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0 대한민국

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 碩 士 學 位 論 文

유세포 분석기(
flow cyt
omet
ry)
를
이용한 플라스미드-DNA의 정량 분석

忠南大學校 大學院

化學科 化學專攻

柳 熙 奉

指導敎授 金 學 眞

2
011年 2月
유세포 분석기(
flow cyt
omet
ry)
를
이용한 플라스미드-DNA의 정량 분석

指導敎授 金 學 眞

이 論文을 理學碩士學位
請求論文으로 提出함

2
010年 1
0月

忠南大學校 大 學 院

化學科 化學專攻

柳 熙 奉
柳熙奉의 理學碩士學位
請求論文을 認准함

2
010年 1
2月

論文審査委員會

委員長 印

委 員 印

委 員 印

忠南大學校 大 學 院
 목 차

목 차 Ⅰ
Li
stofTabl
es Ⅳ
Li
stofFi
gur
es Ⅴ

Ⅰ.서론 1

Ⅱ.배경 5
1.플라스미드-DNA 5
1-1.pBR322플라스미드-DNA 7

2.유세포 분석기 9
2-1.Exhaus
tiveCount
ing 13

3.모세관 전기영동 14
3-1.모세관 전기영동 정의 14
3-2.모세관 전기영동의 장치 구성 15

4.형광 염료의 특징 17

- I -
 4-1.형광 염료의 물리적 특성 17
Ⓡ
4-2.SYBR Gol
d형광 염료 19

Ⅲ.실험방법 21
1.시약 21

2.시료 전처리 23
2-1.유세포 분석기 실험용 시료 전처리 24
2
-1-1.최초 시료 준비 및 희석 24
2
-1-2.시료 효소 처리 24
2
-1-3.젤전기영동(
Gele
lec
trophor
esi
s)을 이용한 DNA 구조 확인
25
2
-1-4.추가 시료 희석 26
2
-1-5.유세포 분석기 시료 제조 및 형광 염료 첨가 26
2-2.모세관 전기영동 실험용 시료 전처리 27

3.유세포 분석기 최적화 조건 28

3-1.유체공학(
Flui
dics
) 28
3-2.검출장치(
Det
ect
ions
yst
em) 30

4.데이터 처리 절차 32
4-1.신호 및 데이터 처리 32

- II -
Ⅳ.결과 및 고찰 35
1.Supe
rcoi
led플라스미드-DNA 절단 35

2.기기의 유효성 검증 39
2-1.직선성 실험 39
2-2.시료의 질량 결정 41
2-3.바탕 잡음 보정 및 모세관내 흡착 제거 43

3.pBR32
2DNA의 계수 기반 정량 46
3-1.모세관 전기영동을 이용한 측정 46
3-2.유세포 분석기를 이용한 측정 및 유효성 검증 48

4.디지털 PCR를 이용한 저농도 DNA 정량 실험 50

Ⅴ.결론 53

Ⅵ.참고문헌 54

ABSTRACT 57

- III -
Li
stofTabl
es

Tabl
e1.Re
sul
tsofme
asur
eme
ntl
ine
ari
tyt
estf
orpBR322DNA 40
Tabl
e2.Re
sul
tsofsampl
ewe
ightme
asur
eme
ntsi
na7,
630mm l
ong
f
use
dsi
li
cac
api
ll
ary 42
Tabl
e3.Re
sul
tsofCE-dNMP det
ermi
nat
ionofpBR322DNA 47
Tabl
e 4.pBR322DNA r
epeat
abi
li
tyt
estus
ing f
low c
ytome
try 48
Tabl
e5.Summar
y of r
esul
ts of f
low c
ytome
tri
c de
ter
minat
ion of
1
/10
000-f
olddi
lut
edpBR322DNA 49
Tabl
e 6.Pr
ime
rs and pr
obe
s des
igned f
or di
git
alPCR de
tec
tion of
pBR3
22DNA 51

- IV -
Li
stofFi
gur
es

Fi
gur
e1.Che
micals
truct
ureofpl
asmi
d-DNA 6
Fi
gur
e2.I
ll
ust
rat
ion ofa bac
ter
ium wi
th pl
asmi
d enc
lose
dshowi
ng
chr
omos
omalDNA andpl
asmi
ds 6
Fi
gur
e3.I
ll
ust
rat
ionofapBR322pl
asmi
d-DNA 8
Fi
gur
e4.Sc
hemat
icoff
low c
ytomet
ry 11
Fi
gur
e5.Par
tspi
ctur
eofhomemade
-fl
ow c
ytome
tryi
nst
rume
nt 11
Fi
gur
e 6.Typi
cal hi
stogr
am of f
low c
ytome
tri
c de
ter
minat
ion of
pBR322DNA 12
Fi
gur
e7.Sc
hemat
icofc
api
ll
arye
lec
trophor
esi
sins
trume
nt 15
Fi
gur
e 8.Sc
hemat
icdi
agr
am showi
ng t
hedi
ff
ere
ntbi
ndi
ng mode
sof
dye
stoDNA 18
Ⓡ
Fi
gur
e 9.Che
mic
als
truc
tur
eofSYBR dye 20
Ⓡ
Fi
gur
e10.Fl
uor
esc
ence e
xci
tat
ion and e
mis
sion spe
ctr
a of SYBR
Gol
d nucl
eic ac
id ge
lst
rai
n bound t
o doubl
est
rande
d
DNA 20
Fi
gur
e 11.Fl
ow c
har
toft
he pr
oce
dur
es off
low cyt
ome
tri
c de
ter
-
mi
nat
ionandCE de
ter
minat
ionofpBR32
2DNA 23
Fi
gur
e 12.El
ect
rof
ocusi
ngofDNA st
ream 29
Fi
gur
e 13.Sc
hemat
icpr
ese
ntat
ionofdet
ect
ions
yst
em 31
Fi
gur
e 14.A s
ingl
e mol
ecul
ecapt
ure
d as i
t pas
sedt
hrough t
he
de
tec
tionz
one 31

- V -
Fi
gur
e15.Fl
uor
esce
nce Si
gnal
s di
spl
aye
d on an os
cil
los
cope and a
hi
stogr
am ofpl
asmi
d-DNA 34
Fi
gur
e16
.Hi
stogr
ams ofs
upe
rcol
ipBR322 DNA,t
he hi
stogr
am i
s
i
mpr
ovedbyl
ine
ari
zat
ionus
ingHi
ndI
IIdi
gest
ion 36
Fi
gur
e17
.Conf
irmat
ionofHi
ndI
IIdi
gest
ionCondi
ti
ons 36
Fi
gur
e18.Re
sul
tsofagar
osegele
lec
trophor
esi
sofHi
ndI
IIdi
ges
ted
pBR322DNA c
ompar
edt
osupe
rcoi
ledf
orm 37
Fi
gur
e19.Hi
stogr
ams of l
ine
ari
zed pBR322 DNA and i
ts Enz
yme
(
PST I
/SalI
)cutDNAs 38
Fi
gur
e 20.Re
sul
ts of me
asur
eme
nt l
ine
ari
ty t
est f
or l
inear
ize
d
pBR322DNA 40
Fi
gur
e 21.Typi
cal hi
stogr
am of pBR322 c
ount
ing wi
thout bac
k-
gr
oundcor
rec
tion 44
Fi
gur
e22.Typi
calhi
stogr
am ofpBR32
2count
ing af
ter bac
kgr
ound
c
orr
ect
ion 44
Fi
gur
e23.Typi
cale
lec
tropher
ogr
am ofCE de
ter
minat
ionof e
nzyme
hydr
olyz
eddNMP f
rom pBR322DNA 47
Fi
gur
e 24.Typi
cal hi
stogr
am of f
low c
ytome
tri
c de
ter
minat
ion of
pBR322DNA 49
Fi
gur
e 25.Di
git
alPCR ar
rayc
hip 50
Fi
gur
e 26.Re
sul
tsofd-PCR de
ter
minat
ionofpBR322DNA 52

- VI -
Ⅰ.서론

지난 20년간 분자생물학을 기반으로 고도로 발전한 바이오테크놀로지

(
BT)
는 21세기 주요 성장 동력으로서 바이오산업뿐만 아니라 의료,
환경,식품,법의학 등 다양한 분야에 광범위한 영향을 미치고 있다.
BT기술을 전방위적으로 활용하면서 관련 측정의 신뢰성이 주요쟁점
으로 대두되고 있다.대표적인 예로 유전자 증폭을 이용한 수돗물 중
바이러스 검출 기술의 유효성,두부에 포함된 유전자변형 콩 검출의
신빙성,그리고 배아줄기 세포 검증의 진위여부가 국내에서 커다란
사회문제가 된 바 있다.이러한 바이오 측정과 관련된 유효성 시비는
BT가 산업으로서 원활하게 정착하고, 소비자들이 BT 신상품 및
서비스를 안심하고 활용하는데 커다란 장애가 되고 있다.또한 신개발
상품의 과학적인 품질관리,품질 보증에 필수적인 신뢰성 있는 바이오
분석기술의 개발이 바이오산업의 정착을 위한 선결과제의 하나로서
크게 대두하고 있다.바이오 측정 또는 분석의 유효성에 대한 시비가
빈번한 데는 분석절차가 매우 복잡할 뿐 아니라 바이오분야 측정표준이
아직 정확하게 확립되어 보급되지 못하고 있기 때문이다.
따라서 바이오측정표준을 신속하게 개발하여 보급하는 일은 매우
중요하다.하지만 과학기술 측면에서 바이오분야의 측정 표준 기술은
아직 전 세계적으로 기술개발 초기 단계에 있으며 바이오물질의 특성
(
구조적으로 복잡하고 거대분자임)
상 기존의 분석기술로 쉽게 분석
하기가 쉽지 않다.또한 그 측정 대상이 너무 다양하며,정량적 개념 및

- 1 -
분석방법의 부재로 인해 분석 하기 쉽지 않다.
본 연구에서는 다양한 분석기술들을 접목하여,바이오 측정 표준의
일차분석법을 바탕으로 인증표준물질 등 실제 측정표준을 개발,보급해
나가고자 한다.이를 통해 현재 현장에서 사용되는 각종 바이오 분석법
보다 원리적으로 그리고 기술적으로 압도적인 우위에 있는 신개념 측정
기술을 개발하고,측정표준을 보급함으로써 바이오분석을 둘러싼 분쟁
을 종식 시키고 나아가 BT산업 및 서비스의 원활한 정착에 도움이
되고자 한다.본 연구에서 추구하는 핵심 연구방법의 하나가 바이오
단분자들의 계수 기반 정량분석(
count
-base
d quant
it
ati
ve anal
ysi
s)
이다.DNA 계수기반 정량기술은 생물학분야 최초의 절대정량 분석법으
로 개발해 오고 있는 분석방법이다.
단분자의 계수는 고감도 형광현미경으로 포착한 이미지에서 측정할
수 있다.하지만 분포의 불균질성,상대적 위치에 따른 신호세기의 변
화,이미지의 겹침,계수 자체의 부정확성 등 여러 가지 이유로 그 계수
정량의 정확도가 매우 부정확하다.또한 UV 흡광법을 이용해 DNA의
농도를 결정하는 방법을 사용하기도 한다.하지만 이 방법은 고농도에
서는 비교적 정확하지만 저농도에서는 매우 부정확하다.또한 I
CP-OES
(
induc
tive
lyc
oupl
ed pl
asma-opt
icale
miss
ion s
pec
tros
copy)및 I
DMS
(
isot
opedi
lut
ion masss
pec
trome
try)
를 이용해 정량할 수 있지만 감도
가 매우 낮기 때문에 저농도의 정량에 부적절하다.PCR(
pol
yme
ras
e
c
hai
n r
eact
ion) 및 RT-PCR(
real
ti
me-pol
ymer
ase c
hai
n r
eac
tion)
을
통해서 정량을 하기도 하지만 절대적 정량이 아닌 상대적 정량 측정
방식으로서 표준물질을 이용해 추가적인 검정을 해야 하는 단점이

- 2 -
 (1
,2)
있다.
유세포 분석(
流細胞 分析)기술은 위 방법들의 단점을 극복 할 수
있는 방법으로 연구되고 있다.DNA분자에는 많은 음이온 인산기가
있기 때문에 모세관의 양 끝 전극에 특정 전압,압력을 걸어주면 DNA
분자들이 모세관 내부에서 가운데로 이동하며 집적되어 이를 LI
F
(
3)
(
Las
eri
nduc
edf
luor
esc
ence
)방식을 통해 관찰할 수 있다. 특정 형광
염료와 결합한 DNA를 압력과 전압을 통해 흘려보내면,모세관의 특정
위치를 지나가는 DNA에서 나오는 형광을 APD(
Aval
anc
hePhot
odi
ode
)
를 통해 검출하고 CCD(
Char
ge Coupl
ed De
vic
e)를 통해 그 이미지를
확인할 수 있다.이 경우 좁은 유체의 흐름 중에 바이오분자를 띄우고
특정지점에서 지나가는 대로 그 수를 세면 되기 때문에 유세포 분석기
술은 여타 다른 측정 방법보다 측정원리상 보다 정확하다.다만,계수
정량용 표준물질을 따로 구하기 어렵기 때문에 교정이 불필요한 시료
부피 내의 모든 대상 분자를 계수하여 몰농도를 결정하는 “
exhaus
tive
(
1)
c
ount
ing”
을 수행할 필요가 있다.이러한 방법은 따로 검정곡선을
그릴 필요가 없기 때문에,또 절대분석법으로서 측정의 소급성을 제공
하기 때문에 DNA 측정 표준분야에서 그 의의가 크다.유세포 분석에서
는 DNA와 같이 상대적으로 형광신호가 작은 단분자들을 하나씩 포착
하기 위해서는 매우 감도가 높은 검출시스템이 필요하며 또한 고속으로
이동하는 단분자들로부터의 형광세기를 정확한 계수신호로 변환시키기
위한 알고리즘 및 데이터 처리 기술도 필요하다.
이 분야는 미국 Los Al
amos Nat
ionalLab에만 그 전문가가 있을
정도로 기술적 난이도가 높고 보편화되어 있지 않기 때문에 오랜 기간

- 3 -
많은 시행착오를 겪어야 했다.그럼에도 불구하고 지속적으로 기술개발
에 성공하여 현재 비교적 크기가 큰 λ-vi
rusDNA(
48.
5kbp)
의 정량적
계수에 성공하고,자체제작한 DAC 회로를 채용하는 등의 다양한 노력
을 통해 신호 대 잡음비를 기존에 비해 크게 개선하였다.또한 플라스
미드-DNA의 구조적 특이성에 따르는 측정의 문제점을 파악하고
해결책을 찾아 5kbp수준의 플라스미드-DNA를 안정적으로 계수 정량
할 수 있었다.

- 4 -
Ⅱ.배경

1.플라스미드-DNA

플라스미드(
plas
mid)
-DNA는 1952년 조슈아 레더버그 박사가 처음
(4
)
제안한 말이다. 세균의 세포 내에 복제되어 독자적으로 증식 할 수
있는 염색체 이외의 DNA 분자를 총칭하며,일반적으로 고리 모양을
띠고 있다.플라스미드-DNA는 염색체-DNA에 비해 그 크기가 상당히
작으며(
4∼100 Kb)스스로 복제가 가능하다.플라스미드-DNA는 세균
의 생존에 필수적이지 않으며,다른 종의 세포 내에도 전달될 수 있다.
이런 성질 때문에 유전공학에서는 세균 내 플라스미드-DNA를 세포
밖으로 빼내고 제한효소로 절단한 뒤 복제 하려는 유전자를 삽입하고
이를 다시 세균에 넣어 배양하는 유전자재조합 기술에 플라스미드-
DNA를 널리 사용하고 있다.따라서 유전 공학에서 널리 사용하는 플라
스미드-DNA의 정량은 매우 중요하다.플라스미드는 항생물질,중금속,
돌연변이원,박테리오파지 등에 대한 내성 유전자가 운반되거나 제한
효소,특별한 아미노산 등을 만들어지기도 하며,복잡한 유기화합물을
분해하는 유전자가 있기도 하다.일부 플라스미드-DNA는 접합과정을
통해 다른 박테리아 세포로 옮겨갈 수 있다.따라서 인위적으로 플라스
미드-DNA를 다른 박테리아 세포에 감염시킬 수 있고,이를 이용하여
유전 형질을 변환시킬 수 있으며,순수 하게 분리 정제하기 쉽기 때문
에 플라스미드-DNA는 현대 분자 생물학에서 가장 널리 사용되는 도구

- 5 -
가 되고 있다.Fi
gur
e1,2에 플라스미드-DNA의 화학적 구성요소와
구조가 나와 있다.

(
5)
Fi
gur
e1.Che
mic
als
truc
tur
eofpl
asmi
d-DNA

Fi
gur
e2.I
ll
ust
rat
ion ofa bac
ter
ium wi
th pl
asmi
dencl
ose
dshowi
ng
(
6)
c
hromosomalDNA andpl
asmi
ds

- 6 -
 1-1.pBR322플라스미드-DNA

자연 상태에 존재하는 플라스미드-DNA는 대부분 이러한 이상적인

특성과 거리가 멀기 때문에,편리하고 작은 인공 플라스미드 운반체가
제조되었다.pBR322 플라스미드-DNA는 유전공학의 발전에 크게 기여
하였으며,현재 사용하고 있는 많은 종류의 플라스미드의 시조가 되었
다.
pBR32
2 플라스미드-DNA가 복제원점(
repl
icat
ion or
igi
n)으로 사용된
것은 이완형으로서 세균의 염색체에 의하여 직접 조절을 받지 않기
때문에 세포당 15개 정도의 많은 수가 존재한다.또한 c
hlor
amphe
nic
ol
을 첨가하면 세균 염색체의 복제는 저해되지만 플라스미드의 복제는
지속되어 엄청나게 그 수는 많아진다(
세포당 1000-3000개까지)
.pBR322
플라스미드-DNA는 이처럼 세포당 사본 수가 많으며,크기는 Fi
gur
e3
과 같이 4,
361 염기쌍으로 구성되어 있으며 특정 효소에 의해 절제
할 수 있는 제한효소절단위치(
res
tri
cti
on s
ite)
를 가지고 있다.이러한
제한효소절단위치를 통해 제한효소가 특이적으로 식별,절제하고 특정
유전자를 삽입하여 증폭,배양 시킬 수 있다.또한 이 부위의 분포는 각
DNA의 특징이 되므로 제한지도로 이용할 수 있다.pBR322플라스미드
6
-DNA는 분자량은 2.
83x10 Da으로 작은 DNA에 속하기 때문에 분리
정제하기가 쉬우며,90% 이상이 super
coi
led 형태로 되어 있다.이렇게
플라스미드-DNA의 활용도가 높기 때문에 이 연구에서 측정대상물질로
하여 궁극적으로 활용도가 높은 인증 표준물질을 개발,보급하고자
한다.

- 7 -
 (
7)
Fi
gur
e3.I
ll
ust
rat
ionofapBR322pl
asmi
d-DNA

- 8 -
2.유세포 분석기

유세포 분석기는 1930년 스웨덴 Kar

oli
nskaI
nst
it
ute의 Cas
per
sson이

세포내 핵산과 단백질 양을 측정하기 위해 mi

crospe
ctr
o-phot
omet
er를
개발한 것이 그 시초이다.1947년 미국 Nor
th-wes
ter
n대학의 Guc
ker
등
이 공기를 빠른 속도로 주입하면서 검사체를 실려 보내고 입자가 통과
하면 빛이 산란되어 광검출기에서 전기 신호를 검출해 낼 수 있는 최초
의 유세포 분석기를 개발 하였다.유세포 분석기에서는 한 줄기의 유체
에 들어있는 미립자를 세고,조사하거나 구분한다.광학적 혹은 전자적
검출방법을 사용하여 각 세포의 물리,화학적인 특징 등 여러 요소를
동시에 분석할 수 있다.유핵 상태의 입자나 세포가 흐름 상태에서
검출영역을 지날 때 핵내의 DNA양이나 세포의 크기,표면항원,내부
조성 등의 차이 또는 변화를 분석할 수 있다.유세포 분석기는 레이저
에서 발진하는 단파장 광선을 유체의 흐름에 초점을 맞추는 방법을
사용한다.또한 여러 가지 검출기들을 사용하여 유체의 흐름이 빛 광선
을 통과하는 점에서 나오는 신호를 측정한다.검출기가 가시광선과
같은 방향으로 향하고 있으면 For
war
d Sc
att
er(
FSC)
라고 하며,빛의
진행 방향과 수직으로 검출기가 향하고 있으면 Si
de Sc
att
er(
SSC)
라
한다.부유하는 입자들은 광선을 산란시키며 입자에 붙어있는 형광물질
은 광원보다 낮은 주파수 에서 빛을 방출하는 들뜬 상태가 된다.검출
기로 측정한 형광의 신호 변이를 분석하여 입자의 여러 가지 물리적
화학적 특성에 대한 정보를 얻을 수 있다.유세포 분석기는 Fl
ow ce
ll,
광원,검출기,증폭기,신호를 분석 하는 컴퓨터로 구성되어있다.Fl
ow

- 9 -
c
ell
은 l
iqui
dst
ream (
she
ath-f
lui
d),광원은 주로 램프,Hi
gh or Low
powe
r수냉식 레이저,Re
d-HeNe(
633nm)
,HeCd(
UV)
,Di
odel
aser
s등
이 쓰인다.FSC는 세포의 부피와 연관되고 SSC는 핵의 모양,cyt
o-
pl
asmi
cgr
anul
e의 양과 종류 또는 세포막의 거칠한 정도 등의 입자의
내부 복잡성에 의존한다.어떤 유세포 분석기는 형광물질을 이용하지
않고 빛의 산란된 정도만을 이용하기도 한다.또 다른 유세포 분석기는
(8
)
각 세포의 형광성,산란된 빛,투과한 빛의 상을 형성하기도 한다.
유세포 분석기의 장점은 짧은 시간 내 수많은 입자나 세포에 대한
양적,질적인 측정을 하여 검체 내 입자나 세포 하나하나의 고유한
특징을 알아 낼 수 있다는 점이다.특히 모든 검출은 단일 세포 수준으
로 이루어지며 각각의 세포마다 여러 형광 물질을 동시에 사용하여
검색 하므로 다양한 물리적,화학적 특성을 한 검체에서 측정하여 객관
적인 계량화가 가능하다는 장점이 있다.
이 연구에서는 이러한 상용화된 유세포 분석기를 참고로 자체 제작한
유세포 분석기를 사용하였다. 유세포 분석기는 일반적으로 Fl
uidi
c
s
yst
em,Opt
icals
yst
em,el
ect
roni
css
yst
em 으로 구성되며 자체제작한
유세포 분석기는 Fi
gur
e4,5와 같이 구성되어 있다.전체적인 시스템의
분석 방식은 Fi
gur
e4와 같이 양쪽의 2개의 전극을 통해 전기를 걸며
압력을 이용해 모세관 내로 플라스미드-DNA분자를 이동시킨다.분자들
은 모세관을 이동하면서 특정 검출 위치에서 레이저에 의해 여기된 후
형광을 방출하며,이를 광 다이오드 어레이를 이용해 검출 한다.Fi
gur
e
5는 자체 제작한 유세포 분석기의 각 장치별 사진이다.

- 10 -
 Fi
gur
e4.Sc
hemat
icoff
low c
ytome
try

Fi
gur
e5.Par
tspi
ctur
eofhome
made
-fl
ow c
ytome
tryi
nst
rume
nt(
A)
Over
allpi
ctur
eoff
low c
ytome
try(
B)Hous
ing (
Sampl
einj
ect
or)(
C)
Pr
ess
urec
ont
rol(
D)Axi
scont
rol(
E)De
tec
tor
(CCD,APD)

- 11 -
 300

250

200
Number of Count

150

100

50

0
2 4 6 8 10
Signal intensity / V

Fi
gur
e 6.Typi
cal hi
stogr
am of f
low c
ytome
tri
c de
ter
minat
ion of
pBR322DNA

Fi
gur
e 6은 자체제작한 유세포 분석기를 이용하여 플라스미드-DNA
를 계수 분석한 결과 히스토그램이다.X축은 측정된 형광 신호 세기를
디지털 펄스로 변화 하여 나타낸 신호의 세기이며,Y축은 측정된 DNA
분자의 도수를 나타내고 있다. 전체적인 히스토그램은 정규분포를
이루고 있으며 측정된 전체 도수는 개개 플라스미드-DNA 개수와 동일
하다.

- 12 -
 2-1.Exhaust
iveCount
ing

이 연구에서는 개개 DNA분자의 절대량을 직접적으로 계수하기 위해

새로운 접근 방식을 사용하였다.이는 DNA의 양을 추적 하여 절대적

으로 계산하는 방식으로 “
Exhaus
tivec
ount
ing”이라고 부른다.유세포
(
1)
분석기에서 사용되어진 “
Exhaus
tive c
ount
ing” 방식은 다음과 같다.
형광 염료와 결합된 DNA분자를 일정 압력을 이용하여 모세관 내부에
채우고,이후 바탕용액을 주입하여 모세관 내부의 DNA 분자를 밀어냄
으로서,일정 체적내의 DNA의 양을 계수 하는 방식을 사용하였다.이
방식의 장점은 부피를 물리적 방법으로 정확하게 측정하면 농도 계산에
추가적인 검정이 불필요하다.따라서 검정 물질 필요 없이 DNA 분자의
기질의 농도를 정확하게 측정할 수 있다.그러므로 제안된 측정 방법은
일차 분석 방법의 원리로 사용할 수 있다.
(
1)
이 식은 다음과 같다.

c
(DNA)=[NC(
DNA)
/NA]/V (
1)

c
(DNA):측정된 DNA의 농도
NC(
DNA):측정된 DNA의 개수
NA :아보가드로의 수
V :시료의 부피

- 13 -
3.모세관 전기영동

모세관 전기영동은 유세포 분석기의 계수 정량의 유효성을 확인

하기 위한 검증 장비로 사용하였다.

3-1.모세관 전기영동의 정의

모세관 전기영동 장치(

CE;c
api
ll
arye
lec
trophor
esi
s)는 최근 분석기술

발전의 방향전환을 대표한다.CE의 가장 큰 이점 중 하나는 그 적용

범위가 넓다는 점이다. 처음에는 주로 생물학적 거대분자의 분석에
이용되었는데 현재는 아미노산,키랄 약품,비타민,살충제,무기이온,
유기산,염료,계면활성제,펩타이드와 단백질,탄수화물,올리고 뉴클
레오타이드와 DNA 제한 절편,심지어는 세포와 바이러스 입자 등과
같은 화합물의 분리에도 유용하게 이용될 수 있음이 입증되었다.CE에
서의 분리 메커니즘은 크로마토그래피에서와 다르므로 상호 보완적인
분석이 가능 하다.또한 CE 분석법 개발이 크로마토그래피보다 간단
하고,적은 양의 시료를 소모하며 유기용매를 거의 사용하지 않아도
된다는 장점이 있다.

- 14 -
 3-2.모세관 전기영동 장치의 구성

일반적인 모세관 전기영동 장치의 모형도가 Fi

gur
e7에 나타나 있다.

Fi
gur
e7.Sche
mat
icofc
api
ll
arye
lec
trophor
esi
sinst
rume
nt

CE는 기기 장비,실험 및 응용이 전반적으로 간단하다.실험과정을

간략히 설명 하면 다음과 같다.먼저 내경이 작은 용융 실리카 모세관

의 양끝이 완충액 저장 용기 안에 놓이게 되는데 이때 저장 용기내의

- 15 -
완충액은 모세관내의 완충액과 같아야 한다.저장 용기에는 고압 전원
공급부와 모세관 사이에 전기적 접촉이 가능하도록 전극이 연결되어
있다. 저장 용기중 하나를 시료 저장용기로 바꾸고(
주로 양극에서)
전기장이나 외부 압력을 걸어서 시료를 모세관 내로 주입한다.시료
용기를 다시 완충액 저장용기로 교환 후 전기장을 걸어주면 분리가
일어난다.시료 도입부의 반대쪽에서 모세관 벽을 통해 직접 광학검출
을 할 수 있다.모세관 전기영동에서 모세관은 폴리이미드(
pol
yimi
de)
로
코팅되어 있는데 이는 용융 실리카 그 자체는 매우 약하고 쉽게 깨지기
때문 이다.폴리이미드로 코팅을 함으로서 모세관을 유연하게 만들어
취급하기 쉽다.광학적 검출기(
opt
icalde
tec
tion:UV,UV/
Vis
,fl
uo-
r
esce
nce등)
를 사용하는 CE시스템에서는 보호되어 있는 폴리이미드
코팅을 조금 벗겨냄으로서 검출이 가능 하다. 모세관 안의 분리는
El
ect
rophor
eti
c mi
grat
ion과 함께 전기 삼투 또는 전기삼투적 흐름
(
EOF;e
lec
troosmot
icf
low)
이 중심적인 역할을 한다.모세관 전기영동
의 가장 중요한 현상은 가해진 전기장 안에서의 용액의 흐름으로 표현
되는 전기영동이다.EOF는 모세관 내의 액체의 흐름으로 이는 모세관
내벽의 표면전하로 인하여 나타나는 현상이다.모세관 내에 머무르는
시간은 그 용질의 전기적 이동도뿐만 아니라 EOF에도 의존하므로 EOF
(9
)
를 변화시키면 용질의 머무르는 시간을 조절 할 수 있다. 이와 같은
모세관 전기영동의 기본 원리 및 장치를 이용하여 플라스미드-DNA를
정량 분석 하였다.

- 16 -
 4.형광 염료의 특징

유세포 분석기를 이용하여 DNA를 계수 정량하기 위해 LI

F(Lase
r

i
nduc
ed f
luor
esc
ence
)방법을 사용하기 위해 형광 염료를 함께 사용
하였다.

4-1.형광 염료(
dye)
의 물리적 특성

핵산,단백질 분석시에는 많은 형광 염료가 사용되는데 형광 염료

마다 각기 다른 특성이 있다.염료는 nuc

lei
cac
ids
tai
ns에 따라 I
nte
r-
c
alat
ing dye,Mi
nor
-gr
oove bi
ndi
ng dye
,Exonuc
leo-t
ide bi
ndi
ng dye
3가지로 분류할 수 있다.
I
nte
rcal
ati
ngdye
는 DNA 분자 내부의 염기 사이로 4∼5염기쌍 마다
끼어 들어가며,ETBR(
ethi
dium br
omi
de)
와,pr
opi
dium i
odi
de가 여기에
속한다.DNA 분자 내부의 염기로 끼어 들어가 결합 하는 게 아니라
외부의 Mi
nor
-gr
oove
에 결합하는 염료이다.일반적으로 DAPI
(4'
,6-di
ami
dino-2
-phe
nyl
indol
e)와,Hoe
chstdye
가 있다.DNA 분자의 3,5
′양
말단에 결합하여 형광을 내는 염료로는 acr
idi
ne or
ange, 7
-AAD
(
ami
no-ac
tinomyc
inD)
가 있다.Fi
gur
e8은 염료의 결합 특성을 보여준
(
10)
다.

- 17 -
Fi
gur
e8.Sc
hemat
icdi
agr
am s
howi
ng t
hedi
ff
ere
ntbi
ndi
ng mode
sof
(
10)
dye
s(andot
herl
igands
)toDNA.

- 18 -
 Ⓡ
4-2.SYBR Gol
d형광 염료

Ⓡ
SYBR 염료(
N',
N'-di
met
hyl
-N-[
4-[
(E)
-(3-met
hyl
-1,
3-benz
othi
azol

-2-yl
ide
ne)
met
hyl
]-1-phe
nyl
qui
nol
in-1-i
um-2-yl
]-N-pr
opyl
propane-1,
3-di
ami
ne)
의 특징은 DNA i
nte
rcal
ati
ng 염료로 형광 감도가 좋아 이중
또는 단일 나선 DNA 또는 RNA를 검출하는데 유용하다.
(Fi
gur
e 9)
겔전기영동,UV 흡광법에 주로 사용되는 이 염료는 일반적으로 많이
사용되는 형광 염료인 c
yani
nedye보다 100
0배 이상 핵산과의 결합력
이 높으며,높은 양자 수율(
∼0.
6)값을 보여준다.형광 염료와 핵산이
결합한 상태에서의 최대 들뜬 파장은 495 nm이며,최대 방출 파장은
Ⓡ
537nm 이다.
(Fi
gur
e10)SYBR Gol
d는 ETBR (
ethi
dium br
omi
de)
에
비해 10배 이상의 검출 감도를 가져 DNA와 RNA의 검출에 유용하다.

- 19 -
 Ⓡ (
11)
Fi
gur
e9.Che
micals
truct
ureofSYBR dye

Ⓡ
Fi
gur
e 10.Fl
uor
esc
enc
eexc
itat
ion and e
miss
ion spe
ctr
a ofSYBR
(
12)
Gol
dnuc
lei
cac
idge
lst
rai
nboundt
odoubl
e-s
trande
dDNA.

- 20 -
Ⅲ.실험방법

1.시약

플라스미드-DNA(
pBR322)
는 Fe
rme
ntas(
#SD0041;Bur
li
ngt
on)
,플라
스미드-DNA를 희석하는데 사용한 1
X(10mM Tr
is-HCl
,1mM EDTA)
Tr
is-EDTA 완충용액을 만들 때 사용한 1M Tr
is-HCl
(pH 8.
0)완충
용액은 J
BI,0.
5M EDTA(
Ethyl
ene
-di
ami
net
etr
aac
eti
c aci
d,pH 8
.0)
은
Bi
one
er에서 구입하여 사용했다.증류수는 r
eve
rse osmos
iss
yst
em과
Mi
ll
ipor
eAl
phaQ pur
ifi
cat
ion s
yst
em을 차례로 통과한 초순수를 사용
Ⓡ
했으며,추가적으로 mi
ll
ipor
edur
apor
e me
mbr
anef
il
ter 22 μm GV
s0.
를 이용하여 de
ioni
zedwat
er를 준비하였다.
유세포 분석기의 최적화에 쓰인 시료 λ-DNA는 Fe
rme
ntas(
#SD0011
Bur
li
ngt
on,Canada)회사에서 구입하였으며,이를 이용하여 플라스미드
-DNA(
pbr
322)분석시 최적 조건을 결정하였다.또한 유세포 분석기에
주입할 시료 제조에 쓰인 1
0% Tr
is-DMSO(
pH 9.
5)완충용액은 Si
gma
Ⓡ
에서 구입한 Tr
izma bas
es고체 시료를 이용하여 준비하였다.DMSO
Ⓡ
(
Dime
thylsul
foxi
de)
는 J
unse
i,형광 염료 SYBR Gol
d염료는 (
Invi
tro
ge
n, Car
ls 에서 구입하였다. SYBRⓇ
bad, CA, USA) Gol
d 염료는
DMSO를 이용,1/
1000
0희석하여 사용하였다.
플라스미드-DNA는 -20℃에서 냉동 보관한다.정량 분석시 시료를
상온에서 1
0∼15분 정도 녹인 후 시료 교반 장비 (
vor
texe
r,r
ocki
ng)
를

- 21 -
이용하여 10∼20초간 DNA 분자들이 균일 하게 섞이도록 한다.두 장비
는 DNA 분자들이 냉동 과정에서 생길 수 있는 클러스터가 최소화
된다.환형 구조의 플라스미드-DNA를 선형 구조로 만들기 위해 사용한
Hi
nd I
II효소와 10X 반응 완충용액(
100 mM Tr
is-HCl
(pH 8.
5),100
mM MgCl
2,1 M KCl
,1 mg/
mL BSA)
은 -20
℃에서 냉동 보관한다.
사용하기 전에 상온에서 10∼1
5분 정도 녹인 후 시료 교반 장비를 이용
하여 균질 하게 섞은 후 사용하며,또한 희석과정에 사용되는 완충용액
도 동일한 방법을 이용하여 잘 섞은 후 사용한다.

- 22 -
2.시료 전처리

이 연구에서는 플라스미드-DNA를 정량 분석하기 위해서 유세포

분석기,모세관 전기영동을 사용한다.하지만 기기에 따라 각기 다른

전처리 과정을 가진다.따라서 전체적인 전처리 과정을 Fi
gur
e 11에
나타내었다.

Fi
gur
e11.Fl
ow c
har
toft
hepr
ocedur
esoff
low cyt
ome
tri
cde
ter
mi-
nat
ionandCE det
ermi
nat
ionofpBR322DNA.

- 23 -
 2-1.유세포 분석기 실험용 시료 전처리

2-1-1.최초 시료 준비 및 희석

Fe
rme
ntas에서 구입한 플라스미드-DNA(
pBR32
2)최초 시료의 농도

는 0. μL이다.최초 시료 5μL를 1X(

5㎍/ 10mM Tr
is-HCl
,1mL EDTA)
Tr
is-EDTA 완충용액 50mL에 녹여,DNA의 농도가 약 0. μL로
05ng/
희석된 용액을 3개 유리병에 담는다.
시료 용액의 농도는 식 (
3)으로 계산된다.

 질량
  농도   ㎍  (
3)
 부피   부피

2-1-2.시료 효소 처리

유세포 분석기에 환형형태의 최초 시료를 그대로 주입하면 결과 히스

토그램이 정규분포의 형태로 얻어지지 않으며,모세관 내에서의 집적도
가 떨어져 DNA 분자들을 구별하기 쉽지 않다.이러한 문제를 해결하기
위해 Hi
nd I
II효소를 이용하여 플라스미드-DNA(
pBR322)특정 위치를
단일 절단하여 선형 구조로 만들면 정규분포가 좋은 히스토그램을 얻을
수 있다.이 결과는 환형 구조의 DNA 분자를 선형 구조로 만들어 바탕
잡음과 쉽게 구분 할 수 있으며 집적도를 향상시킬 수 있다.따라서
0. μL 농도의 DNA 용액 12 μL을 Hi
05 ng/ nd I
II1 μL,1X 완충용액

- 24 -
12 μL,증류수 95 μL와 잘 섞은 후 3
7℃ i
ncubat
or에 1 시간 정도
활성화 한다.이후 8
0℃ 20 분 동안 추가로 i
ncubat
ion 하여 이후의
효소 활성을 억제한다.이 결과 시료의 DNA 농도는 5 μL가 된다.
0pg/

2-1-3. 젤전기영동(
Gel el
ect
rophor
esi
s) 방법을 이용한
DNA 구조 확인

효소 처리된 DNA시료의 일부를 젤전기영동을 이용하여 환형의 구조

에서 선형의 구조로 바뀌었는지를 확인한다.아가로즈(
agar
ose
)의 고체
시료 0.
5 g를 1X TBE(
Tri
s-Bor
ate
-Et
hyl
ene
diami
ne-t
etr
aac
eti
c ac
id)
완충용액 5
0mL에 넣어 1% 아가로즈젤을 만든 후 3
분 동안 전자렌지
( 를 이용해 잘 녹인 후 3 μL ETBR(
극초단파) Ethi
dium br
omi
de)
을
넣어 잘 섞은 후 10∼15분간 젤(
Gel
)을 굳힌다.이후 효소 처리된 시료
5 μL에 6
X l
oadi
ng buf
fer
(2.
5% Fi
col
l400,11 mM EDTA,3.
3 mM
Tr
is-HCl
,0.
017% SDS,0.
015% Br
omophe ue)1 μL를 넣은 후
nolBl
젤에 40분간 100V로 전기영동 하여 결과를 확인한다.
이 방법은 유세포 분석기 주입 시료를 만들기 전 효소 처리 단계에서
사용하여 환형 DNA의 구조가 선형 DNA 구조로 바뀌었는지를 확인
한다.

- 25 -
 2-1-4.추가 시료 희석

유세포 분석기는 극저농도의 시료 분석하기 위해 만들어진 장비로서

기기의 가측범위내의 극저농도의 시료가 필요하다.따라서 측정할 수
μL의 시료를
있는 범위까지 추가로 시료를 희석해야 한다.즉 50 pg/
유세포 분석기에 주입하기에 적절한 농도로 다시 희석한다.가측범위
농도는 이전의 λ-DNA에 대한 직선성 실험을 통해 확인 하였다.50
μL의 시료를 다시 1X(
pg/ 10mM Tr
is-HCl
,1mL EDTA)Tr
is-EDTA
μL로 1
완충용액을 사용하여 5pg/ /10희석한다.과정을 거쳐 최초 시료
를 희석한 것은 효소처리 단계에서 효소 또는 10
X 반응 완충용액의
조성이 유세포 분석기에서 측정할 때 바탕 잡음을 증가시키거나 집적도
에 영향을 주기 때문이다.바탕잡음을 최소화하고 집적도를 최적화하기
위해 다시 1/
1 μL이다.
0로 희석하였다.이때 시료의 DNA 농도는 5pg/

2-1-5.유세포 분석기 시료 제조 및 형광 염료 첨가

μL 농도의 시료 50μL을 유리병에 담고 10% Tr

5pg/ is-DMSO 완충

용액 1450μL와 1
X 형광 염료 5μL를 섞어서 유세포 분석기 주입 시료
1,2,3을 각각 3병씩 총 9병을 만든다.이는 시료의 균질성을 확인하기
위함이다.
각각의 희석 과정 에서 무게를 정확히 측정하여 희석 과정에서 나올
수 있는 오차를 계산하여 최종 결과에서 이를 보정한다.전처리가 완료
된 시료를 바로 분석 하지 않는 경우,형광 염료가 phot
obl
eac
hing 되지

- 26 -
않도록 4℃ 냉장고에서 직사광선을 차단한 상태로 보관한다.각각의
희석 단계와 효소 처리 이후 형광 염료가 첨가된 최종 시료를 유세포
분석기를 이용하여 DNA분자의 계수를 측정한다.시료 압력(
0.04MPa)
을 가하여 60초 동안 모세관에 주입 한 후 바탕 용액을 주입하는 방법
(
1)
(
“Exhaus
itvecount
ing”
)을 사용하여 3∼4
분간 반복 측정한다.

2-2.모세관 전기영동 실험용 시료 전처리

모세관 전기영동으로 플라스미드-DNA를 정량하기 위해서는 특정

효소를 이용,DNA의 phos

phodi
est
erbond를 파괴 시킨다.먼저 DNA
20 μL,DNas
e I3 μL,Phosphodi
est
erase 2 μL,I
othal e 7 μL,
amat
증류수 55μL와 잘 섞은 후 3
7℃ i
ncubat
or에 1시간 정도 활성화 한다.
이와 같이 전처리 과정을 거친 DNA 시료 5 μL를 모세관 전기영동
장치를 통해 분석하는데, DNA를 구성하고 있는 요소 중 하나인
A(
ade
nine
),T(
thymi
ne)
,G(
guani
ne)
,C(
cyt
osi
ne) 각각의 염기를 UV
검출기(
260 nm)
로 그 양을 확인한다.이 방법은 모세관 전기영동을
이용한 dNMP 분석 방법 중 하나로서 상대표준편차가 낮아 매우 정밀
한 분석법으로 알려져 있다.분석과정간 정확하게 그 양이 알려져 있는
CRM(
인증표준물질)
을 표준용액으로 사용하였으며,I
othal
amat
e를 내부
표준물질(
Int
ernalst
andar
d)로 사용하여 모세관 전기영동 장치에 주입
(1
3)
된 양과 내부표준물질 사이의 상관관계를 통해 검정하였다.

- 27 -
3.유세포 분석기 최적화 조건

3-1.유체공학(
Flui
dics)

단분자 DNA를 정량하기 위해서는 유체 채널에서 목표 DNA 분자를

가는 유체의 흐름 속에 이동시켜야 한다.하지만 통상적인 상태에서
DNA 분자들을 검출 위치에서 검출하기는 쉽지 않다.따라서 DNA
분자들을 검출하기 위해 아래와 같은 고감도 검출 방법을 사용하였다.
과거에는 s
heat
h cuve
tte 방식을 구성하여 DNA 분자를 빠른 s
heat
h
f
low를 통해 검출위치의 중앙 축에 집적시킬 수 있었다.하지만 이
시스템을 이용하여 모세관 내에 DNA 분자를 집적 시킬 수 있었지만
DNA 분자의 금속 또는 플라스틱 표면에서의 흡착,탈착을 줄일 수
(1)
없는 단점이 있었다.따라서 "
exhaust
ive c
ount
ing" 을 수행하기 위해
서 간단한 유체 시스템인 사각형 형태의 f
use
dsi
li
cat
ube채널을 사용
하였으며 위 단점을 해결할 수 있었다.또한 염기,중성 pH에서의
(
14,
15)
모세관 흡착을 줄일 수 있었다. 내경 48μm × 5
0 μm 외경 375μm
× 375μm 모세관을 선택하여 실험에 사용했으며 모세관의 전체 길이는
100 cm이다.시료를 주입하는 곳부터 검출위치까지의 거리는 55.
5cm
이다.de
tec
tion wi
ndow에서는 모세관 튜브의 폴리이미드 코팅된 부분
을 제거하였고 압력과 전기장을 이용해 DNA 분자의 흐름을 중앙 축
으로 집적시킬 수 있었다.최초의 거대 DNA 분자의 모세관에서의
(
16,
17)
e
lec
tro-f
ocus
ing 현상은 Zhe
ng and Ye
ung 에 의해 보고되었지만
아직까지 정확하게 그 원리가 밝혀지지 않았다.압력은 0
.04 MPa를

- 28 -
사용하였고 전압은 -5kV를 이용하여 도입부에는 음전하를 반대쪽에는
양전하를 걸어 인산기로 인해 음전하를 뛰고 있는 DNA 분자들을 위와
같은 압력과 전압을 통해 이동시켰다.이러한 조건을 통해 DNA 분자들
은 유체상에 ±5 μm 정도로 중앙 축에 집적시킬 수 있었다.Fi
gur
e12
는 모세관 내에서의 전기장의 걸렸을 때 DNA 분자의 집적도 변화
양상을 보여 준다.

Fi
gur
e 12. El
ect
rof
ocus
ing of DNA st
ream: (
a) no e
lec
tri
cfi
eld
−1 −1
appl
iedf
ora f
low of10cm mi
n ;(
b)10
0 Vc
m ;wasappl
iedf
or
−1 −1
af
low of10 c
m mi
n ;(
c)100 Vc
m ;was appl
iedf
ora f
low of
−1
150cm mi
n ;

- 29 -
 3-2.검출장치(
Det
ect
ion syst
em)

레이저는 48
8 nm 수냉식 Ar
gon i
on l
ase
r(Model95;Le
xelLase
r,
Fr
emont
,CA,USA)
를 사용하였으며 먼저 Kepl
eri
an be
am e
xpande
r를
이용하여 레이저 빔을 확장시키고 4
X 대물렌즈를 이용하여 유체 채널
의 검출 위치에 초점을 맞춘다.대물렌즈는 mi
cro-t
rans
lat
ion st
age
를
이용하여 검출 위치에 정확하게 레이저 빔을 조사하게 조정할 수
있도록 하였다.검출 위치에 조사되는 레이저 빔 사이즈는 보통 20 μm
정도이며 f
use
dsi
li
cat
ubi
ng 채널은 슬라이드 글라스를 이용하여 고정
시켰다.방출되는 형광은 10X 대물렌즈를 이용해 수집하였고 산란되는
레이저 빔은 4
88nm 레이저 필터를 사용하여 제거하였다.또한 미러를
이용하여 형광 이미지는 e
lect
ron mul
ti
plyi
ng CCD(
ModelCasc
ade I
I;
Phot
ome
tri
cs,Pl
eas
ant
on,CA,USA)
를 통해 확인할 수 있도록 설계
하였으며 형광 세기는 APD(
SPCM-AQR12; Pe
rki
nEl
mer
, Fr
emont
,
CA,USA)
를 사용 하여 측정하도록 설계하였다.CCD는 모세관 내부의
DNA 흐름을 실시간 관찰할 수 있으며 APD는 각각의 DNA 입자의
형광 세기를 측정할 수 있다.검출기 앞에 488nm 차단 필터와 520nm
대역 통과 필터(
20nm passband)
를 설치하여 실험에 불필요한 파장의
빛을 차단하였다.APD c
oll
ect
ion l
ens
를 사용하여 매우 작은 det
ect
ing
wi
ndow(
200 μm × 2
00 μm)
에 초점을 맞추었다.전체적인 시스템은
아래의 Fi
gur
e 13
과 같다.전체 측정시스템은 암실에 설치하여 기타
빛의 투과를 최소화 하였으며,Fi
gur
e14는 CCD를 이용해 모세관 내에
DNA 단 분자가 지나갈 때 순간 포착한 이미지이다.

- 30 -
Fi
gur
e 13.Sc
hemat
ic pr
esent
ati
on ofde
tec
tion sys
tem:(
1) Ar i
on
l
ase
r;(
2)mi
rror
s;(
3)Kepl
eri
an be
am e
xpande
r;(
4)488 nm band-
pas
sfi
lt
er;(
5)4× obj
ect
ive l
ens
;(6)f
low c
ell(
fuse
dsi
li
ca squar
e-
t
ubi
ng)
;(7
)gl
asss
lide t
osuppor
tthe f
low c
ell
;(8)10× obj
ect
ive
l
ens;(
9)hal
fmi
rror
;(10)520nm band-pas
sfi
lt
erand 488nm c
ut-
of
ffi
lt
er;(
11)CCD;(
12)f
ocus
ing l
ens
es;(
13)APD det
ect
or

Fi
gur
e 14.A si
ngl
e mol
ecul
ecapt
ure
d as i
t pass
edt
hrough t
he
de
tec
tionz
one

- 31 -
4.데이터 처리 절차

4-1.신호 및 데이터 처리

APD 검출장비의 출력펄스는 phot

on c
ount
er로 계수된다.c
ount
er의

샘플링 속도는 2 kHz

이며 10 데이터 포인트를 주어 전형적인 DNA
피크 형태로 나타낸다.Count
erD/
A 신호는 자체 제작한 회로 시스템
에 의해 측정 신호와 형광 세기 신호로 생성되어 처리된다.검출 위치
를 지나가는 DNA 분자의 형광 세기의 피크는 DNA c
ount
er에 의해
디지털 신호로 생성된다.이를 오실로스코프에서 확인 할 수 있다.
(
Figur
e15,A)
형광세기 신호는 RC 회로(
Time c
onst
ant = 0.
33 ms)
에 의해
s
moot
hing되며 t
hre
shol
dleve
l의 설정보다 크면 피크로 인식하고 그렇
지 않으면 잡음으로 인식하여 제거한다. 피크 간격이 pr
eset t
ime
per
iod보다 작은 신호는 전기 잡음으로 인식하여 DNA 계수에서 제거한
다.피크 사이의 간격이 매우 좁은 형태를 보이는 신호는 DNA 분자가
겹쳐 지나간 것으로 간주하여 이중 피크로 계수한다.또한 피크의 간격
이 pr
ese
tti
me pe
riod보다 커도 이중 피크로 간주한다.일반적으로
전체 2000 계수 중 80에서 100 정도의 c
ount
가 이중 피크로,그 중
2∼3피크는 완벽하게 겹친 피크로 계수된다.모든 피크의 합은 측정된
DNA 분자의 총합과 같다고 간주된다.형광의 세기는 충분한 형광 염료
를 첨가하였을 때 DNA 분자의 크기에 비례하여 직선적으로 증가
(
18)
한다.

- 32 -
 히스토그램은 X 축은 DNA 분자의 형광 세기를 100
개 간격으로 나누
었으며 각 간격은 0.
1 V이다.전체적인 신호의 범위는 0 V부터 1
0V
까지이다.히스토그램은 DNA 시료의 크기의 동질성을 그림으로 표현한
것이다.
(Fi
gur
e15,B)
만약 검출 시스템이 정확하게 구성되어 있지 않다면 최초 플라스미드
-DNA 분자의 형광 세기는 넓게 퍼져서 나타날 것이다.정규분포의
피크의 도수가 주 분포이며 이를 합산하여 일정 체적내의 DNA 양을
계수 한다.정확한 플라스미드-DNA의 양(
numbe
rofmol
es)
은 식 (
4)
(
1)
으로 계산된다.

c
(DNA)=[
NC(
DNA)
/NA]
/V (
4)

최종 데이터 분석시 터보-C언어 소프트웨어 프로그램을 사용해 자체

TM
적으로 제작한 프로그램을 사용하였으며,최종 데이터 산출시 Exc
el,
TM
Mi
croc
alOr
igi
n 프로그램을 사용해 신호 분석 및 데이터 환산을
실행하였다.


   ×     (
5)
 

상대표준편차는 똑같은 방법으로 얻은 데이터들이 서로 얼마나 잘

일치하느냐 하는 정도를 가리키는 정밀도의 지표이다.

- 33 -
Fi
gur
e 15.Fl
uor
esc
enc
e Si
gnal
s di
spl
aye
d on an os
cil
losc
ope and a
hi
stogr
am ofpl
asmi
d-DNA (
A)Fl
uor
esc
enc
esi
gnalwas c
onve
rte
d
byD/
Aconve
rte
r(B)Typi
calHi
stogr
am ofpBR322-DNA c
ount
ing

- 34 -
Ⅳ.결과 및 고찰

1.Super
coi
led플라스미드-DNA의 절단

λ-DNA가 직선형으로 존재하는데 비해 대부분의 플라스미드-DNA는

Supe
rcoi
led 형태로 존재한다.이 Supe
rcoi
led DNA를 직접 계수하면
형광신호가 매우 작고 그 분포도 매우 넓다.따라서 신호와 잡음을
명확하게 구분하는 데 어려움이 따른다.Supe
rcoi
led 형태의 pBR322
DNA를 계수하면 Fi
gur
e16과 같은 결과가 얻어진다.Hi
nd I
II효소를
사용하면 pBR322DNA 고리를 잘라 선형으로 만들 수 있는데 이 경우
형광세기 축 상에 잘 응집된 형태의 히스토그램을 얻을 수 있다.
따라서 Supe
rcoi
led형태의 DNA 계수에는 DNA의 선형화 작업이 선행
되어야 한다.Supe
rcoi
led DNA의 선형화 효소반응의 적정화가 중요한
데 효소의 양과 반응시간을 중요하게 고려한다.Fi
gur
e 17에서처럼
주어진 시간 (
1 시간) 1μL)
과 효소양 ( 에 의해 반응이 완전하게 일어났
음이 확인할 수 있었다.Hi
nd I
II효소에 의해 잘린 pBR322 DNA를
아가로즈젤에서 살펴보면 Fi
gur
e 18과 같다.Supe
rcoi
led DNA에 비해
선형화된 DNA가 아가로즈젤과 더 작용하여 이동속도가 느려지는 것을
알 수 있다.DNA의 밴드가 진하게 하나로 나타나서 효소반응이 잘
진행되었음을 알 수 있다.

- 35 -
 P b r3 2 2 _ N o e n z y m e c u t
P b r3 2 2 _ E n z ym e c u t
400

350
N u m b e r o f C ou n t

300

250

200

150

100

50

0
2 4 6 8 10
S ig n a l I n t e n s i ty / V

Fi
gur
e 16.Poor hi
stogr
am ofs
upe
rcoi
lpBR322 DNA and i
tsi
m-
pr
ove
mentbyl
ine
ari
zat
ionus
ingHi
ndI
IIdi
gest
ion(
one
-cut
).

A B
1.0

1.0

0.8
Fr ac tio n o f In ta ct D N A
F raction of Intact DNA

0.8

0.6
0.6

0.4
0.4

0.2
0.2

0.0 0.0
0.5x 1x 1.5x
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0
Activation Time (h) Amount of Enzyme

Fi
gur
e17.Conf
irmat
ion ofHi
ndI
IIdi
ges
tion c
ondi
ti
ons
:(A)r
eact
ion
t
ime
;(B)e
nzymequant
it
y.Reac
tionwascompl
etewi
th1μL ofHi
nd
I
IIf 5oC.
or1hourat37.

- 36 -
 Hind III cut-pBR322

Hind III cut-pBR322

1 kbp ladder

original pBR322

Fi
gur
e18.Res
ult
sofagar
osege
lel
ect
rophor
esi
sofHi
ndI
IIdi
ges
ted
pBR322 DNA c
ompar
ed t
osupe
rcoi
ledf
orm.El
ect
ro-phor
esi
s was
per
for
medi
n1% agar
osege
l.

이와 같이 선형화된 pBR3
22 DNA의 히스토그램의 유효성을 검증

하기 위해 선형화된 pBR322DNA를 PstI

/SalI효소로 추가로 절편화
하여 계수한 결과 Fi
gur
e19와 같이 예상대로 14
05 bp의 절편과 2
956
bp의 절편이 각각 나타났다.pBR322
의 크기는 4361 bp 이다.특히
4361
,2956,1405 bp의 각 c
ount수가 거의 1:
1:1
에 가깝게 나타났기
때문에 계수의 유효성은 매우 높은 것으로 판단되었다.

- 37 -
 350 H i nd III_ O n e cu t
S a l I & P st I_ Tw o c u t
2956 bp
300
4361 bp
N u m b er of C ou nt

1 4 05 b p

250

200

150

100

50

0
2 4 6 8 10

S ig n a l In t en s ity

Fi
gur
e 19.Hi
stogr
ams ofl
ine
ari
zed pBR322 DNA and i
ts Enz
yme
(
PST I
/SalI
)cutDNAs
.

효소를 이용한 Supe

rcoi
led 플라스미드-DNA의 절단은 시료의 전해
질 농도를 높이는 기술적인 문제를 야기한다.λ-DNA와 같이 큰 DNA
(
48.
5kbp)
는 전기장 초점화에 의해 모세관 중심축을 향해 매우 밀집된
분포를 보이는데 비해 크기가 작은 DNA에서는 이 밀집도가 떨어져
계수성능이 저하된다.특히 시료의 전도도가 높을수록 밀집도가 더욱
떨어지는 경향이 있는데 선형화를 위한 효소처리 과정에서 시료의
전도도가 높아진다.이에 따라 효소반응 처리액의 적절한 희석이 필요
한데,적어도 1/
100의 희석비가 필요한 것으로 나타났다.따라서 효소에
의한 직선화 반응이 요구되는 플라스미드-DNA의 경우 최저 검출농도
가 1
/10
0희석비 때문에 증가한다.

- 38 -
2.기기의 유효성 검증

2-1.직선성 실험

계수정량의 유효성을 검증하는 중요한 방법의 하나는 직선성 실험이

다.이전 λ-DNA의 계수정량 결과에서 알 수 있듯이 농도가 진할 경우,
단일가닥 DNA 절편을 동시에 포착할 가능성이 높아져 결과적으로
계수 정량 결과가 작게 나타날 수 있다.pBR322 DNA 실험 결과
Fi
gur
e 20과 같이 18
0 nmol
/L 농도에서 눈에 띄게 직선성이 저하
되었다.그러나 저농도에서는 0.
1 nmol
/L까지 직선성이 그대로 유지
되었는데 이는 DNA의 흡착과 같은 부적절한 현상이 일어나지 않음을
보여준다.단,저농도에서는 측정도수가 200
여개로 급감하면서 통계적
이유로 측정의 표준편차가 15%까지 급증하므로 본연구의 실험 조건
에서 이와 같이 묽은 시료를 측정하는 것은 바람직하지 않다.Tabl
e1
에 직선성 실험결과를 정리하였다.

- 39 -
 7000
2
R :0 .9 9 9 9
6000

5000

4000
Count

3000

2000

1000

0
0 20 40 60 80 1 00 120 140 160 180
A m o u n t o f S u b s ta n c e C o n ce n tra tio n / (n m o l/l)

Fi
gur
e 20. Res
ult
s of me
asur
eme
nt l
ine
ari
ty t
estf
or l
inear
ize
d
2
pBR322 DNA.R up t
o130 nmol
/L0
.9999.Re
sul
tfor180 nmol
/L
wasof9.
2% unde
rest
imat
ion.

Tabl
e1.Res
ult
sofme
asur
eme
ntl
ine
ari
tyt
estf
orpBR322DNA.

C o n c e n t ra tio n
C o u n t- 1 C o u n t- 2 C o u n t- 3 A ve ra g e S td e v Rsd
( n m o l/ L )

0 . 12 5 293 262 219 25 8 . 0 37.2 14.4%

0.25 570 532 504 53 5 . 3 33.1 6.2%

0.5 10 7 5 1 0 62 1057 10 64. 7 9.3 0.9%

1 21 6 9 2 1 77 2043 21 29. 7 75.2 3.5%

2 42 8 2 3 9 91 4169 41 47. 3 146 .7 3.5%

2.5 52 7 5 5 0 65 5223 51 87. 7 109 .4 2.1%

3.5 67 3 3 6 5 23 6554 66 03. 3 113 .4 1.7%

- 40 -
 2-2.시료의 질량 결정

시료의 질량을 부정확하게 추정하면 계수 결과를 농도로 변환할 때

큰 오류가 발생할 수 있다.제조업체의 규격에 따르면 모세관은 50 m

당 1 μm씩 내경이 달라진다.평균 내경이 50 μm이므로 1 μm의 내경
변화에 약 4%의 질량 변화가 발생 한다.이는 무시할 수 없는 양이므로
시료의 질량을 최대한 정확하게 추정해야 한다.측정대상 모세관을
10m 정도의 길이로 잘라 물로 채우고 이를 되받아 나온 물의 질량을
측정하였다.10m 정도를 채우는 물의 질량이 약 25mg이므로 분해능
이 좋은 저울을 사용할 경우 질량의 추정이 정확하게 이루어질 수
있다.10 m의 모세관을 채울 경우,모세관 내 압력으로 물의 채움과
비움에 시간이 많이 걸려 실제로는 약 7
.5 m의 모세관을 사용하였다.
Tabl
e2에 실험결과를 정리 하였다.4회의 반복실험 결과 상대 표준
편차가 0.
47%에 불과하여 실험이 상당히 정교하게 이루어진 것으로
판단된다.실험에 사용된 모세관의 길이가 정확히 76
30mm이므로 단위
길이 당 시료질량은 평균 2
.42 μg/
mm로 계산된다.이 실험에 사용된
모세관의 중간 부분을 잘라 계수 정량에 적용하였는데,길이가 585mm
이므로 이 실험장치의 시료 질량은 1
.42mg으로 계산된다.

- 41 -
Tabl
e2.Re
sul
tsofs
ampl
ewe
ightme
asur
eme
ntsi
na7,
630mm l
ong
f
use
dsi
li
cac
api
ll
ary(
WWP05037
5;Pol
ymi
croTec
hnol
ogi
es)
.

Me
asur
eme
nt I
nit
ialwei
ght Fi
nalwe
ight Sampl
e
(mg) (
mg) (mg)
1 1898
.28 1916.
8 18 .5
2
2 1904
.03 1922.41 18 .3
8
3 1894
.24 1912.69 18 .4
5
4 1896
.47 1915.05 18 .5
8
Ave
rage 18 .4
8
STDEV 0.09
RSD 0.47%

- 42 -
 2-3.바탕 잡음 보정 및 모세관내 흡착 제거

크기가 작은 플라스미드-DNA는 그 크기에 비례하는 작은 형광신호

를 내므로 신호와 바탕잡음을 구별하는 것이 어려울 수 있다.Fi

gur
e
21의 결과는 잡음 영역을 차단하지 않고 미량신호를 모두 계수한 것인
데 신호의 크기가 아주 작아질 때까지 연속되다가 크게 증가하는 것을
볼 수 있다.이 경우 신호와 잡음을 구분하는(
gat
ing)선을 결정하기
어렵고,따라서 계수결과도 크게 영향을 받을 수 있다.
이러한 신호는 시료용액 내의 미세한 먼지 등에 의해 나타날 수 있기
때문에 용액을 철저히 필터 해야 하며,그럼에도 불구하고 나타나는
잡음신호는 수학적으로 제거할 필요가 있다.특히 DNA의 전처리에
사용되는 효소용액은 필터가 불가능하므로 이 용액을 통해 유입되는
먼지 등에 의한 잘못 측정된 신호를 배제하기 어렵다.따라서 바탕용액
의 계수 결과로 DNA 용액의 결과를 보정하였다.이와 같은 방법으로
바탕신호를 제거하면 Fi
gur
e 22와 같이 중심 피크 세기 이하에서
계수량이 충분히 감소하여 gat
ing의 어려움이 제거되었다.

- 43 -
 2 00
N u m b e r o f C ou n t

1 00

0
2 4 6 8 10
S ig na l in te n si ty / V

Fi
gur
e21
.Typi
calhi
stogr
am ofpBR32
2count
ing wi
thoutbac
kgr
ound
c
orr
ect
ion

2 00
Number of Count

1 00

0
2 4 6 8 10
S i gn a l in te n si ty / V

Fi
gur
e 22
.Typi
calhi
stogr
am ofpBR322 c
ount
ing af
terbac
kgr
ound
c
orr
ect
ion.

- 44 -
 (1
)
“
Exhaus
tive c
ount
ing” 의 정량 방법을 사용하기 위해서는 그 값의

유효성을 확인해야 한다.따라서 계수 정량 과정에서의 모세관 내부의

DNA의 흡착을 방지해야 한다. 알칼리성 pH 완충용액을 사용하여
모세관 표면이 음전하를 뛰게 하면 DNA의 정전기적 반발로 인해,
모세관 내부의 흡착을 막을 수 있다.
염기성 완충용액을 사용하면 유리 표면에 흡착이 일어난다는 것이 잘
(
15)
알려져 있어, pH 9.
5인 Tr
is-완충용액을 사용하여 흡착 문제를 해결
(
14,
15)
하였다. 매우 낮은 농도로 희석된 시료의 직선성을 측정할 때 흡착
이 일어났다면 계수 정량 값이 기대 값 보다 작게 나와야 한다.그러나
μL로 희석된 DNA 용액에서 좋은 직선성을 얻었기 때문에 모세관
5pg/
내부에서의 흡착은 일어나지 않는다고 추론할 수 있다.

- 45 -
3.pBR322DNA의 계수 기반 정량

3-1.모세관 전기영동을 이용한 측정

CE-dNMP 분석 방법의 감도 특성 상 CE-dNMP 분석방법은 계수

정량의 시료보다 약 10,
000 배 정도 진한 시료를 사용해야 한다.CE-
dNMP 분석 결과 Fi
gur
e23에 나와 있다.모세관 전기영동을 이용하여
dNMP를 분석하고 이로부터 pBR322-DNA의 농도를 구한 실험 결과는
Tabl
e3에 나와 있다.효소를 이용해 전처리 과정을 거친 DNA 시료를
4회에 걸쳐 실험을 반복하였는데 상대표준편차가 0.
89%로 매우 정밀
하게 이루어졌다.A,T,G,C 분석 값으로부터 각각 도출된 pBR322-
DNA의 농도도 매우 근접하게 일치하고 있음을 알 수 있다.CE 분석
결과 pBR322-DNA의 농도는 1
.8 0-7 mol
4x 1 /kg으로 결정되었다.

- 46 -
Fi
gur
e23.Typi
cale
lect
rophe
rogr
am ofCE de
ter
minat
ion ofe
nzyme
hydr
olyz
eddNMP f
rom pBR322DNA.

Tabl
e3.Res
ult
sofCE-dNMP de
ter
minat
ion ofpBR3
22DNA.(
uni
t:
mol
/kg)

Testsampl
eResul
t

Day 1 Day 2 Day 3 Aver

age 100X RSD

-7 -7 -7 -7
Cyt
osi
ne(
C) 1.
81x10 1.
83x10 1.
84x10 1.
83x10 0.
92%

-7 -7 -7 -7
Guani
ne(
G) 1.
81x10 1.
88x10 1.
84x10 1.
84x10 1.
03%

-7 -7 -7 -7
Adeni
ne(
A) 1.
81x10 1.
88x10 1.
84x10 1.
84x10 0.
70%
-7 -7 -7 -7
Thymi
ne(
T) 1.
81x10 1.
88x10 1.
84x10 1.
84x10 0.
92%
-7 -7 -7 -7
Aver
age 1.
81x10 1.
87x10 1.
84x10 1.
84x10 0.
89%

- 47 -
 3-2.유세포 분석기를 이용한 측정 및 유효성 검증

계수정량의 일반적 데이터는 Fi

gur
e24와 같다.시료 마다 각각 3회

에 총 9번에 걸쳐 실험을 반복하였는데 상대표준편차는 3% 이내로

매우 정밀하게 이루어졌다.반복성 실험 결과가 Tabl
e4에 나와 있다.
또한 계수정량에 의해 결정된 농도를 바탕으로 pBR322
-DNA 원액의
농도를 추정한 결과가 Tabl
e 5에 나와있다. 계수 정량으로 결정한
-7
pBR322-DNA 농도는 1
.75x 10 mol
/kg 이다.이는 CE 결과의 94.
8%
로 두 결과가 상당히 잘 일치하고 있으며 이는 λ-DNA 에서 얻은 7
0%
(
19)
일치도에 비해 매우 개선된 것이다. 구조적으로 안정된 pBR322-
DNA가 실험도중에 파손되지 않아 원액의 농도가 계수정량까지 그대로
유지되기 때문인 것으로 보인다.

Tabl
e4.pBR322DNA r
epe
atabi
li
tyt
estus
ingf
low c
ytome
try

Testsampl
eResul
t

Measur
ement Measur
ement Measur
ement

100X
1 2 3 Aver
age St
dev
RSD

Sampl
e
2368 2328 2314 2336.
7 28.
02 1.
20%
1

Sampl
e
2328 2305 2389 2340.
7 43.
41 1.
85%
2

Sampl
e
2386 2361 2289 2345.
3 50.
36 2.
15%
3

- 48 -
 300

250

200
Number of Count

150

100

50

0
2 4 6 8 10
S ig n a l in t e n s ity / V

Fi
gur
e24.Typi
calhi
stogr
am of f
low c
ytomet
ric de
ter
minat
ion of
pBR322DNA.

Tabl
e 5.Summar
y of r
esul
ts of f
low cyt
ome
tri
c de
ter
minat
ion of
1/
10000
-fol
ddi
lut
edpBR322DNA.

Count- Capillary Original CE FCM/

mol Number FCM-Conc.
Avg Volume -Conc. -Conc. CE

mol kg mol/kg mol/kg mol/kg %

-21 -6 15 -7 -7
2357.0 3.91 x 10 1.16 x 10 3.37 x 10- 1.75 x 10 1.84 x 10 94.8%

- 49 -
4.디지털 PCR을 이용한 저농도 DNA 정량 실험

본 연구에서 미량 DNA의 정량방법으로 계수정량을 시도하는데 비해

다른 나라의 국가표준기관들에서는 상용 디지털 PCR 장비를 이용하여

미량 DNA를 정량하고 있다.디지털 PCR 장비는 미국 샌프란시스코
소재의 Fl
uidi
gm 회사의 제품으로써,극미세 체적의 PCR 용기 어레이
를 활용하여 각 용기에 한 c
opy씩 들어간 DNA 템플레이트를 증폭하여
통계적으로 DNA의 양을 결정한다.Fi
gur
e25에 디지털 PCR 장비가
나와 있다.

Fi
gur
e25
.Di
git
alPCR ar
rayc
hip(
48channe
l)f
rom Fl
uidgm.

- 50 -
 이 방식의 측정원리의 근본적인 전제는 단일 DNA 템플레이트를
(
20)
100% 증폭,검출한다는데 있다. 그러나 실질적으로 7
0% 수준의 검출
감도가 보고되고 있다.본 연구에서는 DNA 계수정량의 유효성을 검증
하는 한 방법으로 이 디지털 PCR을 적용하였다.이 실험을 위해 일본
AI
ST의 장비를 활용하였다.본 연구의 주요 대상인 pBR322 플라스미
드 DNA를 디지털 PCR 장비로 정량 하기위해 Tabl
e6과 같이 pr
ime
r
쌍 및 pr
obe를 준비 하였다.이 시료에 대한 Di
git
alPCR 실험 결과가
Fi
gur
e 26에 나와 있다.pBR322
의 경우 직선성은 좋으나 이론값에
비해 측정된 값이 30% 적은 결과가 나왔다.이는 PCR이 잘 이루어지
지 않았기 때문인데 이는 pBR322 DNA의 s
upe
rcoi
led 구조와 관계가
있는 것으로 판단된다.

Tabl
e 6.Pr
ime
rs and pr
obe
s de
signe
dfordi
git
alPCR det
ect
ion of
pBR322pl
asmi
dDNA.

Pr
ime
rs/
probe
s Se
que
nce

For
war
dpr
ime
rforpBR322 TATCGACTACGCGATCATGG
Re
ver
sepr
ime
rfor
GCGACTCCTGCATTAGGAAG
pBR322
-DNA
Pr
obef
orpBR322-DNA CGGCCTCAACCTACTACTGG

- 51 -
 6 00

5 00 R:0.997
B:0.318
A:5.303
Detected (copies/uL)

4 00

3 00

2 00

1 00

0
0 40 0 800 1200 1600
Ex pecte d (copie s/uL)

Fi
gur
e26.Re
sul
tsofd-PCR de
ter
minat
ionofpBR322DNA.

- 52 -
Ⅴ.결론

-1
본 연구에서는 유세포 분석 기술을 이용하여 나노몰(
nmolL )정도

농도의 플라스미드-DNA의 계수 정량 방법을 설정하고 활용할 수 있었

다.분석 방법은 DNA 일차 정량 분석방법중 하나로 기존의 고농도
측정 방식을 벗어나 최초로 극 저농도의 단분자를 계수하는 방식을
사용하여 그 정확성을 높일 수 있었다.이 방식의 장점은,첫째 극미량
의 DNA 분자를 단분자 계수가 가능하며,둘째 시료 전처리 과정이
간단하여 시간과 비용을 절약할 수 있으며,셋째 별도의 보정이 필요
하지 않아 짧은 시간 내에 계수정량이 가능하다.측정 반복성은 3
%
이내이며 농도 범위는 약간 좁은 편이지만(
0.1∼14
0nmol
/L)측정 결과
2
의 직선성은 매우 뛰어나다.
(R =0
.9999)제안된 계수 정량 방법을 다양
한 실험 방법을 이용하여 비교하여 본 결과 94% 정도의 일치함을 확인
할 수 있었다.이러한 연구 결과를 통하여 기존 플라스미드-DNA를
정량 분석에 있어서 기존의 방법보다 효과적으로 사용될 수 있을 것으
로 사료되며 일차 분석법으로 유효한 결과를 확인 할 수 있었다.이
계수 기반 정량 방법은 DNA의 크기 분포와 절편화에 대한 정보를
주어 앞으로 널리 사용될 정량법으로 기대된다.앞으로 지속적인 기술
개발을 통해 보다 미세한 분자들을 계수 정량 하는 데 진전이 이뤄지
고,유세포 분석 기술을 개량하면 상업적으로 매력적인 시스템,더 나아
가 Fl
ow c
ytome
tri
csor
ter
를 개발할 수 있을 것으로 기대된다.

- 53 -
Ⅵ.참고문헌

1.O’
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on C,Wool
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Quant
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.Chem.2002,7
43670
-6.
2.YangI
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–61.
3.Vi
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76,59
–64.
4.Le
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03-430
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5.Madpr
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6. Fi
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- 54 -
7.Ayacop,Yi
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,Sche
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8.Zhar
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8.
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61.
14.Kang S H,Shor
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- 55 -
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.Chem.2001,73,10
91–9.
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,259–66.
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49–53
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.Chem.2002,
74,45
36–47
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.Chem.1999,71
,5470
–80.
19.Hyuk-Mi
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387.
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- 56 -
 ABSTRACT*

Count
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- 57 -
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- 58 -
 유세포 분석기(
flow cyt
omet
ry)
를 이용한
플라스미드-DNA의 정량분석

유 희 봉

충남대학교 대학원 화학과 화학전공

(지도교수 김 학 진,박 상 열)

본 연구에서는 고감도 유세포 분석기를 이용하여 개개의 DNA

분자를 정량분석 하였다.유세포 분석기를 이용하여 DNA분자를
분석 하는 방법은 일차 정량 분석방법 중 하나로 기존의 고농도
측정 방식을 벗어나,극 저농도의 단분자를 계수하는 방식을
사용하여 그 정확성을 높일 수 있다.측정에 사용된 DNA 분자는
pBR322 플라스미드-DNA로 4,
361 염기쌍과,이중 나선 구조,
환형의 형태로 되어 있다.유세포 분석기를 이용한 측정 방법은
다음과 같다.48μm x50μm의 실리카로 코팅된 모세관의 양 끝
전극에 특정 전압,압력을 걸어주면 DNA 분자들이 모세관 내부

- 59 -
에서 가운데로 이동하며 집적 되어 이를 LI
F(Lase
rinduc
ed
f
luor
esc
ence
) 방식을 통해 관찰할 수 있다.특정 형광염료와
결합한 DNA를 압력과 전압을 통해 흘려 보내면,모세관의 특정
위치를 지나가는 DNA에서 나오는 형광을 APD(
Aval
anc
he
Phot
odi
ode
)를 통해 검출하고 CCD(
Char
ge Coupl
ed De
vice
)를
통해 그 이미지를 확인할 수 있다.이 경우 좁은 유체의 흐름 중
에 바이오분자를 띄우고 특정지점에서 지나가는 대로 그 수를
세면 되기 때문에 유세포 분석기술은 여타 다른 측정 방법보다
측정원리상 보다 정확하다.다만,계수 정량용 표준물질을 따로
구하기 어렵기 때문에 교정이 불필요한 시료부피 내의 모든 대상
분자를 계수하여 몰농도를 결정하는 “
exhaus
tive c
ount
ing”
을
수행할 필요가 있다.이러한 방법은 따로 검정곡선을 그릴 필요
가 없기 때문에,또 절대분석법으로서 측정의 소급성을 제공하기
때문에 DNA 측정 표준분야에서 그 의의가 크다.
-1
이와 같은 유세포 분석 기술을 이용하여 나노몰(
nmolL )
정도 농도의 플라스미드-DNA의 계수 정량 방법을 설정하고
활용할 수 있었으며,측정 반복성은 3% 이내이며 농도 범위는
약간 좁은 편이지만(
0.1∼140 nmol
/L) 측정 결과의 직선성은
2
매우 뛰어나다.(
R=0.
9999) 제안된 계수 정량 방법을 다양한
실험 방법을 이용하여 비교하여 본 결과 94% 정도의 일치함을
확인할 수 있었다.이러한 연구 결과를 통하여 기존 플라스미드-

- 60 -
DNA를 정량 분석에 있어서 기존의 방법보다 효과적으로 사용될
수 있을 것으로 사료되며 일차 분석법으로 유효한 결과를 확인
할 수 있었다.

- 61 -
 감사의 글

2 년 전 처음으로 이 곳 한국표준과학연구원의 정문을 걸어

들어올 때의 제 모습이 떠오릅니다.대학원과 연구원 생활이라는
새로운 시작에 대한 설레임과 두려움,앞으로 이루어 나아가야
할 연구에 대한 열정 등으로 가득한 저였습니다.이러한 열정
앞에서도 지난 시간 동안 많은 어려움이 저를 힘들게 하였습니
다. 이런 저를 옆에서 지켜보아 주시며 끊임없이 힘을 주신
많은 분들께 이 글을 통해 감사의 마음을 전해드리고자 합니다.
먼저,2년 동안 아낌없이 지도 해주신 김학진 교수님과 박상열
박사님께 감사드립니다.함께 한 시간을 통해 교수님과 박사님으
로부터 참된 연구자의 마음가짐과 삶에 대한 성실한 태도를 마음
깊이 새길 수 있었습니다.학문과 삶에 대한 교수님과 박사님의
진심 어린 말씀 하나하나 새겨가며 최선을 다해 최선을 다해
살아가겠습니다.또한,바쁘신 일정에도 불구하고 논문 심사를
맡아주신 김정권 교수님께 감사드립니다.
연구소에서 2년 동안 함께 실험하고 생활하면서 부족한 점이
있을 때 마다 많은 도움을 주고 많은 것을 가르쳐준 형근이형
감사하고 앞으로 하시는 일 잘되길 바랍니다.그리고 언제나
같은 실험실에서 많은 도움을 주고 격려 해준 혁민이형,난숙누
나 감사합니다.남은 기간 좀 더 힘내서 원하는 목표,꿈 꼭 이루

- 62 -
도록 해요.또한 부족한 저에게 많은 가르침과 조언을 해주신
강덕진 박사님,정지선 박사님,강민정 박사님께 감사의 말을
전하며,그 외에 항상 밝은 모습으로 반갑게 맞아주고 격려해준
경화,혜선,효진누나,한나누나,송이 바이오임상표준센터 모든
분들에게 감사의 말을 전합니다.그리고 부족한 형이지만 잘
따라줘서 고마운 동근이,정혁이 고맙고,앞으로 남은 대학생활
열심히 하여 좋은 결실을 얻었으면 좋겠다.
그리고 내 친구 학정,준기,민규,종윤,정환아 고맙다.항상
내 옆에서 최고의 친구로 남아줘서.힘들고 어려울 땐 너희들이
도움이 많이 되었어.표현은 안했지만 항상 고맙게 생각한다.
아직 우리는 젊다.각자의 분야에서 지금 보다 더 노력해서 꼭
최고가 되자.파이팅!이 외에 글에는 담지 못하였지만 저를 아껴
주시고 격려해주신 모든 분들에게 감사의 말을 전합니다.
마지막으로 지금까지 제가 있도록 낳아 길러주시고 사랑해
주시고 묵묵히 저를 뒷바라지 해주신 부모님께 정말 고맙고 미안
하고 사랑한다고 전하고 싶습니다.많은 것이 부족한 저지만
많은 분들의 도움과 격려가 있었기에 이렇게나마 작은 결실을
맺게 되었으며 이에 다시 한 번 머리 숙여 깊은 감사를 드립니
다.이제는 이것을 끝이 아닌 시작으로 생각하며 용기와 희망을
갖고 앞으로 더욱 열심히 모든 일에 최선을 다하여 여러분의
도움과 관심과 배려에 보답하는 희봉이 되도록 하겠습니다.

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