실험7.

철 염색
임 성연
대전대학교 임상병리학과

Iron Stain
Seong yeon Lim

Dept. of Biomedical Laboratory science, Daejeon University, 62,

Daehak-ro, Dong-gu, Daejeon, Republic of Korea

May, 2, Tuesday, 2023

Email: tjd2936@naver.com

Abstract
이번 실험에 적용한 Iron Stain은 철결핍빈혈이 많이 발생하는 우리나라에서 많이 이용되고
있는 이용법으로 골수에 있어서 환형 철모구의 증가를 특징으로 하는 철적모구성 빈혈의 진단
을 목적으로 한다. Prussian blue 시약을 사용하여 acid ferrocyanide와 3가 철이 반응하여
짙은 청색의 ferric ferrocyanide를 형성하는 원리로 하는 염색법이다. 실험 결과 적혈구가
prussian blue 시약으로 인해 적혈구가 염색된 것을 확인하였고 sideroblast 및 sifderocyte
가 관찰되지 않은 것으로 보아 정상으로 판단된다.
이번 실험은 세포나 골수 내 저장철의 정도를 판단하기 위해 많이 이용되는 염색법을 이용했
다. 철염색은 주로 골수 표본으로 시행하지만 특별한 경우는 철아구와 철세포를 검출하기 위
해 말초혈액을 염색하기도 한다. 철은 페리틴과 결합된 상태로 저장되며 저장된 철은 혈액 내
베타 글로불린, 트렌스페린과 결합하여 이동한다. 이동한 철이 적혈모구 표면으로 유리되고
세포내로 이동한 철이 미토콘드리아에서 heme으로 전환된다. heme이 되지 못한 비햄성 잔
류물이 페리틴이 되고 페리틴이 분해되며 헤모시데른으로 변환한다. 본 실험에 적용한 철염색
법에서 페리틴과 헤모시데린이 청색으로 염색되고 핵은 적색, 세포질은 분홍색으로 염색되어
철 결핍성빈혈이나 철적아구성 빈혈을 진단할 수 있다. 철 결핍성 빈혈은 체내 저장된 철이
적혈구 생성에 필요한 양보다 감소하여 정상 수치보다 낮은 경우 진단되고 철적모구성 빈혈은
인체가 충분한 철을 가지고 있지만 헤모글로빈 생산에 철을 이용할 수 없는 경우에 진단된다.
철 과립을 가지고 있는 적혈모구는 철적혈모구라고 하며 정상적으로 골수에 있는 적혈모구의
약20-50%에서 철 과립이 관찰되고, 정상적인 철적혈모구는 1개 또는 그 이상의 직경 1mm
미만의 작은 푸른색 과립을 가진다. 이 과립들이 증가하여 핵 둘레의 2/3 정도를 둘러싸게 되
어 핵 주변에 목걸이 모양으로 배열하는 경우가 있는데 이를 환상철적모구라 하고 철적모구빈
혈에서 특징으로 나타나며 일부 골수형성이상증후군에서도 관찰된다.
철염색은 주로 골수 표본을 이용하지만 본 실험에 적용한 철염색법은 methonol로 고정 후
prussian blue와 0.1% safranin O 시약을 사용하는 방법이다. 결과적으로 비정상 적혈구를
관찰하고 철결핍빈혈과 철적모구성 빈혈 진단을 목적으로 한다. 시약들로 염색 후 증류수로
수세 과정을 거친다. 증류수는 철 성분에 의한 오염 방지를 위해 거쳐야 하는 과정이며 마지
막 0.1% safranin o 수용액에 1분간 염색 후 증류수로 수세 후 methnol에 담궈두는 과정이
있는데 이는 과잉의 후염색액 제거를 목적으로 하는 과정이다. 본 실험의 중점은 혈액도말 제
작과 염색과정이다. 염색이 잘 되기 위해선 혈액도말을 제작하는 과정이 중요하다. 혈액도말
제작 시 미는 각도와 속도, 도말의 두께, 길이, 모양의 대칭성 등 다양한 요인에 의해 도말의
완성도가 정해진다. 염색하기 전에 적혈구가 비틀어지는 현상을 예방하기 위하여 air dry를
철저하게 하여야 한다. 또한 좋은 염색을 위해서는 염색약이 별로 없는 경우 슬라이드에 염색
약을 뿌려놓기보다 염색약을 교환하는 것이 좋다. 염색약 관리에 문제가 생길 시 세균이 증식
할 수 있으며 이렇게 오염된 염색약은 혈액도말 시 여러 문제를 유발할 수 있다.
본 실험에서 이용한 혈액도말 수기 제작은 수작업으로 이루어져 많은 시간과 인력이 요구되고
감염의 위험이 있다. 서울 아산 병원에서는 자동도말 염색기인 SP-100TM를 도입한 사례가
있다. 이 기기에서 가장 우수하게 평가된 세포의 분포도의 경우 일정한 속도로 얇게 도말되어
백혈구 수 500-1000u/L의 경우에도 세포가 잘 분포되어 검경에 어려움이 없었다. 또한 백혈
구의 염색성 및 모양도 검사자 간의 차이가 없었다. 자동도말염색기의 사용은 제한된 시간에
다량의 검체를 처리하는 검사실에서는 인원 절감과 검사시간 단축의 효과가 있다고 보여진다.

Ⅱ.Meterial
손소독제(루트밀 순진한 손소독제겔(에탄올), rootmill, KOREA), 압박띠(tourniquet), 채혈용
팔 배게(웰리스 코리아), 70% 에탄올 소독용 솜(대한에탄올스왑,(주)대한위재상사,KOREA),
채취한 혈액을 담을 시험관(EDTA K2, BDvacutainer,USA), holder(vacutainer needle
holder, BD vacutainer, CHINA), needle(360213,Becton Dickinson and Company, UK),
needle 수거 용기(의료 폐기물 전용 용기, ㈜대광인더스트리, KOREA), 거즈, 위상차현미경
(ZEISS primo star,Carl Zeiss,GERMANY), slide glass(microscope slides, superior
Marienfeld, GERMANY), Dropper, methanol, D.W, Prussian blue 시약(10% Potassium
ferrocyanide 용액 + 10% HCl 동량 혼합), 0.1% safranin O 수용액

Ⅲ.Methods
EDTA튜브에 채혈을 실시하여 부드럽게 믹싱했다.
slide glass를 청결한 거즈를 이용하여 잘 닦았다.
slide glass에 혈액 한방울을 떨어뜨렸다.
spreader slide를 뒤로 후진하여 slide glass에 올려 놓은 혈액 방울이 spreader slide의
뒷면에 맺히도록 하였다.
slide glass와 spreader slide 사이의 각을 약 30~45도로 유지하며 slide glass를 잡고 있는
왼손 엄지를 향하여 spreader slide를 일정 속도로 이동하였다.
slide 도말을 건조시킨 후 표본 걸개에 올려놓았다.
methanol로 10분간 고정했다.
D.W로 1분간 수세 후 완전히 건조시켰다.
prussian blue 시약으로 30분간 염색했다.
D.W로 1분간 수세 후 완전히 건조시켰다.
0.1% safranin 0 수용액으로 1분간 염색했다.
D.W로 1분간 수세 후 methanol에 수 초 동안 담구었다.
D.W로 수세 후 완전히 건조시켰다.
광학현미경 1000배율에서 적혈구 염색을 확인했다.

Ⅳ.Result
정수진의 혈액으로 제작한 혈액도말의 염색정도를 확인하였으며 sideroblast 및 siderocyte가
관찰되지 않았으므로 정상으로 판단된다.
Ⅴ.Discussion
이번 실험은 prussian blue시약과 0.1% safranine-o 시약을 이용한 철염색을 실시하였다.
정상인의 말초혈액에서는 철적혈구와 철적혈모구가 관찰되지 않는다. 이들은 이온화 철이
acid ferrocyanide와 반응하여 짙은청색의 ferric ferrocyanide를 형성하여 파랗게 염색되므
로 세포나 골수 내 저장철의 정도를 관찰할 수 있다. 비정상 혈액에서는 헤모시데린과 페리틴
철은 청색으로, 핵은 적색으로, 새포질은 분홍색으로 염색된다. 본 실험의 결과 혈액도말을 제
작하여 적혈구의 염색정도를 확인하였고 철적혈구와 철적혈모구와 같은 비정상 적혈구는 관찰
되지 않았으므로 정상으로 판단된다. 만약 혈액 내 철적혈구와 철적혈모구가 관찰되었다면 철
결핍성 빈혈, 철적아구성 빈혈을 의심할 수 있다. 실제로 철결핍 환자의 골수표본을 현미경을
통해 관찰하였다. 많은 수의 철과립을 관찰할 수 있었다. 체내 저장된 철이 적혈구 생성에 필
요한 양보다 감소하여 정상 수치보다 낮은 경우 철결핍성 빈혈을 진단할 수 있다. 또한 성인
의 경우 페리틴이 보통 15ng/mL미만, 혈청 철이 50ug/dL이하이며, 혈액 도말 검사상 정상
적혈구보다 크기가 작은 소구성, 적혈구 중심부의 흰색 부위가 전체 직경의 1/3을 넘는 저색
소성 적혈구가 보이는 경우 철결핍성 빈혈을 진단할 수 있다. 철적모구빈혈에서는헴합성이 감
소되고 적모구 (normoblast)의 미토콘드리아에 철분이 축적된다. 철적모구빈혈 환자의 골수
를 채취하여 철염색을 하여 현미경으로 관찰하면, 적모구의 핵 주위에서 미토콘드리아에 축적
된 철분이 반지모양으로 관찰되는데, 이를 환상철적모구 라고한다. 조직 내 철 농도가 증가하
고 저염색성 적혈구로 나타나는 것이 특징이다. 철적모구는 정상 골수에서 볼 수 있는 형태로
세포질 내 과립은 미세하고 수가 적은 Ⅰ형, 정상보다 큰 과립에 비교적 거친과립이 세포질
내에 5개 이상 산재하는 Ⅱ형, 철 과립5개 이상이 핵의 3/1이상을 감싸고 있는 형태를 보이
는 Ⅲ형으로 분류할 수 있고 Ⅲ형은 철적모구성 빈혈 시 나타나는 환형철적모구이다.
본 실험인 철염색을 위해 질 좋은 혈액도말을 만드는 것이 중요하다. 위에서 설명했듯이 적
당한 혈액의 양으로 도말을 제작해야한다. 혈액의 양이 너무 적으면 갈라지거나 많으면 도말
의 두께가 두꺼워질 수 있다. 또한 두 장의 슬라이드 각도가 너무 크거나 작으면 도말의 길이
가 짧거나 길어질 수 있어 적당한 각도로 밀어야 하며 속도도 잘 조절하면서 제작하는 것이
중요하다. 이번 실험에서는 적혈구를 중점으로 혈액도말을 관찰한다. 적혈구 관찰 시 염색저
하는 혈액 도말상에서 적혈구의 central pallor가 증가하는 것을 나타낸다. 철 결핍은 개에서
이와 같은 염색저하를 나타내는 가장 흔한 원인이다. 따라서 염색약의 관리를 철저히 하고 염
색시간을 잘 지키는 것이 중요하다. 또한 슬라이드는 뒤집어서 수세하도록 하여 혈액검체의
소실을 방지할 수 있다. 철염색은 대부분 골수표본으로 시행하지만 이번 실험에서는 말초혈액
도말로 시행했다. 김백수 외 3명은 골수 표본과 혈액도말의 철염색의 결과를 비교하였다. 골
수표본과 혈액도말에서의 결과는 조직의 고정법이 다르고 골수의 철분포가 불규칙적이므로 철
염색 정도의 차이가 있을 수 있다. 혈액도말법이 간편하고 ringed sideroblast를 같이 관찰할
수 있어 널리 쓰이고 있다. 실험 결과 전체의 5%에서는 골수생검에서 발견되지 않은 철이 혈
액도말에서 발견되었으며 이 반대로 혈액도말에서 발견되지 않은 철이 골수생검에서 8.3%가
발견되었다. 따라서 두 방법 중 어떤 방법이 더 우수하게 철 검출을 했다고 할 수 없다. 골수
생검에서 발견되지 않았던 철이 혈액 도말에서 발견된 경우는 혈액도말이 대체로 두꺼운 경우
였다. 철염색을 통한 저장철의 존재는 상황에 맞는 방법을 이용하면 되겠다.
Ⅵ.Reference
https://blog.naver.com/PostView.naver?blogId=hyouncho2&logNo=60160687004&redirect
=Dlog&widgetTypeCall=true&directAccess=false

https://www.schlab.org/guide/item/28/

김백수, 송경군, 권오헌, 정우희, 골수 생검 및 흡인도말의 철염색 결과비교, 대한임상병리

사협회, 1991, 제 13권 제2호, p205, 206, 208

김덕희,홍훈,김봉철, 박찬정, 자동도말염색기 SP-100TM를 이용한 백혈구 감별 계산의 경험

보고,대한임상병리사학회 초록집,2005, 2005권 1호 p.60

이재희, 병원 내에서 혈액 도말의 평가 1,동물임상의학, 2012, vol.10 No.1, p11,12,14,15

http://www.snuh.org/health/nMedInfo/nView.do?category=DIS&medid=AA000242

https://labmusiclm.tistory.com/399