiate the true

efficacy of bone marrow for
treatment of abnormalities
Mesenchymal Stem Cell (MSC, 중간엽 줄기세포)
 Mesenchyme: embryonic connective tissue that is derived from the mesoderm
 found in the bone marrow
 However MSCs can also be isolated from other tissues including cord blood, peripher
al blood, fallopian tube, and fetal liver and lung
Mesenchymal Stem Cell (MSC, 중간엽 줄기세포)
 Present in bone marrow (bone marrow stromal cells + mesenchymal stem cells)
 Differentiate into many cells forming connective tissue
 Strength
• Autologous: low complication upon transplantation
• Pluripotency: mostly bone, cartilage
 Limitation
• Loss of mulipotent differentiation capacity during expansion
• Hard to control cell properties
Source of MSCs
Adipose-derived stem cell (ADSC)
 Derived from fat tissue
 Discovered in 1992 – potential of stem cells
 Fat tissue – originated from mesoderm
 Mass: 1X10^7 – 6X10^8 stem cells/300 ml
 High survival rate
 Easy expansion, high proliferation, slow aging (compared to bone marrow stem cells)
Isolation of ADSCs
Isolation and Differentiation of Adipose-Derived Stem Cells from Porcine Subcutaneous Adipose
Tissues (from Animal for Experimental Purpose)
https://www.jove.com/video/53886/isolation-differentiation-adipose-derived-stem-cells-from-
porcine
Isolation of ADSCs
from Human Patients for Clinical Purpose
Morphology of Fat tissue: Removal of excess skin in the abdomen

https://www.youtube.com/watch?v=-Y6G_di6siY
Liposuction
https://www.youtube.com/watch?v=DTfhfHqt1ZQ
Instruments for stem cell isolation from human tissues:

https://www.youtube.com/watch?v=c_uy8-0KHzA
Overall Procedure: https://www.youtube.com/watch?v=gyhUpjeDeNs
Autologous Fat Grafting for Breast Augmentation in Underweight Women

: https://academic.oup.com/asj/article/34/7/1066/256229
SVF (Stromal Vascular Fraction)
- a component of the lipoaspirate obtained from liposuction of excess adipose tissue.

- Lipoaspirate, the waste product of liposuction (cosmetic surgery), contains a large population of
regenerative cells called adipose derived stem cells (ADSCs), which share a number of similarities with
bone marrow cells, including the capacity for multilineage differentiation.
- Autologous SVFs containing ADSCs are currently being used in clinical settings for various orthopedic
applications for human patients without any serious side effects.
SVF (Stromal Vascular Fraction)
Application using ADSCs
Cho et al., J of Controlled Release (2020)

Other sources
 Placenta and cord blood stem cells
 Placenta derived cells - Amniotic (양수) stem cells
 Umbilical cord blood stem cells
 Induced Pluripotent Stem Cell (iPS cell) (유도만능줄기세포)

Placenta (태반)
Placenta (태반)
Placenta (태반)
- 호르몬 생산
- 호흡
- 흡수/배설
Umbilical cord blood stem cells
 Isolated prior to or immediately following birth
 Hematopoietic stem cells (Majority)
 100,000 stem cells per mL in UCB
 Alternate to bone marrow stem cells
- Adult stem cells of infant origin
- Less invasive than bone marrow
- Greater compatibility
- Less expensive
 Major characteristics
• Plasticity, homing, engraftment
 Applications
• Hematopoietic cell transplantation for anemia (빈혈증), aplastic anemia (재생불량
성 빈혈) , leukemias (백혈병), metabolic and other congenital disorders
• Ischemic vascular disease , Metabolic storage diseases , Neurological disorders
Umbilical cord blood stem cells: True or False?
Molecular Reprogramming
• Nuclear reprogramming to a pluripotent state by three approaches

Yamanaka & Blau, Nature 465(10) 2010 (DOI:10.1038/nature09229)
Induced Pluripotent Stem Cell
 The generation of iPS cells from adult human dermal fibroblasts with the same four
factors: Oct3/4, Sox2, Klf4, and c-Myc
 Human iPS cells were similar to human embryonic stem (ES) cells in morphology,
proliferation, surface antigens, gene expression, epigenetic status of pluripotent cell-
specific genes, and telomerase activity
 Role of 4 Factors During Reprogramming: Oct3/4, Sox2, Klf4, and c-Myc
Sridharan et al., Cell 136(2) 364-377, 2009

 Somatic cells that have been genetically reprogrammed to an embryonic stem cell–like
state by being forced to express genes important for maintaining the defining
properties of embryonic stem cells
 Tissues derived from iPSCs will be a nearly identical match to the cell donor and thus
probably avoid rejection by the immune system.
Virus engineered
to express four
key “pluripotency”
genes 
Pros: No embryos required

No immune rejection?
Disease in a dish?
Skin cells Cons: May not be = to ESCs iPS cells

Genetically engineered
Viral gene delivery mechanism
 Efficiency of re-programming is poor
 In human cells efficiency of reprogramming ranges between 0.02% to 0.002%
 Potentials
• Ability to differentiate into many cell types
• Easily accessible
• Individual-specific i.e. personalized or non-immunogenic
• Vastly renewable
 Problems
• Low efficiency of reprogramming
• Genetically engineered (Safe enough?)
• Use of viral vectors for induction (need better vector or carrier)
• Risk of tumour formation (Reduced number of transcriptional factor)
• Efficient/Precise differentiation protocols required
Issues in use of stem cells
 Characterization of the biological properties of stem cells
 Optimization of their isolation and ex vivo expansion
 Formulation of appropriate scaffolds and carrier
 Development of bioreactors to create tissue with appropriate biomechanical properties
 Determination of mechanisms by which to mobilize and activate endogenous stem cells

PART II:
Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction
(RT-PCR)
Cell Differentiation (세포분화)
 Differentiation
• phenotypic changes and development of specialized cell types
• a lineage commitment – coordinated series of gene-expression events – become mature cells
(- possibly undergoes transdifferentiation)
 Characterization of differentiation
• Gene expression (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (RT-PCR))
• Biochemistry/cell biology – functional study
• Mathematically described
Change in Gene Expression
 Differential gene expression – usually irreversible change
 Functional cellular state or phenotype
 Careful switch on/off of genes
 For human
• Function of all genes – still unknown
• Expression profiling – time window for gene expression: DNA chips, microarray
Reverse Transcription (RT)-PCR
Kendall & Riley, Contemporary Topics 2000

RT-PCR

RT-PCR
 Advantages
• High sensitivity due to exponential amplification of the template RNA
• Very specific when using gene specific primers in the synthesis of cDNA
• (Relatively) rapid results
 Disadvantages
• RT-PCR detects transcripts (the results of transcription = mRNA expression), not functional
proteins

Real Time RT-PCR
 Detection of amplification
• TaqMan® probe
• SYBR® Green
• Cheap, non-specific amplification • High specificity, expensive
SYBR Green I
1) Denaturation Primer
2) Primer annealing Polymerase
3) Elongation
Real Time RT-PCR
 Baseline
 Threshold Threshold
 Ct (threshold cycle)
 Melting curve
Baseline
 Absolute quantification
 Relative quantification: Comparative Ct (ΔΔCt) method
Ct
Real Time RT-PCR: Experiment Design
 Comparative CT (ΔΔCT) method
 Determine the relative target quantity in samples
 Compare expression levels of a gene in different samples (treated vs. untreated sample, wild-type
vs. mutated)
 Endogenous control : GAPDH, 18s rRNA, beta-actin, Cyclophilin A (PPIA), beta-2-macroglobulin

(B2M), beta-glucuronidase (GUSB), hypoxanthine ribosyltransferase (HPRT),..
 Calibrator: a group for cross-comparison between groups/samples/treatments
Fold difference = 2-ΔΔCt

ΔCt sample - ΔCt calibrator = ΔΔCt
Ct GOIs - Ct norms = ΔCt sample
Ct GOIc - Ct normc = ΔCt calibrator
(GOI : gene of interest)
Real Time RT-PCR: Results
 Amplification curves
 Melting curves: confirm primer dimer formation or nonspecific product amplification
Regular/Nomral False
 Relative quantification (expression level): comparative Ct method
 ΔCt = Ct target – Ct endogeneous
 Normalize the gene expression level using endogenous control
Sample Target Ct Sample Endogen. Ct avg. Ct dCt

0 MyoD 31.5935 0 mGAPDH 27.96328 3.729259
0 MyoD 31.65247 0 mGAPDH 27.81967 27.86424 3.788225
0 MyoD 31.25355 0 mGAPDH 27.80977 3.389303
10 MyoD 32.0937 10 mGAPDH 27.92447 4.195533
10 MyoD 31.91023 10 mGAPDH 27.87521 27.89816 4.012069
10 MyoD 32.23438 10 mGAPDH 27.89482 4.336212
25 MyoD 30.61298 25 mGAPDH 26.9146 3.729655
25 MyoD 30.31296 25 mGAPDH 26.93517 26.88333 3.429635
25 MyoD 30.41562 25 mGAPDH 26.80021 3.532296
80 MyoD 28.3372 80 mGAPDH 25.28748 3.050723
80 MyoD 28.0189 80 mGAPDH 25.46225 25.28648 2.732417
80 MyoD 27.97952 80 mGAPDH 25.10971 2.693036
 Relative quantification (expression level): comparative Ct method
 ΔΔCt = ΔCt sample – ΔCt calibrator: Compare the expression level to the calibrator
 Fold-change in gene expression (relative expression level) = 2 -ΔΔCt
0 10 25 80
dCt-a 3.729258855 4.195533 3.729655 3.050723 calibrator
dCt-b 3.788224538 4.012069 3.429635 2.732417
dCt-c 3.389302572 4.336212 3.532296 2.693036
`
avg. dCt 3.635595322 4.181271 3.563862 2.825392
ddCt-a 0.093663534 0.559938 0.09406 -0.58487
ddCt-b 0.152629217 0.376474 -0.20596 -0.90318
ddCt-c -0.24629275 0.700616 -0.1033 -0.94256
exp. Level a 0.937139982 0.678331 0.936883 1.499906
exp. Level b 0.899609489 0.770318 1.153454 1.870182 `
exp. Level c 1.186155168 0.615309 1.074227 1.921935
avg. exp. 1.00763488 0.687986 1.054855 1.764008
std. exp. 0.155737775 0.077954 0.109578 0.230178
Real Time RT-PCR: Trouble shooting
 Errors
 Abnormal amplification
• Sigmoidal curve
• Too low baseline setting
• High level of fluorescent noise during early cycles of PCR
 Late or no amplification
• Poor qualify RNA sample
• Good RNA : A260/A280 close to 2.0
• A260/A280 1.8 suggests there is about 70~80% proteins that inhibit PCR
• Not enough template sequence : Increase the amount of template / pre-amplify the target
sequence
• Poor reverse transcription : RT inhibitors / not optimal input amount of RNA
 No template control (NTC) positive amplification
(1) Contamination on reactions

 Random contamination (various CT values)
 or reagent contamination (close CT values)
 Use clean workplace, separate working areas for PCR mix prep.
(2) Primer dimer formation (SYBR® Green dye)
Primer dimer peak

(70~75 °C)
Real Time RT-PCR: Representative applications
1) Encapsulated ADSCs could be differentiated

into chondrocytes (관절세포) by exogenously
delivered Insulin-like Growth Factor-1 (IGF-1)
2) There are representative marker genes to

indicate chondrogenic differentiation of stem
` cells
 Marker genes
• Collagen type I:
hypertrophic/Fibrous cartilage
• Collagen type II: hyaluronic/articular
cartilage tissue formation
• Aggrecan: cartilage-specific
proteoglycan core protein or
chondroitin sulfate proteoglycan
• Sox-9: Transcription factor
 Formulation
 1) GM: hydrogel containing only ADSCs in general media (Calibrator group; Fold change = 1)
 2) CM: hydrogel containing ADSCs in chondrogenic media
 3) CI: hydrogel containing ADSCs and IGF-1 in chondrogenic media
 4) CIC: hydrogel containing ADSCs and encapsulated IGF-1 in Coa
 Time point
 Day 14 & 21 (up to 3 weeks in culture)
 Relative Expression
 The levels of all groups were already normalized with GAPDH (housekeeping gene =
endogenous control), ΔCt = Ct target – Ct endogeneous
 As compared with the level of calibrator group (i.e., GM: hydrogel containing only ADSCs in
general media)
 Rerelative expression level: 2 -ΔΔCt
 Fold change (기준 대비 …배)
 ΔΔCt = ΔCt calibrator – ΔCt comparison group
PART III: Flow Cytometry

Flow Cytometry (유세포분석기)
 Conventional optical microscope: Observation of cell morphology + additional staining
 Limitations:
• similar cell shapes in 2D
• Other factors: transmembrane protein complex, cytokines, transcription factors in cytoplasm
 Needs for (1) observing expressed proteins in cellular surface and (2) quantifying expression levels
 Requires the use of fluorochrome-conjugated antibody
 Single-cell level quantification can distinguish an individual cell in population
https://www.ibric.org/myboard/read.php?Board=news&id=318609&ksr=1&FindText=FACS
Flow Cytometry (유세포분석기)
 a laser-based, biophysical technology employed in (1) cell counting, (2) sorting, and (3) biomarker
detection on cell surface
 by suspending cells in a stream of fluid and passing them by an electronic detection apparatus
 allows simultaneous multi-parametric analysis of the physical and chemical characteristics of up
to thousands of particles per second
 Fluidics + Optics + Electronics

 Cell staining using fluorophore-conjugated antibody (This antibody targets specific marker or
protein on the cell)
 Passing the cell suspension through the channel
 Laser light meets cellular particles
 Scattered light from all cells detected (FSC, SSC)
 Emitted light from stained cells detected
 Charger assigner select charged sample separately
 Video tutorial: https://youtu.be/mcnFTjcmykE
Flow Cytometry Basic Principle 01: Single cell measurement
 Flow: an individual cell flow through the channel (one by one)
 Cytometry: cell analysis
 Utilize fluorescence
 Ex) CD4+ CD25- = a cell expressed with CD4, but not CD25
 Prepare stained cell population with fluorochrome-conjugated antibodies (which targets CD4 and
CD25) + analyze how many cells are detected
CD4+ CD25-: 28% (2 out of 7 cells)
Flow Cytometry Basic Principle 02: Fluorescence (형광)
 General observation of visible light
• Light source (광원)
• Visible light (from sun) touches an object + reflection + recognize the reflected light with
specific wavelength by eyes
• Ex) imagine all red-colored objects in a dark room
 Fluorescence
• Light with a spectrum (Excitation spectrum) touches a fluorephore
• The fluorephore reacts with a specific wavelength (or a specific energy) of the light
• The fluorephore then emits its own light, which corresponds with the wavelength (Emission
spectrum)
 In flow cytometry
• Laser radiation
• fluorochrome-conjugated antibodies bound onto cell surfaces react
• Emission its own light with specific wavelength
• The instrument detect the intensity of emitted light (= the presence and amount of
antibodies)
Flow Cytometry Basic Principle 02: Fluorescence (형광)
Experiments 01: Marker Analysis
 Analyze the expressed proteins or markers
 Identify the type of cell
 Targets
• A) membrane proteins (Primary!)
• B) Transcription factors
• C) Cytokines: Secretory protein, could be cumulated in cytoplasm by protein transport
inhibitor
Experiments 01: Marker Analysis
 Example) Analysis of the amount of phosphorylated protein
 Mechanism
• Activation of CD4+ T cells
• Subsequent activation of MAPK signaling
• Phosphorylation of ERK protein
 Use fluorochrome-conjugated anti-phospho-ERK antibody
Experiments 02: Detection of Green Fluorescence Protein
 GFP detection + Tracking cellular plasticity (세포 가소성: 이전에 어떤 세포였는가?)
 Example
• Il17aCre Rosa26YFP mouse
• Cells that previously expressed IL-17A keep producing YFP (Yellow Fluorescent Protein)
• In animal models for multiple sclerosis (강직성 척수염), most CD4+ T cells expressing IFN-γ
come from Th17 cells expressing (or have expressed) IL-17A
Experiments 04: Cell Proliferation
 By using CFSE (Carboxyfluorescein succinimidyl ester) (a fluorescent cell staining dye)
 CFSE is cell permeable and covalently couples, via its succinimidyl group, to intracellular lysine
residues and other amine sources
 Staining cells with CFSE

 Cell division reduces the amount of CFSE in half (1/2n)
Experiments 05: Calcium concentration
 Detection of changes in calcium concentration in a cell
 By using calcium indicators
• Fluo-4, Fluo-5, Indo-1
• binding with calcium ions (increasing!) + modulation in fluorescence properties
• cell permeable
 Monitoring fluorescence intensity changed by calcium indicators
Experiments 06: FACS
 Fluorescence-activated cell sorting (FACS)
 a specialized type of flow cytometry
 It provides a method for sorting a heterogeneous mixture of cells into two or more
containers, one cell at a time, based upon the specific light scattering and
fluorescent characteristics of each cell
 a useful scientific instrument as it provides fast, objective and quantitative recording

of fluorescent signals from individual cells as well as physical separation of cells of
particular interest
 Additional apparatus provides electronic charge to cell-containing droplet, and

charged droplet will be attracted for separation
<Sorting>
 Scattered light from all cells detected (형광에 관계 없이!)

 FSC (Forward Scatter): relative SIZE (크기)
 SSC (Side Scatter): relative Granularity or Internal complexity (구조의 복잡성)
 Emitted light from stained cells detected: Fluorescent intensity

Three Populations
 Scattered light from all cells detected (형광에 관계 없이!)

 FSC (Forward Scatter): relative SIZE (크기)
 SSC (Side Scatter): relative Granularity or Internal complexity (구조의 복잡성)
 Video Tutorial: https://youtu.be/EQXPJ7eeesQ
<Histogram>
 FSC (Forward Scatter):

relative SIZE (크기)
 SSC (Side Scatter): relative
granularity or Internal
complexity (구조의
복잡성)
Dot Plot
Both p
ositive
Only CD45
Positive
Both n Only CD34

egative Positive
 Emitted light from stained cells detected: Fluorescent intensity

 CD34 (marker protein) conjugated FITC (green color fluorescence dye)
 CD45 (marker protein) conjugated PE (blue color fluorescence dye)
 Dot plot & Gating
 Higher # indicates higher fluorescent intensity of stained cellular particles

Thermo Fisher Flow Cytometry 교육자료
보통 혈액세포 기준으로 3,000 event 이상을 분석하는 것을 권장

Event 수가 많으면 많을 수록 정확도 높은 분석이 가능
분석 시의 충분한 event 수도 중요하지만 분석시의 설정하는 flow rate도 중요

low flow rate 일 수록 형광 intensity의 peak값의 CV값이 적어 resolution이 좋은 데이터를 얻을 수 있음
Voltage adjustment: Desired cell population into the center
H(Height)와 A(Area) 값 모두 형광의 intensity에 대한 파라미터
H: 단일세포가 레이저를 지날때 측정되는 Pulse의 높이 (Height), 세포가 가진 '최대 형광값'을 의미

A: Pulse의 면적값 (Area)을 의미, 세포가 레이저를 지나가는 동안에 측정된 '총 형광량' 값을 의미
원하는 세포 군집 확보 후, single cell만을 detection (doublet 제외)

H와 A 값은 일반적으로 정비례 (Single cell)
Singlet gating의 중요성!
각각의 형광의 파장에 따른 profile에서 overlap (=Spill over)
Compensation: overlap 부분을 제외해주는 과정 = PE 영역으로 넘어간 FITC 부분을 제외!
Compensation 필요함!
파장대의 겹침이 적다
형광이 겹치지 않은 Fluorophore 선택이 필요함
Compensation 과정
Negative/positive gating
대각선 100 보정값 직접 입력
나머지 0
Spill over 발생
Cell division마다 형광 intensity의 dilution
세포 죽으면 세포막의 Annexsin V 변화
ELISA와 유사하나, intracellular protein 측정 가능 (한 세포당 발현되는 단백질양)
Method: 세포막에 구멍 뚫어주고 antibody 넣어줌
Method: 세포의 핵막까지 구멍 뚫어주고 antibody 넣어줌
핵막까지 뚫어주는 FoxP3 buffer kit로 IL-4, IFNg 같은 intracellular cytokine을 staining해도 효율 양호

생체의학공학 - 03 - Stem cell engineering

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생체의학공학 - 03 - Stem cell engineering

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HUMAN MEDICAL BIOENGINEERING (Fall 2022)

PART I: Stem Cell Engineering

Dr. KYOBUM KIM

• Cell culture technique

• Stem cell differentiation

• Experimental techniques to evaluate cellular characteristics

(1) 동물세포 (animal cell): 동물의 몸을 구성하는 가장 작은 생체 단위

(1) 각 동물세포 내부에는 각종 세포내 소기관이 존재함

(2) 각 세포내 소기관은 각기 다른 역할을 하며 세포의 생장, 분화, 및 단백질 발현을 담당

(3) 핵 (nucleus)에 존재하는 유전정보로부터 특정 단백질의 발현이 가능함

(1) 핵 (nucleus): DNA를 포함한

(2) Central dogma:

(1) 동물세포는 세포막으로 둘러쌓여 있음 (Cellular membrane)

• 대부분의 고형 조직 유래의 세포는 단층으로 부착하여 증식

• 부착 세포는 바닥의 표면에 부착하기 전에 세포로부터 ECM 단백질이 합성 및 분

(1) 동물세포 배양 (animal/human cell culture)

• 대부분의 동물세포는 표면에 부착하여 생장

배양배지 (cell culture media)

• 일반적인 동물세포 배양의 기본조건 (중요!)

• 배양에 필요한 배지의 조성은 항상 최적화 필요

• 혈청(serum)과 같은 값비싼 성분이 필요

• 동물세포는 섬세한 지질이중층 막 (cellualr membrane)으로 둘러 쌓여 있어

• 동물세포는 일정한 세포수가 유지되어야 세포간 communiation이 잘 이루

• Lag phase: 세포의 생장이 시작되기 전 휴지단계

• Passage (계대 배양, subculture): 배양접시의 바닥을 꽉채운 세포를 떼어내어

• 일반적으로 부착 세포를 계대 배양할 경우에 배지를 제거하고 단층세포를 탈착하

• 세포의 탈착 후 세포를 모아서 적합한 배양 배지에 희석하여 배양함

• 그러나 예외적으로 일부 단층 세포들은 trypsin 처리로 충분히 탈착되지 않는다.

• 세포벽의 구조를 유지하는데 칼슘 이온이 필수적

• 따라서 일반적으로 Trypsin-EDTA 혼합액이 주로 사용됨

• 부유세포의 경우에는 유리제와 플라스틱제의 어느 쪽에도 문제가 없으나,

• 플라스틱제 배양기는 일반적으로 일회용으로서 세척, 멸균 등의 작업이 필요없다.

• 플라스틱제 배양기는 dish, flask, microwell plate, roller bottle 등의 여러가지

• 일반적인 부착세포 배양 조건에 필요한 배양배지

• 마이크로 캐리어를 이용한 CHO 세포배양은 난포자극 호르몬/바이러스 백신 생산

• Cell Factory (Thermo Fisher)

• 배양배지에 세포가 떠있는 상태 (suspension)로 배양

• 필요에 따라서 부착 세포이더라도 기계적으로 부유 상태를 유지하며 증식시킬 수

• 배양배지의 교반을 위한 Agitation (회전에 의한 배양액의 유동성) 필요

• 부유 세포 배양시 탈착 과정 (trypsin처리 등)을 필요로 하지 않음

• 세포를 유지하기 위해서는 주로 배양 세포를 희석시킴으로서, 또는 계대 배양없이

• 단백질 대량생산에 주로 이용됨

• 자기회전력을 이용한 혼합장치를 포함

• 대량생산 직전의 scale-up process에 주로

• Agitator와 heating/cooling 내부장치가

• Batch와 Continuous 리액터의 중간 형태

• 신선한 배양배지가 지속적으로 관을 통해 공급 (Fresh media feed)

• 이러한 유전적 변이를 최소화하고, 세포 노화와 형질전환을 방지하는 등 세포주를 안

• 낮은 온도에서 세포를 얼린 후 장기간 보관

• Freezing medium: 70% 배양배지, 20% 혈청, ~10% DMSO

• 포함된 DMSO는 세포에 독성을 나타낼 수 있으므로 동결 조작은 신속히 진행

• 고밀도 (5x106-1x107 cells/ml)로 cryogenic vial에 저장한다.

• 동결시 감온 속도는 세포에 따라 다르며 보통 -1°C/min 속도로 동결한다. 이를 위해

• 나중에 액체 질소로 옮김으로써 동결 보존을 완료함.

• 액체 질소에 저장 상태인 동결 세포 vial은 액체 질소에서 꺼내는 즉시 37 - 40°C

• DMSO나 glycerol을 제거하기 위해, 2 - 3 분간 원심분리하여 상층액을 버리고

• 이때 보통의 계대 배양때보다 높은 세포 접종 밀도로 배양을 시작

(1) CO2 incubator

(1) Clean Bench

(2) 초순수 물 제조장치

• 일반적인 액상 배지의 한 성분인 Sodium bicarbonate

• 따라서 동물 세포 배양에는 CO2 incubator가 필수적

• 대부분은 water jacket 형으로서 문의 개폐에 따르는 온도변화가 작고 복귀속도도