목 차

Cl o s t r i d i u m d i f f i c i l e Cl i n i c al Pr o t o c o l

Cl o s t r i d i u m d i f f i c i l e To x i n A Cl i n i c al Pr o t o c o l

파상풍균 (Clo s tr i d iu m t etan i) 2

보툴리눔균 (Clo s tr i d iu m b o t u li n u m ) 3

가스괴저균 (Clo s tr i d iu m p er fr i n g en s) 3

식중독 발생 경로 4

독소 4

분리․정량 시험법 5

가스괴저균 액체 증균배지 6

가스괴저균 선택 배양배지 8

확인 시험 12

독소감별키트 14

부록 관련사진: 16
클로스트리디움
관련배지
보존 계대배양
, : Cooked Meat Medium CM81, Liver Broth CM77, RCM CM149, Thioglycolate Medium CM173

Tryptose-sulphite-Cycloserine(TSC) Agar CM 587+SR88

Tryptose-sulphite-Cycloserine(TSC) Agar with Egg Yolk CM 587+SR88+SR47

선택 : Oleandomycin-Polymyxin-Sulphadiazine Perfringens Agar(OPSP) CM543+SR76+SR77

Tryptone-Sulphite-Neomycin Agar(TSN)

확인 생산성 시험
m-CP Medium CM992+SR188

혐기성 시스템
: Enterotoxin , PET-RPLA TD930A

Anaerobic Jar 2.5L AG25A, 3.5L HP11A, Anaerogen 2.5L 용 AN25A, 3.5L 용 AN35A, Anaerobic Indicator BR55

아포를 형성하고 절대 혐기성 세균으로 예를 들어 토양이나 진흙 사람이나 동물의 소화기 등 광범위한 환경 ,

에 존재한다 몇몇 종은 부패된 환경을 선호하고 몇몇은 기회감염성 병원균이다 전형적으로 원형이며

. . 0.3-1.9

㎛이지만 구형 혹은 필라멘트형 혹은 나선형 등 다양할 수 있다 많은 종들은 기초배지에서 잘 자라지

X 2-10 , .

않고 예를 들어 그리고 혹은 를 요구한다 클로스트리디아 배양을 위

p-aminobenzoic acid, biotin / pantothenate .

해 사용되는 배지에는 그리고 가 있다

blood agar, cooked meat medium egg yolk agar .

사람의 질병과 관계가 있는 Clo str id iu m 의 종류

균 종 질병
C.perfringens
Bacteremia, myonecrosis( 가스괴저 ), soft tissue infections, 식중독 , enteritis

necroticans

C.tetani 파상풍
C.botulinum Food-bourne botulism, infact botulism, wound botulism

C.difficile Antibiotic-associated diarrhea, Antibiotic-associated pseudomembranous colitis

다른 Clostridium 종들 예
( , C.septicum, C.ramosum,
Bacteremia, myonecrosis, soft tissue infections
C.novyi, C.bifermentans)

1. 파상풍균 (Clo s tr i d iu m t etan i)

이 균을 최초로 확인한 것은 와 이 환자의 농을 토끼에 감염시킨 것이며 그 후Carlo Rattone(1884)

는 토양에서 얻은 균을 토끼와 마우스에 감염시키는데 성공했다 그 후

Nicolair(1884) 가이균 . Kitassato(1889)

을 혐기성 조건하에서 배양에 성공하여 균을 분리했다 .

형태
길이가 ～ ㎛ 폭이 ～ ㎛정도이고 그람양성 단재성 아포를 형성하여 약간의 운동성 있다
2 5 , 0.3 0.8 , .

- 2 -
배양
편성혐기성 상태에서 잘 자라고 최적 는 ～ 이며 이상의 산성 및 알칼리에서 증식하지 못한다 보통 pH 6.9 7.4 , .

한천배지에서 잘 자라나 포도당을 가하면 더욱 잘 자라고 특히 발육소를 첨가하는 것이 이상적이다 액체배지 .

인 에서도 잘 자란다 특히 강력한 독소 생산을 위해 배지의 선택이 중요하다

Thioglycollate Broth . .

저항성
저항성이 강한 아포는 ℃에서 시간 가열해도 잘 죽지 않고 ℃건열멸균에서도 시간내에 잘 사멸하지
100 30 180 1

않는다 소독제에도 강하여 석탄산 용액에서 ～ 시간 처리해야 한다

. 5% 1 15 .

병원성
창상부위에 감염된 아포는 화농균의 영향력으로 증식이 가속되고 균은 감염부위에서만 증식한다 .

2. 보툴리눔균 (Clo s tr i d iu m b o t u li n u m )

이 균은 식품 중에 감염되면 독소에 의해서 심한 식중독을 일으킨다 보툴리눔의 식중독을 최초로 기술한 사 .

람은 이다
Van Ermenge(1896) .

형태 및 동정
크기가 ～ ～ ㎛정도인 간균이며 연쇄상을 이루고 있다 편모를
3 8 X 0.5 1 . 4-8 개 소유하고 협막은 없다 ℃～ . 20

℃에서 아포를 형성한다

25 .

배양
혐기성 조건하의 일반 배지에서 잘 자라나 육즙배지에서 더욱 잘 자라고 약알칼리성의 배지에서 잘 자란다 .

이 균이 생산하는 독소는 균 동정에 중요하다 .

저항성
A․ 군의 아포는 다른 혐기성 균보다 열에 대한 저항성이 강하다
B .

항원구조
단백분해 능력을 가진 종은 공통적으로 항원을 갖고 독성균주와 비독성균주간에 다른 항원구조를 갖고 있다 O

고 한다 .

대사산물 혹은 독소
독성이 강한 대사산물 즉 외독소를 생산하는데 이것은 거대분자로 혈구응집소와 외독소이다 그리고 항원적
, .

으로 분명히 다른 가지 독소 를 가지고 있다 지역별로 균의 분포가 다르고

6 형이 사람의
(A,B,C,D,E,F) . A, B, E

질병과 관계가 있다 이것들이 형성하는 독소 분자량 . 는 병원성이 강하여 도로 만마리의 마 ( 900,000) 1mgwjd 20

우스를 죽일 수 있다 에서 합성을 방해한다

. Myoneural function acetyl choline .

병원성
식품류에 감염된 독소를 섭취하여 발병한다 특히 통조림 등에 포함된 독소를 섭취하게 되면 부교감신경등의 .

말초신경에 작용한다 .

3. Cl o st r id i u m p er f r in g en s : 가스괴저균

- 3 -
형태 및 특성
그람양성이며 운동성이 없는 혐기성 간균으로 아포를 형성한다 아포는 난원형이고 끝에 가까운 곳에 생긴다 . .

포도당이 풍부한 배지에서는 단간균이 되며 전분이 많은 배지에서는 장간균이 된다 협막이 있으며 특히 조 , .

직 가검물에서 분리한 균에 많다 .

배양
는 종의 아미노산을 필요로 하며 우라실과 아데닌을 첨가하면 잘 자란다 따라서
C.perfringens 14 , .

는 쇠고기와 닭고기에서 잘 자란다 멸균된

C.perfringens 는 훌륭한 배지가 되며 α독소생산을 촉 . ground beef

진시킨다 발육최적온도는 ～ ℃이며 발육 가능한 최고온도는 ～ ℃ 최저온도는 ～ ℃이다 최소

. 43 45 , 50 51 , 14 18.5 .

수분활성범위는 ～ 이다 발육최적 는 ～ 이며 이하에서는 발육이 억제된다

0.97 0.93 이하에서 . pH 6.0 7.0 , 5.5 . pH 5

는 수일 안에 균이 죽는다 아질산나트륨과 소금은 의 발육을 억제한다

. C.perfringens .

집락은 일반적으로 백색이며 혈액배지나 난황배지에 배양할 때 집락 주변에 용혈대나 유백색띠가 생긴다 아
, .

황산염이 들어있는 배지에서는 아황산 환원 때문에 집락이 검게 된다 .

식중독 발생 경로
Clostridium 균은 년대 영국 독일 프랑스에서 각각 개별적으로 발견되었다 과거에는
perfringens 1890 , , .

라 불렀으며 현재에도 관용어로 사용되고 있다 임상 검체에서 분리되는 클로스트리디움속

Clostridium welchii , .

중에서 가장 많이 차지한다 (50%).

건강한 사람이나 동물의 장관내 토양 하수 먼지 등 자연계에 널리 상재하고 있다 , , , .

가스괴저균에 의한 장염은 동물의 장 내용물이나 변 토양등의 자연계에 상재하는 가스괴저균에 의해 식품이 ,

오염되는 것으로 시작되며 식품이 가열조리후의 탈기상태에서 ～ ℃에 놓아둔 경우에 일어나는 가스괴저
, 30 50

균의 이상증식 통상 당 개 이상의 생균이 들어있는 식품의 섭취 장관내에서 가스괴저균 장독소 생산

, 1g 10
5
, ,

가스괴저균 장독소에 의한 설사발현 설사변과 함께 다량의 아포와 장독소 배설 경과를 취한다 , .

대량의 식품을 조리하여 저장하게 되는 집단 급식에서 잘 생기지만 어물로도 발생할 수 있다 우리나라에서는 .

서구국가처럼 많지는 않지만 년에 건의 발생보고가 있다 1984 1 .

독소
는 다양한 독소를 생산한다 이 균은 독소의 종류에 따라 ～ 의 다섯 가지 독소형이 존재하고
C.perfringens . A E

이주 사람에게 장염의 원인이 되는 것은 주로 형균이다 가스괴저균 장염의 원인물질은 가스괴저균 장독소로 A .

불리는 이열성 단백독소이다 대부분의 형 가스괴저균이 가스괴저균 장독소를 생상하는 능력이 있다고 생각
. A

되나 그 생산량이 미량이다 .

Cl ostr i di um p er fr in gen s 의 독성인자

- 4 -
독성인자 활성
Alpha toxin Phospholipase C, hemolytic

Beta toxin Increases capillary permeability

Epsilon toxin Increases capillary permeability

Iota toxin Increases capillary permeability

Theta toxin Increases capillary permeability

Delta toxin Hemolytic

Kappa toxin Collagenase

Mu toxin Hyaluronidase

Nu toxin Deoxyribonuclease

Lambda toxin Protease

Neuraminidase Hydrolyzes serum glcoproteins

Enterotoxin Reverses water, sodium, and chloride transport in intestine

Gamma toxin ?

Eta toxin ?

- 5 -
미국에서 발생한 Clo str id iu m per fr i ng en s 식중독의 원인식품 (1973 ～ 1987)

식품 발생건수 (%) 식품 발생건수 (%)

쇠고기 51(26.3) 어류 3(1.6)

멕시코 음식 23(11.9) 조개류 2(1.0)

칠면조 19(9.8) 야채 1(0.5)

닭고기 9(4.6) 기타 46(23.8)

돼지고기 8(4.1) 불명 28(14.4)

임상증상
잠복기는 ～ 시간 평균 시간이다 다량의 가스괴저균을 섭취한 경우에는 잠복기가 단축된다 집단발생시
8 22 , 12 . .

살모넬라 장염 등 감염형에 비하여 잠복기의 폭이 좁고 환자는 단시간에 집중적으로 발병한다 .

복통과 설사가 반듯이 발생하는 증상이다 설사는 수양성으로 드물게 점상혈변을 볼 수 있다 이들 증상은 일 . .

과성으로 ～ 일의 설사로 정지하며 회복된다 예후는 비교적 양호하다

1 2 . .

분리․정량 시험법
Cl ostr i di um 를 위한 선별과정과 사용된 배지를 지정한 몇몇 규제기관
p er fr in gen s

규제기관 선택배지 다른 배지
Thioglycollate medium CM173

Modified cooked meat medium 혹은 chopped liver

broth

Iron-milk medium

AOAC/FDA Tryptose-sulphite-cycloserine agar(TSC) Lactose-gelatin medium

Bacterialogical Analytical Manual (BAM) (1992) CM587+SR88 Buffered motility-nitrate medium

Sporulation broth

Spray's fermentation medium

AE sporulation medium

Duncan-Strong sporulation medium

Modified cooked meat medium

Agriculture Canada (1988) Tryptose-sulphite-cycloserine agar(TSC) Fluid thioglycollate medium CM173

Method Manual CM587+SR88 Nitrate-motility medium

Lactose-gelatin medium

German Institute of Normalisation (DIN 10165) Thioglycollate medium CM173

Tryptose-sulphite-cycloserine agar(TSC)
adopted by the Official Collection of Investigative Nitrate-motility medium
CM587+SR88
Procedure L06-00-20 (1984) Lactose-gelatin medium

Brithsh Standard Institute (BSI) BS5763:Part Tryptose-sulphite-cycloserine agar(SC agar) Fluid thioglycollate medium CM173

9:1986 (1992) 와 ISO 7937 BS4285:Part 3:Section CM587+SR88 Nitrate-motility medium

3-13 (1990) Lactose-gelatin medium

*BSI Draft Document 95/502681 Tryptose-sulphite-cycloserine agar(SC agar) Lactose-sulphite medium(LS)

(BS5763:Part9revision(BS EN ISO 7937) CM587+SR88

a) Neomycin-cooked meat medium

a) Tryptose-sulphite-cycloserine agar(TSC) with
Standards Australia Committe on Food b) Lactose-egg yolk agar (LEY)
egg yolk CM587+SR88+SR47
Microbiology AS 1766.2.8(1991) c) Lactose-gelatin medium (LG)
b) TSC agar without egg yolk CM587+SR88
d) Nitrate-motility medium (NM)

Tryptose-sulphite-cycloserine agar(TSC) Fluid thioglycollate medium CM173

Normalisation Francaise (AFNOR) V08-056 (1994)
CM587+SR88 Lactose-sulphite medium (LS)

a) Lactose fermentation agar

b) Tryptone-yeast extract agar

a) Tryptose-sulphite-cycloserine agar(TSC)
c) Lactose-milk-egg yolk agar
Spanish Ministeria de Sanidad y b) TSC agar with egg yolk CM587+SR88+SR47

Consumo Institute de Salidad, Carlos Ⅲ c) Oleandomycin-polymyxin-sulphadiazine

d) Reinforced clostridial medium (RCM) CM149

with added neomycin sulphate (100ug/ml)

Technical Manual Perfringens agar (OPSP) CM543+SR76+SR77
e) Cooked meat-neomycin medium
d) Tryptone-sulphite-neomycin agar(TSN)
f) Neomycin-blood agar (CM55+7% horse blood

with added neomycin sulphate (100ug/ml)

- 6 -
 분리와 정량을 위한 실험과정
Clo str id iu m p er fr in g ens (APHA 에 기초 음식물에 대한 미생물 조사를 위한 방법요약
. )

↙ ↘
적절한 증균 세균수가 매우 적다면 실시
: 혐기성 플레이트 계수
↓ ↓
2.0ml 의 혹은
liver broth peptone-glucose-yeast extract
에서 샘플을 혼합
에 대략 의 샘플을 녹인다
broth 2g .
0.1% peptone water 1/10

↓ ↓
시간 ℃에서 배양
18-24 , 35-37 로 까지 배수희석
0.1% peptone water 10
-7
10

↓ ↓
한 쌍의 표면에
TSC agar with egg yolk 혹은 0.1ml

TSC with egg yolk 에 가스발생을 보이는 시험관을 도말 분량을 도말 전체

TSC agar without egg yolk 1.0ml .

표면에 퍼뜨린다 .

↓ ↓
18-24 시간 ℃에서 혐기적으로 배양
, 35-37 을 겹친다
egg yolk-free TSC agar 5-10ml .

↓ ↓
egg yolk- 양성 검은색 집락에 대한 확정시험 18-24시간 ℃에서 배양
, 35-37

↓
TSC with egg yolk 에서의 양성 검은색 집락
egg yolk-

혹은 에서의 검은 색 집락을
TSC without egg yolk

확정 시험

*Pep t on e-g l uc os e-y eas t ex t rac t b ro th

조성 g /l

Tryptone L43 50.0

Peptone L34 5.0

Yeast extract L21 20.0

Glucose 4.0

Disodium phosphate 5.0

Sodium thioglycollate 1.0

Water 1000ml

pH 7.0 ± 0.2

가스괴저균 액체 증균배지
는 주변환경 음식 재료나 조리하지 않은 음식에 널리 산재해 있고 내성 포자를 만들어서
Cl.perfringens ,

식품가공공정에서도 살아남을 수 있기 때문에 음식물에서 증균과정은 필수적이다 .

일반적으로 세균수가 적다고 보일 때 혹은 Robertson's cooked meat, liver broth reinforced clostridial

과 같은 비선택성 배지에서 음식물 샘플에 열처리를 한다 이 과정은 열에 민감한 종들을 파괴해서

medium .

가 순수하게 존재하거나 다른 균과 거의 혼합되어있지 않을 때 유용하지만 다른

Cl.perfringens 의 clostridia

포자가 존재할 수도 있어 그렇게 좋은 방법이라고 볼 수는 없다 .

- 7 -
선택성이 있는 몇몇 항생제가 사용되고 있다 을 포함하는 . 400ug/ml cycloserine tryptone-glucose-yeast extract

은 붉은 색 선육 통조림 의 표면에서
enrichment medium 를 식별하는데 사용된다
( ) Cl.perfringens .

는
Debevre 의 이 들어간
400ug/ml cycloserine 를 의 fluid thioglycollate medium without dextrase Cl.perfringens

적은 수 영양세포 혹은 포자를 식별하는데 사용했다 배양 조건은 ℃ 시간이었고 그런 다음 . 46 , 18 iron sulphite

플레이트에 접종했다 ℃에서 시간 배양 후 특징적인 검은 색 집락을 얻었다

agar . 46 18 .

과 은
Poumeyrol Billon 은 추천했다 이 배지는 조성과 같이
Perfingens Enrichment Medium(PEM) . Debevre

와 산 생산을 최소화하기 위해
casein hydrolysate 를 제외했고 결과적으로 를 억제할 수 dextrose Cl.perfingens

있는 정도까지 가 떨어진다 이 배지는 열이나 이온 처리에 의해 손상받은 영양세포나 아포 세포의 회복을

pH .

위해 사용된다 .

진공상태로 포장된 선육의 조사에 증균 과정은 필요없다 고기 자체가 충분한 수분과 영양분을 제공하고 포장 .

자체가 혐기성 성장 조건을 충족시키기 때문이다 포장육을 ℃에서 배양하고 가 존재하면 . 43-45 Cl.perfringens

다량의 가스가 방출되어 포장이 부풀어오른다 .

Perfringens Enrichment Medium (PEM)

조성 g /l

Tryptone(LP42) 15.0

Yeast extract(LP21) 5.0

Sodium chloride(LP5) 2.5

Sodium thioglycollate 0.5

L-cysteine 0.5

Resazurin 0.001

Agar(LP11) 0.75

pH 7.1 ± 0.1

Cycloserine 400mg

Tryptone-Peptone-Yeast Extract-Glucose Medium (TPYG)

조성 g /l

Tryptone(LP42) 2.0

Peptone(LP34) 5.0

Yeast extract(LP21) 2.0

Glucose 4.0

Cycloserine 800mg

* 이 분량은 배강도 배지를 위한 것이다

2 .

Fluid Thioglycollate Medium Without Dextrose

조성 g /l

Tryptone(LP42) 15.0

Yeast extract(LP21) 5.0

Sodium chloride(LP5) 2.5

Sodium thioglycollate 0.5

L-cysteine 0.5

Resazurin 0.001

Agar(LP11) 0.75

pH 7.1 ± 0.1

- 8 -
가스괴저균 선택 배양배지
PERFRINGENS A GA R (OPSP) CM543

음식물에서 Cl.perfringens의 발현을 위해

조성 g /l

Tryptone 15.0

Yeast extract 5.0

Soya peptone 5.0

Liver extract 7.0

Ferric ammonium citrate 1.0

Sodium metabisulphite 1.0

Tris buffer 1.5

Agar 10.0

pH 7.3 ± 0.2

PERFRINGENS (OPSP) SEL ECTIVE SUPPLEMENT A SR76

병 내용물 각 병은 배지 ( 500ml 용 )

Sodium sulphadiazine 50mg

PERFRINGENS (OPSP) SEL ECTIVE SUPPLEMENT B SR77

병 내용물 각 병은 배지 ( 500ml 용 )

Oleandomycin phosphate 0.25mg

Polymycin B 5000 IU

사용방법
증류수 에 을 넣어서 완전히 녹이기 위해 가열기로 가져간다
500ml 22.8g . 121 ℃에서 분간 15 Autoclave 해서 살
균한다 ℃까지 식히고 증류수 로 용해시킨
. 50 2ml Perfringens Agar(OPSP) Supplement A 와 B, SR76 과 SR77

각 병의 내용물을 첨가한다 잘 혼합하고 살균된 페트리접시에 붓는다

1 . .

설명
Oxoid Perfringens Agar (OPSP) CM543 은 에 의해 개발된 조성에 기초한다
Handford .

이 배지는 Clostridium perfringens 에 대한 높은 선택성과 특이성을 제공하기 위해 동결건조된 첨가제 SR76 과

로 제공된
SR77 sulphadiazine (100ug/ml), Oleandomycin 과 phosphate (0.5ug/ml) polymycin B sulphate (10

을 활용한다
IU/ml) .

와
Sodium metabisulphite 는 기술을 사용할 때 이 배지에서 검은색 집락을
Ammonium ferric citrate pour plate

형성하는 에 의한 환원 지시제로 사용된다

Cl.perfringens sulphite .

확인을 위한 시험은
Cl.perfringens International Commission on Microbiological Specifications for

에 의해 인용된 연구논문에 기술되어있다

Foods(I.C.M.S.F.) .

종과
Salmonellae, Prpteus 뿐만 아니라 포도상구균과 종과 같은 를
Citrobacter freundii Bacillus Cl.perfringens

제외한 환원성 세균은

Sulphite 에서 억제된다 OPSP Agar .

Perfringens 는 와 성장을 억제하는 이점도 가지고 있다 이

Agar(OPSP) Cl.bifermentans Cl.butyricum . sulphite

환원 세균은 배지 전체 표면에 퍼지고 거무스름한 경향이 있는 검은 색 집락으로 Shahidi-Ferguson

- 9 -
 와
Perfringens Agar(SFP) 에서 자란다 Tryptone-Sulphite-Neomycin Agar(TSN) .

장내구균 중 일부 중은 에서 의 커다란 검은색 집락과 구별이 되는 흰

Perfringens agar (OPSP) Cl.perfringens

색 집락으로 자랄 것이다 .

활성을 식별하기 위해
lecithinase 를 포함하는 발현 배지는 집락이 빈번
Egg Yolk Cl.perfringens Cl.perfringens

하게 잘못된 띠를 형성하기 때문에 음성으로 잘못 보이고 세균이 배지를 완전히 검게 하는 커다랗고 번진 형 ,

태의 집락 형태로 자라기 때문에 계수에 있어 비실용적이기 때문에 부분적으로는 만족스럽게 판명되지 않는

다 .

기술
지시에 따라 배지를 만든다 .

균질화시킨 시험 샘플에 대한 일련의 희석물 을 사용해서 플레이트 당 대략 을 포함하는 플레이트를 1ml 25ml

준비한다 세팅하기 전에 잘 섞는다

. .

비록 접종이 한천 막으로 덮인다 할지라도 만일 플레이트가 표면 접종이 된다면 집락은 검은색 Cl.perfringens

이 되지 않을 것이다 .

H2/CO2 Gas 을 사용한 편리한 에서 ℃

Generating 시간동안 플레이트를 배양한다
Kit BR38 Gas-Jar 35 , 18-24 .

대안으로 혹은 를 사용한다
AnaeroGen AN25A 은 물이나 촉매제가 필요 없다 AN35A . AnaeroGen .

는 한천배지의 바닥에서 커다란 검은 색 집락

Cl.perfringens 직경 을 보일 것이다 (2-4mm ) .

작은 무색 집락으로 에서 자라는 Perfringens의 일부 종은 쉽게 Agar (OPSP) Enterococcus faecalis

와 구별된다
Cl.perfringens .

보관조건과 유효기간
℃ 아래에서 분말배지를 저장하고 라벨상에 있는 유효기간전에 사용한다
25 .

만든 배지는 ℃에서 보관한다 2-8 .

품질관리
양성대조군 :

Clostridium perfringens ATCC 13124

음성대조군 :

Clostridium bifermentans ATCC 638

주의
이 배지상의 검은색 집락형성은 Cl.perfringens 에 대한 잠정적인 동정이다 더 많은 동정 테스트를 수행해야만 .

한다 .

PERFRINGENS A GA R B A SE (TSC an d SFP) CM587

Clostridium 에 대한 잠정적인 동정과 발현을 위한

perfringens TSC Agar 혹은 SFP Agar 를 만들기 위한 선택
제제와 함께 사용하기 위한 기초배지
조성 g /l

Tryptose 15.0

Soya peptone 5.0

'Lab-Lemco' powder 5.0

Yeast extract 5.0

Sodium metabisulphite 1.0

Ferric ammonium citrate 1.0

Agar 14.0

최종 pH 7.6 ± 0.2

- 10 -
PERFRINGENS (SFP) SEL ECTIVE SUPPL EMENT SR93

병 내용물 각 병은 배지 ( 500ml 용 )

Kanamycin sulphate 6.0 mg

Polymyxin B 15000 IU

PERFRINGENS (TSC) SEL ECTIVE SUPPLEMENT B SR88

병 내용물 각 병은 배지 ( 500ml 용 )

D-cycloserine 200mg

사용방법
Agar Base 를 만들기 위해
증류수 에 을 넣고 가 완전히 녹을 때까지 부드럽게 가열한다
500ml 23g agar . 121 ℃에서 분간 10 autoclave 해서
살균한다 ℃까지 배지를 식힌다
. 50 .

Tryptose Sulphite Cycloserine Agar(TSC Agar) 를 만들기 위해

℃까지 식은
50 에 용해시킨 Agar Base 500ml TSC Supplement SR88 1 병과 Egg Yolk Emulsion SR47 25ml

을 첨가한다 잘 섞고 살균된 페트리접시에 붓는다

. .

Egg Yolk Free TSC Agar 를 만들기 위해

℃까지 식은
50 Agar Base 500ml 에 용해시킨 TSC Supplement SR88 1 병을 첨가한다 잘 섞고 살균된 페트리 .

접시에 붓는다 .

Shahidi-Ferguson Perfringens Agar (SFP Agar) 를 만들기 위해

℃까지 식은
50 에 용해시킨 Agar Base 500ml SFP Supplement SR93 1 병과 Egg Yolk Emulsion SR47 25ml

을 첨가한다 잘 섞고 살균된 페트리접시에 붓는다

. .

복층을 위한 Agar 를 만들기 위해

복층으로 사용될 혹은 위해 TSC SFP Agarfmfm Egg Yolk Emusion SR47 을 생략한다 이것의 내용물은 .

활성을 향상시키지 않고 집락의 가시화를 감소시킨다

lecithinase .

설명
Perfringens Agar Base (TSC 와 SFP) CM587 은 을 사용한
SR93 Shahidi-Ferguson Perfringens 혹은
Agar

을 사용한
SR88 Tryptose Sulphite Cycloserine Agar 를 준비하기에 Egg Yolk Emusion SR47 과 적당한 항생제
첨가제가 들어간 영양배지이다 .

Egg Yolk 는 더 작은 집락이 형성되는 이점을 가지고 있다고 기술되고 있다 이것은 많은 수

Free TSC Agar .

의 집락을 갖는 플레이트의 계수를 간단하게 할 수 있다 더 높은 수는 기술에 이것을 사용함으로 . pour plate

써 증명되었다 그 차이점은 표면 평판도말 과정에서 높은 수준의 산소에 대한

. 노출에 기인한 Cl.perfringens

것으로 생각되었다 .

는 와 에 의해 개발된 조성에 기초한다

Shahidi-Ferguson Perfringens Agar Shahidi Ferguson .

이 배지는 에 대한 높은 수준의 선택성과 특이성을 제공하기 위한 선택제제로

Cl.perfringens Kanamycin

와
sulphate(12mg/litre) 를 활용한다
polymycin B Ssulphate (30000 IU/litre) .

Tryptose Sulphite 는 와 같은 기초배지를 사용해서 개발되었지만 선택제제로

Cycloserine Agar SFP Agar

이 첨가되었다
400mg/litre D-cycloserine .

와
Sodium metabisulphite 는 두 배지에서 검은색 집락을 형성하는 에의
Ferric ammonium citrate Cl.perfringens

- 11 -
한 sulphite 환원에 대한 지시제로 사용되었다 .

Trials 는 Sulphite 에서 사용된

Polymyxin 와 혹은
Sulphadiazine Agar polymyxin B sulphadiazine Tryptone

에서 사용된
Sulphite Neomycin Agar 보다도 에 사용된 와 neomycin SFP Agar polymyxin B Kanamycin sulphate

가 의 영양세포와 포자 모두에서 더 높은 회복을 할 수 있게 한다고 지적했다 그러나 더 많은

Cl.perfringens .

수의 비 특이 집락이 - 에서 발견되었다 SFP Agar .

또 다른 논문에서는 와 , 는 에서만 자라는 통성 혐기성균이

Serratia marcescens Streptococcus lactis TSC Agar

었고 반면 , 역시 SFP 와Agar 종의 성장은 되지만 보다

Enterococcus, Proteus Enterobacter TSC Agar

의 약간 더 높은 회복이 가능했다
Cl.perfringens .

와
SFP Agar 모두는 에서 완전히 억제된
TSC Agar 와 부분적으로 억제된 TSC Agar Cl.sordellii Cl.bifermentans

를 제외하고 테스트된 다른 환원성 종의 성장을 가능케 했다 두 종은 에서 자

sulphite Clostridium . SFP Agar

랐다 .

중 몇몇 종은
Cl.prtfringens 활성에 기인해서 집락 주변에 불투명한 구역을 형성할 수도 있지만 니
lecthinase

것은 하룻밤동안의 배양 후 모든 종들에 대한 보편적인 것으로 고려되지 않고 검은 Cl.perfringens lecithinase-

양성과 검은색 음성 집락 모두는 혹은 에서 잠정적인

lecithinase- 로 고려되어야만 TSC SFP Agar Cl.perfringens

하고 확정 시험을 수행해야만 한다 양성 통성 혐기성균은 에서 의 . Egg Yolk SFP Agar Cl.perfringens Egg Yolk

반응으로 가려져 완전히 불투명한 플레이트를 형성하면서 자랄지도 모른다 .

기술
1. 지시에 따라 배지를 만들고 대략 의 가 포함된 혹은 로 바닥층을 들어있는 20ml Egg Yolk TSC SFP Agar

플레이트를 준비한다 .

2.균질화된 테스트 샘플에 대한 적당한 일련의 희석물 을 만들고 멸균된 면봉으로 바닥면에 바른다 0.1ml .

가 들어있지 않은
3. Egg Yolk 혹은 을 추가적으로 부어 겹치게 만든다TSC SFP Agar 10ml .

로 덮지 않은 배양물은 검은색 집락으로 자라지 않을 것이다

Agar .

을 사용한 편리한
4. Anaerobic Gas Generating Kit BR38 에서 ℃ 시간동안 플레이트를 Gas-Jar 35 , 18-24

배양한다 대안으로 . 혹은 를 사용한다 은 물이나 촉매제가 필요

AnaeroGen AN25A AN35A . AnaeroGen

없다 .

대신에 플레이트당 , 가 들어간 혹은 대략 을 사용한

Egg Yolk 는 균질화된 테스 TSC SFP Agar 25ml pour-plate

트 샘플에ㅐ 대한 적당한 일련의 희석물 을 사용해서 만들 수 있다 가 굳기 전에 잘 혼합한다 이 기 1ml . Agar .

술을 가지고는 집락의 활성을 보기는 더 어렵다

, Cl.perfringens lecithinase .

집락은 의 깊은 곳에서 커다란 검은 색 집락

Cl.perfringens 직경 으로 보일 것이다
Agar 가 (2-4mm ) . Egg Yolk

들어 있지 않은 는 위에서 기술한 방법을 사용한다

TSC Agar 집락은 검은색이지만 가 . Cl.perfringens egg yolk

없어 어떠한 활성을 식별할 수 없다

lecithinase .

확정 시험은 반응 분해 액화와 운동성 부재를 포함하는

nitrate , lactose , gelatin , International Commission on

에 의해 시작된 논문에 기재되어 있다

Microbiological Specifications for Foods 혹은 에서 자라 . TSC SFP Agar

는 모든 검은 집락은 테스트되어야만 한다 .

보관조건과 유효기간
℃ 아래에서 보관하고 라벨상의 유효기간 전에 사용한다
25 .

만든 배지는 ℃에서 보관한다 2-8 .

- 12 -
품질관리
양성 대조군 :

Clostridium perfringens ATCC 13124

음성대조군 :

Clostridium sordellii ATCC 9714

주의
이들 두 배지에서 나타나는 검은색집락은 Cl.perfringens 이외의 세균일수도 있다 .

배지에 포함된 항생물질과 집락생성 반응

Clostridium perfringens 의 선택분리를 위한 배지내에 포함된 항생제들과 적용된 잠정적인 동정 시스템
International Units 로 업급된곳을 제외하고는 ug/ml

배지 Polymyxin B sulphate Sulphadiazine Neomycin Cycloserine Oleandomycin Kanamycin 동정시스템

Sulphite-Iron Polymyxin Agar 10 환원
Sulphite

S u l p h i t e - P o l y m y x i n

Sulphadiazine(SPS) Agar
10 120 환원
Sulphite

Tryptone-Sulphite

Agar
Neomycin (TSN)
20 50 Sulphite 환원
Shahidi-Ferguson Perfringens(SFP) Lecithinase

Agar
30i.u. 12
Sulphite 환원
Tryptose-Sulphite-Cycloserine Lecithinase(optional)

(TSC) Agar
400
Sulphite 환원
Oleandomycin-Polymycin-Sulphadia Lecithinase

zine-Perfringens (OPSP) Agar

10i.u. 100 0.5
Sulphite 환원
B l o o d - f r e e 50(optional) Lecithinase

Pyruvate-Perfringens(BCP) Agar 혹은 400optional) Inositol 발효

확인 시험
와 함께
Cl.perfringens 를 환원하는 종들은 모두 를 생성하며
sulphite Clostridium lecithinase , lecithinase 활성에
의해서 생성된 검은색 집락은 로 의심되므로 확인시험이 필요하다 Cl.perfringens .

1) Nag l er t es t

난황 한천배지에서 실시 (Egg yolk agar: blood agar base CM55+flides extract SR46C+Egg yolk emulsion

SR47)

Cl.perfringens 형균의 중요한 독소는 α독소라 불리는

A lecithinase C 이다 이 균이 난황한천배지에서발육하면
.

난황의 lecithin 을 분해하여 집락주변이 혼탁해진다 이 반응을 . lecithinase 반응 반응 또는

, nagler lecithovitellin

반응이라 한다 .

활성을 중화시키는
lecithinase Cl.perfringens type A antitoxin 은 매우 유용하지만 양성 결과가 반드시 ,

만을 정의하진 않는다
Cl.perfringens . Cl. bifermentans, Cl.sordellii, Cl.barati 역시 양성 결과를 나타낸다 .

2) rev ers ed CA MP tes t

Nagler 의대체 방법으로서

test 에 대해서만 특정한 반응을 보이므로 매우 효과적인 방법이다
, Cl.perfringens .

94.2% 의 를 분리한다 운동성 발효

Cl.perfringens 액화 환원 실험의 조합된 결과로는 . , lactose- , gelatin , nitrate

89.2% 의 를 분리하고
Cl.perfringens 은 의 를 분리한다 Lactose-Sulphite(LS) medium 43.1% Cl.perfringens .

- 13 -
기술
a. 5% Sheep Blood in Alsever's solution SR53 과 Columbia Blood Agar Base CM331 로 Sheep Blood Agar 를
준비한다 .

의 순수한 배양균을 접종한다 플레이트에 세로로 한 줄을 긋는다

b. Streptococcus agalactiae . ( )

c. 의심되는 배양균을 에 닿지 않도록 수평으로 한 줄을 그어 접종한다

Cl.perfringens Streptococcus agalctiae .

d. 37 ℃에서 시간동안 혐기배양시킨다 24 .

e. 야엉일 경우 와 가 교차되는 지점에서 용혈반응으로 인한 화살표 모

, Streptococcus agalactiae Cl.perfringens

양이 나타난다 .

Cl .p er fr in gen s 의 생화학적 성상
운동성 음성
Nitrate 환원 양성
Gelatin 액화 시간 이내에 양성
44

Lactose 발효 양성
Raffinose 발효 양성
Salicin 발효 음성
Cl .p er fr in gen s 와 다른 Clo str id iu m 속의 감별 특성
Nagler
Nitrite 로 발효
에 의한 운동성
Lecithinas test:antitoxi Gelatin

e n 액화 Nitrate

환원
Indole Urease

억제
Lactose Raffinose Salicin

Cl.perfringens + + - + + + + - - -

Cl.barati(Cl.para-per
+ + - - + + - + - -
fringens)

Cl.bifermentans + + + + - - - - - -

Cl.sordellii + + + + - - - - + ±
혹은
- +
Cl.absonum + -
약한 + >44 시간 + + - +

Cl.celatum - - - - + + - +

Cl.perenne ± - - - + + - ±
Cl.sardiniensis + - 약한 +
>44
+

시간 + + - +

- 14 -
독소감별키트
PET-RPL A : RPLA 에 의한 을 감별하는 키트
Clostridium perfingens enterotoxin

로 배변 샘플이나 배지 여과물에서
RPLA 내독소를 감별 Clostridium perfringens type A .

․ 식중독을 일으키는 내독소를 감별

Clostridium perfringens type A

․ 시간이내에 배변으로부터 직접 감별
24

․ 임상과 식품 미생물 실험실에서 사용하기 위한 유용한 진단 분석

․ 사용하기 간단하고 판독하기 쉽다
․ 분명하고 가시적인 역가를 제시한다
․ 배양 여과체에 대해 의 민감도를 갖는다 2ng/mL

In t ro du c t i o n

는 혐기성이고 주위환경에 널리 분포하고 있는 그람양성 포자생성 간균이다 생물

Clostridium perfringens .

의 포자는 대부분의 사람의 일반적인 배설물 생물군으로 존재한다 .

독성은 대개 준비된 음식물의 일시적인 남용의 결과로 생긴다 생물은 요리 후 소수로 존재하
Perfringens .

고 식히고 저장하는 동안 식중독 수준으로 증식한다 육류 육류 제품과 육수등이 가장 빈번하게 언급되는 . ,

음식물들이다 .

Clostridium 의 영양세포의 섭취는 설사와 비정상적인 경련 등의 특징이 있는

perfringens type A

독성을 일으킨다 전형적인 질병은 적어도 당

perfringens . 을 gram 10
8
Clostridium perfringens type A cell

포함하는 음식물의 섭취 후 시간정도에 시작된다 위에서 증식을 통해 생존한 섭취된 균은 작은창자

6-24 .

에서 포자를 생성한다 질병은 포자생성과정과 연관된 내독소의 생산에 의해 생기나 그러므로 환자로부터
. .

얻은 배변 검체나 세균 분리 검체의 배양액 내에서 내독소를 감별하는 것은 중요하다 .

RPLA 는 Clostridium perfringens type A 내독소의 감별을 위한 신뢰할 수 있는 방법으로 보고되고 있다 .

배변에서 내독소의 감별은 체내에서 형성된 다량의 독소 때문에 적당한

Clostridium perfringens type A

접근법이 될 것이다 배양 방법은 인공배지에서 충분한 독소를 생산하는데 무제가 있기 때문에 신뢰할 수
.

없다 .

Tes t pr i nc i pl e

테스트는 V-well microtitre 플레이트에서 시행한다 .

라텍스 입자는 순수한 내독소에 감작시킨 토끼로부터 얻어진 순수한 항혈

Clostridium perfringens type A

청과 반응된다 내독소의 존재하에 라텍스 입자는 분명항 가시적인 격자구조를 형성하며 응집할 것이다
. .

만일 Cl. perfringems type내독소가 감별 가능한 수준이하논ㅇ도로 존재한다면 어떠한 격자구조를 형

A

성하지 않을 것이고 well 의 가장 바닥에 라텍스 입자가 가라앉을 것이다 .

- 15 -
Pr oc ed ur e

배변으로부터 독소 추출
배변 일정량과 그와 비슷한 량의 를 섞어서 균일화함으로써 추출 phosphate buffered saline(Oxoid BR14A)

할 수 있다 그런 다음 테스트 샘플은 원심분리와 여과를 통해서 추출된다

. .

배양액에서 내독소 생산
분리된 생물은 ℃ 시간 37 에서 배양해야 하고 그런 다음 ℃에
18-20 Cooked Meat Medium(Oxoid CM81) 75

서 분간 가열해서 불활성화시킨다 그 다음 생물은 내독소 생산을 촉진하게 디자인된 배지에서 ℃

20 . 37 24

시간동안 재배양한다 배양 후 테스트 샘플은 원심분리나 여과를 통해서 추출된다

. , .

A s s ay m et h od

1. 시약을 세게 흔든다 .

2. 각 열이 로 구성된8 well 플레이트를 위치시킨다 각 샘플은 개의 열이 필요하다V-well microtitre . ( 2 )

3. 각 열의 첫 번째 을 제외하고 두 개의 열 각각의 에 ㎕희석물을 분주한다

well well 25 .

4. 각 열의 첫 번째와 두 번째 에 ㎕ 테스트 샘플을 넣는다 well 25 .

5. 두 번째 로부터 번째 까지 ㎕를 뽑아서 각 열을 따라 두 배씩 희석한다 최종 에는 희

well 7 well 25 . well

석물만 들어있어야 한다 .

6. 1 번 열의 각 에 ㎕ 민감화된 라텍스 well 를 넣는다 25 (TD931) .

7. 2 번 열의 각 에 ㎕ 대조 라텍스 를 넣는다
well 25 (TD932) .

8. 각 의 내용물을 혼합하기 위해 손이나

well 로 플레이트를 흔들어준다 micromixer .

9. 플레이트를 덮고 시간동안 흔들리지 않게 내버려둔다 20-24 .

10. 검은 색 바탕에서 각 의 응집을 조사한다 모든 은 용액에 버린다

well . item hypochloride(>1.3% w/w) .

In t erp retati o n of r es u l t s

Negative : (-) 와 ± 는 음성으로 분류한다

( ) .

Positive 를 양성으로 분류한다

: (+), (+), (+++) .

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 <TSC + Egg Yolk> <TSC w/o Egg Yolk> <SFP> <OPSP>

<Litmus milk medium> <Lactose-gelatin medium> <Nitrate-motility medium>

<Cl.perfringens 에 의한 sulphite <Nagler Test> <Reversed CAMP Test>

reduction 에 대한 agar overlay 효과

>

- 17 -