생물 공정용 세포 시스템

Prof. Jun-Seob Kim

개요

개요
• 의약품, 식품, 정밀 화학 제품 생산에 세포를 이용 생물 공정용 세포 시스템 (cell system
for bioprocess)은 기존의 화학 공정(chemical process) 에 비하여
 친환경적
 조효소(coenzyme) 첨가가 불필요
 원재료가 저렴
• 목적하는 산물의 종류에 따라 어떤 시스템을 결정할 지 그 선정 기준을 학습함
생물 공정용 세포 시스템
세포의 특징
• 세포 시스템을 이용해 원하는 물질을 생산하고자 할 때 장점
 빠른 생장 속도
 다양하고 편리한 유전자 발현 시스템
 저렴한 공정 단가

• 어떠한 세포를 생물 공정용 시스템으로 선택할 것인가

 벡터의 종류
 외래 유전자(target DNA)의 원천과 성질
 클로닝(cloning)의 목적 등
생물 공정용 세포 시스템

세포 공장
• 미생물, 곤충, 동물, 식물 등의 세포를 이용하여 목적하는 물질을 대량 생산하는 시스템
 다양한 학문의 융합
 생산성이 극대화된 세포를 활용한 생산 시스템
 세포 내 대사 경로의 면밀한 분석
 불필요한 대사 경로 제거
 목적 물질의 대량 생산이 가능하도록 대사 경로를 재설계
미생물 세포

미생물의 종류
• 미생물은 단세포나 균사로 구성, 분류학상 원생생물(Protists)
 원생생물= 원핵 세포(prokaryote), 진핵 세포(eukaryote)
 원핵 세포= 세균류(bacteria), 시아노박테리아류, 조류, 남조류
 진핵 세포= 일반 조류(algae), 원생동물(protozoa), 지의류(lichens), 균류(fungi)
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세균
• 대장균(Escherichia coli)
 생물공학의 발전과 함께 가장 먼저 이용된 미생물
 현재 가장 보편적으로 이용
 대장균을 대표하는 균주는 K-12, B, C, W 4가지
 생물공학적으로 가장 많이 사용되는 균주는 K-12와 BL21(B균주 유래)
 다양한 변이주들이 현재 개발되어 사용 중
미생물 세포

대장균(Escherichia coli)
• 장점
 유전적 특성 및 생리적 특성이 자세히 연구되어 있음
 다양한 변이주들이 개발되어 용도에 따라 필요한 균주를 이용할 수 있음
 생장 속도가 빠름
 고농도 배양(＞50g 건조 중량/L)이 가능
 적절한 프로모터를 이용할 때 높은 발현율(총 단백질의 약 25~50% 또는 그 이상)
 간단하고 값싼 배지의 사용으로 경제적임
미생물 세포
대장균(Escherichia coli)
• 단점
 단백질이 세포 밖으로 배출되지 않고 세포 내부에 고농도로 축적
 단백질 가수분해효소의 공격을 받음
 불용성인 내포체(inclusion body)로 엉김이 생김: 수용액상의 활성 단백질 생산에
제한
 여러 대사산물들이 배지에 축적. 세포 생장을 방해
 단백질 분리 정제 과정에서 세포벽에서 유래한 내독소(endotoxin 또는 발열성 물질
pyrogen)가 유출. 내독소는 리포다당류(lipopolysaccharide, LPS)로서 부작용을
유발
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대장균(Escherichia coli)
• 극복
 단백질 분비(secretion)와 배출(excretion)을 위해 시그널 펩타이드(signal
peptide ,신호 서열)를 융합
 내포체 형성을 억제하기 위해 저온에서 배양, 저농도의 단백질 발현 유도
물질(inducer)을 사용, 단백질 접힘을 돕는 샤페론(chaperone) 단백질을 함께 발현
 배지 내 아세트산의 축적을 방지하기 위해 포도당 용액의 공급 속도를 조절하는
유가식(fed-batch) 배양법 사용
 엄격한 분리 정제 공정 확립
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세균
• 바실러스(Bacillus)
 바실러스 서브틸러스 (Bacillus subtilis, 고초균)
 대표적인 호기성 그람 양성균
 단백질이 체외로 분비되는 특징
 막대형 간균
 이분법으로 분열
 산소와 영양분이 고갈되거나 고온에서 내생 포자(endospore)를 생성
미생물 세포

바실러스(Bacillus)
• B. subtilis 특징
 병원성이 없는 GRAS(generally recognized as safe) 균주
 폴리감마글루타메이트(polygammaglutamate, PGA)를 생성
 세탁 세제용 프로테이스 서브틸리신(subtilisin)을 대량 분비
 산업적 효소인 아밀레이스, 프로테이스 등을 생산
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바실러스(Bacillus)
• B. subtilis의 산업화를 가로막는 문제점
 다양하고 많은 양의 단백질 가수분해효소들을 생산하여 목적하는 단백질
생산물을 분해, 최종 생산 수율을 낮춤
 제한된 벡터 종류와 프로모터로 인해 유전자 조작이 어렵움
 플라스미드 불안정성(plasmid instability)이 대장균보다 높음
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세균
• 코리네박테리움
 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum)
 포자를 형성하지 않는 비운동성의 그람 양성균
 GRAS 균주
 원형의 염색체와 1개의 플라스미드가 있고 유전체 크기는 3.3백만(3.3Mb) 개 염기쌍
 세포 분열 직후 V자형 세포(snapping division)을 만듬
 세포벽이 두 층으로 되어 있으며, 세포 분열 시 내층만이 자람
미생물 세포

코리네박테리움
• 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum)
 Mycolata- 세포벽을 둘러싼 지질이 풍부한 세포 외피이며, 투과
장벽(permeability barrier) 역할을 함
 지질lipid 도메인은 30~36개의 탄소 원자와 비환원성 β-keto그룹을 가지고
있는 corynemycolic acid으로 구성되어 있음
미생물 세포

코리네박테리움
• 코리네박테리움 글루타미쿰 (C. glutamicum) 특징
 식품용으로 사용할 수 있는 안전한 균주
 포자 비형성
 빠른 성장 속도
 필수 영양소를 최소로 요구함
 세포 외로 단백질 가수분해효소를 분비하지 않아 단백질 분비 생산에 적합
 안정적인 유전체를 가짐
미생물 세포

세균
• 젖산균(lactic acid bacteria)
 빠른 속도로 젖산을 생성
 식품의 저장 기간을 연장
 식품에 향기, 물성, 그리고 영양학적으로 유익한 측면을 제공
 유가공 산업이나 김치 등의 채소 발효 산업에 흔히 이용
 Lactococcus, Lactobacillus, Leuconostoc, Oenococcus, Pediococcus,
그리고 Streptococcus가 많이 이용
미생물 세포

젖산균
• 특징
 식품에 사용하는 안정성
 대부분 장 건강에 유익한 프로바이오틱스 미생물

• 단점
 영양 요구성이 높아 복합 영양 배지에서 생육
 젖산 같은 유기산을 대량 생산하여 고농도 배양이 어려움
 유전자 재조합 기술이 타 균주에 비해 까다로움
미생물 세포
세균
• 클로스트리듐(Clostridium)
 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 (Clostridium acetobutylicum)
 극한의 환경(고온, 저온 및 영양소 부족 등)에서 내생 포자를 형성. 그람
양성 후벽균문(Firmicutes), 혐기성 세균
 석유 기반 연료를 대체할 수 있는 바이오부탄올 생산에 가장 적합한 균주
 발효를 위해 글루코스, 수크로스, 락토스, 자일로스, 자일란, 전분과 글리세롤 등
다양한 기질의 이용 가능
 목재나 생활 폐기물, 농업 폐기물 등 다양한 바이오매스도 발효를 위한 기질로 사용
가능
미생물 세포

세균
• 클로스트리듐(Clostridium) 단점
 산업적으로는 여전히 비싼 당밀molasses이 기질로 이용
 부탄올에 의한 피드백 저해와 이종 발효에 의해 부탄올의 생산성과 생산량이 낮음
 부탄올 회수 공정 비용이 비쌈
 Clostridium 속 균주에 의한 감염
미생물 세포
세균
• 방선균(Actinomycetes)
 그람 양성균
 토양, 하천, 해수에 널리 분포
 토양에서 방선균은 식물의 뿌리에 공생하여 질소를 고정하는 역할
 현재 생리 활성 물질 중 절반 이상이 방선균에서 유래. 특히 이차 대사산물로서
항생제를 생산
 여러 생리 활성 물질과 다양한 효소, 색소 등을 생산
 세포 내의 대사산물과 중간 산물이 풍부하여 천연 물질 생합성의 전구체로 이용
미생물 세포

방선균(Actinomycetes)
• 단점
 천연 물질 생합성에 필요한 전사와 대사의 조절이 복잡함
 생합성 기작의 이해도와 알려진 생합성 경로를 재구성할 수 있는 합리적인
가이드라인이 부족
 유전자 조작이 가능한 균주와 방법이 모두 제한적이며 효율도 낮은 편이고, 성장
속도가 느림
미생물 세포

방선균(Actinomycetes)
• 극복
 전구체 생산 방향으로 대사 흐름 조절
 경쟁 생합성 경로의 저해, 항생제 저항성 증가
 생합성 관련 유전자의 과발현
 게놈 셔플링(genome shuffling)
 이종 균주에서 생합성 유전자들의 클러스터(cluster)발현 전략
미생물 세포

방선균(Actinomycetes)
• 유전자 조작 효율을 높이기 위한 다양한 방법
 세포벽이 제거된 프로토플라스트 형질 전환법
 접합(Conjugation)법: 프로토플라스트 형질 전환법에 비해 높은 효율. 방선균에서
유전자 도입을 위한 표준 방법으로 사용
 형질 도입(transfection), 전기 천공법(electroporation)
미생물 세포

방선균(Actinomycetes)
 산업적으로 의약품, 건강식품, 항암제와 항생제, 효소, 색소 등의 생산에 이용
 대표적인 생산물은 항생제: 주요 생산 균주는 Streptomyces
 이차 대사산물로서 다양한 색의 색소를 생산: 대표적인 균주는 Streptomyces
virginiae
미생물 세포
진균
• 효모(Yeast)
 진핵 세포로 세포막과 세포벽을 가지며, 크기는 5~10μm로 세균보다 크고
효모 (Yeast)
출아법budding으로 분열 ✓ 진핵 세포로 세포막과 세포벽을 가지며,
크기는 5~10pm로 세균보다 크고 출아
법,udding으로 분열
 Saccharomyces cerevisiae는 식품 산업과 생물 공정에 사용 ✓ saccharomyces cerevisiae는 식품 산
업과 생물 공정에 사용
 Pichia pastoris와 Hansenula polymorpha는 생물 공정에 주로 사용
v Pichia pastoris와 Hansenula
polymorpha는 생물 공정에 주로
사용
 S. cerevisiae의 최적 pH는 4.5~5.5 v S. cerevisiae의 최적 pH는 4.5~5.5 ✓
광범위한 pH 조건에서 생존이 가능 ✓ 세균
보다 일반적으로 산에 강함
 광범위한 pH 조건에서 생존이 가능
 세균보다 일반적으로 산에 강함
 생장온도는 20~30°C. 세균보다 낮은 편
미생물 세포

진균
• 효모(Yeast)
 탄소원은 단당류와 이당류 이용
 가수분해효소가 없어 다당류를 대사하지 못함
 쌀과 같은 전분질을 이용하지 못함  술을 만드는 발효과정에서 가수분해효소를
누룩이나 맥아의 형태로 첨
 혐기 조건에서 에탄올 발효. 호기 조건에서 세포 증식
 따라서, 양조 발효는 혐기에서 진행하고 제빵효모(bakery yeast) 생산 공정은 호기
조건에서 진행
미생물 세포

효모
• S. cerevisiae 의 장점
 유전자 및 생리학적 충분한 정보
 발효 공정 기술이 개발되어 목적 단백질 생산에 이용
 식품에 사용할 수 있는 안전한 미생물(GRAS)
 고농도 세포 배양이 가능. 생장 속도가 빠름(대장균의 약 25%)
 세균보다 커서 발효 후 배지로부터 쉽게 회수
 세균에 비해 발현된 단백질에 당 첨가 반응glycosylation가능
미생물 세포

효모
• S. cerevisiae 의 단점
 발현 단백질에 첨가되는 당이 대부분 만노스(mannose)로 과다하게 첨가됨 
복잡한 당 사슬 구조를 가진 의약 단백질을 똑같이 생산하기는 어려움
 단백질의 발현량이 대장균에 비해 낮음
 세포 외 배출이 어려움
미생물 세포

효모
 효모 세포 시스템은 의약 단백질 등의 생산에 이용
 α –interferon, 인체 유래의 신경 성장 인자(nerve growth factor), 종양 괴사
인자(tumour necrosis factor), 인슐린, 알부민 등이 생산되고 HIV 백신, 히루딘,
hepatitis B virus surface antigen 등의 의약 단백질 생산
미생물 세포
진균
• 곰팡이
 절대 호기성(strict aerobic). 균사 형태로 세포 분열
 외생 포자(exospore)를 생성, 특징적인 색깔로 구분
 다양한 가수분해효소를 분비 (전분/섬유소 분해)
 Aspergillus속에는 A. oryzae, A. niger, A. awamori 등
 식품의 양조 및 장류 발효에 오랫동안 이용됨
 생물 공정 이용: A. nidulans와 Trichoderma reesei
 이 외에 거미줄곰팡이 Rhizopus속, 털곰팡이 Mucor속, 푸른곰팡이 Penicillium속
미생물 세포

진균
• 곰팡이 장점 및 극복 과제
 고수율로 단백질을 분비 생산
 번역 후 수식post-translational modification 과정이 효모에 비해 인체 시스템과 비슷
 GRAS 균주
 호기성이므로 고체 배양법이 주로 이용
 액체 배양 시에 효율 높은 산소 공급 장치를 필요
 균체가 덩어리로 자라며, 발현된 목적 단백질의 당 사슬이 인간의 구조와 동일하지
않다는 점
미생물 세포

진균
• 곰팡이
 사상성 진균류(A. niger, A. oryzae, A. awamori, T. reesei 등)
 전통적으로 돌연변이법으로 균주를 개량
 발효 식품, 효소, 항생제, 유기산, 색소 등의 대사산물 생산에 폭넓게 이용
 최근에 인간 항체(IgG)와 같은 의약 단백질도 생산 가능
곤충 세포

특징
• 대표적인 곤충 세포는 누에silkworm(Bombyx mori), 거염벌레fall armyworm(Spodoperda
frugiperda), 양배추 자벌레cabbage looper(Trichoplusia ni)에서 유래
• Ac NPV(Autofrapha californica nuclear polyhedrosis virus)라는 배큘로바이러스가
숙주세포로의 재조합 DNA 삽입을 위한 운반체로 사용됨
• 성충  식물성 사료를 제공하여 사육
• 개별 세포  발효기를 이용하여 현탁 배양하는 것이 가능.배양 최적 조건은 약 28˚C,
pH 6.2
곤충 세포

장/단점
• 목적 단백질의 번역 후 수식 과정
• 초기 시스템 확립의 편리성
• 동물 세포에 비해 번역 후 수식 과정이 아직 불완전
• 미생물 대량 배양 공정에 비해 산업화 공정 확립이 어렵움
• 인간유두종바이러스 백신인 서바릭스(Cervarix)
• 동물을 대상으로 한 백신으로 돼지콜레라바이러스 백신, PCV2 (porcine circovirus type
2) 백신 등
동물 세포

구조
• 크기(10~30 μm)와 모양(구형, 타원형)이 다양
• 원형질막(plasma membrane)으로 둘러싸여 있음
• 세포 표면은 음전기를 띠고 있음. 양전기를 띤 표면에서 자라려는 성향이 있음 (부착
의존성 세포anchorage-dependent cells).
• 하이브리도마(hybridoma) 세포는 부착 의존성을 가지지 않으며, 현탁 배양(suspension
culture)에서 생장
• 소포체(endoplasmic reticulum, ER): 단백질 합성과 번역 후 과정의 초기 단계에
결정적으로 중요
동물 세포
구조
• 미토콘드리아- 호흡의 장소. ATP 대량 생산
• 리소좀(lysosome)- 단일막으로 싸인 작은 세포질 내 소기관. 다양한 가수분해효소를
포함. 섭취된 기질 입자 소화
• 골지체(Golgi body)- 복잡한 당 첨가 반응을 완성. 세포 외 단백질을 분비. 세포 내
단백질을 다른 세포 소기관으로 보내는 역할
• 핵(nucleus)- 핵 외피(nuclear envelope)를 형성하고 있는 두 개의 핵막(nuclear
membrane)에 의해 싸여있음. 핵은 염색체 DNA와 핵인(nucleolus)이라고 불리는
몇몇의 어두운 색의 알갱이 구조 보유
• 세포 골격(cytoskeleton) 또는 단백질 필라멘트(filament)의 시스템-세포에 기계적 힘을
제공. 세포 모양을 고정. 세포의 움직임을 인도
동물 세포

종류
• 일반적으로 포유동물 세포(mammalian cells) 배양을 의미
• 1차 배양 세포- 조직으로 직접 얻은 세포
• 2차 배양 세포- 1차 배양 세포로부터 얻은 세포 계통(cell line)
• 하이브리도마 세포- 불멸성으로 유도하기 위해 골수종(myeloma) (암)세포와 융합.
연속적으로 분열가능
• 햄스터 난소 세포(Chinese hamster ovary cells, CHO cells)- 일반적으로 사용하는
포유동물 세포. 주요 단백질 생산용 숙주세포
• 포유동물 세포에 유전자 재조합 처리를 하기 위해 사용되는 벡터는 보통
영장류(primate)의 바이러스
동물 세포

배양 방법
• 동물 세포 배양의 전형적인 배지: 탄소원, 질소원, 혈청, 비타민 미량 원소, 완충제, 무기
염류 등을 포함
동물 세포

배양 방법
• 동물 세포 배양: 체외(in vitro) 에서 인공적으로 체내(in vivo) 와 유사한 조건을 제공하여
세포를 대량 증식시키는 방법
• 단층 부착(monolayer attachment) 상태나 현탁(suspension) 상태로 생장
 1차 배양 또는 초대 배양- 동물 세포를 배양하기 위해 떼어 낸 조직들을 무균 상태에서 T-플라스크나
롤러병(roller bottle)에서 생장
 1차 배양 세포(primary cell line)- 1차 배양으로 얻어지는 세포, 부착 의존성 세포(anchorage-
dependent cell)
 2차 배양 세포(secondary culture)- 1차 배양 세포로부터 얻은 세포 계통(cell line),
골수종myeloma(암) 세포와 융합하여 하이브리도마 세포 제작
동물 세포

배양 방법
• 동물 세포 배양에 필요한 장치
 무균 실험대(clean bench), 이산화탄소 배양기(CO2 incubator), 원심 분리기, 도립
현미경(inverted lens microscope)
동물 세포

장/단점
• 다양한 외부 유전자 발현 시스템이 개발되어 있음
• 단백질 발현에 있어서 복잡한 번역 후 수식이 가능하여 인체에서 활성을 갖는 단백질을
생산
• 발효기를 사용하여 생산 규모를 확대
• CHO 세포의 경우 그 안전성이 잘 입증되어 있어 이 세포로부터의 생산물 승인이 쉬운
편임
동물 세포

장/단점
• 생장 속도가 미생물에 비하여 매우 느림
• 생산성이 낮고 배양 도중 미생물에 의해 오염되기 쉬움
• 배양에 필요한 배지의 조성이 완전하게 알려져 있지 않고, 혈청serum과 같은 값비싼
성분을 요구
• 부드러운 플라스마막(plasma membrane)으로 둘러싸여 있음  전단력(shearforce)에
약함 산소 공급 목적의 심한 교반을 피해야
• 벡터의 발현율이 비교적 낮아 전체 단백질의 1~5% 범위에서 생산
동물 세포

산업적 이용
• 효소, 호르몬, 백신, 면역 조절 인자, 항암제 등 여러 종류의 의료용 치료
단백질을 생산하는 것
• 장기나 조직을 만들어 내는 것
• 번역 후 수식을 많이 요구하는 단백질  생산 비용이 많이 소요되더라도 동물
세포를 이용하여 생산
식물 세포

특징
• 특성이 밝혀진 일부 식물에서 많은 중요한 물질(예, 120가지 이상의 처방약)을
생산
• 식물생산품: 의약품, 염료, 식용 향료, 향수, 살충제, 제초제 등. * 화학합성으로
대체할 수 없을 정도의 복잡성
• 전체 형성능(totipotency)- 식물plant 세포가 미분화 상태라도 계속 배양하면
분화(differentiation)되고 기관화(organization)될 수 있는 능력
식물 세포

배양 방법
• 외식편(explants, 잎, 줄기, 뿌리 ) 조직(tissue) 
하이포아염소산나트륨(sodium hypochlorite, NaClO) 용액을 이용하여 표면
멸균  멸균된 외식편은 고체배지 위에서 배양  캘러스(단세포 집합)를
유도
식물 세포

배양 배지
• 탄소원으로 주로 설탕(sucrose)을 사용: 식물체 내에서는 당이 수크로스 형태로
이동하기 때문. 포도당(glucose)과 젖당(lactose), 또는 서로 다른 당들을
혼합한 경우
• 질소원으로는 질산 이온 (NO3-)과 암모늄 이온(NH4+)이 주로 이용
• 인산: 세포 성장의 제한 요소로 작용함
• 주로 사용되는 호르몬은 옥신 (auxin)과 사이토키닌 (cytokinin)
• 유도체(elicitor)- 2차 대사산물의 생합성을 촉진시키는 물질
• 생물적 유도체(biotic elicitor), 무생물적 유도체(abiotic elicitor)
식물 세포

배양 공정
• 캘러스 단편을 진탕 배양기(shake flask)의 액체 배지에  천천히 교반하면
세포와 세포 덩어리가 떨어짐  27˚C와 pH 5.5 조건에서 계속 배양  현탁
세포들은 복제 시작  2~3주 후에 현탁된 세포를 새 배지로 옮김  큰
덩어리와 나머지 캘러스는 제거

• 생장을 위한 탄소원과 에너지원으로서 외부에서 공급되는 수크로스나

포도당에 의존
• 호흡률은 0.5 mmol O2/h·g 건 조 중량 또는 대장균의 약 5~15%
식물 세포

장/단점
• 식물에서 알려진 천연 화합물의 수는 미생물의 경우보다 약 4배 이상 많음
• 매년 1,500개 이상의 새로운 화학 구조를 가진 신물질이 식물로부터 발견
• 식물 바이러스들은 인간에게 감염성이 없음  내재성 바이러스나 프라이온에
대해 안전함
식물 세포

장/단점
• 목적 물질의 낮은 생산성
• 식물 세포의 느린 성장 속도
• 식물 세포의 배양 기간 중 불안정성
• 대량 배양의 어려움
• 목적 물질의 회수 및 정제의 어려움 등
• 종종 발현 수준이 낮다
• N-결합 당 첨가 반응이 불완전
• 산업적으로 사용하는데 장기간(30개월)이 걸림
조류(수생생물)

특징
• 조류藻類, algae
• 육상 식물을 제외한 모든 광합성 생물의 통칭
• 구분하는 주된 기준: 광합성 색소와 편모의 구조
 단세포성 미세조류microalgae: 식물 플랑크톤
 다세포성 대형 조류macroalgae: 녹조류, 홍조류, 그리고 황색
• 조류의 일부인 갈조류
조류(수생생물)

특징
• 광합성 효율이 낮음
• 일반 미생물에 비해 성장 속도가 느림
• 바이오매스 회수, 탈수, 추출 등의 후처리 공정에서 높은 에너지의 투입이
필요하여 경제적 비용이 발생
• 생산성이 높은 신종 발굴
• 유전공학적 방법을 통해 생산 효율의 증대
• 효율적이고 경제적인 배양 방법의 개발
세포시스템 선정 지침
다양한 세포 시스템의 특징
• 생물 공정의 성패는 (1)세포와 (2)발현 시스템의 선택에 달려 있으므로, 공정 설계 초기에 본
시스템을 신중히 검토하고 선정한다
세포시스템 선정 지침
고려사항
• 단백질 생산물의 번역 후 수식의 필요여부
• 생산물이 식품에 사용될 것인지의 여부
• 1차 선발한 세포 시스템이 한 개 이상의 복수라면 그 다음은 경제성을 평가
(균체 성장 속도, 배양 배지 비용, 발현율, 세포 외 배출 여부, 단백질 접힘 효율
등 생물 공정 효율성을 전체적으로 고려)
Q&A