mRNA 분석시험 방법

세포 mRNA 추출 (Cell mRNA extraction)

mRNA 정량 (mRNA quantification)
cDNA 합성 (cDNA synthesis or reverse transcription)
실시간 PCR 정량 (Real-time quantitative PCR)

세포 mRNA 추출 (Cell mRNA extraction)

Materials
1. 소모품
구분 제품명 Catalog Number 제조사 보관 온도
RNAiso plus 9108 Takara 4 °C
Chloroform 372978 Sigma Aldrich R.T
1X PBS SH30256.01 Hyclone R.T
Reagent
Isopropanol I9516-500mL Sigma Aldrich R.T
Ethanol AH090-4 Burdick&Jackson R.T
Nuclease free water (NFW) P1195 Promega R.T
Equipment Boil proof microtubes 1.5mL MCT-150-C Axygen R.T
 RNaseZAP™ R2020-250ML Sigma Aldrich R.T
※ RNAiso plus, Chloroform, Isopropanol, Ethanol, NFW 는 실험 전 Ice box 에 보관한다.
※ Ethanol 은 NFW 를 사용하여 75% ethanol 용액으로 재구성한다.
2. 비소모품
Ice, Pipette, Centrifuge (미리 4 °C 설정)
3. 검체
Cell

Methods
1. mRNA 분석을 위해 seeding 한 cell 을 준비한다.
1) Adherent cell: plate 에서 media 를 제거하고 1X PBS 로 1 회 wash 한다.
2) Suspended cell: tube 로 옮겨 spin down 후 media 를 제거하고 1X PBS 로 1 회 wash 한다.
(Biological response 를 빠르게 종료시켜야 할 경우 4°C 로 맞춰진 PBS 로 washing 후 냉동보관)
2. 실험대, 도구, 장갑 등 mRNA 가 노출될 수 있는 환경에 대하여 RNaseZAP™을 도포하여 바른다.
3. RNAiso plus 500 uL 를 넣어 충분히 cell 을 lysis 시키고, 1.5 mL tube 에 옮겨 담는다.
4. Chloroform 100 uL 를 넣고, 용액이 섞여서 분홍색을 나타낼 정도로만 약하게 Vortex 한다.
5. R.T 에서 5 min incubation 한다.
6. Centrifuge 를 13,000 rpm, 4 °C, 15 min 조건으로 수행한다.
7. 상층액 200 uL 를 새로운 1.5 mL tube 에 옮겨 담는다.
8. Isopropanol 200 uL 를 넣고, Inverting 을 10 회 한다.
9. Ice box 에서 10 분 incubation 한다.
10. Centrifuge 를 13,000 rpm, 4 °C, 15 min 조건으로 수행한다.
11. mRNA 와 salt 로 구성된 흰색의 pellet 을 확인한 후에 상층액을 최대한 제거한다.
12. 75% ethanol 500 uL 를 넣고, Tapping 과 Inverting 을 10 회 수행한다.
13. Centrifuge 를 13,000 rpm, 4 °C, 10 min 조건으로 수행한다.
14. 상층액을 흘려서 제거한 후에 tube 뚜껑을 연 상태로 뒤집어놓고 R.T 에서 30 min 간 건조시킨다.
15. Pellet 이 건조되어 투명해진 것을 확인하고 pellet 크기에 따라 NFW 15~20 uL 을 넣어 녹인다.
16. mRNA 를 단기 보관할 경우 냉장, 장기 보관할 경우 냉동 보관한다.
mRNA 정량 (mRNA quantification)
Materials
1. 소모품
구분 제품명 Catalog Number 제조사 보관 온도
Equipment RNaseZAP™ R2020-250ML Sigma Aldrich R.T
2. 비소모품
Ice, Pipette, Nanodrop one (Thermo scientific), RNaseZAP™
3. 검체
Extracted mRNA sample

Methods
1. 실험대, 도구, 장갑 등 mRNA 가 노출될 수 있는 환경에 대하여 RNaseZAP™을 도포하여 바른다.
2. Nanodrop one 기계를 켜고, 소프트웨어를 실행한다.
3. 소프트웨어 상에서 DNA 를 선택한 후에 RNA 로 변경한다.
4. NFW 1.5 uL 를 넣고, blank 의 optical density 를 측정한다.
5. 각각의 mRNA sample 1.5 uL 를 넣어 sample 의 optical density 를 측정한다.
6. Data 를 export 한다.
7. mRNA 의 concentration, purity 를 확인하여 기록한다.
(참고 Purity 값: 260/280 (RNA/protein)은 1.8~2.0 범위, 260/230 (RNA/solvent)은 1.8 이상 범위.)
 cDNA 합성 (cDNA synthesis or reverse transcription)
Materials
1. 소모품
구분 제품명 Catalog Number 제조사 보관 온도
MaximeTM RT Premix
25081 iNtRON -20 °C
Reagent (Oligo (dT)15 primer)
Nuclease free water (NFW) P1195 Promega R.T
Equipment RNaseZAP™ R2020-250ML Sigma Aldrich R.T
※ MaximeTM RT Premix, NFW 는 실험 전 Ice box 에 보관한다.
2. 비소모품
Ice, Pipette, T100TM Thermal cycler (BIO-RAD)
3. 검체
Extracted mRNA sample

Methods
1. 실험대, 도구, 장갑 등 mRNA 가 노출될 수 있는 환경에 대하여 RNaseZAP™을 도포하여 바른다.
2. MaximeTM RT Premix 각 tube 에 측정된 농도를 바탕으로 mRNA 1 ug 을 계산하여 넣고 용액의 총
부피가 20 uL 가 되도록 필요한 NFW 의 양을 계산하여 추가로 넣는다.
3. Tapping 과 spin down 을 수행하여 용액을 균질화한다.
4. T100TM Thermal cycler 를 키고, tube 를 장착한다.
5. 정해진 protocol (60 min at 45 °C → 5 min at 95 °C → ∞ at 4 °C)을 선택하고 sample volume 을 20
uL 로 설정하여 Run 한다.
6. Protocol 이 완료되면, cDNA 를 단기 보관할 경우 냉장, 장기 보관할 경우 냉동 보관한다.
 실시간 PCR 정량 (Real-time quantitative PCR)
Materials
1. 소모품
구분 제품명 Catalog Number 제조사 보관 온도
TB Green Premix Ex Taq II RR820A Takara 4 / -20°C
Reagent Primer - 제노텍 4 / -20°C
Nuclease free water (NFW) P1195 Promega R.T
0.1ml 8-strip tube, individual
Equipment NJ902 Takara R.T
flat caps
※ TB Green Premix Ex Taq II 는 차광 보관한다.
※ TB Green Premix Ex Taq II, Primer 는 개봉 전 -20°C 에 보관하며, 한번 녹인 시약은 다시 냉동하지 않고
4°C 에서 보관한다. (4°C 에서 6 개월 간 안정함.)
※ Primer 는 100 uM stock solution 을 NFW 에 10 분의 1 로 희석하여 사용한다.
※ TB Green Premix Ex Taq II, Primer, NFW 는 실험 전 Ice box 에 보관한다.
2. 비소모품
Ice, Pipette, Thermal cycler dice® Real time system III with PC/MRQ (Takara)
3. 검체
cDNA sample

Methods
1. Thermal cycler dice® Real time system III 장비를 켜고, 소프트웨어를 실행해놓는다.
2. Real-time PCR tube 에 다음 표와 같이 시약을 넣는다.
Reagent Volume (ul) Final concentration
TB Green Premix Ex Taq II (2X) 12.5 1X
Forward primer (10 uM) 1.0 0.4 uM
Reverse primer (10 uM) 1.0 0.4 uM
cDNA template 2
NFW 8.5
Total 25
3. 시약을 넣은 tube 를 장비에 넣고, 정해진 protocol 을 선택하여 Run 한다.
Step Temperature (°C) Time (s) Cycle (회)
Initial denature 95 30 1
95 5
PCR 40
60 30
95 15
Dissociation 60 30 1
95 15
4. Plate information 을 입력한다.
5. Data 를 export 한다.