#Sanger sequencing 원리

DNA 서열 증폭을 위해서는 DNA 를 구성하는 기본 단위인 dNTP 가 필요하다. DNA 서열에

dNTP 가 중합될 때, DNA 서열 마지막 nucleotide 3 번 탄소의 수산화기(-OH)와 새로운 dNTP 5
번 탄소의 인산기가 반응하여 결합된다. Snager sequencing 에서 ddNTP 는 dNTP 의 3 번 탄소에
산소(oxygen)이 존재하지 않는, 즉 수산화기(-OH) 대신 수소(-H)가 결합되어 있는 nucleotide
구조이다. Sanger sequencing 을 진행할 때는 dNTP 에 추가적으로 소량의 ddNTP 가 포함된
PCR 을 우선 진행한다. 이 때, 4 가지의 ddNTP 는 서로 다른 형광물질로 염색되어 있다. PCR
과정에서 DNA 가 증폭되던 중 dNTP 대신 ddNTP 가 결합된 경우, ddNTP 의 3 번 탄소에는
수산화기가 없으므로 더 이상 새로운 인산기가 결합될 수 없어 증폭이 중지된다 (chain
termination). ddNTP 의 결합은 무작위적으로 일어나게 되므로, 수 많은 증폭과정을 통해 거의
모든 염기서열 위치에서 chain termination 이 일어나게 된다.

1 차적으로 ddNTP 를 포함한 PCR 이 완료된 후에는, 염기서열을 크기에 따라 작은 순서대로

정렬할 수 있는 전기영동을 이용하여 증폭된 서열을 정렬한다. 크기순으로 정렬된 서열의
순서대로 형광 신호를 인식시키면, 염기서열 순서대로 해당 염기 서열에 해당하는 핵산 정보가
각 서열 끝에 마지막으로 결합된 ddNTP 가 가지고 있던 형광물질 종류에 따라 읽히게 된다.

DNA 복제는 주형 DNA 에 상보적인 dNTP 가 결합하여 이루어지는데 이 염기서열 분석할 때 dNTP
대신에 ddNTP 가 결합하게되면 DNA 복제가 중단되는 원리를 이용하는것이다.

dNTP 는 기존에 있는 DNA 의 마지막 뉴클레오타이드에 새롭게 붙게되는 것이다. 맨 마지막에 있는

뉴클레오 타이드의 3 번탄소의 OH 와 새 dNTP 의 인산의 H 부분이 같이 반응을하여 물이 빠지며
결합하게된다. 이때 ddNTP 와의 차이는 deoxyribose 의 2 번탄소에 산소가 없는 상태이고 ddNTP
라고 하는 것은 2 번탄소와 3 번탄소에도 산소가 없는 상태이다. 이러면 새로운 뉴클레오타이드가
추가적으로 붙지않게되고 반응이 멈추게 된다.

Dideoxyribo Nucleoside Triphosphate 3 번탄소에 산소가없기 때문에 뉴클레오타이드가 이어질 수

없음.
시퀀싱은 크게 sanger sequencing 과 NGS(next generation sequencing)로 나뉜다. 이는 목적에 따라
주로 단일 유전자를 시퀀싱할 때는 sanger, 다수의 DNA 를 시퀀싱할때는 NGS 를 사용하는 것으로 각
실험에 따라 가장 적합한 방법을 선택해야한다. 이번 실험에서 진행하는 sanger sequencing 은
기본적으로 DNA 복제 원리를 이용하게 된다. 염기서열 분석시 primer, DNA template, DNA
polymerase, dNTPs, 형광물질 표지된 ddNTPs 가 필요로 한다. DNA 서열에 dNTP 가 중합 될 때 3
번 탄소의 OH 기와 새로운 dNTP 5 번 탄소의 인산기가 반응하여 결합하게 되는데 ddNTP 는 3
번 탄소의 OH 기가 없어 DNA 의 신장이 종결되는 방식으로 이러한 과정이 반복되고 무작위
적으로 dNTP 와 ddNTP 가 상보적인 결합을 하며 길이가 다른 여러가지 단일 가닥이 생성되고
ddNTP 에 형광물질이 표지된 것을 통해 전기영동과 형광 검출기로 염기서열을 분석할 수 있게된다.

전기영동과 형광 검출기를 통해 염기서열을 알 수 있게되는데 전기영동이란 전기장을 띤 매질에서

전기적 전하나 크기에 의해 이동시켜 분리시키는 방법이다. DNA 의 경우 인산기에 의해 음전하를
띄고 전기를 흘려주게되면 +극으로 이동하게된다. 이때 길이에 따라 이동시에 저항을 크게 받는데
길이가 길수록 저항을 크게받아 이동거리가 짧아지게되는데 이러한 차이를 이용하여 가장 아래쪽에
위치한 가닥이 가장 짧은 가닥이 위치하게 되고 이는 프라이머의 가장 가까운 서열이며, 가장 위쪽에
위치한 가닥이 가장 긴 가닥이 위치하게 되면서 이는 프라이머의 가장 먼 서열임을 알 수 있다. 이를
형광 검출기를 통해 분석하면 프라이머의 가장 가까운 순서대로 형광이 나타나고 이를 통해
염기서열을 알 수 있다.

sanger sequncing 에서는 이러한 원리를 이용하여 4 개 각각의 튜브에 ddGTP, ddATP, ddCTP, ddTTP
와 dNTP 들을 각 튜브에 다 넣어주고 주형가닥을 넣으면 조각의 길이들이 다른 여러 조각들이
생성되게 되는데 이것을 전기영동에 각각 4 개의 튜브에서 만들어진 것을 흘려보내게 되면 길이가
짧은 순서대로 밑에서 부터 나타나게 되고 이를 통해 염기의 서열을 알 수 있게된다. 이러한
염기서열은 ddNTP(5’-3’)에 의한 염기서열이므로 상보적인 결합(3’-5’)을 통해 알고자 하는
염기서열을 알 수 있다. 이러한 시퀀싱 방법은 적은 수의 표적을 빠르고 효율적인 측면이 있으나
많은 수의 타겟을 대상으로는 선호되지 않는 방법이다. 이러한 한계를 극복하기 위해 NGS 라는
방법이 고안되었으며 이는 sanger 보다 더 높은 감도와 같은 양의 DNA 로 더 많은 데이터를 얻을 수
있는 snager 의 한계점을 극복할 수 있는 방법이있다.

NGS 는 MPS(대량 병렬 시퀀싱)이 도입되면서 등장했다. Next Generation Sequencing 으로 Sanger

sequencing 과 유사한 원리를 기반으로 한다. DNA 가닥에 형광염료로 표지된 뉴클레오티드가
추가되고 각 염기는 염료의 색상에 따라 결정된다. Sanger sequencing 과 달리 NGS 는 한 번의
실험으로 전체 DNA 를 시퀀싱 할 수 있고 수백만 개의 PCR 을 동시에 실행하고 각각의 독립적인
반응에 어떤 염기가 추가되는지 확인하여 이를 수행할 수 있다. 즉 많은 양의 DNA 를 시퀀싱할 때
효율적으로 서열을 분석할 수 있는 방법이다. 대표적으로 illumine 사의 sequencing 이 가장
보편적으로 사용되는 방법이다.

시퀀싱 하고자하는 서로 다른 수 십억개의 single-strand DNA 조각들의 양쪽 끝에 double-stranded

linker 라는 adapter 를 붙여준다. Adapter 가 붙어있는 DNA 조각들은 각 상보적인 짧은 sequence
들이 붙어있는 flowwell 에 붙게되면서 이렇게 붙은 DNA 조각은 양끝이 모두 결합되면서 브릿지
모양을 형성한다. Single strand 에서 double strand 가되고 이것이 펼쳐지게 되면 2 개의 sigle strand
가 되고 하나는 forward strand, reverse strand 가 되며 증폭이 일어나고 이는 DNA 의 클러스터를
생성한다. 각 클러스터는 개별적으로 염기서열을 분석하게 된다. 이런 작업을 계속 반복하게 되면 똑
같은 DNA 가 여러 개 가 생성이되고 PCR 과 비슷한 증폭의 성과를 얻을 수 있다. 형광으로 검출이
가능할 정도의 양이 증폭이 되고 각각 base 에 따른 염기서열을 분석할 수 가있다. 분석 시 각각 다른
빛을 내는 형광 물질이 결합된 dNTP 가 DNA polymerase 에 의해 한 염기씩 합성되면서 빛을 읽고
그것을 기록한뒤 기록한 형광 물질을 washing 으로 제거하고 새로운 dNTP 가 합성되는 cycle 을 약
100 번정도 반복되며 결과적으로 수십 억 개의 DNA 조각들에 대한 약 100bp 정도의 sequence 를
얻을 수 있는 것이다.

* reverse strands 없애고 나머지 forward strand 가닥만 시퀀싱한다.