단백질 1 차 구조에 대한 연구

-폴리펩타이드 서열 분석-

대학 : 과학기술대학

과목 : 생화학 I

학과 : 바이오발효융합학과

학번 : 20212106

이름 : 현서연

<목 차>

1. 서론

2. 펩타이드 서열 분석 방법

2-1. Sanger 의 N-terminal 잔기 확인 방법

2-2. Edman degradation 을 통한 펩타이드의 전체 서열 분석

1. 단백질 1 차 구조의 이해

단백질의 구조와 기능을 연구할 때 단백질의 1 차 구조는 매우 중요하다. 단백질의 1 차 구조란

하나의 폴리펩타이드 사슬에서 아미노산 잔기를 연결하는 모든 공유 결합, 주로 펩타이드 결합과
이황결합을 말하며, N-terminal 의 아미노기로 시작해서 C-terminal 의 카복실기로 끝난다.
아미노산 서열의 차이로 단백질의 구조가 달라지며, 1 차 구조로 만들어지는 단백질의 독특한 3 차
구조들은 단백질의 기능을 결정한다. 즉, 아미노산의 서열이 단백질의 기능을 결정한다. 또한
진화적 관점에서 보았을 때, 서로 다른 생물종에서 유사한 기능을 갖는 단백질들은 유사한 서열을
가진다는 것이 관찰되면서 단백질의 1 차 구조와 단백질의 기능 사이의 관계가 밀접하다는 사실이
밝혀졌다.

Sanger 는 1950 년대에 인슐린의 A, B 사슬에 있는 아미노산을 모두 분석하고 이들을 연결하는

disulfide bond 의 위치와 구성을 알아냈다. 폴리펩타이드의 아미노산 서열과 단백질의 복잡한 3 차
구조를 밝히는 것이 어려웠던 그 시기에는 매우 획기적인 사건이었다. 이후 DNA 의
뉴클레오타이드 서열과 단백질의 아미노산 서열 사이에 어떠한 관계가 있다는 것이 밝혀졌고,
단백질 화학 분야에서는 지금까지도 전통적인 기법을 자주 사용하고 있다.

그렇다면, 이러한 단백질의 1 차 구조는 어떻게 결정되는가? 단백질의 1 차 구조는 아미노산의

서열에 의해 결정되며, 이를 알기 위해 우리는 아미노산 서열 정보를 얻어야 한다. 본 내용은 Fred
Sanger 와 Pehr Edman 에 의해 개발된 방법과 protease 를 이용한 폴리펩타이드 서열 결정 방법에
대해 설명한다.

2. 펩타이드 서열 분석 방법
2-1. Sanger 의 N-terminal 잔기 확인 방법

Sanger 는 N-terminal 의 아미노산을 확인하기 위해 FDNB 라는 시약을 이용하여 확인하는 방법을

고안했다. FDNB 가 N-terminal 에 결합하면 아미노산의 구조가 변하고, 이 결합화합물에 HCl 을
첨가하여 가수분해를 통해 폴리펩타이드를 각각 아미노산 단위로 분해한다. 이렇게 분해된
아미노산 중 FDNB 가 결합되어 있는 N-terminal 잔기를 찾아 N-terminal 잔기에서 다른
아미노산과 펩타이드 결합을 이루지 않는 유리 아미노산을 분리한다. 이를 동정하면 어떤
아미노산이 N-terminal 의 잔기인지 확인할 수 있다. N-terminal 잔기를 결정하는 것은
폴리펩타이드 서열을 결정하는 첫 단계이다.

2-2. Edman degradation 을 통한 펩타이드의 전체 서열 분석

Edman degradation 은 Sanger 의 기법과 유사하게 펩타이드를 분해하여 잔기를 확인하는

기술이다. 먼저, 페닐아이소싸이오사이안산염을 N-terminal 에 결합시킨다. 염기성 조건에서 이
시약을 반응시키면 N-terminal 잔기는 PTC 부가물로 구조가 변하고, 이 다음의 펩타이드 결합은
무수 트라이플루오로아세트산 조건에서 잘린다. 잘린 N-terminal 아미노산은
아닐리노싸이아졸리논 유도체에 의해 유도체화 되어 제거된다. 유도체화 된 아미노산을 산성
용액으로 처리하면 더 안정한 형태인 페닐싸이오하이단토인 유도체로 바뀌고, 이를 확인하여 N-
terminal 잔기를 결정한다. 나머지 펩타이드 절편은 정제하여 위 과정을 반복 시행하면 단백질의
전체 서열을 결정할 수 있다.

Edman degradation 은 펩타이드의 모든 아미노산을 분해하는 Sanger 의 기술과는 달리,

펩타이드의 N-terminal 잔기만을 표지하여 제거하고, 그 밖의 모든 펩타이드 결합은 그대로
보존하면서 서열을 분석할 수 있다. 이러한 특성 때문에, N-terminal 잔기가 떨어져 나간 서열은
다시 Edman degradation 으로 반복하여 서열 분석이 가능하다.
 2-3. Protease 를 이용한 단백질 서열 분석

짧은 펩타이드는 Sanger 나 Edman 분석법을 이용하여 그 서열을 결정할 수 있다. 하지만, 너무

긴 펩타이드는 한 번에 분석하기 어렵기 때문에 여러 조각으로 분해하여 서열을 분석한다. 이러한
경우에는 protease 로 단백질을 분해하여 길이가 짧은 펩타이드를 만들어내어 단백질 서열을
분석할 수 있다. Protease 는 기질 특이성이 있는 효소이고, 이로 인해 protease 는 각각의 특정
아미노산 말단의 펩타이드 결합만을 절단한다. 주로 트립신이나 카이모트립신이 사용되며,
트립신은 R(Arg)와 K(Lys) 말단 결합을, 카이모트립신은 F(Phe), W(Trp), Y(Tyr) 말단 결합을
절단한다. 이 방법은 예시를 들어 살펴볼 것이고, 이때 N-terminal 잔기는 E 라고 가정한다.

우선, N-terminal 잔기와 단백질의 아미노산 조성(개수)을 정한다. Sanger 방법에 의해

폴리펩타이드를 FDNB 로 반응시켜 N-terminal 의 잔기를 확인한다. 검출된 2,4-
다이나이트로페닐유도체는 글루탐산이라면, E(Glu)가 N-terminal 잔기라는 것을 알게 된다.
다음으로 단백질을 구성하고 있는 아미노산의 개수를 구해야 한다. 이것은 아미노산 분석기를 통해
알아낼 수 있다.

아미노산 분석기는 HPLC 의 일종으로, 아미노산을 가수분해하여 등전점(전하가 0 이 되는 pH)의

차이 등에 의해 아미노산을 분리한다. 단백질이나 펩타이드를 분해한 후 컬럼을 통과시켜
아미노산들을 분리하고, 유도체 화합물과 반응시켜 유도체 아미노산을 형성한다. 아미노산은 단일
결합으로 주로 이루어져 UV 파장에 대한 흡광을 가지지 않는다. 또한, 아미노산은 형광을 띠지
않기 때문에 형광 유도체화 과정을 거쳐 검출기에서 이들의 흡광도를 측정한다. 각각의
아미노산들을 정량화하여 조성을 파악하고 아래와 같이 조성표로 나타낼 수 있다. 이
폴리펩타이드는 총 38 개의 아미노산 잔기를 갖고 있다.

A 5 H 2 R 1
C 2 I 3 S 2
D 4 K 2 T 1
E 2 L 2 V 1
F 1 M 2 Y 2
G 3 P 3

N-terminal 잔기만 분석하면 단백질 전체 서열을 알 수 없기 때문에 protease 를 이용하여 전체

서열을 결정한다. 만약 단백질에 disulfide bond 가 있다면, 단백질을 절단하고 분해하는 데
어려움이 있을 것이다. 이를 방지하고 서열 결정을 효과적을 하기 위해 시약을 통한 산화환원
반응으로 disulfide bond 를 절단한다.

이제 protease 를 두 차례 이용하여 단백질을 절단하는데, 첫 번째로 트립신을 이용한다.

트립신으로 절단한 조각들을 에드만 분해법으로 서열 결정을 한다. (T-1,2,3,4) 여기서 살펴봐야 할
것은 각 서열의 시작과 끝에 존재하는 아미노산의 종류이다. T-2 는 E 로 시작하는데, 이는 앞서
sanger 방법으로 관찰한 N-terminal 잔기와 동일하기 때문에 T-2 는 N-terminal 에 위치한다는
것을 알 수 있다. T-3 는 D(Asp)로 끝난다. 트립신은 R, K 을 절단 자리로 정의하기 때문에 D 는
절단되는 중간 위치에 올 수 없다. 따라서, T-3 는 마지막에 오는 서열이다. 하지만, T-1 과 T-4 의
서열 위치는 알 수 없기 때문에 다른 시약으로 한 번 더 분해하여 분석한다.

두 번째 protease 로 브롬임화 사이아노젠을 이용한다. 이 시약은 M(Met)만을 절단 부위로

정의한다. 이를 이용하여 T-1,2,3,4 서열들과 비교하여 아직 정해지지 않은 T-1,4 의 순서를
결정한다. 이로써 단백질의 완전한 전체 서열을 결정할 수 있게 된다.

3. 결론
본문에서 Sanger 와 Edman 의 기법, protease 를 이용한 펩타이드의 서열을 분석함으로써
단백질의 1 차 구조를 결정하는 방법을 살펴보았다. 이렇게 결정된 1 차 구조, 단백질의 아미노산의
서열을 통해 몇 가지 중요한 사실을 알 수 있다. 유사한 기능을 가지는 단백질은 유사한 아미노산
서열을 가지고 있으며, 서로 다른 기능을 하는 단백질은 항상 다른 아미노산 서열을 가지고 있다.
또한 사람의 유전병의 원인 중 하나가 단백질에 결함인데, 이는 아미노산 서열의 단일 또는 상당
부분이 변화하거나 결실하여 생기는 것이다.
단백질의 1 차 구조가 중요한 또다른 이유는, 1 차 구조가 접혀 만들어지는 단백질의 독특한 3 차
구조가 단백질의 기능을 결정하는 결정적 요인이라는 것이다. DNA 와 단백질 서열 등을 포함한
다양한 생물학적 데이터베이스의 정보 분석이 생물정보학에서 활발히 이루어지고 있다.
생물정보학을 통해 우리는 더 많은 단백질 서열을 밝혀내고, 궁극적으로 생명체가 어떠한
메커니즘으로 진화되었는가를 알 수 있다. 따라서 우리가 생명의 역사를 밝히기 위해 단백질의
서열, 그 중에서도 1 차 구조를 연구하는 것이 우선이 되어야 한다.

4. 참고문헌

https://namu.wiki/w/CNBr (위키백과-브로민화 사이아노젠)

https://m.blog.naver.com/PostView.naver?
isHttpsRedirect=true&blogId=dyner&logNo=100206763355 (장하림의 생화학-단백질의 서열
분석)

https://en.wikipedia.org/wiki/1-Fluoro-2,4-dinitrobenzene (FDNB)

https://www.whatisbiotechnology.org/index.php/exhibitions/sanger/insulin (Wib-Sequencing
Proteins : Insulin)

http://www.cnucrf.re.kr/EquipView.asp?EquipID=25 (충남대학교 공동실습관–아미노산 분석기)

http://ajoo.or.kr/board/view?bd_id=prod01&wr_id=18 (아주과학-아미노산 분석기)

https://ko.wikipedia.org/wiki/%ED%8A%B8%EB%A6%BD%EC%8B%A0 (위키백과-트립신)

https://ko.wikipedia.org/wiki/%EC%83%9D%EC%96%B4_%EC%97%BC%EA%B8%B0%EC%84%9C
%EC%97%B4_%EB%B6%84%EC%84%9D (위키백과-생어 염기서열 분석)

https://www.youtube.com/watch?v=0UiTsr8dtDc (HPLC 아미노산 분석 방법)

David L. Nelson, 레닌저 생화학 제 7 판 (상), 월드사이언스, 2018, 96~100