연구결과서

팀명 panicmonster
잿빛곰팡이 및 상처로부터 식물을 보호하는 미생물
연구주제
반창고 제작
지도교사 이진희

학생 1. 김희원 2. 신은재
Wang, Xiaoqiang & Zhao, Dong-Lin & Shen, L. & Jing, C. & Zhang, Chengsheng. (2018). Application
and Mechanisms of Bacillus subtilis in Biological Control of Plant Disease. 10.1007/978-981-10-
8402-7_9.

γ-PGA를
https://scienceon.kisti.re.kr/commons/util/originalView.do?cn=JAKO201113663902152&
https://www.cheongdo.go.kr/open.content/farm/cyber.plant.hospital/pest.map/chili/blig
ht/08/default.aspxoCn=JAKO201113663902152&dbt=JAKO&journal=NJOU00296223

박유성, 안시은(2021) 달걀껍질 입자의 농도에 따른 연골 복원. 화학탐구프런티어.

(PDF) Application and Mechanisms of Bacillus subtilis in Biological Control of Plant

Disease (researchgate.net)
INDEX
1. 연구 동기 및 목적

2. 연구 과정 • 청국장에서 고초군 채취&

잿빛곰팡이에 대한 저항성 검증
• 고초균이 포함된 γ-PGA 채취
• γ-PGA 함유 식물 반창고 제작
• 반창고의 식물 상처 보호 효과 검증
• 반창고 제작 보완 및 상용화

3. 결론

4. 기대 효과
 탐구 동기

잿빛곰팡이
식량 손실↑

<청국장>
고초균 : 선점 효과
γ-PGA : 높은 점성
수지증
영양적 손실↑ 기존: 폐기물多/화학물질

고초균과 γ-PGA를 활용한 식물 반창고를 만들자!

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 연구 원리
고초균(Bacillus Subtilis )
• 폴리감마글루탐산(γ-PGA )분비 : 환경에 무해함, 점성 높음

• 극한 환경에 대한 내성이 매우 강함(아포 형태)

• 자라면서 포자 발아 및 미생물 생장 억제(선점 효과)

알긴산/히알루론산의 가교 결합 형성
- 칼슘 이온과의 치환 반응

← 고분자 고체

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청국장에서 고초균 채취
배양 후 colony 분리 PCR, 시퀀싱

Bacillus Subtilis (028-1)

(이하 ‘청국장 고초균‘)
*앞으로 ‘Bacillus
Subtilis’는 구매한
고초균 샘플을 지칭함

Bacillus Subtilis (028-1)

청국장 현탁액

Enterobacter hormaechei
잿빛곰팡이에 대한 저항성 검증

• 식염수에 잿빛곰팡이 균사 푼 후 UV-VIS로

OD600 측정
→ 5 x 10^6 CFU로 희석 후 도말
잿빛곰팡이(직접 배양)

1) 배지 환경

• PDA 배지에 잿빛곰팡이 균액 도말

• 청국장 고초균(앞에서 추출) 배양액 & Bacillus

Subtilis 배양액을
paper disc에 15μl, 30 μl, 45 μl, 60 μl씩 접종
 잿빛곰팡이에 대한 저항성 검증
2) 실제 과일 실험 결과 - 배지

• 사과, 복숭아, 자두, 살구 (나무에서 • Bacillus Subtilis가 자란 곳으로 곰팡

자라는 과일) 이가 더 이상 자라지 못함

• 반으로 잘라 잿빛곰팡이 균액 접종 • Bacillus Subtilis 의 항진균 효과(곰팡

→ 각각 청국장 고초균 배양액 / 이 저항성) 확인
Bacillus Subtilis 배양액 접종
 잿빛곰팡이에 대한 저항성 검증
실험 결과 잿빛곰팡이 : 흰색 균사 -> 검은색 균핵 형성

사과 살구 복숭아 자두

흰색+검은색
청국장
고초균

청국장에서 추출한
고초균과
Bacillus
Bacillus Subtilis는
Subtilis
흰색 곰팡이 생장 억제
효과가 있다!
검은색
대조군
다른 종의
곰팡이도 발생
항바이러스 효과 검증
• NZY 배지에 10^7/ml농도 박테리오파지 1μl + 청국장 고초균/Bacillus
Subtilis 배양액을 5μl , 10μl, 20 μl, 30μl, 40 μl씩 접종

5 10 20 5 10 20

30 40 30 40

청국장 고초균 Bacillus Subtilis

• 고초균 투여량이 많아질수록 플라크 수(≈바이러스 수)가 감소

• 청국장 고초균과 Bacillus Subtilis는 항바이러스 효과가 있다!

 고초균이 포함된 γ-PGA 채취
H𝐶𝑙 → 𝐶𝐻3 𝐶𝑂𝑂𝑁𝑎로 대체!
상층액
채취 pH 5로 적정 후
청국장 3𝑀 𝐻𝐶𝑙(𝑎𝑞) 0.1배 부피
현탁액 가함
12시간 정치
10000g, 40분간 원심분리

25000𝑔 → 10000𝑔로 대체!

25000g, 30분
원심분리
3시간 정치
γ-PGA 3배 부피의 에탄올 가함

배양 고초균 남아 있음!
고초균이 포함된 γ-PGA 채취
HPLC 분석
순수한 γ – PGA (구매)

• HCl 가한 후 가열하여
γ - PGA 가수분해

• 채취한 물질이
γ – PGA임을 확인

• γ - PGA 피크의
직접 채취한 γ - PGA
Rel.Area(%)=95.3058%
-> γ – PGA 순도 약 95%
γ-PGA가 함유된 식물 반창고 제작
실험 방법 고찰
기존 계획) DMEM + 알긴산나트륨 + 히알루론산 + CaCO3 + GDL, 나무에 감는 형식

가교 결합 많음  점성↓, 잘 감아지지 X
상처에 부착하는 형식
GDL CaCO3 /아밀로펙틴 추가

<사용한 물질의 비율>

반창고 베이스 15g + 희석 γ-PGA 0, 1, 2, 4g

* 희석 γ-PGA란 증류수 : γ-PGA =6 : 1로 녹인 것

γ-PGA가 함유된 식물 반창고 제작
부착력 실험

• 아크릴 판과 나무 판에 반창고 sample을 1.5g씩 올려놓음

• 각 판을 90˚, 180˚ 뒤집고 sample이 1cm 흘러내리는 시간/ 떨어지는 시간 측정

0g 1g 2g 4g
아크릴/90˚ 7:47 11:43 14:31 20:28

1 2 4
아크릴/180˚ 13:05 16:59 20:06 27:16
0 나무/90˚ 8:03 7:59 10:43 10:35
나무/180˚ 13:21 14:00 25:01 25:07
아크릴/180˚ 실험 모습 0g<1g<2g<4g 순으로 부착력 좋음
γ-PGA가 함유된 식물 반창고 제작
곰팡이 저항력 실험
균액이 오래돼서인지…잿빛곰팡이는
• PDA 배지 5개에 잿빛곰팡이 균액 도말 관측할 수 없었으나 다른 곰팡이 및
균 확인 가능
• 각 배지에 4가지의 반창고 sample을 1.5g씩 올려놓고 관찰

대조군 0 1 2 4

• γ – PGA 넣지 않은 반창고 위에만 곰팡이 발생

• γ –PGA 1g, 2g은 거의 차이가 없었으나 4g을 넣은 반창고 주변에는 다른

균이 자라지 못함 -> 항균 효과 확인
 반창고의 식물 상처 보호 효과 검증
• 앞 실험에서 (반창고 베이스 : γ-PGA = 15 : 4)가 가장 적합하다고 결정

• 벚나무, 매화나무, 대추나무에 1cm*1cm 크기의 상처를 각각 2개씩 낸 후,

둘 중 한 곳에만 식물 반창고로 상처를 덮음

• 부착 전 / 6일 후 상처 부위에서 균을 채취하여 PCR  부착 전후 균종 변화 관찰

←반창고 바른 직후
반창고의 식물 상처 보호 효과 검증
상처의 변화(7일 후)

반창고 O 반창고 X 반창고 O 반창고 X 반창고 X

반창고 O

매화나무 벚나무 대추나무

• 반창고가 상처 부위에서 투명하게 굳음 -> 상처 상태 확인 가능

• 벚나무에서 수지 억제 효과 확인
반창고의 식물 상처 보호 효과 검증
PCR 결과

분석 결과 반창고를 붙인
상처는 고초균이 확실히
우점종이 된 반면, 붙이지
않은 상처는 다양한 균이
계속 존재함

-> 반창고에 균에 의한
감염 방지 기능이 있다!
 반창고 제작 보완 및 상용화
앞 실험에서 발견한 문제점) 반창고가 약 4시간 뒤에 굳긴 하지만 잘 흘러내림

알긴산, 히알루론산의 가교결합 활용!

반창고의 표면에만 막이 형성되게 하면 어떨까?
→오호(Ooho)형으로 제작

사용 시 손에 묻지 않을 뿐만 아니라 부착력 변함 X, 잘 안 흘러내림

 반창고 제작 보완 및 상용화
소분하여 보급 가능, 상용화에 큰 이점 흘러내린 정도

10

흘러내린 길이(cm)
8
6
4
2
0
15 20 25 30 35 40
시간(분)
CaCl2 X CaCl2 O

얼린 다음 반응시키면 성형 가능! 수돗물에 보관

->이온에 의해 녹음 21
 결론
- 청국장에서 추출한 고초균은 항균 효과뿐만 아니라 곰팡이의 생장을 억제하는 효과
및 항바이러스 효과를 가진다.
- 청국장에서 고초균을 살린 γ –PGA를 추출하여 식물 반창고를 제작 및 보완하였다.
- 식물 반창고는 물리적인 보호뿐만 아니라 고초균을 부착 부위의 우점종으로 만들어
외부 감염을 차단하는 효과가 있다.

기대 효과

높은 경제성/ 환경 친화적/ 상품성 증가/

공정 과정 간소함 탄소중립 농업 폐기물 감소

식물 반창고는 식물을 보호할 뿐만 아니라 농업 생산량 증대와 농업 폐기물

감소에 기여한다!