29th Humantech Paper Award

애엽 추출물의 대장암세포 증식 억제 효과와

텔로머레이스 활성의 관계

본 연구는 암세포의 telomerase 활성을 감소시켜 정상 세포에 영향을 주지 않으며 암세포의 분열만을
억제하는 암 치료제 개발을 위해 필요하다. 이는 암세포의 apoptosis 를 유도함으로써 가능하다. 애엽 추출물
(DAM)의 높은 암세포 증식 억제 효과와 대장암 세포주 HT-29 에 대한 애엽 추출물의 세포 독성 효과와
apoptosis 유도 효과, apoptosis 와 telomere 의 감소의 연관성은 기존 연구에 의해 밝혀져 있다. 이에 DAM 의
암세포 증식 억제 효과, apoptosis 유도 효과와 암세포의 telomerase 활성 및 telomere 길이의 관계를
밝혀내고자 하였다. DAM 처리 시 농도별로 세포의 생존률(viability)을 측정하는 colony forming assay 를
진행하였고 DAM 처리 시 세포의 telomere 길이와 telomerase 발현량을 측정하였다. 또 DAM 처리 농도 별
세포의 형태(morphology) 변화를 관찰하였다. 실험 결과를 바탕으로 생성된 의문인 DAM 처리시 빠른 세포
사멸의 주요 원인에 대해 알아보고자 세포 주기를 조절하여 apoptosis 를 유도하는 p53 과 p21 의 mRNA
발현량을 측정하였다. 그 결과 DAM 처리 시 HT-29 에서 무처리군보다 telomere 길이와 telomerase 발현량이
감소하였다. 또 처리한 DAM 농도가 늘어남에 따라 colony 의 개수가 감소했고, DAM 을 처리했을 때 HT-29
- 논문(Full
에서는 p53 paper) 12 페이지
과 p21 초과 시모두
의 발현량이 탈락 증가했으나
(참고문헌 등HeLa 모든 에서는
내용 포함)p53 의 발현량만 증가했다. 이 연구는 DAM
- 국내외 공개 출판물 게재 예정(accept 포함) 정보 표기 시 탈락
- 처리 시 HeLa 와 비교해 HT-29 에서 telomerase
영문과 국문 양식 중에 선택하여 작성, 홈페이지 內 응모요강 > 작성가이드 활성, p53 과 p21 발현량
참조 변화 관계를 밝혀냈으며, 이를 통해
- 익명 보장을 위해 문서내 개인정보 삭제 (* 파일 – 정보 – 문제확인 – 문서검사 – 검사 - 효과와
인체 세포에 대한 독성효과를 최소화한 암 치료 성분으로써 애엽 추출물의 문서 속성그및가능성을 제시하였다.
개인정보 '모두 제거' - 저장/닫기)

1. 서론 telomerase 활성을 연구하기에 적합한 세포주라고

암은 전 세계 사망률의 약 20%를 차지하며 [1],
국가통계포털 조사 결과에서도 암으로 인한 국내
사망률이 최고를 기록한 바 있다. 이에 삶의 질
향상과 건강한 노후를 위해 암의 발병 원인에 관한
연구가 활발히 진행 중이며, 암치료와 관련하여
암세포의 증식을 억제하는 물질 탐색에 대한
중요성이 강조되고 있다. 암세포는 다양한 요인들로
인해 세포 분열과 관련한 유전자가 손상되어
무분별하게 증식이 일어나는 비정상적인 세포이다.
보통 우리 몸은 암세포의 발생을 감지하고 제어하는
시스템이 갖추어져 있지만, 이런 체계에 문제가
생기면 암이 발병한다 [2]. 암세포의 무한한 증식의
이유 중 하나는 RNA 를 주형으로 염색체 말단에
존재하는 telomere 를 연장해 주는 역전사 효소인
telomerase 활성의 증가이다 [3]. 대부분 체세포에서는
telomerase 활성이 억제되어 세포 분열이 일어날
때마다 telomere 의 길이가 감소하며 [4], 세포 분열이
계속되어 telomere 의 길이가 일정 수준 이상으로
짧아지면 세포 분열이 중지되고 세포자살(apoptosis)이
일어난다 [5]. 하지만 암세포의 경우 증가된 telomerase
활성으로 인해 telomere 의 길이가 일정하게 유지되어
지속적으로 분열이 가능하다. 따라서 telomerase
활성을 억제하여 암세포의 증식을 억제하는 것은
체세포에는 적은 영향을 주면서 암세포를 효과적으로
억제할 수 있는 방법으로 활용될 수 있다 [6].
이와 관련한 암세포의 telomerase 활성 억제
연구에서 대장암 세포를 사용한 사례가 많이 보고된
바 있다. 특히, 대장암 세포주인 HT-29 에 호두
추출물과 Azidothymidine 을 처리했을 때 telomerase
활성이 억제되고 telomere 길이가 감소하였음이
보고됐다 [7-8]. 이에 우리는 대장암 세포주는
판단하였고, telomerase 를 억제하는 물질의 탐색은
대장암 치료제 개발에 긍정적인 방향을 제시해줄 수
있을 것이라 생각하였다. 그러나 고등학교 R&E
연구에서 telomerase 활성과 관련한 새로운 암세포
억제 물질을 탐색하는 것에는 여러 한계가
존재하였기 때문에 대장암 세포 억제 효과가 알려진
기존의 물질에서 Telomerase 활성 억제 관련성을
밝히고자 하였다. 따라서 대장암 세포주 HT-29 에
애엽 추출물을 처리했을 때 apoptosis 가 일어나 HT-
29 의 증식을 억제된다는 연구 결과(이정민 외, 2010)
로부터 애엽 추출물의 대장암 세포 증식 억제 효과가
telomerase 억제에 의한 것인지 알아보고자 하였다.
본 연구는 telomerase 가 정상 세포에서는 발현되지
않고, 암세포에서만 발현된다는 특성을 바탕으로 정상
세포에는 무해하면서 암세포의 증식을 막을 수 있는
암 치료제의 개발 가능성을 제시하기 위해
계획되었다. 본 연구에서는 애엽 메탄올 추출물을
대장암 세포주 HT-29 에 처리하여 애엽 추출물 처리
시 HT-29 의 viability, telomerase 활성 차이 및 telomere
길이 감소 정도를 알아보았다. 또한 애엽 추출물이
다른 암세포에 미치는 영향을 비교하기 위해
자궁경부암 세포주인 HeLa 에도 동일한 실험을
진행하여 애엽 추출물이 HT-29 에 특이적으로
apoptosis 를 유도하는 효과가 있는지 밝히고자 하였다.
2. 이론적 배경
2.1. 선행연구 분석
2.1.1. Walnut phenolic extracts reduce telomere length
and telomerase activity in a colon cancer cell model(Phil-
Kyung Shin 외, 2019)

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본 논문의 모든 저작권은 저자에게 있습니다.
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위 연구에서 호두추출물을 세포에 처리했을 때 , 세
포의 telomere 길이가 감소되고, telomerase 활성이 낮아
지는 것이 보고된 바 있다.
2.1.2. 대장암 세포주 HT-29 에 대한 애엽(Artemisia
argyi) 추출물의 항암 활성(이정민 외, 2010)
위 연구에서는 애엽 추출물을 HT-29 에 처리했을
때 cell cycle 저해와 apoptosis 가 일어난 바가
보고되었다. 이 선행 연구에서는 애엽 추출물이
어떠한 원인에 의해 apoptosis 가 일어나는지 밝히지
않았다. 세포가 apoptosis 를 일으키는 원인에는
telomere 길이의 감소, p53, p21 발현량의 변화 등이
있으므로 이를 확인하는 것이 본 연구의 목적이다.
2.2. Telomere 와 Telomerase
2.2.1 Telomere
Telomere 는 염색체의 끝부분에 있는 반복적인
DNA 부분으로, 세포 분열 시 세포에 관한 정보가
들어있는 염색체 끝부분의 소실을 막는 역할을 한다.
Telomere 는 세포의 수명을 결정하는 데에
관여하는데, 세포 분열을 반복하면서 대부분의
telomere DNA 가 손실되어 telomere 가 특정 길이보다
짧아지면, telomere 는 염색체 보호 기능을 하지
않는다 [9]. 이때, telomere 의 기능 상실은 DNA 의
손상으로 세포에서 인식하여 세포는 세포분열을
멈추고, 세포 노화나 세포 자살 과정으로 이어진다
[10].
2.2.2 Telomerase
Telomerase 는 역전사효소의 일종으로 RNA
분자를 포함하고 있다. 이 RNA 염기서열은 telomere
를 신장시키는데 있어서 주형으로 작용하기 때문에
elomere 와 상보적인 염기서열을 포함하고 있고,
이러한 구조를 이용하여 telomerase 는 DNA
중합효소와 독자적으로 DNA 의 염기서열 끝에
텔로미어 염기서열을 덧붙여 연장할 수 있다 [11].
2.3. Apoptosis 와 p53, p21
2.3.1. p53
p53 은 암 억제 단백질로 genome 의 돌연변이가
발생하지 못하도록 조절하는 역할을 한다 [12]. G1
기가 끝날 즈음, p53 유전자에 의해 생성된 단백질은
세포의 DNA 가 손상을 입었는지 점검한다. DNA 가
건강하다면 p53 은 세포 분열을 진행시키고, 손상된
DNA 를 발견할 경우에는 DNA 를 활성화시켜
수선하기위한 다른 단백질을 유도한다. 만약 손상이
수선하기에 너무 치명적이면 p53 은 세포가 스스로
파괴되도록 유도한다 [13]. 이를 세포사멸(Apoptosis)
라고 부른다. Apoptosis 는 변이된 세포가 계속
성장하지 못하도록 한다. 다른 건강한 세포는 손상된
세포를 대체하기 위해 세포분열을 촉진한다. 만약 p53
유전자의 돌연변이에 의해 p53 이 정상적으로
작동되지 못한다면 손상을 입은 DNA 를 가진 세포는
세포분열을 진행할 수 있게 된다. 이러한 손상된
세포가 계속 분열을 할수록 손상된 DNA 를 감지할
능력이 없으므로 더 많은 돌연변이를 낳게 된다. 이와
같은 돌연변이는 암을 유발한다 [14].
2.3.2. p21
2 본 논문에 포함된 정보의 전부 또는 일부를 무단으로 제 3 자에게 공개, 배포, 복사 또는 사용하는 것을 엄격히 금지합니다.
본 논문의 모든 저작권은 저자에게 있습니다.
p21 은 cyclin-dependent kinase inhibitor 로서 G1 기와
S 기 사이의 세포주기 진행을 저지시켜 손상된 DNA
를 교정하는 역할을 수행하는 종양 억제 단백질이다
15]. p53 이 세포의 운명을 결정하는 과정에서 p21
유전자의 프로모터에 결합하여 p21 이 전사되면
세포주기가 정지하고, 결합하지 못하여 p21 이
전사되지 않으면 세포사멸이 일어난다 [16].
3. 연구 재료 및 방법
3.1. 애엽 추출물 제조
본 연구에서 사용한 애엽은 다온 약초(Korea)에서
구매하였다. 건조된 애엽을 분쇄한 후 분쇄물에
메탄올을 넣고 이틀간 상온에서 진탕 배양하여 1 차
추출물을 제조하였다. 1 차 추출물을 185mm filter paper
와 깔때기를 이용해 여과시켜 2 차 추출물을 얻었다.
2 차 추출물을 50°C 에서 감압농축하여 methanol 을
모두 증발시킨 애엽 추출물(AAM 으로 명명)을
얻는다. AAM 은 syringe filter(0.2㎛)를 사용하여
멸균하였으며, 세포에 처리하였을 때 DMSO(sigma-
aldrich, USA)의 농도가 1%가 되도록 DMSO 에
희석하여 제조하였다. 본 연구에서는 DMSO 에
희석한 애엽추출물을 DAM 으로 명명한다.
3.2. 암세포 배양
본 연구에 사용된 대장암세포주(HT-29)와
자궁경부암세포(HeLa)는 한국세포주은행(KCLB, Seoul)
에서 분양 받았다. HT-29 세포와 HeLa 세포는 각각
10% fetal bovine sereum(FBS; Welgene, Korea)과 항생제
(Welgene, Korea)가 포함된 RPMI1640(Welgene, Korea)
와 DMEM(Welgene, Korea)에서 배양하였다. 세포는
5% 이산화탄소 농도와 37℃가 유지되는 세포
배양기에서 배양하였으며, 세포가 Cell culture flask
또는 dish(SPL, Korea)의 약 90% 정도의 면적을
차지할 때 마다 계대 배양하였다.
3.3. 애엽 추출물(DAM) 처리에 따른 세포 형태
(morphology) 변화
6well plate(30006, SPL, Korea)에 HeLa 세포는 3.3×105
개, HT-29 세포는 1.3×106 개만큼 seeding 하였다. seeding
후 약 18 시간 이후 각 well 별로 DAM 농도가 각각 0,
25, 50, 100μg/mL 가 되도록 처리하였다. 관찰은 도립
위상차 현미경(IX71, OLYMPUS, Japan)을
이용하였으며, 세포 관찰 주기를 일정하게 하기 위해
첫날은 7:30, 13:15, 16:15, 23:30 별로 관찰하였고 다음
날부터는 16:15 을 제외한 시간에 1일 3회
관찰하였다.
3.4. 애엽 추출물(DAM) 처리에 따른 세포의 생존
능력(viability) 측정
애엽 추출물 처리에 따른 세포의 생존 능력은
Colony forming assay 를 통해 확인하였다. 6well plate
에서 각 well 에 300 개의 세포가 첨가될 수 있도록
희석해 seeding 하였다. 다음날, 각 well 에 DAM(0, 25,
50, 100 μg/mL)을 처리한 후, 37℃에서 5% CO2 가
유지되는 배양기에서 13 일 동안 배양하였다. 13 일 후
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배지를 제거하고 Coomassie brilliant blue 용액(50% Primer stock solution(Telomere or SCR) 2μl
methanol, 10% acetic acid, 0.25% Coomassie brilliant blue)
⦁ΔCq(TEL)=Cq(TEL, target DNA qPCR
2X GoldNStart TaqGreen sample)-Cq(TEL,
master reference
1mL 로 5 분간 염색하였다. 3 개의 plate 로 반복하여 DNA sample) 10μl
mix(Cat#MB6018a-1)
실험을 진행한 후 형성된 colony 수를 평균내어 애엽 ⦁ΔCq(SCR)=Cq(SCR, target DNA sample)-Cq(SCR, reference
추출물 처리에 따른 세포의 생존 능력을 분석하였다. Nuclease-free
DNA sample) H2O(Cat #8918c) 7μl
⦁ΔΔCq[=ΔCq(TEL)-ΔCq(SCR)
3.5. 애엽 추출물(DAM) 처리에 따른 telomere 길이 ⦁reference DNA sample 에 대한 target Total
DNAvolume 20μl
sample 상대적
변화 −∆ ∆ Cq
Telomere 길이=2
3.5.1 DNA 추출 ⦁target DNA sample 의 chromosome 말단 1 개의 평균
HeLa, HT-29 세포를 각각 90mm culture dish(11090, telomere 길이=935kb×2−∆ ∆ Cq/92
SPL)에 2.0×106 개, 8.0×106 개를 seeding 한 후, 24 시간
뒤 DAM(0, 25, 50μg/mL)을 처리하였다. telomere 의
길이 변화가 일어날 수 있도록 6 일 동안 Table 3. qPCR program setup
배양하였으며, 이 과정에서 3 번의 계대 배양을
Step Temperature Time cycles
수행하였다. 계대 배양 시 배지에 DAM 을 처리하여
계대 배양 후에도 DAM 의 농도가 유지될 수 있도록 Initial denaturation 95℃ 10 min 1
하였다. DNA 추출은 GenEluteTM Mammalian kit(Sigma-
Aldrich, USA)를 이용하여 제조사 지시 방법대로 Denaturation 95℃ 20 sec
DNA 추출하였다. 추출된 DNA 는 Nanodrop 를 Annealing 52℃ 20 sec
사용하여 정량하였다. 40
3.5.2 qPCR(Real-time PCR)을 통한 Telomere 길이 Exiension 72℃ 45 sec
측정 Data acquisition Plate read
본 연구에서는 Absolute Human Telomere Length
Quantification qPCR Assay kit(ScienCell, USA)를 Opitional Melting curve analysis 1
사용하여 genome DNA 의 평균 telomere 길이를 Hold 20℃ Indefinite 1
측정하였다. qPCR 을 진행하여 telomere 의 길이를
분석하고자 하는 target DNA sample(DAM 을 무처리/
3.6. Western blot 을 통한 Telomerase 발현량 확인
처리한 HT-29 세포와 HeLa 세포의 gDNA)과 Telomere
DAM 을 농도별로 처리한 후 24 시간이 지난 HT-29
의 길이를 알고 있는 reference DNA sample 의
와 HeLa 세포를 Cell scrapper 를 이용하여 수거하여
ΔCq(TEL:Telomere primer 로 증폭하였을 때 Cq)와
3,000 rpm, 4 ℃에서 원심 분리하였다. 세포의 용해는
ΔCq(SCR:single copy gene primer 로 증폭하였을 때 Cq)
RIPA buffer 50µl 를 넣고 피펫으로 현탁시킨 후
를 각각 구하고, Table1 과 같이 Comparative ∆∆Cq
초음파 세포 파쇄기를 이용해 세포를 파쇄시켰다.
(Quantification Cycle Value) Method 로 telomere 의
단백질 정량은 Bradford 용액(BioRad, USA) 2mL 에
길이를 계산하였다.
세포 용해액을 넣고 분광광도계를 이용해 단백질을
정량하였다. 20µg 의 단백질을 gradient sodium dodecyl
sulfate polyacrylamide gel 에 전기영동 하였다. 분리된
단백질은 Nitrocellulose membrane(BioRad, USA)으로
390mA 에서 1 시간 30 분 transfer 하였다. 그 후
membrane 은 TBS 로 3 회 세척 후, non-fat milk 로
실온에서 40 분간 blocking 을 진행하였다. 알아보고자
하는 단백질의 항체를 Table 4 에서 제시된 희석
배율대로 3% bovine serum albumin(BSA) 용액에
희석하여 상온에서 3 시간, 2 차 항체는 5% non-fat milk
에 희석하여 상온에서 1 시간 반응시켰다. 항체
Table 1. Comparative ∆∆Cq (Quantification Cycle Value) Method 처리된 나이트로셀룰로스 막은 세척 후 ECL 용액
(Bio-Rad, USA)을 처리하였고, Chemidoc XRS+(ATTO,
Korea)을 통해 화학적 발광 반응 사진을 촬영하였다.
이를 위해 총 6 개의 gDNA(HeLa, HT-29-DAM 0, 25,
50μg/mL)를 이용해 각각을 주형으로 하여 Table 2 와 Table 4. antibody
Table 3 의 방법대로 qPCR 을 시행하였다. 총 3 회 Antibody manufacturer Dilution
반복 실험을 진행하였다.
Sigma-
Telomerase(R) 1:500
Aldrich(SAB4502945)
Table 2. qPCR reaction
GAPDH(R) Genetex(GTX100118) 1:20000
reference genomic DNA sample or
1μl
target genomic DNA sample Secondary antibody(R) Genetex(GTX213110) 1:10000

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현미경 관찰 시 DAM 을 처리하였을 때 HT-29 가

3.7. p53, p21 발현 정도 비교
본 연구에서는 역전사 중합효소연쇄반응(Reverse
Transcription PCR)을 이용하여 HeLa 와 HT-29 에서
GAPDH, p53, p21 의 mRNA 발현 정도를 분석하였다.
3.7.1 RNA 추출
HeLa, HT-29 세포를 각각 60mm culture dish(20060,
SPL, Korea)에 6.6×105 개, 2.8×106 개를 seeding 한 후, 24
시간 뒤 DAM(0, 25, 50μg/mL)을 처리하였다. DAM 을
처리하고 24 시간 후에 RNANucleoZOL(MN, Germany)
을 이용하여 제조사 지시 방법대로 RNA 를
추출하였다. Cell scrapper 를 이용하여 수거한 세포에
NucleoZOL 을 500µL 와 RNase-free water 200µL 를
넣고 균질화시켰다. 이후 상온에서 5 분 둔 후 15 분간
원심분리(12000g, 25℃) 하였다. 이후 상층액 500µL 를
새로운 tube 에 옮기고, iopropanol 500µL 를 첨가하여
상혼에서 10 분간 incubation 후 10 분간 원심분리
(12000g, 25℃)하여 RNA 를 침전시켰다. 그후
상층액을 버리고, 75% ethanol 로 2 회 wash 후 RNase-
free water 30µL 을 넣고 vortexing 한 후 nano drop 으로
정량하였다.
HeLa 보다 같은 DAM 농도에서 더 많은 비율의 죽은
세포가 관찰되고 세포의 밀도가 빠르게 감소하였다.
HT-29 는 DAM 의 처리 농도가 증가함에 따라 세포
수가 감소하였으며, colony 와 세포 자체의 크기가
작아졌고 응축된 모습을 보인 보였다(Figure 1a). HeLa
는 농도에 따른 세포 수의 변화는 뚜렷하지 않았고
AM 의 처리 농도가 높아질수록 길거나 핵이 여러
개인 경우 등 불규칙한 morphology 를 보였다(Figure
1b). 결과적으로 DAM 농도가 증가할수록 HT-29 와
HeLa 모두 세포의 형태의 변화가 관찰되었지만, 죽은
세포는 HT-29 가 HeLa 보다 더 많은 비율로
관찰되었다.
Fig 1. morphology changes. (a) HT-29 (b) HeLa

3.7.2 역전사 중합효소연쇄반응(Reverse 4.2. 애엽 추출물(DAM) 처리에 따른 세포의 생존

Transcription PCR) 능력(viability) 측정
총 6 개의 RNA(HeLa, HT-29-DAM 0, 25, 50μg/mL)
샘플을 이용해 각각을 주형으로 TOPrealTM One-step
RT qPCR Kit(Enzynomics, Korea)을 이용하여 역전사
반응과 qPCR 을 시행하였다. Reverse transcription 을
통하여 얻은 cDNA(complementary DNA)를 주형으로
하여 각각의 유전자에 대한 qPCR 을 수행하였으며,
총 3회 반복 실험을 진행하였다. 역전사
중합효소연쇄반응에 사용한 primer 는 Ludmila
Weglarz(2006)의 연구[18]에서 사용한 primer 를
변형해서 사용하였으며, primer 의 서열은 다음과 같다.
p53: forward 5′-TAACAGTTCCTGCATGGGCGGC-3′, reverse
5′-AGGACAGGCACAAACACGCACC-3′
p21: forward 5′-CACTCCAAACGCCGGCTGATCTTC-3′, reverse
5′-TGTAGAGCGGGCCTTTGAGGC-3′ HT-29 와 HeLa 에 나타나는 세포사멸 효과를
GAPDH: forward 5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′, reverse 확인하기 위해 colony forming assay 를 실시하여 DAM
5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′ 을 각 농도별로 처리하였을 때 생성된 colony 수를
측정하였다. HT-29 세포주에 DAM 을 0, 25, 50, 100
4. 연구 결과 μg/mL 의 농도로 처리하여 0 μg/mL 의 colony 개수에
대한 각 농도에서의 colony 수를 백분율(%)로
4.1. 애엽 추출물(DAM) 처리에 따른 세포 형태 나타내었다. HT-29 와 HeLa 모두 Figure 2, 3 에서
(morphology) 변화 나타나는 바와 같이 DAM 농도가 증가할수록 세포의
DAM 이 HT-29 와 HeLa 세포주에 대한 형태학적 생존 능력은 감소하였다. 세포 형태(morphology)
변화와 세포사멸 정도에 미치는 영향을 알아보기 관찰에서 HT-29 보다 DAM 에 대해 비교적 낮은
위해 DAM 을 0, 25, 50, 100 μg/mL 처리하였을 때
민감도와 세포사멸 속도가 관찰되었던 HeLa 세포가
시간에 따른 세포의 형태를 관찰하였다. 기본적으로
colony forming assay 에서는 HT-29 와 비슷한 세포의
HT-29 cell 한 개의 크기가 HeLa 에 비해 작으며, 분열
생존 능력이 관찰되었다. DAM 이 50, 100 μg/mL 일 때
후 붙어서 자라므로 colony 가 뚜렷하게 관찰되었다
HT-29 의 DAM 에 대한 민감성이 약간 높게 나타나긴
(Figure 1a, Figure 4). HeLa 는 낮은 세포 밀도에서
했으나, HT-29 와 HeLa 모두 DAM 처리 농도가
colony 를 형성할 때 분열 후 붙어 자라지 않고
높아짐에 따라 colony 개수가 확연히 감소하였다. 또한
주위에 넓게 분포하여 자라며 개체 수가 충분히
Figure 1 에서 DAM 의 농도가 50, 100 μg/mL 일 때도,
많아지면 뭉쳐서 자라게 된다(Figure 1b, Figure 4). 이때
상당히 많은 세포들이 바닥에 붙어서 자라며
colony 를 형성하면 성장 속도가 급격히 증가하였다.
생존하는 것이 관찰되었으나, colony forming assay

4 본 논문에 포함된 정보의 전부 또는 일부를 무단으로 제 3 자에게 공개, 배포, 복사 또는 사용하는 것을 엄격히 금지합니다.
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에서는 두 세포주 모두 같은 DAM 농도일 때 세포 결과를 통해 HT-29 의 평균 telomere 길이가 HeLa 에

형태 관찰 시보다 더욱 DAM 에 대해 높은 민감성을 비해 길다는 특성을 가지고 있음을 알 수 있었다
보였다. 특히 100 μg/mL 의 높은 농도에서는 1% (Figure 5). DAM 처리 농도가 증가함에 따라 HT-29
이하의 강력한 세포독성 효과를 확인할 수 있었다. 에서는 telomere 길이 감소의 정도가 커지는 경향성을
이러한 차이는 세포 형태 관찰과 colony forming assay 보인 반면, HeLa 의 telomere 평균 길이는 DAM 농도에
에서의 서로 다른 세포 밀도에 의한 결과라고 따른 뚜렷한 경향성을 보이지 않았다(Figure 5). 3 회
생각되며, colony forming assay 에서는 하나의 세포가 반복한 실험 결과에서 동일한 양상이 관찰되었지만,
분열하여 colonoy 를 형성하기 때문에 DAM 에 더욱 미세한 Cq 값의 변화만으로 telomere 의 길이가 크게
민감하게 반응하는 것으로 추측된다. 이 부분에 변하기 때문에 이러한 양상 차이가 파이펫 오사용 등
대해서는 고찰에서 다루고자 한다. 결과적으로 HT-29 실험 오차에 의한 가능성 때문임을 배제하기
와 HeLa 세포주 모두 DAM 의 농도가 증가할수록 어려웠다. 따라서 세포 주에서 Telomere 의 길이가
세포의 생존 능력은 급격히 감소하였으며, 세포 감소했다면 Telomerase 의 발현이 감소했을 것이기에
밀도가 낮을 때 DAM 에 대한 민감성이 증가한다. Western blot 을 통해 Telomerase 의 발현량을 확인하여
DAM 의 처리에 따른 Telomere 길이 변화 양상을 2
중으로 검증하고자 하였다.

4.4. Western blot 을 통한 Telomerase 발현량

확인
Western blot 의 결과, telomere 길이 변화
양상과 마찬가지로 DAM 을 처리하였을 때 HT-
29 에서는 GAPDH 대비 telomerase 의 발현량이
Fig 2. viability assay results．A-HT-29, B-HeLa (a) DAM 0μg/mL 뚜렷한 감소를 보인 반면 HeLa 에서는
(b) DAM 25μg/mL (c) DAM 50μg/mL (d) DAM 100μg/mL 경향성을 파악할 수 없었다(Figure 6). 특히 DAM
의 농도가 50μg/mL 일때 HT-29 에서 telomerase
발현량이 크게 감소하였다. 반면 HeLa 에서는
변화가 뚜렷하지 않고 경향성이 없었으며
대체로 비슷한 telomerase 활성이 나타났다. 또한
DAM 을 처리하지 않은 두 세포주를 비교하여
보면 HT-29 의 band intensity 가 HeLa 에 비해
높게 관찰되었으며, 이는 Telomere 길이 변화
실험에서 관찰된 HT-29 의 평균 telomere 길이가
HeLa 에 비해 길다는 특성을 입증해 주는
결과이다. 결과적으로 Telomere 길이 변화와
Western blot 을 통한 Telomerase 발현량 확인
결과를 종합하였을 때 DAM 은 HT-29
특이적으로 Telomerase 의 발현량을 감소시키고,
이로 인해 세포의 Telomere 의 평균 길이를
감소시킨다는 것을 알 수 있었다.

Fig 3. Induced cell death per DAM concentration on HT-29, HeLa

Fig 4. colony formation of HT-29, HeLa

4.3. 애엽 추출물(DAM) 처리에 따른 telomere 길이

변화
Telomere 의 길이 변화를 측정하기 위하여 qPCR 을 Fig 5. Telomere length reduction effect by DAM
실시하였다. colony forming assay 의 결과에 근거하여 concentration on HT-29, HeLa
DAM 을 0, 25, 50 μg/mL 처리한 HT-29 와 HeLa
세포주의 DNA 를 각각 추출하여 연구 방법에 제시된
Comparative ∆∆Cq (Quantification Cycle Value) Method 에
따라 분석하였다. DAM 의 농도가 0μg/mL 에서의

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Fig 6. telomerase activity quantification band results

4.5. p53, p21 발현 정도 비교

DAM 을 처리하였을 때 HT-29 에서 Telomerase 의 Fig 7. Amplification results for GAPDH, p53, p21 raw data
발현량 감소와 Telomerase 길이의 감소를
확인하였지만, 세포 형태 변화 관찰 시 DAM 을
처리한 후 24 시간 이내에 세포사멸 효과가
발생하였다(Figure 1). Telomoere 길이 감소로 인한
세포 사멸(apoptosis)은 충분한 세포 분열 후 telomere
의 길이가 특정 길이 이하로 감소하였을 때
나타나야하기 때문에, DAM 처리에 의한 빠른 세포
사멸을 설명할 수 있는 주요한 원인은 아니라고
생각하였다. 따라서 DAM 을 처리하였을 때 빠른
세포 사멸을 설명할 수 있는 다른 기작을 탐색할
필요가 있었다. HT-29 에 애엽 추출물의 처리가 Sub-
G1 기 세포수 증가를 보인 선행 연구(이정민 외, 2010) Fig 8. relative expression of GAPDH, p53, p21 mRNA
로부터 DAM 을 처리하였을 때 빠른 세포 사멸이 cell quantification
cycle arrest 에 의한 것일 수 있음을 추론하여 cell
cycle arrest 에 관여하는 protein 을 조사하였다. 최영현 5. 고찰
외(2020), 정재헌 외(2000), 정원일 외(2006) 등의 선행
연구에서 p53 과 p21 의 cell cycle arrest 와 apoptosis 및 본 연구는 정상 세포에 무해하면서 암세포의 증식을
막을 수 있도록 Telomerase 활성을 억제하는 방식의 암
antiproliferative activity 의 효과를 확인하였고, 본
치료제 가능 물질을 제시하기 위해 계획되었다. 정상
연구에서 DAM 처리 시 빠른 세포 사멸이 p53, p21 의
세포와 비교하여 암세포 효과를 비교해야 했지만,
관련성이 있는지 확인하고자 하였다. 이에 p53 과 p21
정상 세포를 배양하는 것에 대한 어려움과 정상
의 유전자의 상대적 발현량을 역전사
세포를 고등학교에서 분양 받는 과정에서 제한
중합효소연쇄반응(Reverse Transcription PCR)을 통해
때문에 정상 세포에 애엽 추출물을 처리하여 실험을
측정하고, 3 회 반복 실험을 통해 DAM 농도에 따른
진행하지 못하였다. 대신 HT-29 세포 외 쉽게 분양
양상을 확인하였다(Figure 7, Figure 8). 그 결과 DAM 의
받을 수 있고 잘 알려진 HeLa 세포를 비교하여
처리 농도가 증가함에 따라 HT-29 와 HeLa 에서 모두
대장암 세포주 외 다른 암 세포주에서 DAM 이
p53 의 발현량이 증가하였다. 그러나 HT-29 는 p53 이
어떠한 영향을 미치는지 확인하고자 하였다.
증가함에 따라 p21 의 발현량도 같이 증가하는
우리는 이정민 외(2010)가 수행한 선행 연구에서 HT-
양상을 보임과 달리 HeLa 는 p21 의 발현량 변화가
29 에 애엽 추출물을 처리했을 때 apoptosis 가
없었다. p53 의 증가는 세포 사멸을 유도하므로 HT-29
일어나는 원인이 telomere 길이의 감소일 것이라
와 HeLa 에서 DAM 의 빠른 세포 사멸이 p53 에 의한
추측했고, 이를 확인하기 위해 DAM 처리 시 세포
apoptosis 와 관련 있음을 추론할 수 있었다. HT-29 와
형태 변화, 세포 생존 능력, telomere 길이 측정,
HeLa 에서 p21 의 상대적 발현량의 양상이 다른
telomerase 발현량을 확인하는 연구를 진행하였다. 또한
원인에 대해서는 본 연구에서는 확인할 수 없었다.
결과 분석 과정에서 발생한 의문을 해결하기 위해
HT-29 에서는 p53 이 p21 발현을 촉진하여 p21 의 p53- 추가적으로 DAM 을 처리했을 때 세포 내 p53 과 p21
dependant pathway 에 의한 cell cycle arrest 효과가 상대적 발현량(전사량)을 비교하였다.
일어났을 것으로 생각되며, HeLa 에서는 p21 이 아닌 세포 형태 변화 관찰과 세포 생존 능력을 측정하기
다른 전사인자 발현의 촉진으로 apoptosis 유도가 위한 colony forming assay 를 진행한 결과 HT-29 와
일어났을 것으로 생각된다. 이에 대해서는 고찰에서 HeLa 의 colony 모양이 달랐다. HT-29 는 분열한
다루고자 한다. 결과적으로 DAM 처리 농도가 세포들끼리 붙어 자라며 colony 를 형성하는 반면,
증가함에 따라 HT-29 와 HeLa 세포주 모두에서 p53 HeLa 는 분열한 세포들이 각각 떨어져서 자랐다(Figure
의 상대적 발현량의 증가가 일어났으며, DAM 처리에 4). 하지만 HeLa 도 세포의 개수가 많아지면 서로 붙어
따른 빠른 세포 사멸이 p53 과 관련 있음을 자라며 colony 를 형성하는 모습이 관찰되었다(Figure
확인하였다.

6 본 논문에 포함된 정보의 전부 또는 일부를 무단으로 제 3 자에게 공개, 배포, 복사 또는 사용하는 것을 엄격히 금지합니다.
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1). 특히 세포 형태 변화 관찰에서는 DAM 의 농도가
50, 100μg/mL 일 때도 꽤 많은 세포들이 바닥에 붙어
분열하는 것이 관찰되었지만, colony forming assay
에서는 DAM 의 농도가 50, 100μg/mL 일 때 관찰된
colony 수가 거의 없었다. colony forming assay 는 낮은
세포 밀도에서 세포가 분열하므로 이와 관련된 선행
연구를 탐색하였다. Wu 외(2017), Caviglia 외(2015)의
연구 등 여러 연구들에서 다양한 화학 물질에 대한
민감성이 세포의 밀도에 따라 달라진다는 것을
보고하였으며, 또한 Campbell biology 10 판(2016,
바이오사이언스), 암의 분자생물학(2021, 월드사이언스)
등의 이론서에서 세포가 분열을 위해서는 여러 성장
인자와 세포들 간 화학물질을 통한 신호전달이
필요함을 제시하고 있다. 이에 세포 형태 변화 관찰에
비해 colony forming assay 에서 HT-29 와 HeLa 의 DAM
농도의 민감성이 높게 관찰되는 것은 colony forming
assay 에서는 세포가 하나씩 존재하기 때문에 주변
세포로부터 증식에 필요한 화학 물질을 받지 못하기
때문임을 생각해볼 수 있었다.
telomere 길이 측정 결과 DAM 을 처리하지 않은 HT-
29 와 HeLa 의 telomere 길이를 비교하면 HT-29 의
telomere 길이가 더 길었다(Figure 5). 또 telomerase 의
western blot 결과 DAM 무처리군에서 HT-29 의
telomerase 발현량이 더 높게 측정되었다(Figure 6).
telomere 길이 측정 결과 DAM 의 농도가 증가함에
따라 HT-29 에서는 telomere 의 길이가 감소했지만,
HeLa 에서는 농도에 따른 telomere 길이 감소의
경향성은 보이지 않았다. 이에 세포가 기존에 가지고
있던 telomere 길이가 길고 telomerase 발현량이 높은
HT-29 가 HeLa 에 비해 DAM 을 처리했을 때
telomerase 발현량과 telomere 길이 변화에 더 민감하게
변할 가능성이 높다고 추측했다. 세포가 기본적으로
가지고 있는 telomere 길이와 telomerase 발현량에 따라
애엽 추출물에 대한 민감성이 어떻게 달라지는지
다양한 세포주를 활용한 추가 실험이 필요하다. DAM
의 처리에 따른 HT-29 와 HeLa 의 telomerase 발현량과
telomere 길이 양상이 다른 또 다른 가능성으로는
Telomere 길이를 측정하기 위해 수거한 세포들이 DAM
을 처리한 후 살아남은 세포들을 이용하는 것이기에
AM 에 영향을 덜 받은 세포들로만 실험을 수행한 것
때문일 수도 있다. colony forming assay 결과 DAM 처리
농도가 50μg/mL 일 때는 colony 가 거의 발견되지
않았지만 세포 형태를 관찰할 때나 DNA, RNA 추출용
세포를 배양할 때에는 50μg/mL 이상의 농도에서도
colony 를 형성했다. 세포가 죽으면서 주변 세포에 면역
반응을 일으킨다는 선행 연구들이 있다(Lee 외, 2011).
따라서 죽지 않고 남아있는 HT-29 와 HeLa 세포들은
죽은 세포들이 방출하는 화학물질에 의해 면역
능력이 높아져 같은 DAM 농도에서도 살아남았으며,
이러한 이유가 HT-29 와 HeLa 의 DAM 에 대한 다른
양상을 나타나게 하였을 수도 있다. 이를 검증하기
위한 추가연구가 필요하다.
HT-29 에 DAM 을 처리했을 때 apoptosis 가 일어나는
원인이 telomere 길이의 감소라면 충분한 cell cycle 을
거쳐 telomere 의 길이가 일정 길이 이하가 된 후
apoptosis 가 일어나야 한다. 하지만 세포 형태 관찰
본 논문에 포함된 정보의 전부 또는 일부를 무단으로 제 3 자에게 공개, 배포, 복사 또는 사용하는 것을 엄격히 금지합니다.
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결과 HT-29 와 HeLa 모두에서 DAM 처리 3 시간
후부터 죽은 세포들이 보이기 시작했다. 이에 우리는
DAM 을 처리 초기에 세포가 죽는 것은 telomere
길이의 감소가 주된 원인이 아니라고 추측했고, 추가
연구를 계획했다. 선행연구(이정민 외, 2010)에 따르면
애엽 추출물을 세포에 처리했을 때 세포주기 억제가
일어남이 보고되어 있다. 또 다른 선행 연구들(최영현,
2021)에 따르면 세포 내 p53 과 p21 발현정도에 따라
apoptosis 가 일어남이 보고되어 있다. p53 은 세포주기
조절 단백질이므로 우리는 DAM 을 세포에 처리했을
때 p53 의 발현량이 달라져 apoptosis 를 유도할 것이라
추측했다. 즉, 우리는 DAM 처리 농도에 따라 세포가
죽는 것의 주된 요인이 cell cycle arrest 일 것이라
추측했고, cell cyle arrest 에 관여하는 protein 인 p53 과
p21 mRNA 발현도를 측정하는 qPCR 을 진행했다. 그
결과 HT-29 의 p53 과 p21 의 발현량은 모두
증가했지만 HeLa 의 경우 p53 의 발현량만 증가하고
p21 의 발현량은 DAM 농도에 따른 큰 차이를 보이지
않았다. p21 은 세포 내에서 발현 정도에 따라 apoptosis
를 억제하기도 하고 apoptosis 를 유도하기도 한다
(Gartel 외, 2002). 우리의 연구 결과에서는 DAM 처리
농도가 증가함에 따라 HT-29 에서 p53 과 p21 의
발현량 모두가 증가했으므로 p21 에 의한 apoptosis 가
일어났을 가능성이 높아 보인다. 하지만 DAM 을
처리했을 때 HT-29 의 p21 이 어떤 작용을 거쳐
apoptosis 를 일으키는지에 관해서 가장 큰 가능성은
p21 이 promoter 에 결합하여 전사하지 못할 경우,
apoptosis 가 일어나는데 DAM 이 전사를 방해한다는
것이다. 그러나 정확한 정보를 얻기 위해 이에 관한
추가 연구가 필요하다. 또한 본 연구에서는 시간과
비용의 문제로 p53 과 p21 의 단백질 발현량을
확인하지 못하고 mRNA 의 상대적 발현량만을
확인하였다. 따라서 western blot 을 통해 실제로 세포
내에서 p53 과 p21 의 발현량이 어떻게 달라지는지
확인하는 연구가 필요하다.
추가적으로 앞서 언급하였듯이 본 연구에서는 RNA
를 추출한 세포는 DAM 처리 후에도 살아있는
세포였기 때문에 죽은 세포와 살아남은 세포에서
mRNA 발현량의 양상이 다를 가능성이 있다. DAM 을
처리한 후 세포가 죽기 전에 세포를 수거 후 RNA 를
추출하여 mRNA 발현량을 비교한다면 DAM 처리후
빠른 세포 사멸 과정에서 mRNA 의 발현량을 비교할
수 있을 것이다.
본 연구는 DAM 을 HT-29 와 HeLa 에 처리했을 때
처리 농도에 따른 telomere 길이 변화와 telomerase
발현량, 또 세포 내 p53 과 p21 발현량의 차이를
밝혀낸 첫 번째 연구라는 점에서 의미가 있다. 이후
추가적인 연구로는 세포가 본래 가지고 있는 telomere
길이와 telomerase 활성에 따라 apoptosis 원인이
달라지는 지 알아내어 본 연구에서 HT-29 의 telomere
길이가 DAM 처리 농도에 더 민감하게 반응한 원인을
알아내어야 한다. 또 p21 의 발현량이 DAM 처리
농도에 따라 HT-29 에서만 달라졌는데, p53 의 발현이
증가했음에도 HeLa 에서는 p21 의 발현이 증가되지
않은 원인을 밝히는 연구가 필요하다. 또한 발현이
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증가된 p21 이 어떤 과정을 거쳐 HT-29 가 죽는 것에
영향을 미치는지에 대한 연구가 필요하다.
6. 결론
본 연구에서는 발병률이 급증하고 있는 암의 진행을
억제하거나 감소시키고 암세포의 증식을 억제하며,
세포사멸을 유도할 수 있게 하는 애엽이 HT-29 세포의
특이적 telomerase 발현 억제에 의한 apoptosis 유도
효과를 알아보았다. 세포 형태를 관찰한 결과 DAM 의
처리량이 많아질수록 apoptosis 가 일어난 세포와
죽어서 배지에 붙지 못하고 떠있는 세포가 더 많았다.
이를 바탕으로 colony forming assay 를 실시해 cell 의
viability 를 측정하였다. DAM 처리량이 늘어날수록
colony 의 수가 줄어들었으며, DAM 이 세포 사멸에
영향을 미침을 알 수 있었다. 이 결과가 telomere 와
관계가 있음을 확인해보고자 qPCR 을 진행하여 각
농도 별 cell 에서 DNA 추출 후 반복 실험을 진행한
결과, HT-29 의 경우 DAM 농도에 따른 telomere 길이의
감소 효과가 나타났지만, HeLa 의 경우 뚜렷한
경향성을 나타내지 않았다. telomerase 의 발현량을
측정하기 위해 western blot 을 실시했다. HT-29 의 경우,
DAM 처리 농도가 증가함에 따라 telomerase 발현량의
감소가 뚜렷하게 보였으나 HeLa 의 경우 telomerase
발현량 변화 대한 경향성을 확인할 수 없었다. 여러
실험 결과를 종합하여 우리는 DAM 처리하였을 때
빠르게 일어나는 apoptosis 의 주요한 요인이
Telomerase 발현 억제로 인한 Telomere 감소가 아니라고
생각하였다. apoptosis 의 다른 요인을 찾기 위해 선행
연구를 바탕으로 p53, p21 발현량을 RT-qPCR 을
실시하여 측정하였다. 두 세포주 모두 DAM 농도에
따라 p53 발현량이 증가하였고 p21 의 경우 HeLa
에서는 대체로 큰 변화폭을 보이지 않았으나 HT-29
에서는 발현증가를 확인하였다.
이 연구를 통해 애엽 추출물은 HT-29 에서 HeLa 에
비해 telomerase, p53 과 p21 의 발현에 의한 apoptosis
효과가 높게 나타난다는 결론을 내릴 수 있었지만,
설명하지 못한 여러 가지 의문점을 해결하기
위해서는 추가 연구가 필요하다. 본 연구는 애엽
추출물의 대장암세포에 대한 효과와 Telomere 활성,
p53, p21 의 발현과 관련된 내용을 밝히므로써, 인체
세포에 대한 독성효과를 최소화한 암 치료제의
성분으로써 애엽추출물의 활용 가능성을
제시하였다는 점에서 의미가 있다.
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