Chapter 2.

DNA의 추출법
1. DNA 추출이란?
- 세포 소기관으로부터 핵산을 분리하는 것
- 핵산 = DNA + RNA

2. DNA 추출 원리
1) 총 세포 DNA 추출
(1) Phenol 추출
① 단백질과 핵산이 들어있는 용액에 페놀 첨가
② 흔들어 혼합후 원심분리 -> 응축
③ 유기물상과 액체상으로분리 -> 단백질 제거
④ Rnase를 사용해 -> RNA제거
⑤ 에탄올 침전법으로 -> DNA를 분리

(2) 이온교환 크로마토그래피

- 이온 교환 수지의 이용
- DNA/RNA (음전하)와 양전하 수지 결합
- DNA는 염 처리를 하여 수지로 부터 분리

(3) 칼럼을 이용한 방법

- Chaotropic salt 용액 존재하에 핵산들이 실리카와 가역적으로 결합하여 흡착되는 원리를 응용
① 세포 용해와 단백질 분해
② 에탄올 침전된 DNA용액을 칼럼에 통과
③ 여과지는 알코올 용액 속의 DNA만 결합
④ 결합된 DNA는 low ionic strength buffer 또는 증류수로 용출

3. 지놈 DNA 추출
※ 지놈(Genome)이란?
- 유전자(gene)와 염색체(chromosome)의 합성어로, 우리말로는 유전체라 함.
- 한 생물체가 생명 현상을 영위하는 데 필요한 유전물질(DNA)의 집합체를 뜻함.
- 1게놈은 생물체를 형성하는 유전자의 최소 단위가 됨

(1) 유기용매를 이용한 추출법

(2) 백혈구로부터 추출
(3) 회전분리법을 이용한 추출
- Qiagen사의 genomic DNA miniprep kit 이용하며 200µl의 전혈에서 3~12µg의 DNA 수거효율 가짐.

※ 전혈로부터 백혈구를 분리하는 방법

(1) 적혈구용해분리법
(2) 비중액(Histopaque) 사용법
(3) 5% Dextran saline법
- Dextran은 긴 탄수화물 중합체로서 RBC들을 서로 엉기게 하여 무거워져 이 때문에 침강속도 증가하는 특징
4. 플라스미드 DNA 추출
1) 크기에 기초한 분리
- 조심스럽게 세포를 용해시키면 세균 DNA의 단편화가 감소해 원심분리로 쉽게 분리가능
① Lysozyme, EDTA, 25% sucrose(설탕)처리해 세포를 원형질체로 만듦
② 원형질체의 세포막을 파괴하기 위해 Triton X-100처리
③ 세포 추출물을 원심분리 (10000 rpm, 5~10 min)
④ 세포 찌꺼기는 침전, 삼층액의 상단엔 투명 용해질,
하단엔 큰 DNA 단편들이 존재

(1) 알칼리 방법에 의한 Plasmid DNA의 추출 및 정제

- CsCl 원심분리 방법과 비교해 간단, 신속, 비용이 적게 듬
- 알칼리에 의해 Plasmid, choromosomal DNA가 변성되는 성질 이용
- DNA 용액을 중화시켜 선택적으로 Plasmid DNA를 복구 후 추출 정제

(2) 상품을 이용한 분리법 (QIAGEN plasmid mini kit)

- 플라스미드의 mini prep에는 대표적으로 alkaline lysis 방법 과 boiling방법이 있음
- QIAGEN KIT는 alkaline lysis방법 을 기초로 함
< 원리 >
- Cell tract를 pH12-12.5로 처리하면 nonsupercoiled DNA는 수소결합이 파괴되어 이중가닥이 풀림
→ 작고 형태적으로 밀착되어있는 supercoil의 plasmid는 영향을 받지않음
- 산을 가하면 nonsupercoil 형태의 bacterial 염색체는 나머지 cell debris와 함께 하얀색 덩어리로 뭉쳐짐
- 반면, supercoiled plasmid는 투명한 상층액에 그대로 용해된 채로 남아 원심 하여 플라스미드를 획득 가능
※ plasmid가 supercoil의 형태로 존재하는 반면, bacterial 염색체는 코고 nonsupercoil의 형태로 존재하는
형태의 차이를 이용하여 plasmid를 분리해내는 방법

(3) CsCl Gradient방법에 의한 plasmid DNA의 추출 및 정제

- 알칼리 방법에 비해 복잡하고 시간과 비용이 많이 듬.
- 장점 : 순도가 높은 DNA를 얻을 수 있음

- 고분자와 함께 원심분리되면 분자의 고유한 밀도와 동일한 CsCl밀도 위치에 밴드(band) 형성

- EtBr과 함께 밀도 구배 원심법으로 ,non-supercoiled DNA와 supercoiled DNA 분리 가능
① 세포 추출물과 함께 EtBr, CsCl를 첨가하고 40,000 rpm 으로 48시간 원심분리
② CsCl 밀도구배가 형성되며, EtBr에 의해 부력의 차이가 생긴 linear & open circula DNA는 상단에,
supercoiled DNA는 하단에 band를 형성 (최상단엔 단백질, 최하단 pellet에는 RNA가 존재)
 ※ supercoiled DNA는 EtBr-CsCl gradient에서 linear와 open circular DNA와 다른 위치에 band가 형성됨
*EtBr : DNA 염기 사이에 끼어 들어감으로써 부력 변화시킴.
③ supercoiled DNA의 band만을 주사기로 추출하여 새로운 tube에 옮김.
④ DNA 염기사이에 삽입된 EtBr을 제거하기 위해 n-butanol(n-부탄올) 처리
⑤ 반투과막을 이용하여 투석시킴으로써 CsCl과 DNA를 분리.

5. 형질전환기법
- 원래의 세포가 가지고 있던 것과 다른 종류의 유전자가 있는 DNA사슬 조각 또는 플라스미드가 세포들 사이에
침 투되어 원래 세포에 존재하던 DNA와 결합, 세포의 유전형질이 변화되는 분자생물학적 현상임.
* Competent cell : 정상적인 박테리아에 화학적 처리를 하여 DNA가 잘 들어갈 수 있게 만든 cell.

1) CaCl₂ transformation
(1) 화학적 방법
① 정상적인 bacterium에 CaCl₂ treatment를 처리함.
② CaCl₂ treatment에 의해 세포막에 구멍이 생기게 되어 불안정한 상태의 Competent cell 이 됨.
③ Competent cell에 넣을 외래 DNA를 준비한 뒤, Heat shock을 42℃/2m 을 가해줌.
④ Heat shock으로 인해 세포막 투과성이 증가하여 외래 DNA가 Competent cell 내부로 들어가게 됨.

(2) Electroporator(전기천공기)
- 적정한 전기를 가해줘서 세포막을 불안정하게 만들어서 DNA가 세포 내로 들어갈 수 있게 하는 방법.
< 벡터에 DNA 조각이 삽입되었는지 확인 방법 >
(1) 항생제
- 항생제 감수성 VS 항생제 내성
(2) 야만적힘과 무지
- 균을 무작정 키워서 집락을 하나하나 다따서 PCR을 하여 염기서열 분석
- 비효율적, 비경제적
(3) 색깔 확인
- Blue/white screening법
→ ß-galactosidase 와 X-gal을 이용한 방법
→ ß-galactosidase는 lac Z 유전자와 관련

<원리>
① 외부 DNA가 lac Z 내부 MCS부분에 삽입 X, lac Z는 활성화 되어 ß-galactosidase를 생성 O
→ ß-galactosidase에 의해 X-gal 분해 O → 푸른색을 띰

② 외부 DNA가 lac Z 내부 MCS부분에 삽입 O, lac Z는 불활성화 되어 ß-galactosidase를 생성 X

→ ß-galactosidase가 없어 X-gal 분해 X → 흰색을 띰.
6. 핵산 정량법
ㆍ목적 : 정제한 핵산의 양이 어느 정도인지, 순도가 어떤지 알아 보기 위함
1) 핵산 정량의 원리 : ‘모든 물질은 고유의 흡광 파장을 가진다‘는 원리에서 시작

2) 핵산 정량의 방법
(1) 분광광도계
- 일반적으로 빛이 닿으면 그 빛은 반사, 흡수, 통과하는 빛으로 나뉨
- 물질에 의하여 흡수되는 빛의 양(흡광도)은 물질의 농도에 따라 다름
- DNA, RNA등의 핵산을 추출하기 위해서는 phenol, gunanidine이 포함된 시약 사용
→ 시약류의 오염정도를 확인하기 위해 230 nm 파장을 측정
- 단백질에 쌓여있는 핵산을 추출하는 작업이므로 단백질 오염이 발생
→ 단백질의 오염정도를 측정하기 위해 280 nm 파장을 측정

측정 파장 측정 타겟
230 nm 유기 화합물
260 nm 핵산
280 nm 단백질 구성원

①260 nm/280 nm ratio-> Protein 오염도 측정

②260 nm/230 nm ratio-> Organic compound 오염도 측정
- 특징
ㆍ 희석, 계산 불필요 ㆍ 소량측정가능
※ dsDNA, ssDNA 혹은 ssRNA 구분해 측정
→ 물질마다 흡광 계수가 다름
→ 흡광 계수가 다르면 같은 파장, 같은 흡광도여도 농도 값이 달라짐
- 핵산별 260nm 파장에 대한 흡광계수와 그에 따라 흡광도(Optical density, OD) 1이 나타내는 농도 값
흡광 계수 OD 1일 때, 농도
핵산 종류
Extinction Coefficient Concentration
Nucleic Acid Type
(µg/mL)-1 cm-1 (µg/mL) if OD=1*
double-stranded DNA 0.020 50 µg/ml
single-stranded DNA 0.027 37 µg/ml
single-stranded RNA 0.025 40 µg/ml

※ 흡광도 계산 : 시료용액의 이동길이(pathlength, L) X 시료용액의 농도(Concentration, C) X 흡광계수

※ 농도계산 : 흡광도 측정값 X 희석비율(%) X DNA측정상수(단위μL)
(2) PCR
- PCR을 통해 극히 미량인 DNA를 검출가능
- 증폭산물의 양으로 주형량을 정확히 추정하기는 어려움
→ 가장 큰 이유 : plateau(고원) 효과
= 초기 주형량과 관계없이 같은 양의 PCR 생성물을 얻을 수 있음

① competitive PCR
- DNA Competitor라는 DNA 단편을 이용
→ 실제로 PCR해서 얻고자 하는 product와 size는 다르면서, primer는 일치
→ DNA Competitor의 조건
a. 목적 DNA와 같은 primer로 증폭할 수 있다.
b. PCR 증폭한 후에 목적 DNA와 구별할 수 있다
c. 증폭 크기가 달라 제한효소 처리 단편의 전기영동 패턴이 다르다.
d. 농도 또는 양을 파악할 수 있다
- 동일 tube에 동일 primer를 첨가해 함께 PCR 실시
→ gel 상에서 알고있는 competitor 농도와 모르는 sample의 PCR product를 양적 비교

② real time PCR

- 과정 동안 증폭된 DNA 산물의 양을 실시간으로 모니터링 하는 방법
- 정확한 정량이 가능
- 병원균 감염 진단과 같은 정성 분석 가능
- PCR 증폭산물의 양을 형광을 이용하여 검출
→ 검출 방법
a. intercalater [SYBR Green]
b. 형광표지 probc [TaqMan Probe]
< 장점 > < 단점 >
- 민감도ㆍ특이도가 높음 - 오염의 위험이 적음 - 비특이적인 증폭산물에도 반응

※ SYBR Green 형광법

- PCR에서 합성된 double standard DNA에 결합해서 형광을 발산
- DNA 염색약의 복합체 결과물은 청색광(497nm)을 흡수, 녹색광(520nm)을 방출
- 이중가닥 DNA에 결합하지만 낮은 정도로 단일가닥 DNA도 염색함

※ TaqMan probe법
- SYBR Green에 비해 반응특이도(specificity)가 높아 진단에 많이 사용
- TaqMan Probe의 5’ 말단에는 형광물질(Reporter)이, 3’ 말단에는 형광을 흡수하는 Quencher가 결합되어 있음
- Annealing과정 중에는 Quencher에 의해 발현된 형광이 흡수됨.
- Extension 과정에서 Taq DNA polymeras의 5’→3’ exonuclease의 작용
- 5’ 에 있던 형광물질이 probe에서 떨어져 나와 형광 발현
- 형광량을 측정하면 target 유전자의 증폭량을 측정할 수 있음.
Chapter4. 제한효소
1. 제한효소(restriction enzyme)란?
(1) 제한효소의 정의
- DNA 분자 내의 '특정 염기서열' 을 인식, 인식 부위의 dsDNA를 절단하는 endonuclease
- bacteria가 bacteriophage의 공격을 받으면 생산하는 효소. 바이러스의 침입으로 부터 자신 방어 목적
→ ’제한(restriction)’

(2) 제한효소의 역할
- 세균
ㆍ bacteriophage의 외부 DNA의 특정 염기서열을 제한효소가 인식, 절단해 제거
ㆍ 제한효소 생산 시 동시에 만들어지는 박테리아의 변형효소가 자신의 DNA를 메틸화 하여 보호
- 유전공학
ㆍ 유전자의 벡터 내 삽입에 이용
ㆍ 재조합DNA를 만들 때 사용

2. 제한효소의 작용원리
(1) 제한효소의 절단
- DNA의 절단
ㆍ 특정 염기서열인 인식부위(recognition site)에 결합
ㆍ 역반복서열을 인지
ㆍ 제한 효소로 잘린 DNA의 말단 부위를 점착말단이라고 하며, 점착말단은 상보적인 염기 서열을 가진
다른 DNA 말단과 결합할 수 있는 단일 가닥 부분

3. 제한효소의 종류
- blunt end : 대칭면의 중심이 잘리는 경우
- sticky end : 대칭면의 주위가 잘리는 경우

(1) Ⅰ형 제한효소
- 제한효소 + 메틸화효소
- 인식부위와 절단부위가 다름
- 염기서열은 특이적으로 인식하지만, 인식부위에서 약 1000개 염기 정도 떨어진 곳을 비특이적으로 절단
2+
- 효소 활성에 ATP, S-adenosyl methione, Mg 등 필요
- DNA 절단 위치의 특이성이 없음 (따라서 실험 목적으로는 사용 안함)
 (2) Ⅱ형 제한효소
- 인식부위, 제한부위 특이적
2+
- 효소 활성에 Mg 이 필요로 함, ATP는 필요하지 않음
- 실험실에서 주로 사용
- 제한효소의 유형에 따라 사용되는 효소가 다름.
< Ⅱ형 제한효소의 종류 >
① EcoR1
- E. coil에서 분리
- GAATTC라는 염기서열을 만나면 DNA를 절단해 sticky end 형성
② Pstl
- DNA 클로닝에 유용
③ EcoRV (Eco321)
- E. coil에서 분리
- 절단된 끝이 무뎌서 무딘 복제 위치에 쉽게 연결 가능
(3) Ⅲ형 제한효소
- 제한효소 + 메틸화효소
- 인식한 부위에서 어느 정도 떨어진 부위를 절단
- DNA를 자르기 위해서 DNA 분자 반대 방향으로 놓여 있는 또 다른 염기서열이 존재해야함
2+
- 효소 활성에 ATP, Mg 필요
- 실험에 잘 사용안함

4. 제한효소의 작용시 영향을 주는 것들

1) Methylation
- 제한 효소 인식부위에 methyl기를 붙임 → 절단 불가

2) Star 활성
- 제한효소 반응 조건이 좋지 않은 경우, 특이성이 저하되어 인식부위가 아닌 다른 염기서열 절단
- 발생조건
→ 25mM 이하의 낮은 이온강도
→ 8.0 이상으 높은 pH
→ 효소가 기질에 비해 과다
2+
→ Mg 이외 2가 양이온 존재
→ 유기용매 존재
→ 높은 글리세롤 농도

3) 부분 분해
- DNA순도 : 절단부위 수가 확실한 기질을 이용해 DNA band 확인
- 기질 DNA : DNA의 종류애 따라 인식부위, size가 달라 제한효소 양 변화
- 반응저해 물질 : 2개 이상 제한효소 사용시, 반응용액 내 불순물이 효소활성 억제
- 기질 DNA에 대해 절단이 예상되는 제한효소를 사용하여도 충분히 절단되지 않는 경우
4) DNA 결합 단백질
- 제한효소로 반응한 후 전기영동하였을 때
→ 밴드가 확인되지 않음
→ 밴드의 퍼짐현상 발생
→ 밴드의 이동도가 이상한 경우
→ 효소 단백질 자신이나 다른 단백질이 DNA에 결합해 DNA가 gel 속으로 들어가지 않거나,
DNA가 ETBR에 염색되지 않기 때문
- 해결방법 : SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) 등의 변성제를 최종농도 0.1%가 되도록 시료에 첨가해 전기영동

< 주의사항 >

- 제한효소는 냉장고에서 꺼냈을 때 바로 얼음에 보관하는 것이 좋음
- 대부분의 제한효소는 37°C가 최적 활성 온도임
- 반응시간은 효소 활성 단위에 따르면 1시간이 적당함
- 20°C (같은 온도 유지시가 가장 적당한 보관 온도)