Ⅱ.

화학물질이 유전자에 미치는 영향

Exp. 3. total RNA 추출 및

cDNA 합성
Exp. 3-1. Total RNA 추출 및 전기영동
 RNA (Ribonucleic acid)
• 리보핵산 (Ribonucleic acid) 또는 RNA 는
오탄당의 일종인 리보오스를 기반으로
뉴클레오타이드를 이루는 핵산의 한 종류
• 하나의 나선이 길게 꼬여 있는 구조를 지니며
DNA 의 일부가 전사되어 만들어 짐 .
• RNA 는 단백질을 합성하는 과정에 작용하
고 , 일부 바이러스는 DNA 대신 RNA 를
유전물질로 가짐 .
 RNA (Ribonucleic acid)
• RNA 는 오탄당인
리보오스를
기반으로 함 .
• RNA 에만
존재하는
하이드록시 (OH)
그룹으로 인해
RNA 가 DNA 에
비하여 불안정
 RNA 와 DNA 의 차이점
• 질소염기는 DNA 와 달리 티민 (T) 대신
우라실 (U) 을 갖는다 .
• 이중 나선인 DNA 와 다르게 RNA 는 단일
가닥으로 , DNA 에 비하여 짧은
뉴클레오타이드 서열을 가지고 있다 .
• DNA 가 deoxyribose 를 가지고 있는데
반하여 RNA 는 ribose 를 가지고 있다 .
 RNA 의 종류
• mRNA (messenger RNA)
– mRNA 는 단백질 서열 정보를 ribosome 으로 전달하는 역할
– 3 개의 뉴클레오타이드 서열 (codon) 이 하나의 아미노산을
암호화
– 5’ Cap 과 3’ poly A tail 을 갖는다 .
– 진핵세포에서 , mRNA 는 핵에서 세포질로 이동하여 ribosome
에 결합하고 , tRNA 와 함께 작용하여 단백질 서열로 번역
– 원핵세포에서는 , 핵과 세포질의 구분이 없으므로 , mRNA 는
전사가 일어나는 동시에 ribosome 에 결합되어 번역
 RNA 의 종류
• rRNA (ribosomal RNA)
– rRNA 는 ribosome 을 구성하는 RNA
– 진핵생물의 ribosome : 18S, 5.8S, 28S/ 5S
– 세포질에서 , ribosomal RNA 와 단백질은
결합하여 ribosome 이라 부르는 핵단백질
형태를 구성
• Small subunit : 18S + ribosomal proteins
• Large subunit : 28S + 5.8S + 5S + ribosomal proteins
 RNA 의 종류
• tRNA (transfer RNA)
– tRNA 는 80 개의 뉴클레오티드로 이어진 작은
RNA
– 폴리펩타이드를 신장하는 동안에 특정 아미노산을
전달하는 역할
– tRNA 는 아미노산 부착 지역과 코돈을 인지하는
안티코돈 지역을 가짐
• 기타
– snRNA, snoRNA, siRNA, miRNA
 유전자 발현
• 유전자에 의해 결정되는 형질이 표현형으로
드러나는 것 .
화학물질에 의한 유전자 발현 변화
• 유전자에 의해 결정되는
형질이 표현형으로
드러나는 것 .
• 전사 수준에서 특정
유전자의 전사량 변화는
표현형에 영향을 미칠
수 있음 .
– 항상성 변화 , 질병 , Bric, 2017
노화 등에 원인이 됨 .
II. RNA extraction
 RNA 추출 시 주의사항
• RNase 로부터 RNA 를 보호해야 한다 .
– 타액과 땀에 많은 양 포함되어 있음 .
– DEPC (DiEthyl PyroCarbonate) : 물 및
실험실기구에서 RNase 효소를 불활성화
– 세포 파괴 시 나오는 endogenous RNase 는
Guanidine HCl, Guanidinium thiocyanate
사용하여 불활성화 시켜야 함 .
RNA 추출의 원리
• 조직의 균질화 및 단백질 제거 : RNA
추출에 TRIzol reagent 사용
– guanidinium thiocyanate 와 acidic phenol/
chloroform 이 존재
– guanidinium thiocyanate 는 강력한 단백질
변성제로써 RNase 의 활성을 차단하는 역할
– acid phenol/chloroform 은 RNA 를 수용액
상태에 녹여 다른 물질들과 구분시킴
– Chloroform 처리하여 phenol 성분 제거
 RNA 추출의 원리
• RNA 회수 및 보관
– Isopropanol 을 이용하여 수용액에 녹지 않도록
함으로써 pellet 형태로 회수하여 DEPC water
에 보관 (-80 도 )

https://www.zymoresearch.com/pages/what-is-trizol
III. 전기영동
 RNA 전기영동
• RNA 분자는 음전하를 띄고 있어 (-) 에서 (+) 로
이동한다 .
• RNA 분자는 2 차 구조를 이루기 쉬워 겔 상에서
이동할 때 영향을 받는다 .
• 따라서 RNA 는 2 차 구조를 제거하기 위한 dena-
turing condition ( 변성 상태 ) 에서 전기영동한다 .
– Formaldehyde, Formamide, glyoxal, methyl mer-
cury 등 사용
2 개 band 의 의미는 ?
DNA 를 제거하기 위한 방법은 ?
 실험 목적
• 본 실험에서는 산화적 스트레스를 유발하는
것으로 알려진 대표적인 중금속인 카드뮴과 H2O2
( 저농도 , 고농도 ) 에 48 시간 처리한 기수산
물벼룩으로부터 total RNA 를 추출해 봄으로써
RNA 추출의 원리 , DNA 추출 방법의 차이점 ,
시약의 역할 및 실험기기 사용 방법을 익힌다 .
• 또한 화학물질 노출에 따른 유전자 발현의 과정과
의미를 이해한다 .
Exp. 3-2. RNA 정량 및 cDNA 합성
1. 핵산의 정량
 핵산 정량 및 정성분석
• 핵산 추출 후 얻어진 핵산의 양을 측정하는
정량 분석과 제한효소 실험이나 PCR 실험을
위한 시료로서 적합한가를 판정하기 위하여
정성 분석을 실시
① 자외선 흡광도법 (spectrophotometric analy-
sis),
② 겔 전기영동 (gel electrophoresis) 을 통한
band 밝기 비교
③ EtBr fluorescent quantitation 방법
 자외선 흡광도법
• UV 흡광도 분석은 시료 내에 핵산의 농도 뿐 아니라 순도를
간단하고 정확하게 측정
• 핵산 , 뉴클레오티드 및 뉴크레오시드 등은 purines 및 pyrim-
idines 염기의 공명구조 때문에 자외선 (260nm) 을 강하게 흡수
• 핵산의 총 흡광도는 핵산을 구성하는 염기들의 총 흡광도의
합과 같다고 생각할 수 있기 때문에 260nm 에서 흡광도를
측정하여 핵산의 농도를 산출한다 .
• 이때 , A260 값이 1 일 경우 두 가닥 DNA 는 대략 50 ug/ml 와
일치하며 , RNA 는 40ug/ml 와 일치한다 .
 자외선 흡광도법
• 한편 , 단백질이 강하게 흡수하는 280nm 에서의
흡광도를 측정하여 A260/A280 의 비를 계산함으로써
단백질에 의한 오염상태 추정 ( 시료의 순수도 측정 )
– 그 비가 1.8 과 2.1 사이에 속하면 순수한 DNA 또는 RNA
라고 할 수 있음 .
– 1.8 보다 작으면 protein 이나 carbohydrate 등 오염

A230 = 유기용매가 흡수하는 파장 (ex, phenol)

- 마찬가지로 A260/230 의 비를 통해서 유기용매 오염을
판단 1.8-2.1 사이면 순수한 DNA 또는 RNA 로 판단 가능
 자외선 흡광도법
• 이 방법은 시료의 양이 너무 적거나 시료가
깨끗하게 준비되지 못한 경우에는 정확한
분석이 이루어지기 어렵다는 단점이 있다 .
• 예를 들어 sheared DNA 나 RNA 등이
존재하면 높은 분자량을 가진 total ge-
nomic DNA 또는 total RNA 의 양을
정확히 측정하기 어렵게 된다 .
 핵산 농도 계산
• Double strand DNA 농도 (ug/ml) =
측정된 OD260 x 50 x 희석배수
• RNA 농도 (ug/ml) = 측정된 OD260 x 40 x
희석배수
– 1 A260 Unit 가 ds-DNA 는 50ug/ml, ss-RNA
는 40ug/ml 을 나타냄
cDNA 합성
 cDNA (Complementary DNA)
• 상보적 DNA(complementary DNA, cDNA)
는 전령 RNA(mRNA) 를 주형으로
역전사효소와 DNA 중합효소에 의하여
합성된 DNA
• mRNA 의 상보적인 복사본이므로 상보적
DNA(cDNA) 라 부르며 , mRNA 로부터
역전사 된 DNA 이므로 번역에 필요한
엑손만으로 이루어져 있다 .
 cDNA (Complementary DNA)
• 원핵생물에서 진핵생물의 유전자를
복제하거나 정상적으로는 발현되지 않는
특정한 단백질을 발현시키기 위해서 cDNA
를 이용한다 .
• 대장균 (E.coli) 을 이용하여 성장호르몬이나
인터페론 등을 생산할 때 cDNA 를
클로닝하여 이루어진다 .
mRNA  cDNA  plasmid vector 내 insertion  단백질 합성
 역전사 효소
• Reverse transcriptase
– RNA 를 주형으로 하여 이에 상보적인 DNA 를
합성하는 효소 : RNA 의존성 DNA 중합효소
– 1970 년대 테민 (Howard Temin) 과 볼티모어
(David Baltimore) 교수가 발견
– 역전사효소는 숙주 내에서 바이러스의 RNA 에
상보적인 DNA 가닥을 합성하며 , 바이러스는
이 DNA 가닥을 이용한 전사와 번역을 거쳐
증식된다 . ( 대표적인 예는 HIV)
 역전사 효소
• Reverse transcriptase
– 다른 여타의 DNA 합성 효소와 마찬가지로
프라이머 없이는 DNA 를 합성할 수 없다 .
– 때문에 대부분 진핵생물의 mRNA 의 3‘ 말단에
존재하는 폴리 (A) tail 을 이용하여 Oligo(dT)
또는 random hexamer 를 프라이머로 이용한다 .
 실험 목적
• 핵산의 정량 및 정성 분석 방법을 익히고 ,
cDNA 합성의 원리를 이해한다 .