Instrumental Analysis 1

Chap 30. 모세관 전기이동 , 장흐름 분획법

 개요
* 전기이동법 : dc 전기장에서 하전된 화학종의 이동 속도 차이로 분리
→ 분리분석이 힘든 무기 음이온과 양이온 , 탄수화물 , 아미노산 등에 응용
→ 장점 : 하전된 고분자 물질들을 분리
→ DNA 의 서열을 알아내기 위한 유일한 폴리뉴클레오티드 식별 방법
* 평평한 다공성 지지체 매질 위의 수용성 완충용액에 작은 양의 시료 주입
→ 양쪽 전극에 높은 dc 전압이 걸려 시료 이온이 다른 전극 쪽으로 이동
→ 주어진 화학종들의 이동속도는 이들의 전하와 크기에 따라 다르다
→ 분석물들의 전하 - 대 - 크기의 비의 차이에 따라 분리
→ 이 비가 크면 클수록 , 이온들은 전기장에서 더 빨리 이동
 종류 , 원리
* 평판 전기이동법 : 분자량이 큰 생물학적 화학종들을 분리에 오랫동안 사용
→ 다공성 반고체 겔로 되어 있고 완충용액으로 채워진 얇고 평평한 층을 이용
→ 시료 : 평판 위에 점적 또는 띠 주입 → dc 전압을 일정시간 동안 걸어줌
→ 분리가 끝나면 TLC 처럼 분리 화학종 발색
* 모세관 전기이동법 : 평판 전기이동법을 기기장치화 한 것
* 전기이동 분리법의 원리
→ 전기장에서 한 이온의 이동속도 , ν = μeE (cm/s)

→ μe: 전기이동 이동도 (cm2/V·s), E: 전기장의 세기 , V/cm

→ 전기이동 이동도 , μe ∝ ( 분석물의 이온전하 / 마찰 지연인자 )

→ 분석물 이온에 대한 마찰 지연력
→ 이온의 크기 , 모양 , 매질의 점도에 의해 결정
→ 크기가 같을 경우 , 전하가 클수록 더 빨라짐
→ 전하가 같을 경우 , 이온이 작을수록 , 마찰력이 작아지고 더 빨라짐
 모세관 전기이동법
* 모세관 전기이동법의 장점 :
→ 매우 작은 시료부피 (0.1∼10 nL) 에 대해 빠른 속도와 큰 분리능
→ HPLC 의 검출기 가능

* 이동속도와 단높이
→ ν = μeE = μe(V/L), E: 전압 크기 (V) 에 비례 , 모세관의 길이 L 에 반비례
→ 띠넓힘 : 전기이동법은 세로확산 (B/u) 고려
→ N = μeV/2D, D: 용질의 확산계수 (cm2s-1)
→ 단수 , 분해능 증가 : 높은 전압 , L 증가 : 단수와 상관없음

* 모세관 긴 길이와 작은 단면적 때문에 용액의 저항이 매우 큼

→ 10,000∼25,000V 높은 전압 : 속도와 분리능 증가
→ 큰 표면적 : 빠르게 식힘 , 띠넓힘 작음
→ 단수 : 보통 100,000∼200,000, 폴리뉴클레오티드에 대한 단 수 : 10,000,000
 전기삼투 흐름
* 전기삼투 흐름 : 독특한 특징
→ dc 전압하에서 용매가 움직임
→ 실리카 / 용액의 전기 이중층 → pH 3, 양이온의 전기 이중층
→ 양이온이 용매를 끌고 움직임 → 띠 넓힘이 거의 없음
 전기삼투 흐름

* 전기삼투 흐름 속도 : 이온들의 이동속도보다 큼

→ 이동상 펌프 효과 → 중성 , 음이온까지 끌고 감
→ 전기삼투속도 , ν = μeoE, μeo: 전기삼투 이동도

→ 전기삼투의 이온속도 , ν = (μe + μeo)E

→ 용리 순서 : 그림 30-4

* 이동시간
tm = l / {(μe + μeo)E} = lL / {(μe + μeo)V}

* 단수
N = 16 (tm/W)2
 기기장치
* 용융 실리카 모세관 : 내부지름 10∼100 ㎛ , 길이 40∼100 ㎝ , 완충용액
채워짐
• 검출기 쪽에 음 또는 양 전압

* 시료주입
① 동전기 주입법
→ 모세관 한쪽을 시료에 넣고 전압을
걸어주는 방법
→ 단점 : 속도가 빠른 이온이 많이 주입

② 압력 주입법
→ 압력차이로 시료용액 주입
→ 단점 : 겔 모세관에 사용불가
 기기장치

* 흡광 검출법
→ 관에서 직접 검출 :
nL 이하의 검출 부피를 유지
→ 감도 증가 : 통과거리 증가
 응용
* 모세관 띠 전기이동법 (capillary zone electrophoresis, CZE)
→ 작은 이온 분리 , 이온교환법과 경쟁
ⓐ 양이온 분리 → 모세관 벽의 전기이중층 사용
ⓑ 음이온 분리에 유리 → alkyl ammonium salt 로 모세관 벽 처리
→ 장점 : 낮은 기기 비용 , 작은 시료크기 , 좋은 감도 , 빠른 속도 , 좋은 분리능
 응용
* 모세관 띠 전기이동법 (capillary zone electrophoresis, CZE)
→ 분자화학종 분리
ⓐ 자체적으로 이온 , 이온형태로 유도체화되는 분자
ⓑ 단백질 , 아미노산 , 탄수화물 분리
 응용
* 모세관 젤 전기이동법 (capillary gel electrophoresis, CGE)
→ 다공성 젤 구멍크기와 분석물 이온의 크기에 따라 속도 차이
→ 동일 전하의 크기가 다른 DNA 토막 , 뉴클레오티드 등의 고분자 분리 용이

* 모세관 등속 이동법 (capillary isotachophoresis, CITP)

→ 양이온 또는 음이온 동시에 분리하기 위한 방법
→ 이동도가 큰 이온 포함 완충용액은 시료의 앞 , 느린 이온 포함 완충용액은 뒤
→ 앞 용액은 양극 , 뒤 용액은 음극에 연결
→ 전기장을 걸어줄 때 , 각 이온들은 μeE 로 이동
 모세관 등전 집중법

* 양쪽성 양성자성 화합물 : 양성자 주기도 받기도 하는 화학종

eg) glycine, NH2CH2COOH = NH3+CH2COO-

NH3+CH2COO- + H2O = NH2CH2COO- + H3O+, Ka = 2 x 10-10

NH3+CH2COO- + H2O = NH3+CH2COOH + OH-, Kb = 2 x 10-12

→ glycine 은 약산성

→ 등전점 (isoelectric point, pI): 양이온과 음이온 농도가 같아지는 pH

등전점에서 [NH2CH2COO-] = [NH3+CH2COOH] 알짜이동이 없음
→ glycine 의 등전점 pI 는 pH 6.0
 모세관 등전 집중법

* 양쪽성 양성자성 화학종의 등전점 분리

→ pH 가 연속적으로 변화되는 혼합 완충용액에서 분리

→ 등전 집중법 실험
→ 분석물을 양쪽성 전해질에 녹임 → 음극 쪽 NaOH, 양극 쪽 인산을 넣음
→ 전압이 걸리면 , H+ 는 음극을 향해 , OH- 는 양극으로 이동
→ 알짜 음전하의 분석물 양극으로 → 점차적으로 양성자 첨가반응
→ 알짜 전하 0 이 되는 등전점 도달
 장 - 흐름 분획법
* 중합체 , 큰 입자 및 콜로이드와 같이 용해되거나 분산되어 있는 물
질을 분리하고 특성을 분석하는데 매우 유용한 분석

* 분리 메커니즘
─ FFF 에서의 분리는 얇은 리본 같은 흐름 채널에서 수행
─ 채널의 길이는 25~100 cm, 폭은 1~3 cm, 두께는 50~500 μm
─ 전기장 , 열 장 또는 원심장 (centrifugal field) 은 흐름 방향의 직각
방향으로 전달

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─ 시료는 채널 입구에 주입 , 외부 장은 채널 단면을 가로질러 전달
─ 외부 장이 존재할 경우 , 외부 전달 힘과 분석성분과의 상호작용
세기에 따라 시료 성분은 누적 벽을 향해 이동
─ 시료 성분은 누적 벽 근처에서 농도분포를 형성
─ 시료 층의 평균 두께 l 은 분자의 확산계수 D 와 장 - 유도 속도 U
값에 의존
─ 외부 장과 강하게 상호작용하는 시료 성분 A 는 느리게 용리 , B 와
C 는 채널에서 덜 압착되어 빠른 속도
─ 용리 순서는 C, B, A 순

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─ 분석성분들이 누적 벽 가까이에서 정류상태 모습을 나타내면 , 채널
흐름을 전달하기 시작하며 흐름은 층류 (laminar) 로 포물선의 모양이
됨
─ 운반체 흐름은 채널의 중앙에서 가장 속도가 빠르고 , 채널벽에서
가장 느린 속도
─ FFF 에서 분리된 성분들은 UV- 가시선 흡수 , 굴절률 , 형광 검출기
등과 같이 HPLC 분리에서 사용되는 것들과 유사한 검출기를
통과하여 검출기의 감응에 따라 도시 , 분획도 (fractogram)

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 FFF 방법
침강 (sedimentation) FFF
─ 채널은 침강 장 상자 안에 코일 형태로 장착
─ 질량과 밀도가 가장 큰 시료들은 침강 힘에 의해 늦게 용리 ,
작은 질량의 화학종이 먼저 용리
─ 크기가 다른 입자들 사이에 비교적 큰 선택성
─ 침강 FFF 는 분자 질량기준으로 106 보다 큰 분자에 쉽게 응용
─ 천연과 공업용 콜로이드 , 에멀전 , 세포 내 입자들과 같은
물질들이 침강 FFF 에 의해 쉽게 분리

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흐름 FFF
─ 모든 FFF 방법 중 가장 다양성이 높은 방법
─ 대칭 흐름 FFF: 교차흐름이 채널의 윗벽에 있는 다공성 프릿을
통해 유입되어 채널 바닥 벽에 놓인 초미세 여과막과 다공성
프릿을 통해 채널을 빠져나감
─ 수직 방향으로 전달되는 흐름은 비선택적으로 성분들을 누적
벽으로 이동
─ 하나의 주입 흐름은 채널 내에서 채널 흐름과 교차 흐름 두 개로
나뉘며 교차 흐름은 대칭 흐름 FFF 에서와 같이 채널 바닥을
통과
─ 흐름 FFF 는 단백질 , 합성 중합체 , 여러 종류의 콜로이드
입자의 분리에 응용

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 FFF 의 장점
① 분리하는데 충전물이나 정지상을 필요로 하지 않음
② 머무름과 이론단 높이에 대한 이론적 예측 정확
③ 외부 장은 FFF 에서 머무름을 지배함

- FFF 가 크로마토그래피와 상호 보완적

- 크로마토그래피 분자량 영역을 넘어서는 거대 분자와 입자에 가장
잘 어울리는 방법

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