목련에 존재하는 미생물에 대한 연구

김북일1
1
북일고등학교 2학년

A Survey Study on the Microorganism from Magnolia

Bugil Kim1
1
Second Grade, Bugil Academy, Chungcheongnam-do 330-992, Korea

ABSTRACT : Microorganism lives anywhere, even in bodies of animals, and the kind of them
is various. Because researchers incubate microorganism with simple plates, the microorganism is
used to research of biology. In this survey study class, Biotechnology(Bio), we survey on the
microorganism for one semester. We got a sample, magnolia’s bud, and surveyed microorganisms
which existed in them with LB mediums, and distinguished the kind of microorganism. I found
the ‘curtobacterium’ which lives in the plants, and occur the disease of plants that leaves are
decayed.

서 론 미생물이란?
미생물은 매우 작아서 눈으로는 볼 수 없는 아주
작은 생물이라는 뜻이다. 미생물의 종류는 세균, 시
미생물은 우리 주변 환경뿐만 아니라 동물들의 원세균, 원생동물, 조류, 곰팡이, 바이러스, 비로이
몸속에도 살고 있으며, 그 종류도 매우 다양하다. 드, 프리온 등 살아있는 생물체와 살아있는 생물체
미생물은 간단하게 배지를 제작하여 쉽게 배양가능 라 할 수 없는 물질들을 포함한다. 이러한 미생물은
하기 때문에 유전 현상 등 복잡한 생명 현상을 연 지구상 어디든지 존재하고 있으며 우리 몸속에도
구하는데 널리 이용되고 있다. 과제연구 “생명공학 수많은 미생물이 살고 있으며 우리의 건강에 영향
(바이오)”는 이러한 미생물이 존재하는 시료를 직 을 미친다. 현재 살고 있는 사회는 미생물과 더불어
접 채취하여서 그 속에 어떠한 세균이 있는지 판별 살아가는 사회라 말할 수도 있다. 미생물은 1674년
하는 실험 위주로 진행되는 아주 흥미로운 수업이 안토니오 반 루벤후크의 현미경 발명으로 활발한
었다. 과제연구를 시작하기 전에는 아주 기초적인 연구가 시작되었다.
실험 준비물인 배지, 마이크로피펫 등을 알지 못하
였지만 이 분야의 전문가 박사님께서 직접 가르쳐
주셔서 쉽게 이해할 수 있었다. 그러다 설명을 해주
셨지만 이해가 되지 않는 부분은 인터넷을 통해 찾
아보는 기회가 되어 지식을 한층 더 쌓을 수 있는
기회가 되었다. 미생물을 연구하는데 아주 기초적인
실험 방법인 ‘조직 배양법’이 있다는 것을 알 수
있었고, 각각의 세균마다 특징이 있어 세균 마다 LB
Fig. 1 미생물
배지, MSA 배지 등의 선택배지가 있다는 것도 알게
되었다.
그람염색이란?

1
그람염색은 1884년 덴마크의 의사 그람이 고안한
특수 염색법으로, 이때 보라색으로 염색되는 것은
PCR(Polymerase chain reaction), 전기영동
그람양성균, 붉은 색으로 염색되는 것은 그람음성균
‘PCR(Polymerase chain reaction)’은 1985년 캐리
이다. 이러한 차이를 보이는 이뉴는 그람양성균은
멀리스에 의해 개발되었으며 현재 유전물질을 조작
세포벽의 성분 대부분이 펩티도글리칸이라는 특수
하여 실험하는 거의 모든 과정에서 사용하고 있는
한 성분으로 구성되어 있어, 이로 인해 1차 염색 후
검사법으로, 검출을 원하는 특정 유전물질을 증폭하
탈색제를 뿌려줘도 탈색이 되지 않는다. 반면 그람
는 방법이다.
음성균은 세포벽이 펩티도글리칸이 아닌 셀룰로스
전기영동은 전기영동 장치를 이용하여(Fig. 4 참고)
와 같은 다른 성분으로 구성되어 있어 1차 염색 후
DNA 절편을 크기별로 분리시킬 때 사용하는 것으
탈색제를 뿌리면 탈색이 되어 2차 염색 때 그 색으
로 Agarose나 acrylarmide로 만든 젤을 이용한다.
로 염색된다.
DNA 절편 크기가 작을수록 DNA의 이동속도가 빠
르며 Ethidium bromdie로 염색 후 자외선에서 형광
관찰을 해야 한다. 이때 DNA는 +방향으로 움직인
것을 확인 가능하다.

Fig. 2 그람음·양성균의 각 단계의 색변화

배지, 선택배지
‘배지’는 미생물이나 동식물의 조직을 배양하
기 위하여 배양체가 필요로 하는 영양물질을 주성 Fig. 4 전기영동 장치
분으로 하고, 다시 특수한 목적을 위한 물질을 넣어
혼합한 것이다. 생존·발육에 불가결한 물을 비롯하
여 영양물질로서 탄소원·질소원·무기염류·발육
인자(비타민류) 등을 공급해준다. 이러한 배지는 형 본 론
태에 따라서 액체 배지와 고체 배지로 나뉜다. 이둘
의 차이점은 배지를 제작할 당시 Agar라는 배지를
이제 미생물에 대한 의의와 이를 이용한 실험에
굳히게 해주는 물질을 넣는지 안 넣는지 가이다. 배
대한 간단한 이론을 파악하였으니 본론으로 들어가
지 중에서 특정한 세균만을 선택적으로 증식시키기
과제연구 생명공학(바이오)에서 한 학기동안 진행하
위해 사용하는 배지를 ‘선택배지’라고 한다.
여 과연 어떠한 미생물이 관찰되었는지 확인해보도
록 하자.

실험 재료 및 방법(Materials and Method)

미생물을 채취하기전 미생물을 키울 LB배지를 제
작한다. LB배지를 제작하기 위해서는 LB배지 분말
20g, 증류수 1L, 멸균기, 은박지, 마그네틱바, 핫플
레이트가 필요하다. 배지 제작은 LB 배지 분말 20g
을 증류수가 1L가 담긴 삼각플라스크에 넣고 마그
네틱바를 넣어 핫플레이트를 이용하여 고르게 섞어
준다. 그 후 입구는 은박지로 감싼 후, 고압증기멸
균기 121°C 15파운드에서 15분간 멸균한다. 40°C
Fig. 3 여러 가지 배지
정도로 식으면 클린벤치에서 알코올램프에 옆에서

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멸균된 페트리접시에 배지를 약 20ml씩 붓는다. 배
지가 식으면 나중에 생기는 습기에 의해서 배지가
오염되는 것을 막기 위해 뒤집어서 보관한다.
세균을 배양하기 위해서 천호지로 가서 각 조별로
시료를 직접 수집하였다. 우리 조는 목련꽃을 수집
하였다. 그 뒤 세균을 배양하기 위해서 마이크로 피
펫, 50ml Conical Tube, 스프레더, Incubator, Vortex,
Fig. 5 세균 배양 과정
알코올램프, 알코올, LB배지를 준비한다. 실험 과정
순수 분리는 배양시킨 세균들을 정확하게 관찰하
으로는 Conical Tube에 시료와 증류수를 넣는다. 그
기 위해서 진행하는 과정으로 이를 진행하기 위해
뒤 Vortex로 2분 동안 섞어 균이 증류수에 잘 섞이
서 루프, 알코올램프, 세균배지, 배지를 준비한다.
게 한다. 100μL를 마이크로피펫을 이용하여 배지에
세균 배지에서 Single Colony를 하나 따서 새 배지
뿌려준 뒤 화염소독한 스프레더로 고르게 도말해준
에 획선평판법을 하여 순수 분리를 한다. 그 뒤
다. 랩으로 실링 한 수, 세균배지에 배지종류, 날짜,
랩으로 실링을 한 후 마찬가지로 25도 Incubator
시료를 적어둔 후 25도 Incubator에서 세균이 자랄
에서 배양시켜준다. 정확한 결과를 위해서 총 세
때까지 배양시켜준다.
차례에 걸쳐서 순수 분리를 진행하였다.

세균들의 특성을 파악하기 위해서 선택배지를 이

용하여 그 특성을 파악하였다. MAC 배지, EMB 배
지, MSA 배지 총 3가지 배지를 사용하였다. MSA배
지는 대조군으로 포도상구균을 선택하였고 MAC배
지와 EMB배지는 대조군으로 대장균을 선택하였다.
Fig. 8 MSA배지 Fig. 9 EMB배지 Fig. 10 MAC배지
PCR은 직접 진행하지는 않았지만 PCR과정은 다음
과 같다.
1. Denaturation – ATGC 염기서열 배열이 2가닥으
로 되어있는 이중 나선 구조인 DNA를 95도에서
15~30초간 처리하여 단일 가닥의 DNA로 해리시
킨다.
2. Annealing – 단일가닥 DNA와 primer를 시험관에
함께 넣고 적정온도(55도 30초)로 낮추면 2종의
primer는 각각 상보적인 한 가닥의 주형 DNA와
결합하게 되는데 양쪽 끝 방향에 dNTP에 의해서
primer가 결합된다. 앞쪽을 forward primer, 뒤쪽
을 reverse primer라 한다.
3. Extension – dNTP를 넣어주면 DNA polymerase가
작용하여 primer가 연장, 중합하게 된다. 대부분
의 경우 연장 단계를 25~35순환 진행한다. 72도
에서 30초 정도 연장한다.
PCR 동정 과정과 전기영동은 직접 진행하였다.
PCR 동정 과정은 마이크로피펫으로 튜브에 세균 시
Fig. 6 순수 분리
그람염색을 하기 위해서는 증류수, 크리스탈 바
이올렛, 사프라닌, 요오드, 알코올, 슬라이드 글라
스, 커버글라스, 알코올램프, 루프가 필요하다. 실
험 과정으로는 깨끗한 슬라이드 글라스 위에 증류
수 한 방울을 떨어뜨리고 그 위에 순수 분리된 세
균을 풀어준다. 알코올램프 위에서 좌우로 흔들면
서 말려준 후, 크리스탈 바이올렛으로 1분간 1차
염색을 해준다. 그 뒤 슬라이드 글라스 뒷면을 흐
르는 물에 씻고, 알코올램프 위에서 말려준다. 요
오드을 한 방울 뿌린 후 위의 과정을 반복한다.
알코올을 한 방울을 뿌려 탈색을 시켜주고 위의
과정을 반복한다. 마지막으로 사프라닌으로 1분간
2차 염색을 시켜준 후 마찬가지로 위의 과정을 반
복하고 증류수 한 방울을 떨어뜨린 후 커버 글라
스를 덮어 세균을 관찰한다.
Fig. 7 그람염색 과정
료 3마이크로리터, primer 각각 2마이크로리터, 증
류수 13마이크로리터, taq polymerase 20마이르코리
터 총 40마이크로리터를 만들었다. 그 후 agarose로
만들 젤을 이용하여 전영영동을 진행하여 원만하게
움직인 DNA샘플만 PCR product purification을 진행

3
하였다. 센터(ncbi)홈페이지에서 어떤 세균인지 확인한다.

Fig. 11
taq polymerase Fig. 12 전기영동
Fig. 16 염기서열

Fig. 13 PCR 과정
Fig. 17 sequence

결과(Data&Results)
LB배지 제작한 결과 아래와 같이 고체 LB배지가
만들어졌다.(Fig. 18 참고)

Fig. 14 전기영동 과정
PCR product purification의 과정은 다음의 사진과
같다.
Fig. 18 LB배지
세균을 배양한 결과 LB배지에서 곰팡이와 세균이
모두 자랐으며, 세균은 돔 형태의 colony 군체를 형
성하고 있고 곰팡이는 솜털처럼 퍼진 원 형태를 이
루고 있다.

Fig. 15 PCR product purification 과정

마지막 실험은 염기서열 분석이 완료된 파일 518F
와 800R 두 개를 가지고 유전자 분석을 통하여 어
떤 종류의 세균인지 밝혀내는 실험이었다. 518F는
정상 방향, 800R은 반대 방향으로 800R을 뒤집어서
공통부분을 찾고 두 개를 연결한다. 이 때 파일을
분석 할 때 위의 네모에 색깔이 가득 채워져 있어
야 sequence가 정확한 것으로 잘 되지 않은 앞부분 Fig. 19 세균 배양 결과
과 뒷부분은 지워버린다. 그 뒤 미국 국립생물정보

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배양된 세균을 순수 배양한 결과 처음처럼 여러
종류의 세균이 한 배지에서 발견된 것이 아니라 한
가지의 세균만 발견되었다.(Fig. 20 참고)
Fig. 20 순수분리결과
그람염색의 결과 그람양성균은 크리스탈 바이올렛
에 의해 보라색으로 염색되었고, 그람음성균은 사프
라닌에 의해 붉은색으로 염색되었다.
Bacillus(대장균)은 보라색을 띄어 그람양성균이라는
결과를 보였다.
Fig. 21 Bacillus 현미경 관찰
선택배지에서의 결과는 명확한 차이를
MSA배지에서는 대조군으로 설정한 포도상구균이 자
라면서 붉은색이었던 배지 색이 노랗게 변한 것이
관찰되었고 나머지 3종류의 세균이 배양된 부분은
변함이 없었다. MAC배지에서는 대조군으로 설정한
대장균은 분홍색으로 세균이 자랐지만 나머지 3종
류의 실험군들은 자라지 않았다. EBM배지에서도 마
찬가지로 대조군으로 설정한 대장균은 연두색으로
자랐지만, 나머지 3종류의 실험군들은 자라지 않았
다.
Fig. 22 선택배지 결과
전기영동 결과 우리 조 5명의 것 중에서 1개만이
성공하여 PCR product purification을 진행하였다.
(Fig. 23 참고)
Fig. 23 전기영동 결과
PCR product purification까지 진행하여 DNA의 염
기서열을 분석한 결과 curtobacterium이라는 세균으
로 판별되었다.
내가 한
PCR product purification까지 진행하여 DNA의 염
기서열을 분석한 결과 curtobacterium이라는 세균으
로 판별 되었다.
Fig. 24 결과
결 론
보였다. 1학기 동안 과제연구 ‘생명공학(바이오)’에서 진
행한 실험을 통해서 최종적으로 목련의 꽃봉우리에
는 curtobacterium이라는 세균이 있는 것을 확인하
였다. curtobacterium은 방선균의 세균으로써 그람양
성균을 띈다. 이 세균은 병해충으로 식물의 입이나
꽃 등 식물 주위에 살고 있으며 사진과 같은 잎이
썩어버리는 병을 발생시킨다. 과제연구 ‘생명공학
(바이오)’를 통해서 아주 기초적인 배지 만들기부
터, 미생물의 종류를 판별하는 실험까지 알게 되어
지식을 한 층 더 쌓는 기회가 되었으며, 기회가 되
면 여러 종류의 시료들을 관찰하여 어떤 세균이 있
는지 판별하고 싶다는 생각도 들었다.(FIg. 25 참고)
5
Fig. 25 curtobacterium에 의해 병든 식물 잎

참고문헌

네이버 백과사전
http://terms.naver.com/entry.nhn?docId=1620684&cid=
50317&categoryId=50317 - 선택배지
http://terms.naver.com/entry.nhn?docId=927698&mobil
e&cid=51007&categoryId=51007 - PCR
http://terms.naver.com/entry.nhn?docId=1068860&cid=
40942&categoryId=32330 - 그람염색

네이버 블로그
http://blog.naver.com/pinacocate?Redirect=Log&logNo
=220130702145 - 전기영동
http://blog.naver.com/pinacocate/220132101824
- PCR 과정

위키백과
https://en.wikipedia.org/wiki/Curtobacterium
-curtobacterium